KR101450773B1 - 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 활성을 면역활성 증진용 의약품인 크레스틴(PSK) 보다도 촉진하는 효능이 매우 뛰어나며 세포독성이 전혀 없어, 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

Description

막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조 방법{Glycoprotein fraction isolated from rice wine lees and method for producing the same}
본 발명은 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 약학적, 식품 조성물에 관한 것이다.
당단백질은 탄수화물이 단백질의 특정 아미노산에 복합체로 이루어진 생체분자로서 동식물의 세포조직에 널리 분포하고 있으며, 주로 세포외벽에 많이 존재하면서 수많은 세포표면의 반응에 관여한다. 또한 당단백질은 단백질 및 핵산과 달리 순수한 선형 및 가지형 구조와 같은 거대한 삼차원적 구조를 지니고 있어 구조적으로 다양할 뿐만 아니라 생물학적으로 잠재적인 기능들을 많이 갖고 있다.
면역이란 인체 내에서 외부로부터 침입하는 미생물 동종의 조직 등의 다른 물질, 특이 세포가 발생하면 면역계가 관여하여 이들을 항원으로 인식하여 특이하게 반응하여 항체를 생산하는 능력을 나타냄으로서 개체의 항상성을 유지하려는 현상을 말하며, 면역 반응에 관여하는 세포는 임파구, macrophage, NK cell, 수지상세포 등이 있다. 최근 생체의 면역세포로부터 cytokine 방출을 촉진시켜 암세포를 괴사시키는 면역요법이 주목받고 있다. 면역요법은 면역반응의 증강 및 억제 유도를 통해 생체의 방어능력을 조절함으로써 암세포를 사멸하기 때문에 기존의 약물에 의한 항암치료법보다 더 큰 효과를 기대할 수 있다. 따라서 안전성이 보고된 천연물로부터 면역활성 증진 효능을 갖는 천연물을 탐색하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있다.
막걸리는 우리나라 고유의 전통주로서 우리민족의 식생활에 지대한 영향을 미쳐왔다. 막걸리에는 Aspergillus, Rhizopus, Mucor속의 곰팡이와 Saccharomyces, Pichia, Candida, Torylopsis, Hansenula 속의 효모 및 Bacillus, Micorcoccus, Aerobacter, Pseudomonas sp.의 세균이 생육하고 있으며 이들의 상호작용에 따라 다양한 맛과 향이 형성된다.
막걸리박은 탁주(막걸리)를 빚은 후 술을 걸러내는 과정에서 나오는 부산물로, 술지게미, 주박 등으로도 불린다. 누룩 및 고두밥에 효모를 넣으면 효모가 번식하면서 생성한 효소에 의하여 녹말과 단백질이 분해됨과 동시에 효모에 의하여 알코올 발효가 일어난다. 알코올 발효가 끝난 후 술과 찌꺼기를 분리하는데, 이때 분리된 술이 막걸리이고, 찌꺼기가 막걸리박이다. 막걸리박은 원료인 쌀 중량의 약 20% 정도가 수득되는데도 불구하고 일부가 돼지 사료로 이용될 뿐 대부분의 막걸리박은 폐기되는 것이 현실이다.
본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법에 관하여 연구하던 중 본 발명의 막걸리박유래 당단백 분획물이 대식세포의 활성을 촉진하는 효능이 매우 뛰어난 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110 kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기, 아토피, 만성피로 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
(a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 막걸리박 유래 당단백 분획물 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110 kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기, 아토피, 만성피로 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
(a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 막걸리박 유래 당단백 분획물 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110 kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물을 제공한다.
