CN110128563A - 一种酵素水解滑菇多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种酵素水解滑菇多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种酵素水解滑菇多糖及其制备方法和应用，先用热水萃取经过脱脂处理的滑菇子实体粉末得到水萃液，在水萃液中加入水解酵素进行水解反应，反应完后灭活，最后在水萃液中加入95％的乙醇进行沉淀得到酵素水解滑菇多糖。酵素水解滑菇多糖在抗氧化、抗发炎及促进伤口愈合中的应用。本发明制备的滑菇多糖分子质量小于4500道耳顿(Dalton,Da)，容易被吸收。将制得的多糖用于化妆品中有抗氧化、清除自由基的作用，并且有抗炎，促进伤口愈合的作用。

Description

一种酵素水解滑菇多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种酵素水解滑菇多糖及其制备方法和应用，属于生物提取领域。
背景技术
滑菇(Pholiota nameko)别名珍珠菇，中文学名又叫光帽鳞伞，光滑锈伞、珍珠菇等，属于担子菌纲，伞菌目，丝膜菌科，鳞伞属，在中国和日本被广泛种植用作食品和传统医药，富含多种营养物质，如含有蛋白质含量33～35％、醣类38％以上及多种矿物质和维生素B1、B2，具有一般菇菌的保健功效如抗氧化、抗发炎、免疫调节以及抗癌的作用。生长于初冬群簇腐生于阔叶朽木上，菌伞为金褐色，成熟平展时可达3-10公分，菌伞表面具有黏液，菌柄圆柱状且柄上有黄褐色之菌环。滑菇的菇伞表面含有一层其他菇种没有的黏性物质，滑菇的黏质物质仅出现于子实体，今是利用温度来进行滑菇的生长调控，产菇(子实体)的温度界于6-20℃，温度高于15℃菇伞小、菌柄细长，温度低于8℃缓慢然菇伞较大。
多糖的萃取方法，大多将菇蕈类之菌丝体进行液态发酵培养或直接采用子实体，以热水萃取法、酶萃取或酸碱萃取法等进行萃取，进一步再藉由有机溶剂，如酒精等，进行沉淀以得到多糖。此传统方式所萃取出来之多糖分子质量较大，约为100k道耳顿(Dalton,Da)至1000k道耳顿之间，人体皮肤较无法轻易吸收，应用于添加在化妆品及药物配方中，可能无法使其达到较佳促进伤口癒合和抗皱之功效。
目前在生产小分子多糖的制作过程中，大都利用高浓度有机溶剂淀析后，使初萃物析出粗多糖。之后再添加酸性溶剂或多糖水解酵素于粗多糖以形成混合物，并将混合物进行水解程式及冷冻乾燥程式以得到小分子多糖体。而这些小分子多糖萃取製程较为複杂且花费成本较高，不易进行大量的工业化生产。因此，有必要开发能简化快速萃取制程且成本花费较低的小分子多糖的制备方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种酵素水解滑菇和其制备方法，本发明还提供该种酵素水解滑菇的应用
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种酵素水解滑菇多糖的制备方法，其特征在于；先用热水萃取经过脱脂处理的滑菇子实体粉末得到水萃液，在水萃液中加入水解酵素进行水解反应，反应完后灭活，最后在水萃液中加入95％的乙醇进行沉淀得到酵素水解滑菇多糖。
按照以下步骤制备：
(1)脱脂：滑菇子实体粉末经过醇溶液脱脂处理，脱去脂类、有色物质和小分子物质；
(2)提取：经过脱脂处理的滑菇子实体粉末用热水超声萃取，离心后取上清液得到水萃液；
(3)水解：在水萃液中加入水解酵素，调节pH在7.0-8.0之间，在温度20-40℃下进行水解反应，水解完后灭活；
(4)沉淀：在水解液中加入95％的乙醇沉淀，沉淀完后固液分离得到酵素水解滑菇多糖。
上述方案中：步骤(1)中，用75％～85％醇溶液，在65～75℃下反应6～8小时脱脂。
