KR101170998B1 - 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법 - Google Patents

미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101170998B1
KR101170998B1 KR1020110142783A KR20110142783A KR101170998B1 KR 101170998 B1 KR101170998 B1 KR 101170998B1 KR 1020110142783 A KR1020110142783 A KR 1020110142783A KR 20110142783 A KR20110142783 A KR 20110142783A KR 101170998 B1 KR101170998 B1 KR 101170998B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rice bran
dialysis
glycoprotein fraction
supernatant
precipitate
Prior art date
Application number
KR1020110142783A
Other languages
English (en)
Inventor
최희돈
박용곤
최인욱
김윤숙
박호영
하상근
이상훈
홍희도
유아름
김하형
이광원
Original Assignee
한국식품연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국식품연구원 filed Critical 한국식품연구원
Priority to KR1020110142783A priority Critical patent/KR101170998B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101170998B1 publication Critical patent/KR101170998B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

따라서 본 발명은 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 단백질 중량 대비 당 중량비가 5:1 내지 15:1인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적, 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 NO와 TNF-α의 생성을 촉진하는 효능이 매우 뛰어나며 세포독성이 전혀 없어 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

Description

미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법 {Glycoprotein fraction isolated from rice bran and method for producing the same}
본 발명은 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 단백질 중량 대비 당 중량비가 5:1 내지 15:1인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적, 식품 조성물에 관한 것이다.
당단백질은 탄수화물이 단백질의 특정 아미노산에 복합체로 이루어진 생체분자로서 동식물의 세포조직에 널리 분포하고 있으며, 주로 세포외벽에 많이 존재하면서 수많은 세포표면의 반응에 관여한다. 또한 당단백질은 단백질 및 핵산과 달리 순수한 선형 및 가지형 구조와 같은 거대한 삼차원적 구조를 지니고 있어 구조적으로 다양할 뿐만 아니라 생물학적으로 잠재적인 기능들을 많이 갖고 있다.
면역이란 인체 내에서 외부로부터 침입하는 미생물 동종의 조직 등의 다른 물질, 특이 세포가 발생하면 면역계가 관여하여 이들을 항원으로 인식하여 특이하게 반응하여 항체를 생산하는 능력을 나타냄으로서 개체의 항상성을 유지하려는 현상을 말하며, 면역 반응에 관여하는 세포는 임파구, macrophage, NK cell, 수지상세포 등이 있다. 최근 생체의 면역세포로부터 cytokine 방출을 촉진시켜 암세포를 괴사시키는 면역요법이 주목받고 있다. 면역요법은 면역반응의 증강 및 억제 유도를 통해 생체의 방어능력을 조절함으로써 암세포를 사멸하기 때문에 기존의 약물에 의한 항암치료법보다 더 큰 효과를 기대할 수 있다. 따라서 안전성이 보고된 천연물로부터 면역활성 증진 효능을 갖는 천연물을 탐색하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있다.
인류의 식량자원으로서 오랜 역사가 있는 벼는 도정하는 정도에 따라 현미 또는 백미의 형태로 얻게 되고, 또한 이들 현미나 백미를 제외하고 남게 되는 벼의 껍질인 왕겨, 쌀겨, 쌀눈, 싸라기 등의 부산물인 미강을 얻게 된다. 벼를 구성하는 구성요소로서 도정과정에서 부산물로 발생되는 미강은 몸에 유익한 성분을 함유하고 있음에도 상대적으로 선호도가 높은 백미와 달리 식용으로 사용되지 못하고 사료나 거름을 위한 퇴비로 활용되거나 특정폐기물로서 별도의 비용을 들여 처분하고 있는 실정이므로 좀더 폭넓은 산업적 이용에 대한 연구가 요구되고 있다.
일본에서는 미강 발효액으로부터 추출한 물질이 첨가되어 피부 보습효과가 우수한 화장품, 입욕제 등을 개발하여 시판하고 있다(참조: Nakayama, Y. and Horii,I., Skin moisturization and NMF, pp8-12, 1988). 그러나 미강 유래 당단백 분획물이 면역 기능 증진 활성이 있는지에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다.
본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법에 관하여 연구하던 중 본 발명의 미강유래 당단백 분획물이 대식세포의 TNF-α의 생성을 촉진하는 효능이 매우 뛰어난 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 단백질 중량 대비 당 중량비가 5:1 내지 15:1인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
(a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 미강 유래 당단백 분획물 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 단백질 중량 대비 당 중량비가 5:1 내지 15:1인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
(a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 미강 유래 당단백 분획물 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 단백질 중량 대비 당 중량비가 5:1 내지 15:1인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획물을 제공한다.
