KR20160014445A - 효소처리 인삼유래 면역기능 증강용 다당분획물 및 이의 제조방법 - Google Patents

효소처리 인삼유래 면역기능 증강용 다당분획물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역증강효과가 강화된 효소처리 인삼유래 다당 분획물 제조 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 다당분획물에 관한 것으로 보다 구체적으로는 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 2종 이상의 효소를 순차적으로 부가하여 효소처리하는 단계; 및 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 다당분획물에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 복합효소 처리 공정을 통하여, 면역활성 증가 효과가 우수한 다당분획물을 경제적으로 제조할 수 있으며, 본 발명의 다당분획물은 기존의 인삼 유래 다당에 비하여 면역증강 효과가 우수하므로 면역증강용 식품 제조에 효과적이다.

Description

효소처리 인삼유래 면역기능 증강용 다당분획물 및 이의 제조방법{Polysaccharide fraction isolated from Panax ginseng treated enzymes with immune-enhancing activity and method for producing the same}
본 발명은 면역증강효과가 강화된 효소처리 인삼유래 다당 분획물 제조 방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 다당 분획물에 관한 것으로 보다 구체적으로는 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 2종 이상의 효소를 부가하여 효소처리하는 단계; 및 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역활성 증강용 인삼유래 다당분획물 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 다당분획물에 관한 것이다.
면역이란 인체 내에서 외부로부터 침입하는 미생물 동종의 조직 등의 다른 물질, 특이 세포가 발생하면 면역계가 관여하여 이들을 항원으로 인식하여 특이하게 반응하여 항체를 생산하는 능력을 나타냄으로서 개체의 항상성을 유지하려는 현상을 말하며, 면역 반응에 관여하는 세포는 임파구, macrophage, NK cell, 수지상세포 등이 있다. 최근 생체의 면역세포로부터 cytokine 방출을 촉진시켜 암세포를 괴사시키는 면역요법이 주목받고 있다. 면역요법은 면역반응의 증강 및 억제 유도를 통해 생체의 방어능력을 조절함으로써 암세포를 사멸하기 때문에 기존의 약물에 의한 항암치료법보다 더 큰 효과를 기대할 수 있다. 따라서 안전성이 보고된 천연물로부터 면역활성 증진 효능을 갖는 천연물을 탐색하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있다.
인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 오갈피나무과에 속하는 다년생 초본으로 한국, 중국 시베리아 동부에서 자생하는 식물이다. 인삼의 주요 생리활성 성분으로는 사포닌, 폴리아세틸렌, 페놀성분, 정유성분, 펩타이드, 다당체 성분 등이 있으며, 이들의 약리활성으로 사포닌의 중추신경억제, 항당뇨, 항스트레스, 항피로 효과와 폴리아세틸렌의 항암활성, 페놀성분의 항산화, 항암, 미백, 혈당강하 활성이 알려져 있다. 식물체 유래 다당체는 면역증강 물질로 잘 알려져 있으며, 그중에서도 인삼에서 분리한 다당체는 항당뇨, 혈당저하, 인슐린 분비 촉진과 함께 림프계 세포 증식 자극, 항보체 활성과 같은 면역 증강 활성이 보고되어 있다.
홍삼유래 산성다당체의 면역증진 효능에 대해서는 많이 알려져 있으나, 홍삼을 포함한 인삼 유래 다당체의 생산기술에 관한 연구가 활발히 진행되지 아니하여, 일반적인 식물유래 다당체 분리 공정에 따라 생산되고 있는 실정이다. 따라서 효소 공학적 기술, 당쇄구조의 변형 등의 부가기술을 적용하여 기능성 다당체의 대량생산과 함께 식품의 가공공정상 품질을 개선하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 면역증강 활성이 강화된 다당분획물을 경제적으로 제조할 수 있는 방법에 관하여 연구하던 중, 인삼 추출물을 아밀라제 및 셀룰라제로 병행 효소 처리하여 다당분획물을 제조하는 경우 고가의 분리 정제 공정이 없이도, 면역증강 활성이 강화된 다당분획물을 제조할 수 있다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 순차적으로 처리하는 단계; 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 순차적으로 처리하는 단계; 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 순차적으로 처리하는 단계; (b) 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명의 제조방법을 단계에 따라 설명한다.
(a) 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 순차적으로 처리하는 단계;
(a) 단계에서는 인삼에 효소처리를 한다. 본 발명의 효소처리단계는 아밀라제 및 셀룰라제를 순차적으로 처리하는 것을 특징으로 한다.
인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 오갈피나무과에 속하는 다년생 초본으로 한국, 중국 시베리아 동부에서 자생하는 식물이다. 인삼의 주요 생리활성 성분으로는 사포닌, 폴리아세틸렌, 페놀성분, 정유성분, 펩타이드, 다당체 성분 등이 있으며, 이들의 약리활성으로 사포닌의 중추신경억제, 항당뇨, 항스트레스, 항피로 효과와 폴리아세틸렌의 항암활성, 페놀성분의 항산화, 항암, 미백, 혈당강하 활성이 알려져 있다. 인삼은 그 가공 형태에 따라 다양한 이름으로 불린다. 갓 수확한 인삼은 수삼이라 하며, 뿌리를 껍질째 수증기로 쪄서 말린 것을 홍삼이라 한다. 건삼은 수삼을 말린 것을 말하며, 껍질을 벗겨 말린 백삼, 껍질을 벗기지 않고 말린 피부직삼이 건삼에 속한다. 본 발명의 인삼은 그 사전 가공 형태에 상관없이 모든 인삼(Panax ginseng)을 모두 포함하며, 바람직하게는 본 발명의 인삼은 수삼 또는 백삼일 수 있다. 더욱 바람직하게는 가공형태인 수삼분말 또는 백삼분말일 수 있다.
아밀라제(amylase)는 전분(starch)을 가수분해하는 효소를 말한다. 아밀라제의 종류에는 α-amylase(α-1,4-glucan-4-glucano hydrolase), β-amylase(α-1,4-glucan malto hydrolase), γ-amylase(amyloglucosidase)가 있으며, 본 발명의 아밀라제는 그 종류가 특별히 한정되지 아니하나, 바람직하게는 α-amylase일 수 있다.