상기 당단백 분획물을 Laemmli의 방법에 따라 분석한 결과, 분자량이 15 내지 110kDa 으로 확인되었다(실시예 3-4 및 도 2 참조). 또한, 당단백 분획물의 단백질과 당의 중량비 비율이 2:1 내지 3:1 인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 당단백 분획물은 전체 아미노산 대비 아스파르트산은 5 내지 15%(w/w), 트레오닌은 3 내지 7%(w/w), 세린은 3 내지 10%(w/w), 글루탐산은 10 내지 30%(w/w), 프롤린은 3 내지 10%(w/w), 글리신은 3 내지 10%(w/w), 알라닌은 3 내지 10%(w/w), 발린은 3 내지 10%(w/w), 메티오닌은 1 내지 5%(w/w), 이소루신은 3 내지 10%(w/w), 루신은 3 내지 10%(w/w), 티로신은 1 내지 5%(w/w), 페닐알라닌은 1 내지 5%(w/w), 리신은 1 내지 5%(w/w), 히스티딘은 1 내지 5%(w/w), 아르기닌은 3 내지 10%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 당단백 분획물을 아미노산 조성을 조사한 결과, 아스파르트산은 12.87%, 트레오닌은 5.77%, 세린은 6.02%, 글루탐산은 20.36%, 프롤린은 8.04%, 글리신은 7.98%, 알라닌은 5.83%, 발린은 5.59%, 메티오닌은 1.24%, 이소루신은 4.04%, 류신은 5.79%, 티로신은 2.51%, 페닐알라닌은 3.60%, 리신은 2.89%, 히스티딘은 2.13%, 아르기닌은 5.43%의 중량비로 나왔다.(실시예 3-2 및 표 2 참조)
본 발명의 당단백 분획물은 전체 당 대비 퓨코오스는 0.1 내지 0.5%(w/w), 람노오스는 0.1 내지 0.5%(w/w), 아라비노스는 20 내지 40%(w/w), 갈락토오스는 0.5 내지 5%(w/w), 글루코오스는 3 내지 10%(w/w), 만노오스는 3 내지 10%(w/w), 자일로스는 40 내지 60%(w/w), N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 0.5 내지 5%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 당단백 분획물의 당 구성을 조사한 결과, 퓨코오스는 0.15%, 람노오스는 0.28%, 아라비노스는 33.70%, 갈락토오스는 1.64%, 글루코오스는 6.42%, 만노오스는 3.22%, 자일로스는 52.45%, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 2.16%의 중량비로 나왔다. (실시예 3-3 및 표 3 참조)
또한 본 발명의 당단백 분획물은 면역 기능 증진 활성이 있는 것을 특징으로 한다.
면역기능이란 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 다음 죽임으로써 질병으로부터 생명체를 보호하는 기능을 말한다.
면역기능은 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune) 기능이 있으며, 내재면역은 미생물들과 독소들이 체내로 진입하는 데 성공하였을 때 곧바로 작용하는 면역 기능으로 패턴 인식 수용체가 미생물들 사이에 널리 보존되어 있는 부분을 인지하여 외부의 미생물을 감지하는 방식으로 작용하거나, 손상된 세포들이 방출하는 경고성 신호를 같은 종류의 수용체가 이를 인지하여 미생물의 존재 사실을 감지하는 방식으로 작용한다.
적응면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적이며 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.
본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 NO, TNF-, IL-6의 생성을 촉진시켜 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune)을 모두 증진시키는 효능이 있다(실시예 4-2 및 4-3 참조).
또한 본 발명의 당단백 분획물은 세포독성이 없어 식품 또는 의약품에 활용이 용이하다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 일실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 당단백 분획물을 대식세포에 처리하여 세포 생존율을 측정하는 방법으로 세포독성이 있는지 시험하였다. 그 결과 본 발명의 당단백 분획물은 세포독성이 없는 것을 확인하였다(실시예 4-1 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 당단백 분획물을 대식세포에 처리하여 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 본 발명의 당단백 분획물을 처리하는 경우 대식세포의 산화질소(NO) 생성량이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 NO 생성량은 면역활성 증진 의약품인 PSK(Krestin) 보다도 훨씬 높은 수치를 보였다(실시예 4-2 및 도 4 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 당단백 분획물을 대식세포에 처리하여 면역관련 cytokine의 생성에 미치는 영향을 실험하였다. 그 결과 본 발명의 당단백 분획물을 처리하는 경우 TNF-,IL-6 등의 Cytokine의 생성량이 매우 증가하는 것을 확인하였다. 상기 싸이토킨 생성량 또한 PSK 보다 월등히 높았다(실시예 4-3 및 도 5, 도 6 참조).
IL-6는 B세포 자극인자2(BSF2) 또는 인터페론 2라고도 호칭된 사이토카인이다. IL-6는 B 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature, 324, 73-76, 1986), 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993). 또한 IL-6는 T 림프구계 세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어 있으며 (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. 167, 1253-1258, 1988), T cell이나 thymocytes에 co-stimulator로 작용을 하여 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다(Kuby J. In 'Immunology' 2nd ed. 1994, Chap. 15. W.H. Freemn company. USA.).