상기 당단백 분획물은 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 특징을 갖는다.
상기 당단백 분획물을 BCA 방법으로 분석한 결과, 단백질 함량이 65.7%, 당 함량이 7.7%로, 단백질과 당의 중량비가 8.5:1인 것으로 나왔다.(실시예 3-1 및 표 1 참조)
본 발명의 당단백 분획물은 분자량이 각각 18 내지 20kDa, 24 내지 26kDa, 30 내지 33kDa, 34 내지 35kDa 및 50 내지 60kDa인 당단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 당단백 분획물을 Laemmli의 방법에 따라 분자량을 측정한 결과 20, 25, 30, 35, 55 kDa 정도의 분자량을 가진 당단백질이 포함된 것을 확인하였다.(실시예 3-4 참조)
또한 상기 당단백 분획물은 전체 아미노산 대비 아스파르트산은 5 내지 15%(w/w), 트레오닌은 3 내지 7%(w/w), 세린은 3 내지 7%(w/w), 글루탐산은 10 내지 20%(w/w), 프롤린은 3 내지 10%(w/w), 글리신은 3 내지 10%(w/w), 알라닌은 3 내지 10%(w/w), 발린은 3 내지 10%(w/w), 메티오닌은 1 내지 5%(w/w), 이소루신은 3 내지 10%(w/w), 류신은 5 내지 10%(w/w), 트레오닌은 1 내지 5%(w/w), 페닐알라닌은 3 내지 10%(w/w), 리신은 5 내지 10%(w/w), 히스티딘은 1 내지 5%(w/w), 아르기닌은 5 내지 15%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 당단백 분획물을 아미노산 조성을 조사한 결과, 아스파르트산은 9.3%, 트레오닌은 4.28%, 세린은 4.73%, 글루탐산은 14.96%, 프롤린은 5.56%, 글리신은 5.99%, 알라닌은 6.79%, 발린은 6.48%, 메티오닌은 2.00%, 이소루신은 4.38%, 류신은 7.92%, 트레오닌은 2.92%, 페닐알라닌은 5.10%, 리신은 6.50%, 히스티딘은 3.24%, 아르기닌은 9.85%의 중량비로 나왔다.(실시예 3-2 및 표 2 참조)
본 발명의 당단백 분획물은 전체 당 대비 퓨코오스는 0.5 내지 5%(w/w), 아라비노스는 20 내지 40%(w/w), 갈락토오스는 10 내지 20%(w/w), 글루코오스는 20 내지 35%(w/w), 만노오스는 4 내지 10%(w/w), 자일로스는 10 내지 20%(w/w), N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 0.5 내지 5%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 당단백 분획물의 당 구성을 조사한 결과, 프럭토오즈는 1.8%, 아라비노스는 29.4%, 갈락토오스는 16.0%, 글로코오스는 31.3%, 만노오스는 6.4%, 자일로스는 14.0%, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 1.1%의 중량비로 나왔다. (실시예 3-3 및 표 3 참조)
또한 본 발명의 당단백 분획물은 면역 기능 증진 효능이 뛰어나다.
면역기능이란 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 다음 죽임으로써 질병으로부터 생명체를 보호하는 기능을 말한다.
면역기능은 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune) 기능이 있으며, 내재면역은 미생물들과 독소들이 체내로 진입하는 데 성공하였을 때 곧바로 작용하는 면역 기능으로 패턴 인식 수용체가 미생물들 사이에 널리 보존되어 있는 부분을 인지하여 외부의 미생물을 감지하는 방식으로 작용하거나, 손상된 세포들이 방출하는 경고성 신호를 같은 종류의 수용체가 이를 인지하여 미생물의 존재 사실을 감지하는 방식으로 작용한다.
적응면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적이며 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.
본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 NO, TNF-α의 생성을 촉진시켜 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune)을 모두 증진시키는 효능이 있다.
또한 본 발명의 당단백 분획물은 세포독성이 없어 식품 또는 의약품에 활용이 용이하다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 일실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 당단백 분획물을 대식세포에 처리하여 세포 생존율을 측정하는 방법으로 세포독성이 있는지 시험하였다. 그 결과 본 발명의 당단백 분획물은 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 당단백 분획물을 대식세포에 처리하여 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 본 발명의 당단백 분획물을 처리하는 경우 대식세포의 산화질소(NO) 생성량이 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 당단백 분획물을 대식세포에 처리하여 면역관련 cytokine의 생성에 미치는 영향을 실험하였다. 그 결과 본 발명의 당단백 분획물을 처리하는 경우 TNF-α 등의 Cytokine의 생성량이 매우 증가하는 것을 확인하였다.
