CN113288831B - 灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途及其护肤品或化妆品 - Google Patents

灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途及其护肤品或化妆品 Download PDF

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Abstract

本发明“灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途及其护肤品或化妆品”属于植物提取及化妆品或类似梳妆用配制品领域。本发明一方面提供灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途，还提供灵芝或人参在抗自由基、或，调控抗菌肽、或，降低黑色素方面的用途。另一方面本发明提供基于灵芝/人参双向发酵产物的化妆品或护肤品。本发明的灵芝‑人参双向发酵产物对ABTS清除率高达98.58％，DPPH清除率为95.98％，对UVB辐照引起LL‑37有促进作用，对UV引起的IL‑1α分泌水平也有一定程度的降低，同时对UV引起的PGE2分泌和黑素细胞B16F10的黑色素含量均有显著的抑制作用。

Description

灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途及其护肤 品或化妆品
技术领域
本发明属于植物提取及化妆品或类似梳妆用配制品领域，具体涉及灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途及其护肤品或化妆品。
背景技术
双向发酵技术是指用真菌为发酵菌种，利用药材或药渣作为药性基质共同构成发酵组合进行发酵的方式。双向发酵后菌质相比于原药材主要有几个方面的效果：增强药效，扩大用途。“双向发酵工程”展示了药用真菌(含其它真菌)与中药材的有机结合，很好的克服了野生药用植物利用的难题。
灵芝(Ganoderma lucidum)被称为“扶正固本，滋补强壮”的珍贵中药材，属多孔菌科药用真菌，一直被用作治疗肝病、高胆固醇、高血脂等疾病。灵芝中主要抗氧化活性成分被认为是灵芝三萜与灵芝多糖。灵芝多糖还能显著促进细胞核内DNA合成功能，并可促进细胞的分裂，从而起到延缓衰老的作用，并具有增强免疫力的作用。灵芝分为三个生长阶段：孢子、菌丝、子实体，灵芝菌作为第二生长阶段，近年来灵芝菌丝体与发酵液的充分利用，为灵芝开发了一条新的应用途径。
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是五加科、人参属多年生草本植物。人参的肉质根为强壮滋补药，适用于调整血压、恢复心脏功能、神经衰弱及身体虚弱等症，也有祛痰、健胃、利尿、兴奋等功效。人参的茎、叶、花，果以及加工副产品都是轻工业的原料，可加工出诸如含有人参成分的烟、酒、茶、晶、膏等商品。
自然界真菌约有40万种，其中高等真菌数千种，现有供药用与食用的真菌达数百种，已知真菌的酶类近400种，不同种类真菌的酶系统有所不同，而中药材目前达一万种左右不同种类的成分也有不同。如果双方交叉组合可能构成大量不同的发酵组合，可产生几乎是无限量的、成分、性质不同的“菌质”这些不同发酵组合产生的菌质各具一定的变化特色，可据既定的临床治疗目标用相应的免疫、药效等指标进行筛选，可获得具有一定功效的发酵产品，再对选定的品种作进一步研究，开发成新型真菌产品。
有关灵芝或人参在抗PGE2等炎症因子方面的应用和研究，本领域目前尚未见报道。
发明内容
基于本领域的上述空白，本发明提供灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途及其护肤品或化妆品。本发明通过新型双向发酵技术，将人参与灵芝菌配伍进行发酵，提供一种具有抗光(UVB)损伤的中药组合物双向液体发酵技术和应用。
本发明的技术方案如下：
灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途。
所述炎症因子选自PGE2或IL-1α。
所述抗炎症因子产品的活性成分为灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得的灵芝人参双向发酵产物；
优选地，所述人参与培养基的添加用量比例为：1.0g∶90ml；
