CN113230287B - 灵芝和/或桦树茸在制备抗炎症因子产品、调控抗菌肽方面的用途 - Google Patents

灵芝和/或桦树茸在制备抗炎症因子产品、调控抗菌肽方面的用途 Download PDF

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Abstract

本发明“灵芝或桦树茸在制备抗炎症因子产品、调控抗菌肽方面的用途”属于真菌发酵技术领域。本发明一方面提供灵芝和/或桦树茸在制备抗炎症因子产品方面的用途，另一方面提供灵芝和/或桦树茸在调控抗菌肽方面的用途，同时提供一种灵芝、桦树茸双向发酵工艺，特征是将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的培养基中发酵，还提供工艺发酵所得的灵芝桦树茸发酵物，以及灵芝桦树茸发酵物的用途及其护肤品或化妆品。灵芝桦树茸发酵物具有一定的抗自由基、抗糖化及抗光(UVB)损伤功效，且对抗菌肽LL‑37的分泌有促进作用，为化妆品行业提供了一种具有抗衰、抗糖化以及抗炎的中药组合物双向液体发酵技术和应用。

Description

灵芝和/或桦树茸在制备抗炎症因子产品、调控抗菌肽方面的用途
技术领域
本发明属于真菌发酵技术领域，具体涉及灵芝和/或桦树茸在制备抗炎症因子产品、调控抗菌肽方面的用途。
背景技术
灵芝(Ganodermalucidum)被称为“扶正固本，滋补强壮”的珍贵中药材，属多孔菌科药用真菌，一直被用作治疗肝病、高胆固醇、高血脂等疾病。灵芝中主要抗氧化活性成分被认为是灵芝三萜与灵芝多糖。灵芝多糖还能显著促进细胞核内DNA合成功能，并可促进细胞的分裂，从而起到延缓衰老的作用，并具有增强免疫力的作用。灵芝分为三个生长阶段：孢子、菌丝、子实体，灵芝菌作为第二生长阶段，近年来灵芝菌丝体与发酵液的充分利用，为灵芝开发了一条新的应用途径。
桦树茸，又名桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，是真菌门，担子菌亚门，层菌纲，无褐菌目，多孔菌科，纤孔菌属。越来越多研究发现的桦褐孔菌中的有效化学活性成分已高达215种，主要有多糖类、三萜类、甾类、多酚类、黄酮类化合物及木脂素等成分。桦褐孔菌中三萜类及多糖类化合物通常具有抗肿瘤活性，对于治疗肿瘤有重要意义；多酚类物质则有较好的抗氧化作用，可以清除氧化自由基；黄酮类物质可以有效降血压、降血脂以及保肝等生物活性；而木脂素类化合物不仅有降酶保肝、抗癌的活性，在心血管系统的保护，抗过敏增强免疫的方面也有重要作用。
双向发酵技术是指用真菌为发酵菌种，利用药材或药渣作为药性基质共同构成发酵组合进行发酵的方式。双向发酵后菌质相比于原药材主要有几个方面的效果：增强药效，扩大用途。“双向发酵工程”展示了药用真菌(含其它真菌)与中药材的有机结合，很好的克服了野生药用植物利用的难题。
自然界真菌约有40万种，其中高等真菌数千种，现有供药用与食用的真菌达数百种，已知真菌的酶类近400种，不同种类真菌的酶系统有所不同，而中药材目前达一万种左右不同种类的成分也有不同。如果双方交叉组合可能构成大量不同的发酵组合，可产生几乎是无限量的、成分、性质不同的“菌质”，这些不同发酵组合产生的菌质各具一定的变化特色，可据既定的临床治疗目标用相应的免疫、药效等指标进行筛选，可获得具有一定功效的发酵产品，再对选定的品种作进一步研究，开发成新型真菌产品。
关于灵芝、桦树茸在抗炎症因子、调控抗菌肽，本领域尚未见报道。
发明内容
基于本领域的上述空白，本发明开拓性发现了灵芝、桦树茸的发酵产物在抗炎症因子、调控抗菌肽方面的用途。
本发明的技术方案如下：
灵芝和/或桦树茸在制备抗炎症因子产品方面的用途。
所述炎症因子选自：IL-1α或PGE2。
所述抗炎症因子指用灵芝桦树茸发酵物抗炎症因子；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物指将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的固体培养基中发酵所得的产物；
优选地，所述灵芝培养物指，将灵芝菌株接入固体培养基传代培养所得的灵芝菌丝再接入液体培养基中培养所得的灵芝菌种子液；
优选地，所述灵芝菌丝指第四代培养的灵芝菌丝；
优选地，所述灵芝菌丝再接入液体培养基中培养指，第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中进行第一级培养所得培养物再接入液体培养基中进行第二级培养即得灵芝菌种子液；
优选地，所述发酵培养基中桦树茸的添加量为0-20g/L；
优选地，所述发酵指28℃、150r/min恒温培养7d；