또한, TNF-α는 특정 암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Kuby J. In 'Immunology' 2nd ed. 1994, Chap. 15. W.H. Freemn company. USA.).
이로서 본 발명의 당단백 분획물의 면역 기능 증진 활성이 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명의 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 막걸리박 유래 당단백 분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 막걸리박유래 당단백 분획물과 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 막걸리박유래 당단백 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 막걸리박 유래 당단백 분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.
또한, 본 발명의 막걸리박유래 당단백 분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 본 발명의 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기, 아토피, 만성피로 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 당단백 분획물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 면역기능 증진용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 당단백 분획물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당단백 분획물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 당단백 분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 당단백 분획물을 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명은 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 막걸리박유래 당단백 분획물의 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명의 당단백 분획물을 제조하는 방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.
(a) 막걸리박을 탈지하는 단계;
(a) 단계에서는 본 발명의 분획물을 제조하기 위한 원료인 막걸리박을 탈지(脫脂)한다.
탈지는 지방을 제거하는 것을 말하며, 막걸리박은 탈지를 통하여 산패를 막고, 가공성을 높일 수 있다.
탈지하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 초임계 추출 또는 n-hexane을 이용하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 n-hexane에 침지하는 방법일 수 있다.
(b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계;
(b) 단계에서는 상기 탈지된 막걸리박을 완충용액에 혼합한다.
상기 완충용액은 일반적인 완충용액이면 어떠한 것도 가능하며, 바람직하게는 Tris-HCl 용액 일 수 있다. 완충용액의 pH는 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0일 수 있다.
혼합용액은 막걸리박의 유효성분이 추출될 수 있도록 교반할 수 있으며, 교반 시간 및 온도는 특별히 제한이 없으나, 바람직하게는 10시간 내지 24시간동안 교반할 수 있으며, 교반시 혼합용액의 온도는 4 내지 24 일 수 있다.
(c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
(c) 단계에서는 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득한다.
본 단계의 원심분리는 상등액과 침전물을 분리할 수 있는 정도이면 회전수 및 온도에 제한이 없다.
또한 원심 분리 후 여과지로 상등액을 여과하는 과정을 추가할 수 있다.
(d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계;
(d) 단계에서는 상기 수득한 상등액을 투석 반투막으로 투석한다.
투석에 사용되는 용액은 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 Tris-HCl 완충용액 일 수 있으며, 용액의 pH는 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0일 수 있다. 투석 시, 분자량 cuf-off는 6000 내지 8000이 바람직하다.
투석 시 온도는 상기 (b)단계의 혼합용액과 동일한 온도에서 투석할 수 있으며, 투석 시간은 상기 (c) 단계의 상등액의 부피에 따라 다를 수 있으며, 바람직하게는 24시간 내지 48시간 일 수 있다.
(e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계;
(e) 단계에서는 투석이 완료된 상등액으로부터 단백질을 분리한다.
당단백질을 침전시키기 위하여, 단백질을 침전시키는 염을 사용하는데, 상기 침전 염은 단백질 함유 수용액의 이온강도(ionic strength)를 증가시켜 단백질 침전(salting-out)시킬 수 있는 염은 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 양이온이 NH4 +, K+ 및 Na+로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이고, 음이온이 씨트레이트(citrate), PO4 3 -, SO4 2 -, CH3COO-, Cl-, OH- 및 NO3 -로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 상기 양이온과 음이온이 결합된 화합물이고, 더욱 바람직하게는 NH4OH, (NH4)2SO4, KNO3, NaNO3, NaSO4 등이고, 가장 바람직하게는 황산 암모늄 일 수 있다. 단백질 침전에 사용되는 염의 농도는 분리하고자 하는 단백질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 70%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도일 수 있다. 황산 암모늄의 첨가에 따라 당단백질이 침전되며, 반응 시간은 4시간 내지 10시간 일 수 있다. 침전된 당단백질의 분리는 통상의 침전물 분리 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리에 의하여 분리 할 수 있다.
(f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계;
(f) 단계에서는 상기 회수된 침전물을 완충용액에 용해한 후 투석하여 염을 제거한다. 투석에 사용되는 용액은 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 Tris-HCl 완충용액 일 수 있으며, 용액의 pH는 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0일 수 있다.
투석 시 온도는 회수된 유효성분이 비가역적인 변형을 일으키지 않는 한 특별히 제한되지 아니하며, 투석 시간은 상기 (c) 단계의 상등액의 부피에 따라 다를 수 있으며, 바람직하게는 24시간 내지 72시간 일 수 있다.