上述方案中：步骤(2)中热水的温度为95℃以上，萃取时间为2-5h。
上述方案中：步骤(3)中，水解酵素的加入量为水萃液的0.2wt％-1wt％，水解反应时间为1-3h。
上述方案中：灭活的温度为95℃以上。
上述方案所制备得到的酵素水解滑菇多糖。
所制备得到的酵素水解滑菇多糖在抗氧化、抗发炎及促进伤口愈合中的应用。
有益效果：本发明制备的滑菇多糖分子质量小于4500道耳顿(Dalton,Da)，容易被吸收。将制得的多糖用于化妆品中有抗氧化、清除自由基的作用，并且有抗炎，促进伤口愈合的作用。
附图说明
图1为水解滑菇多糖和滑菇多糖体外抗氧化ABTS实验结果图。
图2为水解滑菇多糖和滑菇多糖螯合亚铁离子实验结果图。
图3为水解滑菇多糖和滑菇多糖细胞存活率结果实验图。
图4为水解滑菇多糖和滑菇多糖细胞增殖实验结果图。
图5为水解滑菇多糖和滑菇多糖促进伤口愈合实验结果图。
图6为水解滑菇多糖和滑菇多糖抑制NO浓度实验结果图。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
滑菇多糖粗品制备
(1)脱脂：取滑菇子实体冷冻干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g与1000mL80％(体积浓度)乙醇溶液混合，65～75℃下回流6小时脱脂，去除脂类、低聚糖色素和小分子物质，过滤取固体。
(2)提取：经过脱脂处理的滑菇子实体粉末用2000mL95℃以上热水超声萃取5h，离心后取上清液得到水萃液。
(3)在水解液中加入体积浓度为95％的乙醇沉淀，乙醇与水萃液的体积比为3:1，沉淀完后固液分离得到滑菇多糖粗品(以下简称CRUDE)，分子量为300k道耳顿(Dalton,Da)。
实施例2
酵素水解滑菇多糖的制备
(1)脱脂：取滑菇子实体冷冻干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g与1000mL75％(体积浓度)乙醇溶液混合，65～75℃回流8小时脱脂，去除脂类、低聚糖色素和小分子物质，过滤取固体。
(2)提取：经过脱脂处理的滑菇子实体粉末用2000mL95℃以上热水超声萃取2h，离心后取上清液得到水萃液。
(3)水解：在水萃液中加入0.2wt％水解酵素，调节pH为7.0-8.0之间，在温度40℃下水解反应1h，水解完后在95℃以上灭活。
(4)沉淀：在水解液中加入95％的乙醇沉淀，水萃液与加入的乙醇的体积比为1:3。沉淀完后固液分离得到酵素水解滑菇多糖(以下简称EH)，分子量小于4500道耳顿(Dalton,Da)。
实施例3
酵素水解滑菇多糖的制备
(1)脱脂：取滑菇子实体冷冻干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g与1000mL80％(体积浓度)乙醇溶液混合，65～75℃回流6小时脱脂，去除脂类、低聚糖色素和小分子物质，过滤取固体。
(2)提取：经过脱脂处理的滑菇子实体粉末用2000mL95℃以上热水超声萃取5h，离心后取上清液得到水萃液。
(3)水解：在水萃液中加入1wt％水解酵素，调节pH为7.0-8.0之间，在温度20℃下水解反应3h，水解完后在95℃以上灭活。
(4)沉淀：在水解液中加入95％的乙醇沉淀，水萃液与加入的乙醇的体积比为1:3。沉淀完后固液分离得到酵素水解滑菇多糖(以下简称EH)，分子量小于4500道耳顿(Dalton,Da)。
实施例4
酵素水解滑菇多糖的制备
(1)脱脂：取滑菇子实体冷冻干燥至含水量低于5％，粉碎后取100g与1000mL85％(体积浓度)乙醇溶液混合，65～75℃回流7小时脱脂，去除脂类、低聚糖色素和小分子物质，过滤取固体。
(2)提取：经过脱脂处理的滑菇子实体粉末用2000mL95℃以上热水超声萃取4h，离心后取上清液得到水萃液。