优选地，所述第一级培养指25℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述第二级培养指28℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述液体培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，其余为水；
优选地，所述固体培养基指所述液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
灵芝和/或桦树茸在调控抗菌肽方面的用途。
所述抗菌肽选自人抗菌肽；
优选地，所述人抗菌肽指LL-37；
优选地，所述调控抗菌肽指上调抗菌肽；更优选地，所述上调抗菌肽指促进抗菌肽的表达。
所述调控抗菌肽指用灵芝桦树茸发酵物调控抗菌肽；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物指将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的固体培养基中发酵所得的产物；
优选地，所述灵芝培养物指，将灵芝菌株接入固体培养基传代培养所得的灵芝菌丝再接入液体培养基中培养所得的灵芝菌种子液；
优选地，所述灵芝菌丝指第四代培养的灵芝菌丝；
优选地，所述灵芝菌丝再接入液体培养基中培养指，第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中进行第一级培养所得培养物再接入液体培养基中进行第二级培养即得灵芝菌种子液；
优选地，所述发酵培养基中桦树茸的添加量为0-20g/L；
优选地，所述发酵指28℃、150r/min恒温培养7d；
优选地，所述第一级培养指25℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述第二级培养指28℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述液体培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，其余为水；
优选地，所述固体培养基指所述液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
一种灵芝、桦树茸双向发酵工艺，其特征在于，将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的培养基中发酵。
优选地，所述培养基指固体培养基；
优选地，所述灵芝培养物的培养步骤包括：将灵芝菌株接入固体培养基进行传代培养得到的灵芝菌丝，再将第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中培养；优选地，所述灵芝菌株在固体培养基的接入量为0.1g/ml；
优选地，所述灵芝菌丝指第四代培养的灵芝菌丝；
优选地，所述灵芝菌丝再接入液体培养基中培养指，第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中进行第一级培养，第一级培养所得培养物再接入液体培养基中进行第二级培养；优选地，所述第一级培养中灵芝菌丝在液体培养基中的接入量为0.1g/ml；
优选地，所述发酵培养基中桦树茸的添加量为0-20g/L；
优选地，所述发酵指28℃、150r/min恒温培养7d；
优选地，所述第一级培养指25℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述第二级培养指28℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述液体培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，其余为水；
优选地，所述固体培养基指所述液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
所述的一种灵芝、桦树茸双向发酵工艺发酵所得的灵芝桦树茸发酵物。
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物的灵芝三萜含量为0.116-0.287mg/mL。
所述的灵芝桦树茸发酵物在清除自由基、抗糖化、或，抗UV损伤方面的用途。
优选地，所述清除自由基指清除DPPH或ABTS；
优选地，所述抗糖化指抑制AGEs；
优选地，所述抗UV损伤指抑制炎症因子、或，提高细胞存活率、或，上调抗菌肽；
优选地，所述炎症因子选自：PGE2或IL-1α；
优选地，所述上调抗菌肽指促进抗菌肽的表达；
优选地，所述抗菌肽指人抗菌肽LL-37；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物的浓度为0.0078-0.25mg/mL；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物的抗糖化活性体积浓度为0.5％-1％。