优选地，所述发酵指将灵芝菌的二级种子液接种至发酵培养基进行发酵培养；
优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述灵芝菌的二级种子液指将灵芝菌活化培养物接种于种子培养基中进行一级培养得到的一级种子液再接种于种子培养基中进行二级培养得到；
优选地，所述种子培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述发酵培养、一级培养、二级培养的条件均为28℃、150r/min培养7天；
优选地，所述灵芝菌活化培养物指将原始灵芝菌株接入平面培养基中活化培养所得；
优选地，所述平面培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L，其余为水；
优选地，所述活化培养指30℃恒温培养7天；
优选地，所述原始灵芝菌株为灵芝Ganodermalingzhi菌株CICC 14023；
优选地，所述灵芝人参双向发酵产物中灵芝三萜含量为0.17780mg/mL，灵芝多糖含量为9.882mg/mL。
灵芝或人参在抗自由基、或，调控抗菌肽、或，降低黑色素方面的用途。
所述自由基选自ABTS或DPPH；
优选地，所述抗菌肽选自人抗菌肽，进一步优选抗菌肽LL-37；
优选地，所述降低黑色素指降低黑素细胞B16F10的黑色素含量；
优选地，所述调控抗菌肽指正向调控抗菌肽。
一种护肤品或化妆品，其特征在于，活性成分包括：灵芝人参双向发酵产物；所述灵芝人参双向发酵产物为灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得。
所述灵芝人参双向发酵产物的灵芝三萜含量为0.17780mg/mL，灵芝多糖含量为9.882mg/mL。
所述灵芝人参双向发酵产物通过抗炎症因子、或，抗自由基、或，调控抗菌肽、或，降低黑色素降低UV损伤；
优选地，所述护肤品或化妆品还包括辅料；
优选地，所述灵芝人参双向发酵产物为灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得的发酵液的冻干粉；
优选地，所述人参与培养基的添加用量比例为：1.0g∶90ml；
优选地，所述灵芝人参双向发酵产物抗炎症因子、或，抗自由基、或，调控抗菌肽、或，降低黑色素的起效浓度为0.0781-0.1563mg/mL优选0.1563mg/mL冻干粉溶液。
一种护肤品或化妆品的制备方法，其特征在于，将灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得的灵芝人参双向发酵产物做为活性物质。
所述人参与培养基的添加用量比例为：1.0g∶90ml；
优选地，所述发酵指将灵芝菌的二级种子液接种至发酵培养基进行发酵培养；
优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述灵芝菌的二级种子液指将灵芝菌活化培养物接种于种子培养基中进行一级培养得到的一级种子液再接种于种子培养基中进行二级培养得到；
优选地，所述种子培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述发酵培养、一级培养、二级培养的条件均为28℃、150r/min培养7天；
优选地，所述灵芝菌活化培养物指将原始灵芝菌株接入平面培养基中活化培养所得；
优选地，所述平面培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L，其余为水；
优选地，所述活化培养指30℃恒温培养7天；
优选地，所述原始灵芝菌株为灵芝Ganodermalingzhi菌株CICC 14023。
本发明制备了灵芝-人参双向发酵液，并检测灵芝-人参发酵液对自由基的清除率，同时检测灵芝-人参双向发酵液的细胞毒性，并进行灵芝-人参双向发酵液抗UVB光损伤研究。经实验验证，灵芝-人参双向发酵产物的冻干粉在0.156mg/mL时，对UVB辐照引起PGE2的分泌有显著抑制作用(p<0.05)，具有一定的抗光(UVB)损伤功效。本发明的灵芝-人参双向发酵产物对ABTS清除率高达98.58％，DPPH清除率为95.98％；本发明的灵芝-人参双向发酵产物对UVB辐照引起LL-37有促进作用，对UV引起的IL-1α分泌水平也有一定程度的降低，同时对UV引起的黑素细胞B16F10的黑色素含量有显著的抑制作用。
附图说明
图1为本发明实验例部分的灵芝三萜标准曲线。