(3)水解：在水萃液中加入0.5wt％水解酵素，调节pH为7.0-8.0之间，在温度30℃下水解反应3h，水解完后在95℃以上灭活。
(4)沉淀：在水解液中加入95％的乙醇沉淀，水萃液与加入的乙醇的体积比为1:3。沉淀完后固液分离得到酵素水解滑菇多糖，分子量小于4500道耳顿(Dalton,Da)。
实施例5
分别秤取ABTS(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)粉末及过硫酸钾分别用水溶解，将ABTS溶液以及过硫酸钾溶液以1:1的体积比混合反应12-16小时，得到ABTS反应试剂。
配置不同浓度(0-6mg/ml)CRUDE以及EH(实施例3制备的)样品溶液，在96孔盘中加入20μl样品溶液后，加入180μl ABTS反应试剂，均匀混合后，进行避光反应6min，最后以分光光度计在波长734nm中检测吸光值。
精密秤量0.1g l-抗坏血酸溶解于10ml ddH2O，依序稀释成0、0.625、1.25、2.5mg/ml浓度之维生素C溶液并以上述方法進行，为正向控制组。
清除率％＝[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100
其中Acontrol＝对照的吸光度(包含除测试化合物外的所有试剂)
Asample＝样品的吸光度(包含所有试剂，包括测试化合物)，
Vitamin C用作阳性对照。
测试结果如图1所示，从图1中可以看出，对于ABTS，EH之IC50约为2.85mg/mL。
实施例6
螯合亚铁
将等体积之不同浓度样品溶液(配置不同浓度(0-6mg/ml)CRUDE以及EH(实施例3制备的)样品溶液)与2mM FeCl2·4H2O混合，加入5mM菲洛嗪(ferrozine)，晃动混合物，反应10分钟后，用分光光度法在562nm处测量所得溶液的吸光度。使用下式计算ferrozine–Fe2+复合物形成的抑制百分比：
螯合效应％＝[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100
其中Acontrol＝对照的吸光度(包含除测试化合物外的所有试剂)
Asample＝样品的吸光度(包含所有收集，包括测试化合物)
EDTA-2Na用作阳性对照。
测试结果如图2所示，从图2中可以看出，EH之IC50约为0.48mg/mL
可以得出水解滑菇多糖可以有效消除细胞自由基受到的氧化损伤，促使细胞增生进而达到伤口愈合。
实施例7
细胞存活率实验
将小鼠成纤维细胞L929种于96孔盘中隔夜培养，以不同浓度的CRUDE以及EH样品处理细胞24h，未处理当对照组。加入100μL 0.5mg/ml四唑盐(MTT)培养2小时，移除培养上清液，再加入200μL DMSO溶出甲臜formazan结晶。使用ELISA reader侦测570nm的吸光值。
将小鼠成纤维细胞L929种于96孔盘中隔夜培养，以不同浓度的CRUDE以及EH样品处理细胞24h，未处理当对照组。于24小时培养后，再以1.0mmol/L H2O2处理24小时，并以MTT测定分析细胞存活率。
测试结果如图3所示，测试不同浓度酵素水解滑菇多糖与H2O2处理L929细胞之存活率试验。此结果显示，未给予滑菇多糖防护的L929细胞存活率明显下降，而在给予不同浓度滑菇多糖条件下，浓度越高其抵抗H2O2的L929细胞存活率效果越佳，滑菇多糖为一种能有效抵抗L929细胞受到氧化损伤的机能性成分物质。本发明以酵素水解滑菇多糖并不会对细胞造成毒害且具有保护H2O2自由基攻击的作用，显示其对于化妆品保养品之应用开发应无安全上之疑虑。而相同浓度下，CRUDE抵抗H2O2的L929细胞存活率效果低于EH。
实施例8
细胞增殖