이로서 본 발명의 당단백 분획물의 면역 기능 증진 활성이 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명의 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 미강유래 당단백 분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 미강유래 당단백 분획물과 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 미강유래 당단백 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 미강유래 당단백 분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.
또한, 본 발명의 미강유래 당단백 분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 본 발명의 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 당단백 분획물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 면역기능 증진용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 당단백 분획물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당단백 분획물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 당단백 분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 당단백 분획물을 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명은 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 미강유래 당단백 분획물의 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명의 당단백 분획물을 제조하는 방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.
(a) 미강을 탈지하는 단계;
(a) 단계에서는 본 발명의 분획물을 제조하기 위한 원료인 미강을 탈지(脫脂)한다.
미강은 현미를 백미로 정미하는 과정에서 발생하는 부산물로서 쌀겨와 쌀눈으로 이루어진 분말을 말한다. 미강은 풍부한 양의 지질, 비타민 B군, 양질의 단백질을 함유하고 있으며 섬유질 및 인 등도 풍부하게 함유하고 있다.
탈지는 지방을 제거하는 것을 말하며, 미강은 탈지를 통하여 산패를 막고, 가공성을 높일 수 있다.
탈지하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 초임계 추출 또는 n-hexane을 이용하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 n-hexane에 침지하는 방법일 수 있다.
(b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계;
(b) 단계에서는 상기 탈지된 미강을 완충용액에 혼합한다.
상기 완충용액은 일반적인 완충용액이면 어떠한 것도 가능하며, 바람직하게는 Tris-HCl 용액 일 수 있다. 완충용액의 pH는 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0일 수 있다.
혼합용액은 미강의 유효성분이 추출될 수 있도록 교반할 수 있으며, 교반 시간 및 온도는 특별히 제한이 없으나, 바람직하게는 10시간 내지 24시간동안 교반할 수 있으며, 교반시 혼합용액의 온도는 4℃ 내지 24℃ 일 수 있다.
(c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
(c) 단계에서는 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득한다.
본 단계의 원심분리는 상등액과 침전물을 분리할 수 있는 정도이면 회전수 및 온도에 제한이 없다.
또한 원심 분리 후 여과지로 상등액을 여과하는 과정을 추가할 수 있다.
(d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계;
(d) 단계에서는 상기 수득한 상등액을 투석 반투막으로 투석한다.
투석에 사용되는 용액은 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 Tris-HCl 완충용액 일 수 있으며, 용액의 pH는 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0일 수 있다.
투석 시 온도는 상기 (b)단계의 혼합용액과 동일한 온도에서 투석할 수 있으며, 투석 시간은 상기 (c) 단계의 상등액의 부피에 따라 다를 수 있으며, 바람직하게는 24시간 내지 48시간 일 수 있다.
(e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계;
(e) 단계에서는 투석이 완료된 상등액으로부터 단백질을 분리한다.
단백질 침전에 사용되는 황산 암모늄의 농도는 분리하고자 하는 단백질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 방법에서는 황산 암모늄을 70%(w/v) 내지 80%(w/v)가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 황산 암모늄의 첨가에 따라 당단백질이 침전되며, 반응 시간은 4시간 내지 10시간 일 수 있다. 침전된 당단백질의 분리는 통상의 침전물 분리 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리에 의하여 분리 할 수 있다.
(f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계;
(f) 단계에서는 상기 회수된 침전물을 완충용액에 용해한 후 투석하여 염을 제거한다. 투석에 사용되는 용액은 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 Tris-HCl 완충용액 일 수 있으며, 용액의 pH는 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0일 수 있다.
투석 시 온도는 회수된 유효성분이 비가역적인 변형을 일으키지 않는 한 특별히 제한되지 아니하며, 투석 시간은 상기 (c) 단계의 상등액의 부피에 따라 다를 수 있으며, 바람직하게는 24시간 내지 72시간 일 수 있다.
(g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계;
(g) 단계에서는 상기 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득한다. 당단백 분획물 수득 과정은 일반적인 단백질 분획 과정일 수 있으며, 바람직하게는 동결건조 방법에 의할 수 있다.