一种护肤品或化妆品，其特征在于，其活性成分包括权利要求8所述的灵芝桦树茸发酵物。
优选地，所述护肤品或化妆品还包括护肤品或化妆品可用的辅料。
本发明通过灵芝与桦树茸双向发酵技术来得到一种组合物，开拓其在化妆品领域的应用。本发明将桦树茸与灵芝菌配伍进行发酵，提供一种具有抗衰、抗糖化以及抗炎的中药组合物双向液体发酵工艺和应用。
本发明一方面确定灵芝桦树茸双向发酵时桦树茸最佳添加量；同时检测灵芝-桦树茸双向发酵液对自由基清除率；并且检测灵芝-桦树茸双向发酵液对体外抗糖化效果；还对灵芝桦树茸双向发酵液抗UV光损伤研究，并研究其对抗菌肽分泌的影响。经实验验证，本发明发酵工艺所得的灵芝桦树茸发酵物的灵芝三萜含量为0.116-0.287mg/mL；自由基清除率高达90％以上，抗糖化效率高达92.65％以上。在抗UV损失方面可使细胞存活率高达80％以上，并对IL-1α和PGE2等炎症因子具有显著的抑制作用，同时对人抗菌肽LL-37具有显著的促进表达的效果。灵芝桦树茸发酵物具有一定的抗自由基、抗糖化及抗光(UVB)损伤功效，且对抗菌肽LL-37的分泌有促进作用，为化妆品行业提供了一种具有抗衰、抗糖化以及抗炎的中药组合物双向液体发酵技术和应用。
附图说明
图1为本发明实验例第一部分桦树茸标准曲线。
图2为本发明实验例第四部分的灵芝桦树茸对HaCaT细胞分泌IL-1α检测结果图，图中BC为空白对照组(即调零组)，NC为UVB造模组(即阴性对照组)，PC为阳性对照组，灵芝桦树茸为样品组。
图3为本发明实验例第四部分的灵芝桦树茸对HaCaT细胞分泌PGE-2检测结果图，图中BC为空白对照组(即调零组)，NC为UVB造模组(即阴性对照组)，PC为阳性对照组，灵芝桦树茸为样品组。
图4为本发明实验例第四部分的灵芝桦树茸对HaCaT细胞分泌LL-37检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的具体内容做进一步详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源
灵芝菌株(Ganodermalingzhi)编号为CICC 14042，来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
桦树茸、HaCaT细胞均可商购获得。
第1组实施例、本发明的灵芝、桦树茸制备抗炎症因子产品新用途
本组实施例提供灵芝和/或桦树茸在制备抗炎症因子产品方面的用途。
本领域技术人员可根据本发明的教导，将灵芝或桦树茸用于抗炎症因子。任何将灵芝或桦树茸用在抗炎症因子产品中，或者在包含灵芝或桦树茸的产品上标明抗炎症因子用途，或者用灵芝或桦树茸直接用于抗炎症因子的行为均落入本发明的保护范围。
在一些实施例中，所述炎症因子选自：IL-1α或PGE2。
本领域技术人员可根据本发明的记载，将炎症因子做进一步拓展，除IL-1α或PGE2外，将灵芝或桦树茸用于抗其它炎症因子的行为也落入本发明的保护范围中。
在具体的实施例中，所述抗炎症因子指用灵芝桦树茸发酵物抗炎症因子；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物指将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的固体培养基中发酵所得的产物；
优选地，所述灵芝培养物指，将灵芝菌株接入固体培养基传代培养所得的灵芝菌丝再接入液体培养基中培养所得的灵芝菌种子液；
优选地，所述灵芝菌丝指第四代培养的灵芝菌丝；
优选地，所述灵芝菌丝再接入液体培养基中培养指，第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中进行第一级培养所得培养物再接入液体培养基中进行第二级培养即得灵芝菌种子液；
优选地，所述发酵培养基中桦树茸的添加量为0-20g/L；
优选地，所述发酵指28℃、150r/min恒温培养7d；
优选地，所述第一级培养指25℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述第二级培养指28℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述液体培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，其余为水；
优选地，所述固体培养基指所述液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
第2组实施例、本发明灵芝或桦树茸调控抗菌肽的新用途
本组实施例提供灵芝和/或桦树茸在调控抗菌肽方面的用途。
在具体的实施例中，所述抗菌肽选自人抗菌肽；
优选地，所述人抗菌肽指LL-37；