셀룰라제(cellulase)는 셀룰로오스를 가수분해하는 효소를 말한다.
아밀라제 및 셀룰라제는 고등식물, 동물, 미생물 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 본 발명의 아밀라제 및 셀룰라제는 그 기원에 있어 특별히 제한되지 아니하나, 미생물 유래의 아밀라제 및 셀룰라제가 바람직하다. 본 발명의 가수분해 효소는 고등식물, 동물 또는 미생물로부터 직접 분리하거나 상업적으로 판매하는 것을 구매하여 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 본 발명의 아밀라제는 Bacillus licheniformis 유래의 SPEZYME XTRA일 수 있으며, 셀룰라제는 Trichoderma reesei 유래의 ROHAMENTCL일 수 있다.
본 발명의 효소처리는 두 효소를 동시에 처리하거나, 순차적으로 처리할 수 있으나, 셀룰라제 및 아밀라제는 활성을 보이는 온도가 상이하므로 각각 순차적으로 처리하는 것이 바람직하다. 효소투여량 및 처리온도, 시간, pH 등 반응 조건은 처리대상인 인삼 추출물의 양, 투여되는 셀룰라제 또는 아밀라제의 종류, 순도에 따라 달라질 수 있으며, 목적하는 가수분해 효과를 나타내는 한 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명의 효소처리는 바람직하게는 셀룰라제를 부가하여 12시간 내지 24시간 동안 효소처리 한 후, 아밀라제를 부가하여 6시간 내지 24시간 동안 효소처리하는 방법에 의할 수 있다.
또한 본 발명의 인삼은 효소 반응의 효율성을 위하여 세절하거나 분말화하여 사용할 수 있으며, 증류수 등 적절한 용매를 가하여 효소처리를 할 수 있다.
(b) 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계;
(b) 단계에서는 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 분획물을 수득한다.
바람직하게는 상기 (b)단계는
(b1) 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물에서 잔사를 제거하는 단계;
(b2) 상기 잔사가 제거된 인삼 가수분해물에 유기용매를 넣어 침전된 조다당을 수득하는 단계; 및
(b3) 상기 조다당으로부터 분자량 10kDa 이상의 분획물을 분리 수득 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
(b1) 단계에서는 효소 처리된 인삼 가수분해물에서 잔사를 제거한다. 잔사 제거 방법은 원심분리, filtration 등 공지의 혼합물로부터 고형분을 제거하는 방법에 의할 수 있다. 바람직하게는 원심분리에 의할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 (b1) 단계는 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물에 포함된 효소를 불활성화 처리를 하고, 원심분리 방법에 의해 잔사를 제거하고 상등액을 분리하여 수득하는 방법에 의할 수 있다. 상기 불활성화 처리 방법은 바람직하게는 열처리에 의한 것으로, 가수분해물을 100℃ 내지 120℃의 온도로 10 내지 30분간 유지하는 방법에 의할 수 있다.
(b2) 단계에서는 잔사가 제거된 인삼 가수분해물에 유기용매를 넣어 침전된 조다당을 수득한다. 상기 유기용매는 에탄올일 수 있다. 에탄올 침전은 공지의 에탄올 침전법에 의할 수 있으며, 상기 에탄올 침전에 사용되는 에탄올은 물과 혼합하여 70% 내지 95%(v/v)의 농도를 가지는 에탄올이 바람직하다.
(b3) 단계에서는 상기 (b2) 단계에서 수득한 조다당에서 분자량 10kDa 이상의 분획물을 수득한다.
상기 분획물 수득 방법은 물질을 분자량에 따라 분리하는 공지의 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 제거할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 분획물 수득 방법은 투석막을 이용한 투석 방법에 의해 조다당으로부터 목적 분자량 이하의 물질을 제거하는 방법 일 수 있다.
상기 수득되는 분획물은 10kDa의 분자량을 가지는 분획이며, 바람직하게는 10 kD 이상 500 kDa 이하의 분자량을 가지는 분획물이다. 더욱 바람직하게는 50 kDa 이상 400 kDa 이하의 분자량을 가지는 분획물일 수 있다.
또한, 상기 수득되는 분획물의 전체 대비 중성 다당(neutral sugar)은 70 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid)은 20 내지 30 중량% 일 수 있다. 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 구성될 수 있으며, 상기 다당 분획물의 중성 다당은 람노오스, 퓨코오스, 아라비노오스, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스로 구성될 수 있다.
상기 다당 분획물의 중성 다당은 상기 인삼유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 람노오스는 2 내지 10 mole%, 아라비노스는 10 내지 25 mole%, 갈락토오스는 15 내지 45 mole%, 글루코오스는 40 내지 70 mole% 인 다당으로 구성될 수 있으며, 퓨코오스, 자일로스 및 만노오스와 같은 잔량의 중성 다당을 미량 함유 할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하면 면역기능 증강 효과가 우수한 다당분획물을 제조할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 증강활성을 가진 인삼유래 다당분획물을 제공한다.
본 발명의 다당분획물은 본 발명의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하며, 면역기능 증강 효능이 기존의 단순 열수 추출 방법 또는 효소 단독처리 방법에 의해 제조된 인삼 유래 다당체에 비하여 면역기능 증강 효능이 우수하다.
면역기능이란 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 다음 죽임으로써 질병으로부터 생명체를 보호하는 기능을 말한다.
면역기능은 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune) 기능이 있으며, 내재면역은 미생물들과 독소들이 체내로 진입하는 데 성공하였을 때 곧바로 작용하는 면역 기능으로 패턴 인식 수용체가 미생물들 사이에 널리 보존되어 있는 부분을 인지하여 외부의 미생물을 감지하는 방식으로 작용하거나, 손상된 세포들이 방출하는 경고성 신호를 같은 종류의 수용체가 이를 인지하여 미생물의 존재 사실을 감지하는 방식으로 작용한다.
적응면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적이며 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.