따라서 본 발명은 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 단백질 중량 대비 당 중량비가 5:1 내지 15:1인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적, 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 NO와 TNF-α의 생성을 촉진하는 효능이 매우 뛰어나며 세포독성이 전혀 없어 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.
도 1은 가시오가피, 달맞이, 들깨박 등 총 10종의 다양한 식물체(의 건조 분말)의 추출물의 macrophage NO 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과이다. (con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, Nitric Oxide(μM): 생성된 일산화질소의 농도)
도 2는 본 발명의 방법에 의해 제조된 미강 유래 당단백 분획물에 포함되는 당단백질의 분자량을 측정한 결과이다(Marker: 사이즈 마커, Rice bran: 본 발명 당단백 분획물의 전기영동 결과).
도 3은 본 발명 미강 유래 당단백 분획물의 세포독성을 실험한 결과 그래프이다(con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 12: 미강 유래 당단백 분획물을 12ug/ml로 처리한 군, 15: 미강 유래 당단백 분획물을 15ug/ml로 처리한 군, 50: 미강 유래 당단백 분획물을 50ug/ml로 처리한 군, Cell viability(%): 세포 생존율(%)).
도 4는 미강 유래 당단백 분획물의 대식세포의 NO생성에 미치는 영향을 측정한 실험 결과 그래프이다(con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 12: 미강 유래 당단백 분획물을 12ug/ml로 처리한 군, 15: 미강 유래 당단백 분획물을 15ug/ml로 처리한 군, 50: 미강 유래 당단백 분획물을 50ug/ml로 처리한 군, Nitro oxide(uM): 산화질소 농도(uM)).
도 5는 미강 유래 당단백 분획물의 대식세포의 TNF-α에 미치는 영향을 측정한 실험 결과 그래프이다(con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 12: 미강 유래 당단백 분획물을 12ug/ml로 처리한 군, 15: 미강 유래 당단백 분획물을 15ug/ml로 처리한 군, 50: 미강 유래 당단백 분획물을 50ug/ml로 처리한 군, TNF-alpha(pg/ml): TNF-alpha농도(pg/ml)).
도 6은 미강 유래 당단백 분획물의 대식세포의 IL-6에 미치는 영향을 측정한 실험 결과 그래프이다. (blank: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 12: 미강 유래 당단백 분획물을 12ug/ml로 처리한 군, 15: 미강 유래 당단백 분획물을 15ug/ml로 처리한 군, 50: 미강 유래 당단백 분획물을 50ug/ml로 처리한 군, IL-6(pg/ml): IL-6농도(pg/ml)).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
면역 증진 활성이 있는 식물 소재 선별
가시오가피, 산사, 산약, 어성초 등의 생약재는 경동시장에서 구입하였고, 부산물 중 들깨박, 참깨박은 국산 들깨와 참깨를 시중에서 구입해서 볶고 기름을 짜고 남은 박이며, 미강은 경기도 안성지역에서 수집하였다. 상기 확보된 다양한 식물체 시료를 n-Hexane으로 3시간 처리하여 탈지한 후 건조, 분쇄하여 실험에 사용하였으며, 탈지시료 100 g을 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 2000 mL에 용해하고, 4℃에서 16시간 교반 후 원심분리하였다. 상등액을 여과지 (Whatman, No. 4)를 이용하여 불순물을 제거하고, 여과 용액은 투석 반투막 (MWCO 6000～8000)을 이용하여 4℃의 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액에서 48시간 투석한 후 동결건조하여 -18℃ 이하에 보관하면서 실험에 사용하였다.
RAW 264.7 macrophage 세포를 2.0x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간 후 시료를 2.0x105 cells/well의 농도로 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 이때 양성 대조군으로는 LPS 1 ug/mL을 단독 처리하였고, 음성 대조군으로는 아무것도 처리 안한 RAW 264.7 macrophage 세포로 하여 동일 조건에서 배양하였다. Cell culture medium 100 uL와 Griess reagent (sigma-aldrich co.) 100uL 동량을 혼합하여 상온에서 15분 반응 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite로 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 정량하였다.
10종의 식물 추출물의 macrophage NO 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 [도 1]에서 보는 바와 같이, LPS로 활성화된 세포의 경우 NO 함량이 31.64±1.38 uM수준을 나타내었으며, 미강, 민들레, 천궁 등의 추출물의 NO 함량이 높았으며, 특히 미강 추출물의 NO 생성 활성이 높은 것으로 나타났다.