图2为本发明实验例部分的葡萄糖标准曲线。
图3为本发明实验例部分的不同浓度冻干粉1处理的细胞存活率曲线图。
图4为本发明实验例部分的不同浓度冻干粉1处理的细胞形态学检测结果，其中第二行最右侧图的SC代表空白对照。
图5为本发明实验例部分不同组别处理的IL-1α含量变化趋势图。
图6为本发明实验例部分不同组别处理的PGE2含量变化趋势图。
图5和图6中，用t-test方法进行统计分析时，#表示与BC对比，p<0.05；##表示与BC对比，p<0.01；*表示与NC对比，p<0.05；**表示与NC对比，p<0.01；BC代表空白对照组，即细胞样品中不加入任何物质不做任何处理；NC代表阴性对照组，即细胞样品中不添加任何物质仅进行UV处理；PC代表阳性对照组，即细胞样品中添加地塞米松进行UV处理；冻干粉1代表细胞样品中添加了本发明的灵芝人参双向发酵产物进行UV处理。
图7为本发明实验例部分不同组别对HaCaT细胞中LL-37分泌的影响；其中，##表示与BC对比，p<0.01；
BC代表空白对照组，即细胞样品中不加入任何物质不作任何处理；NC代表阴性对照组，即细胞样品中不添加任何物质仅进行UV处理；冻干粉1代表细胞样品中添加了本发明的灵芝人参双向发酵产物进行UV处理。
图8为本发明实验例部分不同浓度PGE-2对黑素细胞B16F10黑色素含量影响。
图9为本发明实验例部分不同组别对黑素细胞B16F10黑色素含量影响；其中#表示与BC对比，p<0.05；**表示与NC对比，p<0.01；
BC代表空白对照组，即细胞样品中不加入任何物质不作任何处理；NC代表阴性对照组，即细胞样品中不添加任何物质仅进行UV处理；冻干粉1代表细胞样品中添加了本发明的灵芝人参双向发酵产物进行UV处理。
具体实施方式
下面结合具体实施例、附图和实验例对本发明的详细内容做进一步描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源
灵芝菌株(Ganodermalingzhi)编号为CICC 14023，来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心；
人参、HaCaT细胞、黑素细胞B16F10均可商购获得。
第1组实施例、本发明灵芝/人参的抗炎新用途
本组实施例提供灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途。
在一些实施例中，所述炎症因子选自PGE2或IL-1α。
在另一些实施例中，所述抗炎症因子产品的活性成分为灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得的灵芝人参双向发酵产物；
在具体的实施例中，所述人参与培养基的添加用量比例优选为：1.0g∶90ml。
优选地，所述发酵指将灵芝菌的二级种子液接种至发酵培养基进行发酵培养；
优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述灵芝菌的二级种子液指将灵芝菌活化培养物接种于种子培养基中进行一级培养得到的一级种子液再接种于种子培养基中进行二级培养得到；
优选地，所述种子培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述发酵培养、一级培养、二级培养的条件均为28℃、150r/min培养7天；
优选地，所述灵芝菌活化培养物指将原始灵芝菌株接入平面培养基中活化培养所得；
优选地，所述平面培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L，其余为水；
优选地，所述活化培养指30℃恒温培养7天；
优选地，所述原始灵芝菌株为灵芝Ganodermalingzhi菌株CICC 14023；
优选地，所述灵芝人参双向发酵产物中灵芝三萜含量为0.17780mg/mL，灵芝多糖含量为9.882mg/mL。
第2组实施例、本发明灵芝/人参抗自由基等新用途
本组实施例提供灵芝或人参在抗自由基、或，调控抗菌肽、或，降低黑色素方面的用途。
在一些实施例中，所述自由基选自ABTS或DPPH；
优选地，所述抗菌肽选自人抗菌肽，进一步优选抗菌肽LL-37；
优选地，所述降低黑色素指降低黑素细胞B16F10的黑色素含量；
优选地，所述调控抗菌肽指正向调控抗菌肽。
第3组实施例、本发明的护肤品/化妆品