优选地，所述调控抗菌肽指上调抗菌肽；更优选地，所述上调抗菌肽指促进抗菌肽的表达。
在进一步的实施例中，所述调控抗菌肽指用灵芝桦树茸发酵物调控抗菌肽；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物指将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的固体培养基中发酵所得的产物；
优选地，所述灵芝培养物指，将灵芝菌株接入固体培养基传代培养所得的灵芝菌丝再接入液体培养基中培养所得的灵芝菌种子液；
优选地，所述灵芝菌丝指第四代培养的灵芝菌丝；
优选地，所述灵芝菌丝再接入液体培养基中培养指，第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中进行第一级培养所得培养物再接入液体培养基中进行第二级培养即得灵芝菌种子液；
优选地，所述发酵培养基中桦树茸的添加量为0-20g/L；
优选地，所述发酵指28℃、150r/min恒温培养7d；
优选地，所述第一级培养指25℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述第二级培养指28℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述液体培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，其余为水；
优选地，所述固体培养基指所述液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
第3组实施例、本发明的灵芝、桦树茸双向发酵工艺
本组实施例提供一种灵芝、桦树茸双向发酵工艺。本组所有的实施例都具备如下共同特征：将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的培养基中发酵。
在优选的实施例中，所述培养基指固体培养基；
优选地，所述灵芝培养物的培养步骤包括：将灵芝菌株接入固体培养基进行传代培养得到的灵芝菌丝，再将第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中培养；优选地，所述灵芝菌株在固体培养基的接入量为0.1g/ml；
优选地，所述灵芝菌丝指第四代培养的灵芝菌丝；
优选地，所述灵芝菌丝再接入液体培养基中培养指，第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中进行第一级培养，第一级培养所得培养物再接入液体培养基中进行第二级培养；优选地，所述第一级培养中灵芝菌丝在液体培养基中的接入量为0.1g/ml。
优选地，所述发酵培养基中桦树茸的添加量为0-20g/L；
优选地，所述发酵指28℃、150r/min恒温培养7d；
优选地，所述第一级培养指25℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述第二级培养指28℃、150r/min恒温培养7天；
优选地，所述液体培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，其余为水；
优选地，所述固体培养基指所述液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
第4组实施例、本发明的灵芝桦树茸发酵物
本组实施例提供第3组实施例任一项所提供的一种灵芝、桦树茸双向发酵工艺发酵所得的灵芝桦树茸发酵物。
在优选的实施例中，所述灵芝桦树茸发酵物的灵芝三萜含量为0.116-0.287mg/mL。
第5组实施例、本发明灵芝桦树茸发酵物的用途
本组实施例提供第4组实施例任一项所提供的灵芝桦树茸发酵物在清除自由基、抗糖化、或，抗UV损伤方面的用途。
在优选的实施例中，所述清除自由基指清除DPPH或ABTS；
优选地，所述抗糖化指抑制AGEs；
优选地，所述抗UV损伤指抑制炎症因子、或，提高细胞存活率、或，上调抗菌肽；
优选地，所述炎症因子选自：PGE2或IL-1α；
优选地，所述上调抗菌肽指促进抗菌肽的表达；
优选地，所述抗菌肽指人抗菌肽LL-37；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物的浓度为0.0078-0.25mg/mL；
优选地，所述灵芝桦树茸发酵物的抗糖化活性体积浓度为0.5％-1％。
第6组实施例、本发明的护肤品或化妆品
本组实施例提供一种护肤品或化妆品。在本组所有的实施例中，所述护肤品或化妆品都具备如下共同特征：所述护肤品或化妆品的活性成分包括第4组实施例任一项所提供的灵芝桦树茸发酵物。
在进一步的实施例中，所述护肤品或化妆品还包括护肤品或化妆品可用的辅料。