(g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계;
(g) 단계에서는 상기 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득한다. 당단백 분획물 수득 과정은 해당기술분야에서 통상적으로 쓰이는 건조 방법일 수 있고, 바람직하게는 분무건조, 열풍건조 또는 동결건조 방법일 수 있으며, 가장 바람직하게는 동결건조 방법에 의할 수 있다.
본 발명은 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110 kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물, 이의 제조 방법 및 이 용도에 관한 것이다.
본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 활성을 촉진하는 효능이 면역 증진용 의약품인 크레스틴(PSK)보다도 매우 뛰어나며 세포독성이 전혀 없어 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.
도 1은 가시오가피, 달맞이, 들깨박 등 총 10종의 다양한 식물체(의 건조 분말)의 추출물의 macrophage NO 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과이다. (con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, Nitric Oxide(M): 생성된 일산화질소의 농도)
도 2는 본 발명의 방법에 의해 제조된 막걸리박 유래 당단백 분획물에 포함되는 당단백질의 분자량을 측정한 결과이다(Marker: 사이즈 마커, Makgeolli Lees: 본 발명 당단백 분획물의 전기영동 결과).
도 3은 본 발명 막걸리박 유래 당단백 분획물의 세포독성을 실험한 결과 그래프이다(con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 25, 50, 100 : 막걸리박 유래 당단백 분획물 처리 농도(ug/mL), Cell viability(%): 세포 생존율(%)).
도 4는 막걸리박 유래 당단백 분획물의 대식세포의 NO생성에 미치는 영향을 측정한 실험 결과 그래프이다(con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 25, 50, 100 : 막걸리박 유래 당단백 분획물 또는 PSK 처리 농도(ug/mL), Nitro oxide(uM): 산화질소 농도(uM)).
도 5는 막걸리박 유래 당단백 분획물의 대식세포의 TNF-에 미치는 영향을 측정한 실험 결과 그래프이다(con: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 25, 50, 100 : 막걸리박 유래 당단백 분획물 또는 PSK 처리 농도(ug/mL), TNF-alpha(pg/ml): TNF-alpha농도(pg/ml)).
도 6은 막걸리박 유래 당단백 분획물의 대식세포의 IL-6에 미치는 영향을 측정한 실험 결과 그래프이다. (blank: 음성대조군, LPS: 리포폴리사카라이드, 25, 50, 100 : 막걸리박 유래 당단백 분획물 또는 PSK 처리 농도(ug/mL), IL-6(pg/ml): IL-6농도(pg/ml)).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
면역 증진 활성이 있는 식물 소재 선별
가시오가피, 산사, 산약, 어성초 등의 생약재는 경동시장에서 구입하였고, 부산물 중 들깨박, 참깨박은 국산 들깨와 참깨를 시중에서 구입해서 볶고 기름을 짜고 남은 박이며, 막걸리박은 국내산 쌀로 막걸리 제조한 후, 남은 박이다. 상기 확보된 다양한 식물체 시료를 n-Hexane으로 3시간 처리하여 탈지한 후 건조, 분쇄하여 실험에 사용하였으며, 탈지시료 100 g을 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 2000 mL에 용해하고, 4℃에서 16시간 교반 후 원심분리하였다. 상등액을 여과지 (Whatman, No. 4)를 이용하여 불순물을 제거하고, 여과 용액은 투석 반투막 (MWCO 60008000)을 이용하여 4℃의 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액에서 48시간 투석한 후 동결건조하여 -18℃ 이하에 보관하면서 실험에 사용하였다.
RAW 264.7 macrophage 세포를 2.0x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간 후 시료를 2.0x105 cells/well의 농도로 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 이때 양성 대조군으로는 LPS 1 ug/mL을 단독 처리하였고, 음성 대조군으로는 아무것도 처리 안한 RAW 264.7 macrophage 세포로 하여 동일 조건에서 배양하였다. Cell culture medium 100 uL와 Griess reagent (sigma-aldrich co.) 100uL 동량을 혼합하여 상온에서 15분 반응 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite로 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 정량하였다.
10종의 식물 추출물의 macrophage NO 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 [도 1]에서 보는 바와 같이, LPS로 활성화된 세포의 경우 NO 함량이 31.64±1.38 uM수준을 나타내었으며, 특히 막걸리박 추출물의 NO 생성 활성이 높은 것으로 나타났다.