本组实施例提供一种护肤品或化妆品，其特征在于，活性成分包括：灵芝人参双向发酵产物；所述灵芝人参双向发酵产物为灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得。
在具体的实施例中，所述人参与培养基的添加用量比例优选为：1.0g∶90ml。
在一些实施例中，所述灵芝人参双向发酵产物的灵芝三萜含量为0.17780mg/mL，灵芝多糖含量为9.882mg/mL。
在另一些实施例中，所述灵芝人参双向发酵产物通过抗炎症因子、或，抗自由基、或，调控抗菌肽、或，降低黑色素降低UV损伤；
优选地，所述护肤品或化妆品还包括辅料。
在具体的实施例中，所述辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
优选地，所述灵芝人参双向发酵产物为灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得的发酵液的冻干粉；
在具体的实施例中，所述人参与培养基的添加用量比例优选为：1.0g∶90ml。
优选地，所述灵芝人参双向发酵产物抗炎症因子、或，抗自由基、或，调控抗菌肽、或，降低黑色素的起效浓度为0.0781-0.1563mg/mL优选0.1563mg/mL冻干粉溶液。
第4组实施例、本发明护肤品/化妆品的制备方法
本组实施例提供一种护肤品或化妆品的制备方法。将灵芝菌在添加有人参的培养基中发酵所得的灵芝人参双向发酵产物做为活性物质。
在具体的实施例中，所述人参与培养基的添加用量比例优选为：1.0g∶90ml。
在具体的实施例中，所述发酵指将灵芝菌的二级种子液接种至发酵培养基进行发酵培养；
优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述灵芝菌的二级种子液指将灵芝菌活化培养物接种于种子培养基中进行一级培养得到的一级种子液再接种于种子培养基中进行二级培养得到；
优选地，所述种子培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水；
优选地，所述发酵培养、一级培养、二级培养的条件均为28℃、150r/min培养7天；
优选地，所述灵芝菌活化培养物指将原始灵芝菌株接入平面培养基中活化培养所得；
优选地，所述平面培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L，其余为水；
优选地，所述活化培养指30℃恒温培养7天；
优选地，所述原始灵芝菌株为灵芝Ganodermalingzhi菌株CICC 14023。
实验例、本发明灵芝/人参双向发酵产物的制备及其效果验证
第一部分：制备灵芝-人参双向发酵物
1、培养基的配制：
1.1、菌种来源：灵芝菌株(Ganodermalingzhi)编号为CICC 14023，来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.2、平面培养基：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L，蒸馏水100mL，121℃下灭菌20min。
1.3、种子培养基：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，蒸馏水100mL，121℃下灭菌20min。
1.4、发酵培养基：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，蒸馏水100mL，121℃下灭菌20min。
1.5、灵芝菌种活化:将第一代灵芝菌CICC 14023菌丝接入1.2配制的培养基，放置于30℃恒温培养箱中培养7天左右。
1.6、灵芝菌一级种子液培养：切取2个平面培养基中的琼脂块(d＝1.0cm)，接入装有100mL灵芝菌液体种子培养基的250mL锥形瓶中，放置于28℃、150r/min的恒温摇床中培养7天，即得灵芝菌的一级种子液。
1.7、灵芝菌二级种子液培养：吸取10mL一级种子液，再接种到液体培养基(即1.3所述的种子培养基)中，28℃、150rpm条件下培养7天。
1.8、灵芝菌发酵：根据1.4配置发酵培养基，用蒸馏水定容至900mL，分装于250mL锥形瓶中，每瓶90mL，在向其中分别称量加入1.0g的人参粉并封口，121℃灭菌20min，冷却后备用。取二级种子液10mL接种于液体发酵培养基中，在28℃，150rpm条件下进行液体发酵7天。
1.9、收集发酵液：将步骤1.8的发酵液进行过滤，发酵结束后，取8层纱布过滤，得到菌丝体，烘干并称重。