본 발명의 다당분획물은 대식세포의 NO, TNF-α 및 IL-16, IL-12의 생성을 촉진시켜 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune)을 모두 증진시키는 효능이 있다.
또한 본 발명의 다당분획물은 세포독성이 없어 식품 또는 의약품에 활용이 용이하다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 일실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일실시예에서는 인삼을 열수 추출하여 효소처리를 하지 않은 다당분획물 및 인삼 분말을 아밀라제, 셀룰라제, 펙티나제 및 프로테아제로 각각 단독으로 처리한 다당분획물을 제조하여 면역기능 증강 활성을 측정하였다. 그 결과 대조군인 단순 열수추출물, 프로테아제 또는 일반적으로 다당분획물 제조시 사용하는 펙티나제 처리군에 비하여 아밀라제 또는 셀룰라제를 처리한 군의 면역기능 증강 활성이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 아밀라제 및 셀룰라제를 병행처리한 다당분획물을 제조하고, 아밀라제 또는 셀룰라제를 처리한 다당분획물과 아밀라제 및 셀룰라제를 병행처리한 다당분획물의 면역기능 증강 활성을 비교하였다. 그 결과 아밀라제 또는 셀룰라제를 단독으로 처리한 다당분획물에 비하여 아밀라제 및 셀룰라제를 병행처리한 다당분획물의 면역기능 증강 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 다당분획물을 대식세포에 처리하여 세포 생존율을 측정하는 방법으로 세포독성이 있는지 시험하였다. 그 결과 본 발명의 다당분획물은 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 다당분획물을 대식세포에 처리하여 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 본 발명의 다당분획물을 처리하는 경우 대식세포의 산화질소(NO) 생성량이 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 다당분획물을 대식세포에 처리하여 면역관련 cytokine의 생성에 미치는 영향을 실험하였다. 그 결과 본 발명의 다당분획물을 처리하는 경우 TNF-α, IL-6 및 IL-12등의 Cytokine의 생성량이 매우 증가하는 것을 확인하였다.
이로서 본 발명의 다당분획물은 면역 기능 증강 활성이 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명의 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 인삼유래 다당분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 인삼유래 다당분획물과 면역기능 증강의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 인삼유래 다당분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 인삼유래 다당분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.
또한, 본 발명의 인삼유래 다당분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알레르기 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 본 발명의 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 다당분획물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 면역기능 증강용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 다당분획물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당단백 분획의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 다당분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 다당분획물을 면역기능 증강제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알레르기 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 2종 이상의 효소를 순차적으로 부가하여 효소처리하는 단계 및 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 다당분획물을 제공한다. 본 발명의 제조방법은 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 복합효소 처리 공정을 통하여, 면역활성 증가 효과가 우수한 다당분획물을 경제적으로 제조할 수 있으며, 본 발명의 다당분획물은 기존의 인삼 유래 다당에 비하여 면역증강 효과가 우수하므로 면역증강용 식품 제조에 효과적이다.
도 1은 인삼의 열수추출에 의한 조다당 제조 공정도 이다.
도 2는 본 발명의 병행효소 처리에 의한 인삼 유래 다당분획물 제조 공정도 이다.
도 3은 효소 단독처리 인삼유래 다당시료에 의한 마우스 복막 대식세포(mouse peritoneal macrophage)의 증식률 변화를 측정한 세포독성 시험 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당추출물 처리군; FGEz1 : 펙티나제 처리 다당분획물 처리군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz4 : 엔도 프로테아제 처리 다당분획물 처리군;).
도 4는 효소 단독처리 인삼유래 다당시료에 의한 마우스 복막 대식세포의 사이토카인 IL-6 생산능 변화를 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당추출물 처리군; FGEz1 : 펙티나제 처리 다당분획물 처리군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz4 : 엔도 프로테아제 처리 다당분획물 처리군; a, b, c, d, ab, bc : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 5는 효소 단독처리 인삼유래 다당시료에 의한 마우스 복막 대식세포의 사이토카인 IL-12 생산능 변화를 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당추출물 처리군; FGEz1 : 펙티나제 처리 다당분획물 처리군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz4 : 엔도 프로테아제 처리 다당분획물 처리군; a, b, c, ab : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 6은 효소 단독처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7세포의 사이토카인 IL-6의 생산능 변화를 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당추출물 처리군; FGEz1 : 펙티나제 처리 다당분획물 처리군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz4 : 엔도 프로테아제 처리 다당분획물 처리군; a, b, c, ab : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 7은 효소 단독처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7세포의 사이토카인 IL-12의 생산능 변화를 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당추출물 처리군; FGEz1 : 펙티나제 처리 다당분획물 처리군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz4 : 엔도 프로테아제 처리 다당분획물 처리군; a, b, c, d, ab : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 8은 HPLC 실험에 의한 효소 단독처리 인삼유래 다당시료의 분자량 분포 측정 결과이다(STD : 실험에 사용된 표준물질을 측정한 결과; A : FGW0(효소 무처리 다당추출물 처리군)을 측정한 결과; B : FGEz2(셀룰라제 처리 다당분획물 처리군)를 측정한 결과; C : FGEz3(아밀라제 처리 다당분획물 처리군)을 측정한 결과).
도 9는 효소 단독 처리 및 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 마우스 복막 대식세포의 사이토카인 IL-6의 생산능 변화를 비교 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당분획물 처리군; FGEz2+3 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군; a, b, c, d : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 10은 효소 단독 처리 및 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 마우스 복막 대식세포의 사이토카인 IL-12의 생산능 변화를 비교 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz2+3 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군; a, b, c : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 11는 효소 단독 처리 및 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7 세포의 사이토카인 IL-6의 생산능 변화를 비교 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz2+3 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군; a, b, c, ab : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 12는 효소 단독 처리 및 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7 세포의 사이토카인 IL-12의 생산능 변화를 비교 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz2+3 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군; a, b, c, ab : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 13은 효소 단독 처리 및 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7 세포의 사이토카인 IL-10의 생산능 변화를 비교 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz2+3 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군; a, b, c, ab : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 14는 효소 단독 처리 및 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7 세포의 사이토카인 TNF-α의 생산능 변화를 비교 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGEz2 : 셀룰라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz3 : 아밀라제 처리 다당 분획물 처리군; FGEz2+3 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군; a, b, c, ab, bc : 유의성을 나타내는 문자로 동일한 문자를 가지지 않은 결과는 통계학적으로 유의성이 있음).