<실시예 2>
막걸리박 유래 당단백 분획물 제조
전남 광주에서 수집한 벼(Orysa sativa L.)에서 분리한 막걸리박을 n-hexane에 3시간 동안 침지하여 탈지처리 한 후, 건조 분쇄 하였다.
탈지한 막걸리박 100g을 20mM Tris-HCl(pH 8.0)용액 2L에 용해하고, 4℃에서 16시간 동안 교반한 후 원심분리 하였다. 상등액을 여과지(Whatman, No4.)로 여과하고, 여과 용액을 투석 반투막(MWCO 6000~8000)으로 4℃의 20mM Tris-HCl(pH 7.4)용액으로 48시간 투석하여 막걸리박 유래 당단백 추출물을 제조하였다.
막걸리박 유래 당단백 추출물에서 당단백 분획물을 분리하기 위하여, 상기 당단백 추출물에 황산암모늄(ammonium sulfate)를 80% 농도가 되도록 첨가하여 6시간 정치 후 형성된 침전물을 원심분리하여 회수하였다. 회수한 침전물을 20mM Tris-HCl(pH 7.4)용액으로 용해 후 투석 반투막(MWCO 6000~8000)으로 4℃의 증류수로 48시간 투석한 후 동결건조 하였다.
그 결과 약 5.7g의 당단백 분획물을 수득하였으며, 본 발명의 방법에 의한 막걸리박 유래 당단백 분획물의 수득율은 약 5.7% 임을 확인하였다.
<실시예 3>
막걸리박 유래 당단백 분획물의 분자구조적 특성 규명
<3-1> 단백질 함량 및 당함량 측정
제조된 당단백 분획물의 단백질 함량은 BCA방법으로 측정하였다. 25uL의 시료에 BCA working reagent(Cat No. 23227, Thermo, 독일) 200ul을 가하여 37℃에서 30분간 반응하여 발색시킨 후 spectrophotometer(Biotek, 미국)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 Bovine serum albumin을 이용하여 작성한 후 단백질 함량을 계산하였다.
제조된 당단백 분획물의 당 함량은 시료를 증류수에 희석한 희석액 200ul와 5% 페놀 용액 200ul, 황산 1ml을 혼합하고, 실온에서 20분간 방치한 후, spectrophotometer(Biotek, USA)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 측정하였다. 표준곡선은 glucose를 이용하여 작성한 후 당함량을 계산하였다.
그 결과 [표 1]에서 보는 바와 같이, 본 발명 당단백 분획물의 단백질 함량은 15.97% 이며, 당함량은 6.6%인 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 당단백 분획물은 단백질과 당의 비율이 2.4:1 인 것을 확인하였다.
막걸리박 유래 당단백 분획물의 구조특성
추출수율(%) 단백질 함량(%) 당 함량(%) 단백질 : 당
4.0 15.97 6.6 2.4 : 1
<3-2> 아미노산 조성 분석
본 발명의 당단백 분획물을 약 10mg 함유하는 시료를 가수분해 시험관에 넣고 6N HCl 약 15mL을 가한 후 봉관하여 110℃에서 24시간 가수분해 하였다. 가수분해 종료 후 봉관을 절단하여 이 여액을 50ml 플라스크에 넣고 증류수로 정용한 다음 여과하였으며, 여과한 여액을 정당히 희석하여 아미노산 자동분석기(Hitachi AAA L-8900, 일본)를 이용하여 아미노산 조성을 분석하였다.
그 결과 본 발명의 막걸리박 유래 당단백 분획물은 [표 2]와 같은 아미노산 구성을 가지고 있으며, glutamic acid가 20.36%로 가장 많이 함유되어 있으며, 그 다음으로 aspartic acid 및 proline이 각각 12.78%, 8.04%를 차지하는 것으로 나타났다.
막걸리박 유래 당단백 분획물의 구성 아미노산 조성
아미노산 % 아미노산 %
Asp 12.78 Met 1.24
Thr 5.77 Ile 4.04
Ser 6.02 Leu 5.79
Glu 20.36 Tyr 2.51
Pro 8.04 Phe 3.60
Gly 7.98 Lys 2.89
Ala 5.83 His 2.13
Val 5.59 Arg 5.43
<3-3> 당 조성 분석
미량원심분리 튜브에 시료를 1mg 넣고 건조시킨 후 4N HCl을 가하고, 100℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 상온에서 식힌 시료는 Speed-vac으로 건조시킨 후, 정제수를 이용하여 2회 수세 건조하였다. 50ul의 정제수로 시료를 녹인 후, CarboPac PA1(Dionex, 미국) 컬럼을 이용하여 이동상 A: 200nm NaOH와 B: DW로 80분에 걸쳐 HPAEC-PAD(Dionex, ICS-3000, 미국)로 분석하였다.