2、三萜含量检测(高氯酸显色法)
2.1、样品处理：将样品(即上述1.9步骤收集得到的发酵液)摇匀后取1.0mL，加入9.0mL的蒸馏水稀释；
2.2、柱层析：用10mL注射器作层析管，内装3cm高的Amberlite-XAD-2大孔树脂，先用25mL70％乙醇洗柱，弃去洗脱液，再加入1.0cm中性氧化铝。用25mL70％乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25mL去离子水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL待测样品，用25mL去离子水洗柱，弃去洗脱液，用25mL70％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，以此作显示用。
2.3、灵芝三萜的标准曲线制作：分别吸取人参皂苷Re标准溶液(2.0mg/mL)25μL、50μL、100μL、150μL、200μL，置于60℃水浴蒸发挥干。此处是采用人参皂苷Re作为标准品，对灵芝三萜进行检测。
2.4、显色：在已蒸发挥干的蒸发皿中加入0.2mL5％香草醛冰乙酸溶液，使蒸发皿上的残渣全部溶解，再加入0.8mL高氯酸溶液，混匀后加入到10mL的EP管中，60℃水浴10min，取出，用凉水冷却后，准确加入冰乙酸5.0mL，于560nm波长处用酶标仪进行测定。
3、多糖含量检测
3.1、葡萄糖标准曲线的制作：精密称取标准葡萄糖50.00mg，用蒸馏水进行溶解，混匀后转移至50mL容量瓶中，并以蒸馏水进行定容，定容后的溶液为1mg/mL。之后将1mg/mL标准葡萄糖溶液稀释为0.2mg/mL的标准葡萄糖溶液，再分别准确吸取0.2mg/mL标准葡萄糖溶液50、100、200、300、400、500μL并分别补水至2mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，震荡摇匀后加入5.0mL浓硫酸混匀，放入沸水中反应30min。反应结束后，放入冷水中冷却至室温，在490nm处用酶标仪测量其吸光度值。
3.2、发酵液多糖含量的测定：吸取稀释后的样品2.0mL，然后加入1.0mL5％苯酚，震匀，再加入5.0mL浓硫酸混匀，放入沸水浴中反应30min，反应结束后，放入冷水中冷却至室温，在490nm处用酶标仪测量其吸光度值，根据葡萄糖标准溶液曲线计算其多糖含量。
4、实验结果
4.1、菌丝体指标检测：菌丝体干重51.87g，菌丝体得率13.31％。
4.2、灵芝三萜标准曲线建立
标准曲线见图1。
图1所示为相应的标准曲线，其中线性回归方程为：y＝1.3867x-0.013，R2为0.998，有较好的线性相关性，因此可以用此方程计算灵芝三萜化合物的含量。
检测出未加人参的发酵液的灵芝三萜含量为0.11430mg/mL，而加人参的发酵液的灵芝三萜含量为0.17780mg/mL，加入人参后，灵芝三萜含量显著提升。
4.3、灵芝多糖标准曲线建立
标准曲线见图2。
图2所示为相应的标准曲线，其中线性回归方程为：y＝16.89x+0.0273，R2为0.9977，有较好的线性相关性，因此可以用此方程计算灵芝多糖的含量。
检测出未加人参的发酵液的多糖含量为9.787mg/mL，而加人参的发酵液的多糖含量为9.882mg/mL，加入人参后，灵芝多糖的含量有一定提升。
第二部分：将第一部分得到的发酵液进行抗自由基检测
1、ABTS清除率检测
1.1、储备液1(7mMABTS水溶液)：精密称取0.03841g ABTS，溶解定容于10mL水中；
1.2、储备液2(2.45mM K2S2O8水溶液)：精密称取0.0662g K2S2O8，溶解定容于100mL水中；
1.3、母液：将储备液1和储备液2等体积混合，低温避光反应12～16h；
1.4、ABTS·工作液：将母液用无水乙醇(水)稀释至OD734＝0.7±0.02，现用现配。
1.5、实验步骤：按下表加入各试剂
样品 水 ABTS试剂
实验组(A) 0.2mL --- 0.8mL
空白组(A0) --- 0.2mL 0.8mL
室温条件下避光反应30min，用酶标仪测定其在734nm下的吸光值。
清除率(％)＝[(A0-A)/A0]*100％。
2、DPPH清除率检测
2.1、DPPH乙醇溶液的配置：称取2mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于25mL容量瓶中，0-4℃下避光保存，现配现用，4h内有效。