도 15는 본 발명의 병행효소 처리에 의한 인삼 유래 다당 분획물 제조 공정도 이다.
도 16은 HPLC 실험에 의한 효소 병행처리에 의한 인삼유래 다당시료의 분자량 분포를 비교한 측정 결과이다(STD : 실험에 사용된 표준물질을 측정한 결과; A : FGW0(효소 무처리 다당 추출물 처리군)을 측정한 결과; B : FGEz0(셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군)을 측정한 결과).
도 17은 효소 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7세포의 증식률 변화를 측정한 세포독성 시험 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당 추출물 처리군; FGEz0 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군).
도 18은 효소 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7세포의 사이토카인 IL-6 생산능 변화를 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당 추출물 처리군; FGEz0 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군).
도 19는 효소 병행처리 인삼유래 다당시료에 의한 Raw 264.7세포의 사이토카인 TNF-α 생산능 변화를 측정한 결과 그래프이다(Con : 무처리군; LPS : 내독소인 Lipopolysaccharide 처리 군; FGW0 : 효소 무처리 다당 추출물 처리군; FGEz0 : 셀룰라제 및 아밀라제를 병행 처리한 다당 분획물 처리군).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
조다당 추출물 제조
<1-1> 열수추출에 의한 조다당 추출물 제조
본 실험에 사용된 인삼(raw ginseng)은 2013년에 생산된 4년근 수삼을 구입하여 실험에 사용하였다.
다당을 분리하기 위한 단순 열수추출 방법은 다음과 같다. 수삼 100 g에 증류수 3배(w/v)를 가하여 분쇄한 다음 100℃에서 추출한 후 4℃로 조절된 원심분리기(Mega 17R, Hanil Science Industrial Co. Ltd., Inchun, Korea)로 6,500×g 에서 20분간 원심분리 하였다. 분리한 상등액은 최종농도가 80%가 되도록 냉에탄올을 첨가하여 하룻밤 방치한 후 생성된 침전물을 회수하여 소량의 증류수에 용해한 다음 투석막 (Membrane Filteration Products, INC., Seguin Texas, USA; MWCO 6,000~8,000)을 이용하여 2~3일간 투석을 행하고 동결건조(Tokoyo Rikakikai Co. Ltd., FD-1000, Tokyo, Japan)하여 열수추출 조다당 추출물(FGW0, 수율3.2%)을 조제하였다([도 1]).
<1-2> 효소처리에 의한 다당 분획물 제조
효소처리에 사용되는 가수분해효소로는 RAPIDASE C80MAX(Pectinase, from Aspergillus niger ; Ez1), ROHAMENTCL(Cellulase, from Trichoderma reesei ; Ez2), SPEZYME XTRA(α-amylase, from Bacillus licheniformis ; Ez3), PROTEX 6L (Endo-Protease, from Bacillus licheniformis ; Ez4) 등 총 4종을 Bision biochem(Bision corporation, 경기도)으로부터 구입하여 사용하였다.
효소처리를 이용한 다당 분획물은 다음과 같이 조제하였다. 수삼 100 g에 증류수 3배(w/v)를 가하여 분쇄한 후 101℃로 20분간 가열한 다음 4종류(Ez1, Ez2, Ez3, Ez4)의 가수분해효소를 [표 1]의 조건으로 각각 또는 2종 이상을 병행 처리하였다. 그 후 90~100℃, 20분간 가열처리하여 잔존 가수분해효소를 불활성화 시킨 다음 6,500×g 에서 20분간 원심분리하여 잔사를 제거하고, 분리한 상등액은 최종농도가 80%가 되도록 냉에탄올을 첨가하여 하룻밤 방치하여 다당을 침전시켰다. 생성된 침전물을 소량의 증류수에 용해시켜 투석막 (Membrane Filteration Products, INC., Seguin Texas, USA; MWCO 6,000~8,000)을 이용하여 저분자 물질을 제거한 후 동결 건조하여 효소처리 다당 분획물을 얻었다([도 2]). 이 때 가수분해 효소들을(4종; Ez1~4) 각각 처리하여 조제한 효소처리 다당 분획물인 FGEz1, FGEz2, FGEz3, FGEz4의 수율은 1.5, 2.7, 1.5, 3.8%였다.
효소 처리 조건
Trade name Enzyme Orgin conditions 사용량 반응시간 및 특징
RAPIDASE C80MAX pectinase Aspergillus niger pH 3.0~5.0
Tem. 10~55℃		 원료당 0.05~0.1% 45~50℃,1~2hr
10~15℃, 10~24hr
ROHAMENT
CL		 cellulase β-glucanase
hemicellulase		 Trichoderma
reesei		 pH 4.5~5.0
Tem. 50~60℃		 기질대비 0.05~0.2% 2~6hr
SPEZYME
XTRA		 α-amylase Bacillus licheniformis pH 4.5~6.0
Tem. 85~95℃		 전분중량대비
0.03~0.1%		 -
PROTEX
6L		 protease (Endo-type) Bacillus licheniformis pH 7.0~9.0
Tem. 55~60℃		 기질대비 0.1~0.3% 실활조건:
90℃, 15분유지
< 실시예 2>
면역활성 평가
본 연구에 사용한 실험동물은 생후 5~6주령의 웅성 BALB/c를 3일간 적응을 거친 후 실험에 사용하였다. Mouse는 사육 조에 2마리씩 넣어 일정한 온도, 습도로 유지되는 사육장에서 사육하였으며 물과 사료는 자유 급식 형태로 유지하였다.