<실시예 2>
미강 유래 당단백 분획물 제조
<2-1> 당단백 분획물 제조
경기도 안성에서 수집한 벼(Orysa sativa L.)에서 분리한 미강을 n-hexane에 3시간 동안 침지하여 탈지처리 한 후, 건조 분쇄 하였다.
탈지한 미강 100g을 20mM Tris-HCl(pH 8.0)용액 2L에 용해하고, 4℃에서 16시간동안 교반한 후 원심분리 하였다. 상등액을 여과지(Whatman, No4.)로 여과하고, 여과 용액을 투석 반투막(MWCO 6000~8000)으로 4℃의 20mM Tris-HCl(pH 7.4)용액으로 48시간 투석하여 미강 유래 당단백 추출물을 제조하였다.
미강 유래 당단백 추출물에서 당단백 분획물을 분리하기 위하여, 상기 당단백 추출물에 황산암모늄(ammonium sulfate)를 80% 농도가 되도록 첨가하여 6시간 정치 후 형성된 침전물을 원심분리하여 회수하였다. 회수한 침전물을 20mM Tris-HCl(pH 7.4)용액으로 용해 후 투석 반투막(MWCO 6000~8000)으로 4℃의 증류수로 48시간 투석한 후 동결건조 하였다.
그 결과 약 4.89g의 당단백 분획물을 수득하였으며, 본 발명의 방법에 의한 미강 유래 당단백 분획물의 수득율은 약 4.9% 임을 확인하였다.
<실시예 3>
미강 유래 당단백분획물의 분자구조적 특성 규명
<3-1> 단백질 함량 및 당함량 측정
제조된 당단백분획물의 단백질 함량은 BCA방법으로 측정하였다. 25uL의 시료에 BCA working reagent(Cat No. 23227, Thermo, 독일) 200ul을 가하여 37℃에서 30분간 반응하여 발색시킨 후 spectrophotometer(Biotek, 미국)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 Bovine serum albumin을 이용하여 작성한 후 단백질 함량을 계산하였다.
제조된 당단백 분획물의 당 함량은 시료를 증류수에 희석한 희석액 200ul와 5% 페놀 용액 200ul, 황산 1ml을 혼합하고, 실온에서 20분간 방치한 후, spectrophotometer(Biotek, USA)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 측정하였다. 표준곡선은 glucose를 이용하여 작성한 후 당함량을 계산하였다.
그 결과 [표 1]에서 보는 바와 같이, 본 발명 당단백 분획물의 단백질 함량은 65.7% 이며, 당함량은 7.7%인 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 당단백 분획물은 단백질과 당의 비율이 8.5:1 인 것을 확인하였다.
미강 유래 당단백 분획물의 구조특성
추출수율(%) 단백질 함량(%) 당 함량(%) 단백질 : 당
1.8 65.7 7.7 8.5:1
<3-2> 아미노산 조성 분석
본 발명의 당단백 분획물을 약 10mg 함유하는 시료를 가수분해 시험관에 넣고 6N HCl 약 15mL을 가한 후 봉관하여 110℃에서 24시간 가수분해 하였다. 가수분해 종료 후 봉관을 절단하여 이 여액을 50ml 플라스크에 넣고 증류수로 정용한 다음 여과하였으며, 여과한 여액을 정당히 희석하여 아미노산 자동분석기(Hitachi AAA L-8900, 일본)를 이용하여 아미노산 조성을 분석하였다.
그 결과 본 발명의 미강 유래 당단백 분획물은 [표 2]와 같은 아미노산 구성을 가지고 있으며, glutamic acid가 14.96%로 가장 많이 함유되어 있으며, 그 다음으로 arginine 및 aspartic acid가 각각 9.85%, 9.30%를 차지하는 것으로 나타났다.
미강 유래 당단백 분획물의 구성 아미노산 조성
아미노산 % 아미노산 %
Asp 9.30 Met 2.00
Thr 4.28 Ile 4.38
Ser 4.73 Leu 7.92
Glu 14.96 Thr 2.92
Pro 5.56 Phe 5.10
Gly 5.99 Lys 6.50
Ala 6.79 His 3.24
Val 6.48 Arg 9.85
<3-3> 당 조성 분석
미량원심분리 튜브에 시료를 1mg 넣고 건조시킨 후 4N HCl을 가하고, 100℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 상온에서 식힌 시료는 Speed-vac으로 건조시킨 후, 정제수를 이용하여 2회 수세 건조하였다. 50ul의 정제수로 시료를 녹인 후, CarboPac PA1(Dionex, 미국) 컬럼을 이용하여 이동상 A: 200nm NaOH와 B: DW로 80분에 걸쳐 HPAEC-PAD(Dionex, ICS-3000, 미국)로 분석하였다.