2.2、实验步骤：按下表加入各试剂
编号 DPPH溶液 无水乙醇 待测液 总体积
A 1mL —— 1mL 2mL
B 1mL 1mL —— 2mL
C —— 1mL 1mL 2mL
反应30min后，在517nm下测吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[(B+C)-A]/B。
3、检测结果：
灵芝-人参发酵液对ABTS清除率为98.58％，对DPPH清除率为95.98％。
第三部分：将第一部分得到的发酵液进行细胞毒性、形态学、炎症因子、抗菌肽LL-37、黑色素含量检测
将第一部分制得的发酵液制成冻干粉以便后续检测，其命名为冻干粉1。
1、实验方法
(1)细胞毒性检测
1.细胞接种：按1×104个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.实验分组：实验设置调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
3.配液：按测试浓度设定表配制不同浓度的受试物工作液。2)储备液2(2.45mMK2S2O8水溶液)：精密称取0.0662g K2S2O8，溶解定容于100mL水中；
表1测试浓度设定表
4.给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL的培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度受样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL的细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养。
5.检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL，现配现用)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。
6.细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力(％)＝OD样品/OD空白*100％。
(2)形态学检测
1.细胞接种：按4.5×104个/孔的密度接种细胞至24孔板中，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.配液：根据MTT检测结果，选取细胞活力拐点附近浓度，进行形态学观察，确定检测样品的形态学观察浓度。
3.给药：待24孔板细胞铺板率达到40％～60％时，进行给药。样品组加入含相应浓度样品的细胞培养液，溶剂对照组加入细胞培养液，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育培养24h。
4.形态观察：孵育结束后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照(20×)。
(3)炎症因子检测
1.接种：按2.5×105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.配液：按照测试分组配置受试物工作液。
表2测试分组
3.给药：根据表2测试分组，待6孔板中细胞铺板率达到30％～40％时，进行分组给药，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔。37℃，5％CO2培养箱继续培养24h。
4.UVB辐照：给药24h后，弃掉培养液，并在每孔加入1mL PBS溶液，清洗细胞，重复清洗3次。按测试分组对样品组、阴性对照组和阳性对照组)分别进行UVB辐照(辐照剂量为300mJ/cm2)。
5.后孵育及收集上清液：UVB辐照结束后，每孔加入1mL PBS溶液清洗，重复3次，清洗结束后，每孔加入2mL细胞培养液，培养24h后，收集细胞培养上清液于EP管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。
6.IL-1α和PGE2含量检测：根据人IL-1αELISA和PGE2 ELISA试剂盒的操作说明书进行ELISA检测。
(4)抗菌肽LL－37检测
1.接种：按3×105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.配液：第1组为空白对照，只有细胞(不做任何处理)