본 실험에 사용한 mouse peritoneal macrophage 세포는 BALB/c mouse의 복강에 5% thioglycollate medium을 1mL 주입하고, 72~96 시간 내에 유도된 macrophage를 PBS를 이용하여 회수하였다. 그 후 RPMI 1640 medium으로 2~3회 세척하고 세포 수를 2.5×106 cells/mL로 조정하여 96 well plate(NUNC Co., Roskilde, Denmark)에 배양하였다. 배지는 RPMI 1640에 10%(v/v) FBS와 1%(v/v) penicillin-streptomycin을 혼합해 사용하였다. 이후 다양한 농도로 희석된 시료를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 일정한 조건으로 유지하며 배양하였다.
<2-1> Mouse peritoneal macrophage 세포에 대한 독성 측정
각 세포에 대한 시료의 독성 여부는 MTT assay(Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth cell kill. Journal of Immunological Methods, 1989, 119: 203-210.) 방법으로 측정하였다. 96 well plate의 상등 액을 제거한 후, 0.5 mg/mL MTT 용액을 첨가하여 4시간 동안 배양하여 formazan을 형성시켰다. 그 후, 상등 액을 제거하고 DMSO를 각 well에 첨가하여 formazan을 녹인 후 ELISA 판독기(Infinite M200 Pro, TECAN, M, Switzerland)를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
일정한 세포수로 조정하여 배양 세포에 다당 추출물 시료 FGW0 및 FGEz1~4를 각각 1, 10, 100 ug/mL의 농도로 세포에 처리하여 배양한 후 세포의 생존 여부를 확인한 결과는 [도 3]에 나타난 바와 같다. Mouse peritoneal macrophage 세포의 경우 FGEz4 100 ug/mL를 처리한 군을 제외하고 모두 80% 이상의 생존율을 보여 1~100 ug/mL의 농도범위 내에서 세포 독성에 큰 영향을 미치지 않는 다는 것을 알 수 있었다. FGEz4 또한 100 ug/mL에서 78%의 생존율로 오차범위 내에서 세포의 생존에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.
<2-2> Mouse peritoneal macrophage 세포의 Cytokine 생산량 측정
배지로 희석시킨 시료를 농도 별로 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후, macrophage에 의해 유도, 분비된 상등 액 중 cytokine의 양을 ELISA kit을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 즉, Anti-cytokine capture antibody를 coating buffer(0.2 M Sodium Phosphate, pH 6.5)에 희석하여 96 well plate에 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. Tween 20을 PBS에 0.05% (v/v)가 되도록 가한 PBS/Tween 용액으로 plate를 3회 세척하였다. Assay diluent(PBS with 10% FBS)를 plate에 넣은 후 상온에서 1시간 방치하였다. PBS/Tween로 3회 세척 후, 배양 상등 액을 각 well에 넣어준 뒤 2시간 상온에서 방치하였다. PBS/Tween로 5회 세척 후, detection antibody인 biotinylated antibody와 enzyme reagent인 stretavidin-horseradish peroxidase conjugate를 assay diluent(PBS with 10% FBS)에 희석하여 plate에 넣은 후 상온에서 1시간 방치하였다. PBS/Tween로 7회 세척 후, substrate solution을 넣고 암소에서 30분 방치하였다. Stop solution인 2 N 황산용액을 넣어 반응을 중지시키고 ELISA 판독기를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
Macrophage는 체내 거의 모든 조직에 분포하며 이물질이나 노폐물을 탐식, 제거하는 역할을 하는데, 이 과정에서 여러 가지 cytokine을 분비하여 면역 반응을 조절한다고 알려져 있다. Cytokine은 면역세포에서 생성되는 단백질 중재자로 외부 항원에 대한 여러 면역 세포간의 협력을 중재하므로, 이들의 생성과 분비는 면역반응 조절에 있어 매우 중요하다고 알려져 있다. Macrophage가 분비하는 대표적인 면역반응 유도 cytokine으로는 IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α 등이 밝혀져 있다(Wang H, Actor JK, Indrigo J, Olsen M, Dasgupta A. 2003. Asian and siberian ginseng as a potential modulator of immune function: An in vitro cytokine study using mouse macrophage. Clin Chim Acta 327:123-128). 수삼 유래 다당의 자극에 의한 mouse peritoneal macrophage의 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과 IL-6, IL-12의 생산을 촉진하였으며, 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하는 것으로 나타났다. IL-6는 모든 시료가 대조군에 비해 높았으며, 효소처리 시료군(FGEz1~4)이 FGW0에 비해 높은 활성을 보였다([도 4]). 그 중에서도 100 ug/mL의 농도에서 FGW0에 비해 FGEz2와 FGEz3는 약 2.2배 정도 높은 활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 특히 FGEz2의 경우 10 ug/mL의 농도에서 큰 차이를 보였으며 유의미한 값을 가져 비교적 낮은 농도에서부터 IL-6의 활성이 크게 나타나는 것으로 확인되었다.
IL-12의 경우에도 대조군(Con)과 FGW0에 비해 효소처리 시료군(FGEz1~4)의 활성이 높은 것을 확인할 수 있었다([도 5]). 효소들 간에 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, 상대적으로 낮은 농도인 10 ug/mL에서 87 pg/mL의 수치를 보인 FGW0에 비해 FGEz2는 434 pg/mL, FGEz3은 180 pg/mL, FGEz4는 177 pg/mL의 수치를 나타내 차례로 높은 값을 나타냈다. 특히 FGEz2는 낮은 농도에서부터 큰 활성을 보여 적은 양으로도 높은 면역 활성을 보이는 것으로 추측할 수 있었다.