그 결과 본 발명의 미강 유래 당단백 분획물은 [표 3]과 같은 당구성을 가지고 있으며, glucose가 31.3%로 가장 많은 함량을 차지하고 있으며, 5탄당인 arabinose 역시 29.7%로 많이 함유된 것을 확인할 수 있었다.
미강 유래 당단백 분획물의 구성 당 조성
당 % 당 %
Fuc 1.8 Man 6.4
Ara 29.4 Xyl 14.0
Gal 16.0 GlcNAc 1.1
Glc 31.3
<3-4> 전기영동
제조한 당단백 분획물에 포함된 당단백질의 분자량을 측정하기 위하여 Laemmli의 방법에 따라 15% polyacrylamide gel을 제작 후 당단백 분획물을 주입하고 전기영동 완충용액(0.025M Tris-HCl, 0.192M glycine, 0.1% SDS, pH 8.3)으로 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였으며, 이를 Coomassie Blue로 염색한 후 탈색하였다. 분자량 표준물질은 7~240 kDa Marker(Dokdo)를 이용하였다.
그 결과 [도 2]에서 보는 바와 같이 분자량 20, 25, 30, 35, 55 kDa 정도의 분자량을 가진 당단백질이 포함된 것을 확인하였다.
<실시예 4>
미강 유래 당단백 분획물의 면역활성 증진 효능 실험
<4-1> 세포독성 시험
RAW 264.7 대식세포(macrophage)를 2.0X105 cells/well의 농도로 96well plate에 분주하고, 24시간 후 시료를 12, 25, 50, 100ug/ml의 농도로 처리하고, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때 대조군으로 lipopolysaccharide(LPS) 1ug/ml을 단독 처리하여 동일 조건에서 배양하였다.
세포 배양 후 0.5mg/ml농도의 MTT( (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 넣고 4시간 동안 37℃ incubator에서 반응시킨 후 형성된 formazan을 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 [도 3]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 당단백 분획물을 RAW 264.7 cell에 12, 25, 50, 100 ug/mL 농도로 24시간 처리하였을 때 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
<4-2> 대식세포의 NO 생산에 미치는 영향 측정
RAW 264.7 macrophage 세포를 2.0x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간 후 시료를 12, 25, 50 μg/mL의 농도로 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 이때 대조군은 LPS 1 μg/mL을 단독 처리하여 동일 조건에서 배양하였다. Cell culture medium 100 μL와 Griess reagent (sigma-aldrich co.) 100 μL 동량을 혼합하여 상온에서 15분 반응 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite로 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 정량하였다.
미강 당단백 분획물의 macrophage NO 생성에 미치는 영향을 농도별로 처리하여 조사하였으며, 면역활성 증진을 위한 의약품으로 사용되고 있는 polysaccharide K (PSK - ‘krestin’이라고도 함)와 비교하였다. [도 4]에서 보는 바와 같이, LPS로 활성화된 세포의 경우 NO 함량이 32.03±0.48 uM수준을 나타내었고 미강 당단백 분획물을 12, 12, 25, 50, 100 ug/mL 처리시에는 각각 3.4±0.5 uM, 7.1±1.2 uM, 15.7±1.6 uM, 27.2±1.7 uM으로 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타나 음성 대조군에 비해 월등히 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다.
<4-3> 대식세포의 Cytokine 분비에 미치는 영향 측정
TNF-α 등의 cytokine은 ELISA kit(Enzo)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 대식세포(macrophage)를 2.0X105 cells/well의 농도로 96well plate에 분주하고, 24시간 후 시료를 12, 25, 50ug/ml의 농도로 처리하고, 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때 양성 대조군으로는 LPS 1 ug/mL을 단독 처리하였고, 음성 대조군으로는 아무것도 처리 안한 RAW 264.7 macrophage 세포로 하여 동일 조건에서 배양하였다. 미강 당단백 분획물이 macrophage의 TNF-α 등의 cytokine의 발현에 미치는 영향을 조사하였으며, 면역 활성 증진을 위한 의약품으로 사용되고 있는 polysaccharide K (PSK -‘krestin’이라고도 함)와 비교하였다. 배양 후 상등액을 취하여 ELISA kit(Enzo)를 이용하여 사이토카인 생성량을 측정하였다.