在具体的实施例中，所述护肤品或化妆品可用的辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
实验例、本发明灵芝桦树茸发酵物的发酵工艺及效果验证
第一部分：确定灵芝桦树茸双向发酵时桦树茸最佳添加量
所述组合物通过下述步骤制备得到：
1、桦树茸粉的制备。
1.1取干燥的桦树茸，粉碎机粉碎，过80～100目筛，取80～100目之间的桦树茸粉。
2、培养基的配制：
2.1、菌种来源：灵芝菌株(Ganodermalingzhi)编号为CICC 14042，来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
2.2、斜面培养基。葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，琼脂粉15g/L，蒸馏水100mL，121℃下灭菌20min。
2.3、种子培养基。葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蒸馏水100mL，121℃下灭菌20min。
2.4、灵芝菌的斜面培养。将第一代灵芝菌CICC 14042菌丝接入2.2配制的培养基，放置于28℃恒温培养箱中培养5天左右进行复活，并进行传代培养。
2.5、灵芝菌一级种子液培养。挑取2.4中第四代灵芝CICC 14042斜面菌丝接入装有100mL灵芝菌液体种子培养基的250mL锥形瓶中，放置于25℃、150r/min的恒温摇床中培养7天，即得灵芝菌的种子液。
2.6、灵芝菌二级种子液培养。再将10mL种子液分别接入2.3配制的培养基，按照后续实验要求放置于28℃、150r/min的恒温摇床中培养7天。
2.7灵芝菌发酵。把从1.1得到的桦树茸分别添加20g/L、15g/L、10g/L、5g/L、0g/L到2.2中的发酵培养基(配方同2.2的斜面培养基)中，进行灭菌；将步骤2.6得到的灵芝菌种子液取10mL分别接入各发酵培养基，并放置于28℃、150r/min的恒温摇床中培养7d。
2.8收集发酵液。将步骤2.7的发酵液进行过滤，过滤板为2.2μM，收集发酵液即得，并检测灵芝三萜含量。
3、三萜含量检测(高氯酸显色法)
1)样品处理：将样品摇匀后取1.0mL，加入9.0mL的蒸馏水稀释；
2)柱层析：用10mL注射器作层析管，内装3cm高的Amberlite-XAD-2大孔树脂，先用25mL70％乙醇洗柱，弃去洗脱液，再加入1.0cm中性氧化铝。用25mL70％乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25mL去离子水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL待测样品，用25mL去离子水洗柱，弃去洗脱液，用25mL70％乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，以此作显示用。
3)标准溶液：桦树茸标准曲线：分别吸取白桦脂醇标准溶液(2.0mg/mL)25μL、50μL、100μL、150μL、200μL，置于60℃水浴挥干。人参皂苷Re标准曲线：分别吸取人参皂苷Re标准溶液(2.0mg/mL)25μL、50μL、100μL、150μL、200μL，置于60℃水浴挥干。
4)显色：将已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL5％香草醛冰乙酸溶液，使蒸发皿上的残渣全部溶解，再加入0.8mL高氯酸，混匀后加入到10mL的ep管中，60℃水浴10min，取出，用凉水冷却后，准确加入冰乙酸5.0mL，于560nm波长处用酶标仪进行测定。
4、实验结果
桦树茸标准曲线如图1所示。
添加了桦树茸粉的灵芝发酵产物中的灵芝三萜含量检测结果如下表1所示。
表1灵芝三萜含量检测
Figure BDA0003094615850000111
结论：添加桦树茸后，灵芝三萜含量随之增加。
第二部分：将第一部分得到的发酵液进行ABTS自由基清除率检测
实验方法
(1)ABTS自由基清除率
1)储备液1(7mMABTS水溶液)：精密称取0.03841g ABTS，溶解定容于10mL水中；
2)储备液2(2.45mM K2S2O8水溶液)：精密称取0.0662g K2S2O8，溶解定容于100mL水中；
3)母液：将储备液1和储备液2等体积混合，低温避光反应12～16h；
4)ABTS·工作液：将母液用无水乙醇(水)稀释至OD734＝0.7±0.02，现用现配。
具体实验步骤如下：
1)用移液枪分别准确吸取0.2mL不同浓度的待测液和0.8mL ABTS·工作液，充分混匀后，在室温条件下避光反应30min，用酶标仪测定其在734nm下的吸光值A；
2)用0.2mL蒸馏水代替多糖溶液，其他条件不变，测定吸光值A0；
3)采用维生素C为阳性对照；