<2-3> Raw 264.7 세포 자극에 의한 cytokine 생산량 측정
Raw 264.7 cell line(KTCC No. 40071)은 한국 세포주은행(KTCC, Seoul)에서 분양받아 사용하였다. 세포 수를 2.0×105 cells/mL로 조정하여 배양하였으며, 배지는 DMEM 배지에 10% (v/v) FBS와 1% (v/v) penicillin-streptomycin을 혼합해 사용하였다. 이후 다양한 농도로 희석한 시료를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
Raw 264.7 세포에서도 같은 시료를 이용해 10~150 ug/mL의 농도 범위에서 cytokine을 측정한 결과, [도 6]에서 보는 바와 같이, IL-6는 FGW0에 비해 효소처리 시료군(FGEz1~4)이 높은 활성을 보인 것을 확인할 수 있었으며, 그 중 FGW0와 비교하였을 때 FGEz2와 FGEz3는 IL-6에서 유의적인 차이를 보였다. FGEz2의 경우 100, 150 ug/mL 농도에서 약 5~10배 이상 IL-6의 증가하였고, FGEz3는 100, 150 ug/mL 농도에서 약 9~11배 이상 증가한 것으로 나타났다.
IL-12도 IL-6와 같이 유사한 양상을 보이는 것으로 나타났다. FGEz4가 150 ug/mL에서 다소 높은 활성을 보인 것 이외에는 FGEz2와 FGEz3가 FGW0에 비해 모든 농도에서 유의적인 활성의 차이를 보였다([도 7]).
이상의 cytokine 생성능의 결과를 통해 FGW0보다 효소처리 시료군(FGEz1~4)의 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 FGEz2와 FGEz3의 활성이 대체로 높은 것을 확인하였다. 따라서 두 효소의 병행처리를 통해 얻은 시료가 단일 효소 처리와 비교하여 활성의 차이를 나타내는지 확인하는 작업이 필요하다고 판단하였다.
< 실시예 3>
분자량 분포 측정
효소처리 된 4종류의 다당 분획물 시료(FGEz1~4)에 따른 면역실험에 따른 결과 열수추출 다당추출물(FGW0)보다 cellulase(Ez2) 및 α-amylase(Ez3)를 이용하여 처리하였을 때 수삼의 면역 활성을 높아지는데 가장 효과적인 것으로 판단되었다. 따라서 HPLC를 이용하여 분자량 분포를 열수추출 다당추출물(FGW0) 및 효소처리 다당 분획물(FGEz2, FGEz3) 등과 비교하여 살펴보았다.
분자량 측정을 하기 위하여 표준물질과 열수 및 가수분해 효소로 처리된 다당 각각의 시료 20mg을 0.2M NaCl 1ml에 녹인 후, 막여과지로 여과하여 HPLC(Jasco Co., Japan) 분석에 사용하였다. 사용된 Column은 GS520(7.5mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan)+GS320(8.0mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan)을 사용하였으며, 이동상으로는 0.2M NaCl를 용매를 사용하였으며, 시료 주입량은 20ul, 유속은 0.4ml/min로 하였으며, refractive index detector(Jasco Co., Toyko, Japan)로 검출하였다. 정제다당의 분자량은 Pullulan Standard는 Fluka 제품(molecular size; 10K, 48.8K, 366K)를 표준물질로 하여 얻어진 표준곡선과 비교하여 측정하였다.
그 결과, [도 8]에서 보는 바와 같이, 열수 추출된 다당추출물(FGW0)의 경우 분자량이 10K 이상인 고분자 분획이 3개로 나누어졌고 cellulase(Ez2) 효소처리시에는 10K 이상인 고분자 분획 2개와 1개 이상의 저분자 분획들로 FGW0와 비슷하게 분자량이 분포되었음을 알 수 있었다. 반면 α-amylase(Ez3)를 이용하여 효소처리하였을 때는 10K 이상인 2개의 고분자 분획과 10K이하인 3~4개 이상의 저분자 분획들로 나누어짐을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
효소 병행처리에 의한 수삼 유래 신규 면역증진 다당분획물 조제
수삼 분말 100 g에 증류수 5~20배(w/v)를 가하여 현탁시킨 후 2종류(Ez2, Ez3)의 가수분해효소를 순차적으로 처리한다. 즉, 초기 현탁액의 온도와 pH를 50~60℃, 4.5~6.0으로 조정한 후 Ez2의 효소를 첨가하여 하루 동안 반응을 시킨 다음 반응물의 온도를 85~90℃로 조정한 후 Ez3의 효소를 첨가하여 9~12시간 반응시킨 후 최종반응물을 101℃, 20분간 처리하여 효소의 불활성화를 유도한 다음 6,500×g 에서 20분간 원심분리하여 잔사를 제거하고, 분리한 상등액은 최종농도가 80%가 되도록 냉에탄올을 첨가하여 하룻밤 방치한 후 다당을 침전시켰다. 생성된 침전물을 소량의 증류수에 용해시켜 투석막 (Membrane Filteration Products, INC., Seguin Texas, USA; MWCO 6,000~8,000)을 이용하여 저분자 물질을 제거한 후 동결 건조하여 효소처리 다당 분획물을 얻었다.
< 실시예 5>
효소 병행처리 시료의 macrophage 자극에 의한 cytokine 생산 활성
<실시예 2-2> 및 <실시예 2-3>에서와 동일한 방법으로 효소 병행처리 시료의 cytokine 생산활성을 측정하였다.
<5-1> Mouse peritoneal macrophage 세포 자극에 의한 cytokine 생산능
효소 병행처리 한 수삼 유래 다당의 자극에 의한 mouse peritoneal macrophage의 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. [도 9]에서 IL-6의 양은 모든 시료가 대조군에 비해 높았으며, FGW0에 비해 효소처리 시료군 FGEz2, FGEz3, FGEz2+3가 높은 활성을 보인 것을 확인했다. 특히 효소 병행처리 시료인 FGEz2+3이 100 ug/mL의 농도에서 2033 pg/mL의 수치를 보였는데 이는 FGEz2 보다 1.8배, FGEz3보다 1.1배 높은 값으로 유의적으로 가장 큰 활성을 보여 효소 병행 처리(FGEz2+3)가 단일효소처리(FGEz2, FGEz3)에 비해 활성을 높이는 것을 확인할 수 있었다. IL-12도 [도 10]에서 보는 바와 같이, FGW0에 비해 효소처리 시료군 FGEz2, FGEz3, FGEz2+3에서 높은 활성을 보인 것을 확인하였다. 특히 효소 병행 처리 시료인 FGEz2+3가 100 ug/mL의 농도에서 683 pg/mL의 수치를 보였는데 이는 FGEz2보다 1.5배, FGEz3보다 1.2배 정도 높은 값으로 유의적으로 가장 큰 활성을 보여 효소 병행 처리 시료가 단일효소처리 시료들에 비해 IL-12의 활성을 높이는 것을 확인하였다.