그 결과 [도 5]에서 보는 바와 같이 TNF-α의 생성을 측정한 결과, LPS를 단독으로 처리 시 23,123 pg/mL로 나타났으며, 미강 당단백 분획물을 12, 25, 50, 100 ug/mL 농도로 처리 시 각각 26,256±14.58, 26,623±42.1, 28,744±14.2, 28,602±12.5 pg/mL으로 나타나 음성대조군은 물론 PSK를 동일 농도로 처리하였을 때보다 월등히 높은 수준으로 나타나 미강 당단백 분획물이 PSK(krestin)보다 TNF-α의 발현에 높은 영향을 주는 것으로 나타났다.
또한 IL-6 발현을 관찰한 결과 [도 6]에서 보는 바와 같이, 미강 당단백 분획물을 12, 25, 50, 100 ug/mL 농도로 처리시 각각 14.8±0.3, 107.8±3.8, 524.3±4.8, 649.5±11.0 pg/mL의 IL-6 농도를 나타냈는데, 이는 음성 대조군에 비해 월등히 높은 수치이다. 반면 PSK 처리군의 경우에는 100 ug/mL로 처리하였을 때 111.5±1.0 pg/mL의 IL-6 함량을 나타내었지만 12～50 ug/mL에서는 전혀 발현되지 않는 것으로 나타났다.
이상 살펴본 바와 같이, 따라서 본 발명은 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 미강을 탈지하는 단계; (b) 미강을 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 침전제를 첨가하고 침전물을 분리하는 단계; (f) 상기 침전물을 완충용액에 용해하여 투석 반투막으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 단백질 중량 대비 당 중량비가 5:1 내지 15:1인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적, 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 NO와 TNF-α의 생성을 촉진하는 효능이 매우 뛰어나며 세포독성이 전혀 없어 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (6)

  1. (a) 미강을 탈지하는 단계;
    (b) 미강을 pH가 7.0 내지 8.0인완충용액에 혼합하는 단계;
    (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
    (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계;
    (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계;
    (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및
    (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 동결건조로 수득하는 단계;
    를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 18 내지 60kDa인 것을 특징으로 하는 미강 유래 당단백 분획물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당단백 분획물은 전체 아미노산 대비 아스파르트산은 5 내지 15%(w/w), 트레오닌은 3 내지 7%(w/w), 세린은 3 내지 7%(w/w), 글루탐산은 10 내지 20%(w/w), 프롤린은 3 내지 10%(w/w), 글리신은 3 내지 10%(w/w), 알라닌은 3 내지 10%(w/w), 발린은 3 내지 10%(w/w), 메티오닌은 1 내지 5%(w/w), 이소루신은 3 내지 10%(w/w), 류신은 5 내지 10%(w/w), 트레오닌은 1 내지 5%(w/w), 페닐알라닌은 3 내지 10%(w/w), 리신은 5 내지 10%(w/w), 히스티딘은 1 내지 5%(w/w), 아르기닌은 5 내지 15%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 당단백 분획물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 당단백 분획물은 전체 당 대비 퓨코오스는 0.5 내지 5%(w/w), 아라비노스는 20 내지 40%(w/w), 갈락토오스는 10 내지 20%(w/w), 글루코오스는 20 내지 35%(w/w), 만노오스는 4 내지 10%(w/w), 자일로스는 10 내지 20%(w/w), N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 0.5 내지 5%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 당단백 분획물.
  4. 제1항의 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물.
  5. 제1항의 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기, 아토피, 만성피로 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. (a) 미강을 탈지하는 단계;
    (b) 미강을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계;
    (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
    (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계;
    (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계;
    (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및
    (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 동결건조로 수득하는 단계;
    를 포함하는 미강유래 당단백 분획물의 제조방법.