4)计算ABTS自由基清除率：清除率(％)＝[(A0-A)/A0]*100％
实验组(A)和空白组(A0)的加样情况如下表2所示：
表2
Figure BDA0003094615850000112
Figure BDA0003094615850000121
实验结果：
添加不同量桦树茸粉的灵芝发酵液的ABTS自由基清除率如下表3所示：
表3.添加不同量桦树茸粉的灵芝发酵液的ABTS自由基清除率
Figure BDA0003094615850000122
结论：随着添加桦树茸粉的增加，ABTS自由基先增加后减少，桦树茸添加量在10g/L时，ABTS自由基清除率最高。桦树茸添加量在10g/L时，灵芝桦树茸发酵液要比灵芝发酵液的抗氧化效果更优。
第三部分：将第一部分得到的发酵液进行抗糖化检测
3.1、实验前准备
(1)使用分析天平称取0.5gBSA(牛血清蛋白)，2.25g果糖，22mg氨基胍，每种样品取其50mg，配置成5000、1000、500、250ug/mL
3.2、实验过程
(1)在PBS中加入0.02％叠氮化钠防腐剂(起到抑制细菌的作用)
(2)20mg/mL的BSA(牛血清蛋白)溶液：将0.5gBSA(牛血清蛋白)倒入50mLEP管中，加入PBS至25ml，0.45水系滤膜过滤(BSA(牛血清蛋白)溶液容易结块不易溶解，溶解时应在合适的容器中涡旋、震荡、搅拌)
(3)0.5mol/L果糖溶液：2.25g果糖，用PBS定容至25ml
(4)BSA(牛血清蛋白)-果糖反应液：使用移液枪5ml枪头，取BSA(牛血清蛋白)溶液20ml、果糖溶液20ml，加入烧杯中，均匀混合。
(2)氨基胍溶液：22mg氨基胍加入去离子水溶解定容至10ml作为阳性对照组。另配制质量浓度为5000、1000、500、250ug/mL的溶液用以与样品组抑制能力做对比。
(5)样品用去离子水溶解，漩涡器加快溶解，再用65℃的热水浸泡15min，使用离心机转速6000时间为5min，取其上清液。需要达到澄清状态，否则会影响荧光值的准确性。样品浓度稀释梯度以1％、0.5％、0.05％(按实际情况决定稀释梯度)，受试样品稀释时使用PBS溶液进行稀释。
(6)阴性对照组为：PBS+反应液。阳性对照组：氨基胍+反应液，空白对照组：受试样品或氨基胍+PBS。样品组：受试样品+反应液。反应液：PBS:受试样品统一为1：1.
每组三个平行样，每组都应当跟着一个空白对照组。
表4.反应体系(mL)
Figure BDA0003094615850000131
加入两种试剂后应立即用漩涡器混匀
如：1mL样品加1mL反应液为样品组，应有三个平行样，和一个空白对照组：1mL样品+1mLPBS。
(7)配置不同试验组，于37℃培养箱里避光孵育。
(8)在第5天时检测各实验组的荧光强度，激发波长370nm，发射波长为440nm，增益87、80、75(该值需要根据实际测试进行适当的手动调节，通常调节该值，使得最终阴性组的荧光读数5位数最佳)，测其空板后进行点样，根据公式计算抑制率。
3.3、数据处理
每个样品设定3个平行，取3次测定的算数平均值作为检测结果，并计算RSD(相对标准偏差)，3个平行测定的荧光值RSD应小于3％。
抑制率(IR)的计算公式为：
Figure BDA0003094615850000132
阳性对照组抑制率在90％以上则试验结果可用。
3.4实验结果
表5.不同浓度灵芝桦树茸抗糖化实验结果
Figure BDA0003094615850000141
上表中的抗糖化百分率指的是灵芝桦树茸发酵样品对AGEs的抑制率。
结论：灵芝桦树茸具有抗糖化效果
第四部分：灵芝-桦树茸发酵液抗UV光损伤研究及对抗菌肽分泌的影响
4.1细胞毒性检测
1.细胞接种：按1E4个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.实验分组：实验设置调零组(空白对照组，BC)、溶剂对照组(阴性对照组、UVB造模组，NC)、阳性对照组(PC)与样品组(灵芝桦树茸，H2)。实验设置调零组(空白对照组，BC)为无细胞接种的细胞培养液，溶剂对照组(阴性对照组、UVB造模组，NC)为有细胞接种的细胞培养液，阳性对照组(PC)为添加了DMSO的有细胞接种的细胞培养液，样品组(灵芝桦树茸，H2)为添加了灵芝桦树茸发酵物的有细胞接种的细胞培养液；每组样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
3.配液：按测试浓度设定表(表6)配制不同浓度的受试物工作液。
4.给药：待96孔板中细胞铺板率达到80％～90％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL的培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度受样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL的细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养。