將L929种于96孔盘隔夜培养，以不同浓度的CRUDE以及EH樣品处理细胞48小時，未处理当对照组。加入100μL 0.5mg/ml MTT培养2小时，移除培养上清液，再加入200μL DMSO溶出formazan结晶。使用ELISA reader侦测570nm的吸光值。
测试结果如图4所示，随着酵素水解滑菇多糖样品浓度增加，L929增生效果越佳，显示本样品可促进纤维细胞增生，达到促进伤口愈合之效果。而相同浓度下，CRUDE促进纤维细胞增生的效果低于EH。
实施例9
伤口愈合实验
将L929细胞(105个细胞/ml)接种到24孔板的每个孔中，并在37℃和5％CO2下孵育。在形成汇合的单层L929细胞后，用无菌移液管尖端水平划痕在每个孔中产生划痕。用PBS洗涤除去细胞碎片，并加入CRUDE以及EH样品。其中，样品浓度均为500μg/mL，显示在相同浓度下经过相同时间，酵素水解后的多糖体具有较优于EH的伤口愈合效果，该浓度的选择是依据细胞存活率的结果所设定，在第0天使用显微照片拍摄照片，然后将板在37℃下与5％CO2培养24h，并测量愈合区域的百分比。
实验结果如图5所示，经24小时后，酵素水解滑菇多糖具有促使细胞癒合的情形，可有效抵抗L929细胞受到氧化损伤，抑制发炎产生的组织损伤，促使细胞增生进而达到伤口癒合。
实施例10
NO生成实验
将巨噬细胞RAW264.7接种在96孔板中，并加入不同浓度的CRUDE以及EH样品和脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导(此试验以LPS诱导)，在37℃温育18小时，使用Griess法测量NO产生量。
实验结果如图6所示，NO为细胞发炎时的产物，会造成组织细胞损伤，进一步延缓伤口癒合速度，图表显示，滑菇粗多糖都有抑制NO浓度的效果，但酵素水解的滑菇多糖的效果比粗萃取多糖效果的更佳。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种酵素水解滑菇多糖的制备方法，其特征在于；先用热水萃取经过脱脂处理的滑菇子实体粉末得到水萃液，在水萃液中加入水解酵素进行水解反应，反应完后灭活，最后在水萃液中加入95％的乙醇进行沉淀得到酵素水解滑菇多糖。
2.根据权利要求1所述酵素水解滑菇多糖的制备方法，其特征在于，按照以下步骤制备：
(1)脱脂：滑菇子实体粉末经过醇溶液脱脂处理，脱去脂类、有色物质和小分子物质；
(2)提取：经过脱脂处理的滑菇子实体粉末用热水超声萃取，离心后取上清液得到水萃液；
(3)水解：在水萃液中加入水解酵素，调节pH在7.0-8.0之间，在温度20-40℃下进行水解反应，水解完后灭活；
(4)沉淀：在水解液中加入95％的乙醇沉淀，沉淀完后固液分离得到酵素水解滑菇多糖。
3.根据权利要求2所述酵素水解滑菇多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，用75％～85％醇溶液，在65℃～75℃下反应6～8小时脱脂。
4.根据权利要求3所述酵素水解滑菇多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，热水的温度为95℃以上，萃取时间为2-5h。
5.根据权利要求2-4任一项所述酵素水解滑菇多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，水解酵素的加入量为水萃液的0.2wt％-1wt％，水解反应时间为1-3h。
6.根据权利要求5所述酵素水解滑菇多糖的制备方法，其特征在于：灭活的温度为95℃以上。
7.一种权利要求1-6任一项所制备得到的酵素水解滑菇多糖。
8.权利要求1-6任一项所制备得到的酵素水解滑菇多糖在抗氧化、抗发炎及促进伤口愈合中的应用。
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