KR1020110142783A 2011-12-26 2011-12-26 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법 KR101170998B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110142783A KR101170998B1 (ko) 2011-12-26 2011-12-26 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110142783A KR101170998B1 (ko) 2011-12-26 2011-12-26 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101170998B1 true KR101170998B1 (ko) 2012-08-08

Family

ID=46886964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110142783A KR101170998B1 (ko) 2011-12-26 2011-12-26 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101170998B1 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101450773B1 (ko) 2012-11-22 2014-10-17 한국식품연구원 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법
KR101467350B1 (ko) * 2012-11-22 2014-12-03 한국식품연구원 밀기울 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법
KR101826214B1 (ko) * 2016-05-18 2018-02-06 한국식품연구원 미강 유래 당단백질 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제 및 알러지성 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101876449B1 (ko) * 2016-09-01 2018-07-13 전석 쌀눈을 포함하는 미강분을 이용한 친수성 호화분말의 가공방법 및 그 방법에 의한 호화분말
KR20230065694A (ko) 2021-11-05 2023-05-12 한국식품연구원 인산염 대체용 당단백중합체 및 이를 이용한 유화형 소시지
KR20230075825A (ko) 2021-11-23 2023-05-31 한국식품연구원 인산염 대체용 근원섬유 단백질 및 이를 이용한 유화형 소시지

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100912054B1 (ko) 2007-09-12 2009-08-12 씨제이제일제당 (주) 미강 단백질 추출물의 제조 방법
KR101090926B1 (ko) 2009-07-08 2011-12-08 주식회사 비케이바이오 단백질을 포함하는 미유의 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100912054B1 (ko) 2007-09-12 2009-08-12 씨제이제일제당 (주) 미강 단백질 추출물의 제조 방법
KR101090926B1 (ko) 2009-07-08 2011-12-08 주식회사 비케이바이오 단백질을 포함하는 미유의 제조방법

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101450773B1 (ko) 2012-11-22 2014-10-17 한국식품연구원 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법
KR101467350B1 (ko) * 2012-11-22 2014-12-03 한국식품연구원 밀기울 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법
KR101826214B1 (ko) * 2016-05-18 2018-02-06 한국식품연구원 미강 유래 당단백질 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제 및 알러지성 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101876449B1 (ko) * 2016-09-01 2018-07-13 전석 쌀눈을 포함하는 미강분을 이용한 친수성 호화분말의 가공방법 및 그 방법에 의한 호화분말
KR20230065694A (ko) 2021-11-05 2023-05-12 한국식품연구원 인산염 대체용 당단백중합체 및 이를 이용한 유화형 소시지
KR20230075825A (ko) 2021-11-23 2023-05-31 한국식품연구원 인산염 대체용 근원섬유 단백질 및 이를 이용한 유화형 소시지

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6818018B2 (ja) 筋肉疾患の予防、改善または治療用または筋機能改善用組成物
KR101170998B1 (ko) 미강 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법
KR100971599B1 (ko) 혈관 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물
KR101999916B1 (ko) 긴불레기말 추출물을 포함하는 근력 강화 또는 근감소증 예방 및 치료용 조성물
JP4826696B2 (ja) 血管新生阻害剤
US10105439B2 (en) Polysaccharide fraction originating in persimmon leaf with immunostimulating activation and antitumor activation and method for manufacturing same
KR101449804B1 (ko) 홍어 껍질 유래 젤라틴 추출물 및 상기 추출물로부터 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항고혈압 조성물
KR20170134843A (ko) 범용성 바이러스 포획 단백질 및 이의 제조방법
JP7144441B2 (ja) 抗酸化及び抗高血圧効果を有するヒラメ練肉及びその製造方法
KR101704123B1 (ko) 활성아민 함유 봉독의 분리 방법 및 그의 식품 조성물
KR20170124426A (ko) 아마란스 또는 곡류의 추출물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물
JP4681801B2 (ja) 血管新生阻害剤およびその製造方法
KR20210056771A (ko) 새싹귀리 추출물을 포함하는 면역증강 조성물
KR20150058698A (ko) 정제 봉독을 유효성분으로 함유하는 항산화조성물
KR102339984B1 (ko) 세넨데스무스 인터메디우스 가공 추출물을 유효성분으로 하는 항균 및 항산화 조성물
KR101467350B1 (ko) 밀기울 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법
KR101905009B1 (ko) 면역기능 증진 활성이 있는 케일박 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법
KR101450773B1 (ko) 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법
KR101830395B1 (ko) 스쿠알렌을 함유하는 근기능 향상 및 근육 손상 예방용 조성물
KR101826214B1 (ko) 미강 유래 당단백질 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제 및 알러지성 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101895158B1 (ko) 두충과 누에의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물
KR102362988B1 (ko) 유청단백 가수분해물 및 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 근기능 개선 또는 근육질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
KR20150113709A (ko) 삼채 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물
KR101894657B1 (ko) 맥문동과 누에의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물
KR101987821B1 (ko) 육계와 누에의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150722

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160718

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170908

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180823

Year of fee payment: 7