<5-2> Raw 264.7 세포 자극에 의한 cytokine 생산능
병행 효소 처리한 수삼 유래 다당의 자극에 의한 Raw 264.7 세포의 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다.
[도 11]에서 보는 바와 같이, IL-6는 모든 시료가 대조군에 비해 높았으며, FGW0에 비해 효소처리 시료군 FGEz2, FGEz3, FGEz2+3가 높은 활성을 보인 것을 확인했다. 특히 병행 효소 처리 시료인 FGEz2+3가 150 ug/mL의 농도에서 646 pg/mL의 수치를 보였는데 이는 FGEz2보다 1.3배, FGEz3보다 1.2배 정도 높은 값으로 유의적으로 가장 큰 활성을 보여 병행 효소 처리가 단일효소처리에 비해 활성을 높이는 것으로 나타났다.
[도 12]에서 보는 바와 같이, IL-12도 FGW0에 비해 효소처리 시료군 FGEz2, FGEz3, FGEz2+3가 높은 활성을 보인 것을 확인했다. 특히 병행 효소 처리 시료인 FGEz2+3가 100 ug/mL의 농도에서 563 pg/mL의 수치를 보였는데 이는 FGEz2 (389 pg/mL) 와 FGEz3 (483 pg/mL)보다 각각 1.45배(45%), 1.16(16)배 정도 높은 값이었으며 150 ug/mL의 농도에서도 FGEz2+3의 경우 659 pg/mL의 수치를 보였는데 이는 FGEz2(412 pg/mL) 보다 1.6배 높은 값이었으며 FGEz3 (644 pg/mL)보다도 다소 높았다. 이상의 결과로 보아 FGEz2+3가 유의적으로 가장 큰 활성을 보여 병행 효소 처리 단일효소처리에 비해 활성을 높이는 것이 확인되었다.
[도 13]에서 보는 바와 같이, IL-10은 FGW0을 제외하고 농도 의존적으로 증가하는 양상을 나타내었으며, 100 ug/mL이상의 농도에서 FGW0에 비해 FGEz2, FGEz3, FGEz2+3이 높은 활성을 나타내었다. 특히 FGEz2와 FGEz2+3은 유의미한 값의 변화를 보였지만, FGEz2+3의 값이 다소 높은 것으로 볼 때 병행 효소 처리 시 cytokine의 활성을 일정수준 이상으로 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
[도 14]에서 보는 바와 같이, TNF-α는 FGW0와 FGEz2, FGEz3 각각 효소처리를 한 결과 간에는 차이가 없었지만 FGEz2+3로 병행 효소 처리 시 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 단일효소 처리를 통해서는 얻을 수 없었던 면역 활성의 증가를 병행 효소 처리를 통해 얻을 수 있었다는 사실을 반영하는 결과로 보인다.
따라서 병행 효소 처리를 통해 얻은 시료 FGEz2+3은 단순 열수추출물인 FGW0 외에도 단일효소처리를 통해 얻은 FGEz2, FGEz3의 활성을 능가하는 활성의 변화를 대부분의 cytokine에서 나타내었으며, 세포의 사멸에도 영향을 미치지 않아 유효한 면역 활성 소재로 개발이 가능한 것으로 사료된다.
< 실시예 6>
효소 병행 처리에 의한 수삼 유래 면역증진 다당소재 제조 및 분석
<6-1> 효소 병행 처리에 의한 수삼 유래 면역증진 다당 소재 제조
이상의 모든 연구결과를 종합하여 면역 활성이 높은 효소 병행 처리 수삼 유래 신규 면역증진 다당소재(FGEz0)의 제조공정은 [도 15]와 같고, 이에 따라 효소 병행 처리에 의한 수삼 유래 면역증진 다당소재(FGEz0)를 제조하였다.
시료 분말 100 g에 증류수 5~20배(w/v)를 가하여 현탁시킨 후 2종류(Ez2, Ez3)의 가수분해효소를 순차적으로 처리한다. 즉, 초기 현탁액의 온도와 pH를 50~60℃, 4.5~6.0으로 조정한 후 Ez2의 효소를 첨가하여 하루 동안 반응을 시킨 다음 반응물의 온도를 85~90℃로 조정한 후 Ez3의 효소를 첨가하여 9~12시간 반응시킨 후 최종반응물을 101℃, 20분간 처리하여 효소의 불활성화를 유도한 다음 6,500×g 에서 20분간 원심분리하여 잔사를 제거하고, 분리한 상등액은 UF 처리하여 분자량 10K 이상의 다당분획을 얻고 이를 동결건조(또는 분무 건조)등의 방법으로 건조하여 면역력 증진 활성이 강화된 수삼 다당분획물(FGEz0)을 얻었다.
<6-2> 이화학적 분석
앞서 제시한 공정에 따라 조제한 효소 병행 처리 다당분획물(FGEz0)의 이화학적 성분 특성 및 HPLC를 통한 분자량 분포 등을 열수 추출물(FGW0)과 비교하여 살펴보았다.
이들의 이화학적 성분 특성을 살펴본 결과는 [표 2]와 같았다. FGW0의 중성당 함량은 67.7% 산성당 30.4%, 단백질 1.4%, KDO 0.5%로 구성되어 있으며, 효소 병행 처리 분획물(FGEz0)의 경우 중성당은 73.8%로 FGW0와 비교하였을 때 높은 함량을 나타내었으며, 산성당은 24.9%, 단백질 함량은 0.8%로 낮아진 반면, KDO 함량은 0.5%로 변화가 없었다.