그 결과 본 발명의 막걸리박 유래 당단백 분획물은 [표 3]과 같은 당구성을 가지고 있으며, xylose가 52.45%로 가장 많은 함량을 차지하고 있으며, 그 다음으로 arabinose가 33.70% 함유되어 있었다.
막걸리박 유래 당단백 분획물의 구성 당 조성
당 % 당 %
Fuc 0.15 Gal 1.64
Rha 0.28 Glc 6.42
Ara 33.70 Man 3.22
GlcN 2.16 Xyl 52.45
<3-4> 당단백 분자량 측정을 위한 전기영동
제조한 당단백 분획물에 포함된 당단백질의 분자량을 측정하기 위하여 Laemmli의 방법에 따라 15% polyacrylamide gel을 제작 후 당단백 분획물을 주입하고 전기영동 완충용액(0.025M Tris-HCl, 0.192M glycine, 0.1% SDS, pH 8.3)으로 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였으며, 이를 Coomassie Blue로 염색한 후 탈색하였다. 분자량 표준물질은 15~250 kDa Marker(Dokdo)를 이용하였다.
그 결과 [도 2]에서 보는 바와 같이 분자량 15, 17, 27, 30, 50, 60, 68, 80, 110 kDa 정도의 분자량을 가진 당단백질이 포함된 것을 확인하였다.
<실시예 4>
막걸리박 유래 당단백 분획물의 면역활성 증진 효능 실험
<4-1> 세포독성 시험
RAW 264.7 대식세포(macrophage)를 2.0X105 cells/well의 농도로 96well plate에 분주하고, 24시간 후 시료를 12, 25, 50, 100ug/ml의 농도로 처리하고, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때 대조군으로 lipopolysaccharide(LPS) 1ug/ml을 단독 처리하여 동일 조건에서 배양하였다.
세포 배양 후 0.5mg/ml농도의 MTT( (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 넣고 4시간 동안 37℃ incubator에서 반응시킨 후 형성된 formazan을 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 [도 3]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 당단백 분획물을 RAW 264.7 cell에 25, 50, 100 ug/mL 농도로 24시간 처리하였을 때 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
<4-2> 대식세포의 NO 생산에 미치는 영향 측정
RAW 264.7 macrophage 세포를 2.0x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간 후 시료를 25, 50 ㎍/mL의 농도로 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 이때 대조군은 LPS 1 ㎍/mL을 단독 처리하여 동일 조건에서 배양하였다. Cell culture medium 100 ㎕와 Griess reagent (sigma-aldrich co.) 100 ㎕ 동량을 혼합하여 상온에서 15분 반응 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite로 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 정량하였다.
막걸리박 당단백 분획물의 macrophage NO 생성에 미치는 영향을 농도별로 처리하여 조사하였으며, 면역활성 증진을 위한 의약품으로 사용되고 있는 polysaccharide K (PSK - 'krestin'이라고도 함)와 비교하였다. [도 4]에서 보는 바와 같이, LPS로 활성화된 세포의 경우 NO 함량이 39.69±1.15 uM수준을 나타내었고 막걸리박 당단백 분획물을 25, 50, 100 ug/mL 처리시에는 각각 26.77±0.08 uM, 31.04±0.35 uM, 33.50±0.04 uM으로 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타나 음성 대조군에 비해 월등히 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다.
<4-3> 대식세포의 Cytokine 분비에 미치는 영향 측정
TNF-α 등의 cytokine은 ELISA kit(Enzo)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 대식세포(macrophage)를 2.0X105 cells/well의 농도로 96well plate에 분주하고, 24시간 후 시료를 25, 50, 100 ug/ml의 농도로 처리하고, 37, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때 양성 대조군으로는 LPS 1 ug/mL을 단독 처리하였고, 음성 대조군으로는 아무것도 처리 안한 RAW 264.7 macrophage 세포로 하여 동일 조건에서 배양하였다. 막걸리박 당단백 분획물이 macrophage의 TNF-α 등의 cytokine의 발현에 미치는 영향을 조사하였으며, 면역 활성 증진을 위한 의약품으로 사용되고 있는 polysaccharide K (PSK - 'krestin'이라고도 함)와 비교하였다. 배양 후 상등액을 취하여 ELISA kit(Enzo)를 이용하여 사이토카인(cytokine) 생성량을 측정하였다.