第2组为辐照组UVB照射
第3组为样品组UVB照射后加不同提取物
3.当HaCaT细胞融合达80％～90％时，吸去培养液后，用PBS冲洗两次，再加适量的PBS覆盖细胞，进行UVB辐射。结束后立即吸去孔板中的PBS缓冲液，再分别加入适量无血清培养基或样品溶液，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养24h后收集上清液，用ELISA试剂盒检测LL－37的表达量。
(5)黑色素含量检测
5.1、冻干粉1对B16-F10细胞存活率的影响
采用CCK-8法测定B16-F10细胞活率。收集对数生长期B16细胞，接种于96孔培养板，培养过夜。分别加入终浓度为1mg/mL、0.5mg/mL的冻干粉1和10μM、20μM、40μM、80μM、100μM的PGE-2对照品溶液。以未处理组做为细胞对照组，每组设3个复孔，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养36小时，培养结束后，加入CCK-8继续孵育1小时，M3读板仪于450nm波长测定各孔吸光度值。
细胞活率＝(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)*100％
5.2、PGE-2对黑色素肿瘤细胞B16F10中黑色素含量的影响
取对数生长期B16F10细胞，接种于24孔板，培养过夜。分别加入终浓度为最大细胞无毒时的浓度为最终上样浓度。培养36小时后，弃掉培养基，PBS洗涤1次，加入50uL胰酶，消化细胞。收集细胞，4℃、1000转离心5分钟。加入PBS洗涤1次，加入150ul的1M NaOH(10％DMSO)，放入80℃水浴30分钟，取上清液加入96孔板，M3读板仪于475nm读取吸光度值。
黑色素含量变化＝[OD值/所对应的蛋白含量]/[空白对照OD值/所对应的蛋白含量]
5.3、灵芝发酵液组合物对炎症后色素沉着影响
造模：取2瓶对数生长期B16F10细胞，进行传代。其中传代后的细胞瓶中2瓶细胞加入含10uM PGE-2的培养基、另外2瓶加入无PGE-2的培养基。置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养24h进行铺板。
铺板：将造模后的细胞与未造模后的细胞分别接种于24孔板(每孔10万个细胞)，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养12h后进行加药。
加药：分别加入终浓度为最大细胞无毒时的浓度为最终加药浓度，以无PGE-2的培养基作为空白对照，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养12h培养36小时后检测黑色素含量。
黑色含量测定：培养36小时后，弃掉培养基，PBS洗涤1次，加入50μL胰酶，消化细胞。收集细胞。加入PBS洗涤1次，加入1M NaOH(10％DMSO)，放入80℃水浴30分钟，取上清液加入96孔板，M3读板仪于475nm读取吸光度值。
黑色素含量＝(样品OD/空白OD)*100％
(6)结果统计分析
测试结果采用GraphPad Prism Program软件作图，样品组与阴性对照组比较，采用t-test统计分析，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。
2、实验结果
(1)细胞毒性检测
样品设定8个给药浓度，在角质形成细胞上开展细胞毒性检测实验，MTT检测结果见表3，细胞活力变化趋势如图3所示。
表3冻干粉1检测结果
以发酵液冻干粉所选8个浓度为横坐标，细胞相对活力值为纵坐标，绘制细胞相对活力曲线，如图3所示。
基于MTT测试结果，选择5个浓度进行形态学检测，形态学检测结果如图4所示。
根据MTT结果和形态学结果，样品冻干粉1在0.1563mg/mL的浓度范围内无细胞毒性。
(2)炎症因子检测结果
1.IL-1α测试结果
依据ELISA试剂盒说明书，开展IL-1α含量的检测，检测结果如表4所示，变化趋势如图5所示。
表4 IL-1α检测结果
与空白对照组(BC)相比，NC组的IL-1α含量极显著升高(p<0.01)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与NC组相比，PC组IL-1α分泌水平极显著降低(p<0.01)，表明本次阳性对照检测有效。与NC组相比，冻干粉1组的IL-1α分泌水平也有一定程度的降低。