효소 병행 처리에 의해 제조된 시료의 성분분석 결과
Chemical property FGW0 FGEz0
Yield(%) 3.2 2.0
Chemical composition (%)
Neutral sugar 67.7 73.8
Uronic acid 30.4 24.9
Protein 1.4 0.8
KDO-liked 0.5 0.5
Total Polyphenol - -
Componet of neutral sugar(Mole%)
Rhamnose 1.20±0.15 3.50±0.35
Fucose 0.08±0.07 0.19±0.04
Arabinose 8.75±0.65 15.76±1.03
Xylose 0.38±0.39 0.56±0.48
Mannose 0.25±0.01 0.81±0.10
Galactose 10.29±0.06 25.32±0.19
Glucose 79.05±1.35 53.86±1.06
Componet of uronic acid (Mole%)
GalA+GlcA 30.4 22.6
<6-3> 분자량 분석
최적 공정에 따라 조제한 효소 병행 처리 다당분획물의 분자량 분포를 <실시예 3>에서와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, [도 16]에서 보는 바와 같이, 열수 추출물 다당추출물(FGW0)의 경우 분자량이 10K 이상인 고분자 분획이 3개로 400K이하의 다당체의 경우 비교적 넓은 범위의 분자량을 가지는 것으로 보이는 반면, 효소 병행 처리 후 MWCO 50K cassette를 이용하여 UF 처리하였을 경우(B)에는 10K 이상인 고분자 분획이 2개였으며, 10K 이하의 저분자 분획이 약간 제거됨을 확인 할 수 있었다.
<6-4> Raw 264.7 세포의 세포독성 및 nitric oxide 생산능
효소 병행 처리를 이용해 만든 신규 다당 소재의 Raw 264.7 세포에 대한 독성 여부를 확인하기 위하여 <실시예 2-1>에서와 동일한 방법으로 MTT assay를 실시하였다.
그 결과 [도 17]에서 보는 바와 같이, 수삼 다당 시료 FGW0와 FGEz0를 50, 100, 150 ug/mL의 농도로 세포에 처리했을 때, 모든 농도에서 80% 이상의 생존율을 보여 50~150 ug/mL의 농도범위 안에서 세포 독성에 큰 영향을 미치지 않았다. 오히려 모든 농도에서 100% 이상의 생존율을 보여 세포 성장에 도움을 주는 인자가 존재할 가능성을 추측할 수 있었다.
<6-5> Raw 264.7 세포 자극에 의한 cytokine 생산능
효소 병행 처리를 이용해 만든 신규 다당 소재의 Raw 264.7 세포에 대한 cytokine 생산능을 <실시예 2-3>에서와 같이 ELISA 방법으로 측정하였다.
그 결과, IL-6, TNF-α의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. [도 18]에서 보는 바와 같이, IL-6는 모든 시료가 대조군에 비해 높았으며, FGW0에 비해 신규 다당 소재 FGEz0가 모든 농도에서 높은 활성을 보인 것을 확인했다. 특히 신규 다당 소재 FGEz0가 50, 100, 150 ug/mL의 농도에서 각각 169, 363, 1051 pg/mL의 수치를 보였는데 이는 FGW0보다 모든 농도범위에서 2배 이상의 활성 증가를 보였다. 또한 통계처리 결과 모두 유의미한 차이를 보이는 것으로 나타나 효소 병행처리를 통해 얻은 신규 다당소재의 면역 활성이 단순 열추출물(FGW0)에 비해 효과적임을 확인할 수 있었다.
[도 19]에서 보는 바와 같이, TNF-α도 FGW0에 비해 신규 다당 소재 FGEz0가 모든 농도에서 높은 활성을 보인 것을 확인했다. 특히 신규 다당 소재 FGEz0가 50, 100, 150 ug/mL의 농도에서 각각 3340, 3674, 4332 pg/mL의 수치를 보였는데 이는 FGW0보다 모든 농도범위에서 2배 이상의 활성 증가를 보였다. 특히 저 농도에서는 4배 이상의 활성 증가가 나타났는데, 고농도인 150 ug/mL에서 값의 증가가 상대적으로 미약한 것은 시료의 활성이 양성대조군인 LPS에 준하는 수준으로 나타나 활성의 최대 한계수준까지 검출되었기 때문인 것으로 보인다. 저 농도에서 더욱 큰 활성의 증가를 가져온 것은 적은 양의 시료로도 큰 효과를 얻을 수 있는 것으로 판단되며, 이는 산업화하여 소재를 활용할 경우 경제적으로도 긍정적인 평가를 받을 수 있을 것으로 기대된다.
결론적으로 수삼유래 다당은 인체에 유익하다고 여겨지는 면역기능을 자극하는 효과가 있으며, 수삼에 효소의 병행처리를 하여 다당을 분리할 경우, 단순 열수추출 방식에 비해 우수한 면역활성다당을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 순차적으로 처리하는 단계 및 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강 활성을 가진 효소처리 인삼유래 다당분획물 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 다당분획물을 제공한다. 본 발명의 제조방법은 아밀라제 및 셀룰라제를 포함하는 복합효소 처리 공정을 통하여, 면역활성 증가 효과가 우수한 다당분획물을 경제적으로 제조할 수 있으며, 본 발명의 다당분획물은 기존의 인삼 유래 다당에 비하여 면역증강 효과가 우수하므로 면역증강용 식품 제조에 효과적이어서 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (8)

  1. (a) 인삼에 아밀라제 및 셀룰라제를 순차적으로 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물로부터 분자량 10kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 셀룰라제를 12시간 내지 24시간 동안 효소처리 한 후, 아밀라제를 6시간 내지 24시간 동안 효소처리 하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 다당분획물은 분자량 10 kDa 이상 500 kDa이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는
    (b1) 상기 효소 처리된 인삼 가수분해물에서 잔사를 제거하는 단계;
    (b2) 상기 잔사가 제거된 인삼 가수분해물에 유기용매를 넣어 침전된 조다당을 수득하는 단계; 및
    (b3) 상기 조다당으로부터 분자량 10kDa 이상의 분획물을 분리 수득 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인삼은 수삼 또는 백삼으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 증강 활성을 가진 인삼유래 다당분획물.
  7. 제6항의 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물.
  8. 제6항의 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물.
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