그 결과 [도 5]에서 보는 바와 같이 TNF-α의 경우, LPS를 단독으로 처리 시 25,825 pg/mL로 나타났으며, 막걸리박 당단백 분획물을 25, 50, 100 ug/mL 농도로 처리 시 각각 8,875±48.50, 22,4460±272.00, 27,935±118.50 pg/mL으로 나타나 음성대조군은 물론 PSK를 동일 농도로 처리하였을 때보다 월등히 높은 수준으로 나타나 막걸리박 당단백 분획물이 PSK(krestin)보다 TNF-α의 발현에 높은 영향을 주는 것으로 나타났다.
또한 IL-6 발현을 관찰한 결과 [도 6]에서 보는 바와 같이, 막걸리박 당단백 분획물을 25, 50, 100 ug/mL 농도로 처리시 각각 470±2.50, 2,057±3.75, 7,310±5.0 pg/mL의 IL-6 농도를 나타냈는데, 이는 음성 대조군에 비해 월등히 높은 수치이다. 반면 PSK 처리군의 경우에는 100 ug/mL로 처리하였을 때 1,335±1.0 pg/mL의 IL-6 함량을 나타내었다.
이상 살펴본 바와 같이, 따라서 본 발명은 막걸리박 유래 당단백 분획 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 (a) 막걸리박을 탈지하는 단계; (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인완충용액에 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계; (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및 (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 동결건조로 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 당단백 분획물은 대식세포의 면역 활성을 촉진하는 효능이 면역 활성 의약품인 PSK보다 매우 뛰어나며 세포독성이 전혀 없어 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (7)

  1. (a) 막걸리박을 탈지하는 단계;
    (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계;
    (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
    (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계;
    (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계;
    (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및
    (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계;
    를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 분자량이 15 내지 110 kDa인 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당단백 분획물은 전체 아미노산 대비 아스파르트산은 5 내지 15%(w/w), 트레오닌은 3 내지 7%(w/w), 세린은 3 내지 10%(w/w), 글루탐산은 10 내지 30%(w/w), 프롤린은 3 내지 10%(w/w), 글리신은 3 내지 10%(w/w), 알라닌은 3 내지 10%(w/w), 발린은 3 내지 10%(w/w), 메티오닌은 1 내지 5%(w/w), 이소루신은 3 내지 10%(w/w), 루신은 3 내지 10%(w/w), 티로신은 1 내지 5%(w/w), 페닐알라닌은 1 내지 5%(w/w), 리신은 1 내지 5%(w/w), 히스티딘은 1 내지 5%(w/w), 아르기닌은 3 내지 10%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 당단백 분획물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 당단백 분획물은 전체 당 대비 퓨코오스는 0.1 내지 0.5%(w/w), 람노오스는 0.1 내지 0.5%(w/w), 아라비노스는 20 내지 40%(w/w), 갈락토오스는 0.5 내지 5%(w/w), 글루코오스는 3 내지 10%(w/w), 만노오스는 3 내지 10%(w/w), 자일로스는 40 내지 60%(w/w), N-아세틸글루코사민(GlcNAc)은 0.5 내지 5%(w/w)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 당단백 분획물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 당단백 분획물은 면역 기능 증진 활성이 있는 것을 특징으로 하는 막걸리박 유래 당단백 분획물.
  5. 제1항의 당단백 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물.
  6. 삭제
  7. (a) 막걸리박을 탈지하는 단계;
    (b) 막걸리박을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 혼합하는 단계;
    (c) 상기 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
    (d) 상기 상등액을 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계;
    (e) 상기 투석된 상등액에 단백질을 침전시키는 염을 첨가하여 당단백질을 침전시키는 단계;
    (f) 상기 침전물을 pH가 7.0 내지 8.0인 완충용액에 용해하여 투석 반투막(MWCO 6000-8000)으로 투석하는 단계; 및
    (g) 상기 투석된 침전 용해물에서 당단백 분획물을 수득하는 단계;
    를 포함하는 막걸리박 유래 당단백 분획물의 제조방법.
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