2.PGE2测试结果
依据试剂盒说明书，开展PGE2含量的检测，检测结果如表5所示，变化趋势如图6所示。
表5 PGE2检测结果
与空白对照组(BC)相比，NC(造模)组的PGE2分泌水平极显著升高(p<0.01)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与NC组相比，PC组PGE2分泌水平极显著降低(p<0.01)，表明本次阳性对照检测有效。
与NC组相比，冻干粉1在0.156mg/mL时对UVB辐照引起PGE2的分泌有显著抑制作用(p<0.05)。
(3)抗菌肽LL-37检测结果
依据ELISA试剂盒说明书，开展LL-37含量的检测，检测结果如表6所示。
表6冻干粉1对HaCaT细胞中LL-37分泌的影响
如图7所示，与空白对照组(BC)相比，NC(造模组)组的PGE2分泌水平极显著升高(p<0.01)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与NC组相比，冻干粉1对UVB辐照引起LL-37有促进作用。
(4)黑色素含量检测
4.1、PGE-2对B16F10细胞存活率的影响
表7 PGE-2对黑素细胞B16F10细胞存活率的影响
PGE-2对B16F10细胞的细胞活力的影响进行测定，结果显示，PGE-2对B16F10细胞无细胞毒性，细胞存活率均达到80％以上。
表8 PGE-2对黑素细胞B16F10黑色素含量影响
根据实验结果，如图8所示，随着PGE-2浓度的增加，B16F10细胞中的黑色素含量呈现先增加后下降的趋势，其中PGE-2浓度为100μM时，黑色素含量最高，达到129.39±15.02％。接下来，采用浓度为100μM的PGE-2对黑色素肿瘤细胞B16F10进行刺激实验。
4.2、冻干粉1对B16F10细胞存活率的影响
表9冻干粉1对B16F10细胞存活率的影响
冻干粉1对B16F10细胞的细胞活力的影响进行测定，结果显示，冻干粉1在1mg/mL浓度下对黑素细胞B16F10无细胞毒性，细胞存活率均达到80％以上，所以采用1mg/mL进行接下来实验。
4.3、冻干粉1对B16F10细胞黑色素含量的影响
表10冻干粉1对PGE-2刺激后的B16F10细胞黑色素含量的影响
结果如图9显示，冻干粉1可以显著性抑制黑色素的含量，说明灵芝人参发酵液对炎症后色素沉着具有显著抑制作用。

Claims (6)

1.灵芝人参双向发酵产物在制备上调抗菌肽的化妆品中的用途；所述灵芝人参双向发酵产物为灵芝Ganodermalingzhi菌株CICC 14023在添加有人参的培养基中发酵所得的；所述人参与培养基的添加用量比例为：1.0g∶90ml；所述灵芝人参双向发酵产物中灵芝三萜含量为0.17780mg/mL，灵芝多糖含量为9.882 mg/mL；所述发酵指将灵芝菌的二级种子液接种至发酵培养基进行发酵培养；所述灵芝菌的二级种子液指将灵芝菌活化培养物接种于种子培养基中进行一级培养得到的一级种子液再接种于种子培养基中进行二级培养得到；所述发酵培养、一级培养、二级培养的条件均为28℃、150r/min培养7天；所述抗菌肽为人抗菌肽LL-37。
2.根据权利要求1所述的灵芝人参双向发酵产物在制备上调抗菌肽的化妆品中的用途，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水。
3.根据权利要求1所述的灵芝人参双向发酵产物在制备上调抗菌肽的化妆品中的用途，其特征在于，所述种子培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，其余为水。
4.根据权利要求1所述的灵芝人参双向发酵产物在制备上调抗菌肽的化妆品中的用途，其特征在于，所述灵芝菌活化培养物指将灵芝Ganodermalingzhi菌株CICC 14023接入平面培养基中活化培养所得。
5.根据权利要求4所述的灵芝人参双向发酵产物在制备上调抗菌肽的化妆品中的用途，其特征在于，所述平面培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L，其余为水。
6.根据权利要求4所述的灵芝人参双向发酵产物在制备上调抗菌肽的化妆品中的用途，其特征在于，所述活化培养指30℃恒温培养7天。
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