5.检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL，现配现用)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。
6.细胞相对活力计算：根据公式计算，
Figure BDA0003094615850000142
Figure BDA0003094615850000151
4.2炎症因子及抗菌肽检测
1.接种：按2.5E5个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.实验分组：实验设置空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)、阳性对照组(PC)和灵芝桦树茸样品组(H2)。
3.UVB辐照：待6孔板中细胞铺板率达到80％～90％时，弃掉培养液，并在每孔加入1mL PBS溶液，清洗细胞，重复清洗3次。按测试分组对样品组、阴性对照组和阳性对照组分别进行UVB辐照(辐照剂量为100mJ/cm2)。
4.给药：UVB辐照结束后，每孔加入1mL PBS溶液清洗，重复3次，清洗结束后，进行分组给药，样品浓度为0.0313mg/mL，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔。37℃，5％CO2培养箱继续培养24h。
5.后孵育及收集上清液：培养24h后，收集细胞培养上清液于EP管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。
6.IL-1α和PGE2含量检测：根据人IL-1αELISA和PGE2 ELISA试剂盒的操作说明书进行ELISA检测。
7.LL-37含量检测：根据人LL-37ELISA试剂盒的操作说明书进行ELISA检测。
4.3结果统计分析
测试结果采用GraphPad Prism Program软件作图，样品组与阴性对照组比较，采用t-test统计分析，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。
4.3.1细胞毒性检测结果
表6.MTT检测结果
Figure BDA0003094615850000152
4.3.2IL-1α测试结果
依据ELISA试剂盒说明书，开展IL-1α含量的检测，检测结果如表7和图2所示。
表7.IL-1α检测结果
样品名称 IL-1α(pg/mL) SD p value(VS NC)
BC 8.34 0.37 0.000##
NC 23.00 0.64 /
PC 12.10 0.43 0.000**
H2 16.19 0.52 0.000**
如图2所示，用t-test方法进行统计分析时，#表示与BC对比，p<0.05；##表示与BC对比，p<0.01；*表示与NC对比，p<0.05；**表示与NC对比，p<0.01
与空白对照组(BC)相比，UVB造模组(NC)组的IL-1α含量极显著升高(p<0.01)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与NC组相比，PC组IL-1α分泌水平极显著降低(p<0.01)，表明本次阳性对照检测有效。
与NC组相比，灵芝桦树茸在0.0313mg/mL时对UVB辐照引起的IL-1α的分泌有显著的抑制作用(p<0.05)。
4.4.3PGE2测试结果
依据试剂盒说明书，开展PGE2含量的检测，检测结果如表8所示
表8.PGE2检测结果
样品名称 PGE2(pg/mL) SD p value(VS NC)
BC 159.86 12.70 /
NC 2099.84 136.89 0.0000##
PC 808.37 20.24 0.0001**
H2 1292.16 99.69 0.0012**
如图3所示：用t-test方法进行统计分析时，#表示与BC对比，p<0.05；##表示与BC对比，p<0.01；*表示与NC对比，p<0.05；**表示与NC对比，p<0.01
与空白对照组(BC)相比，UVB造模组(NC)的PGE2分泌水平极显著升高(p<0.01)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与NC组相比，PC组PGE2分泌水平极显著降低(p<0.01)，表明本次阳性对照检测有效。
与NC组相比，灵芝桦树茸发酵液在0.0313mg/mL时对UVB辐照引起PGE2的分泌有显著抑制作用(p<0.05)。
4.3.4 LL-37测试结果
依据试剂盒说明书，开展LL-37含量的检测，检测结果如表9所示
表9.LL-37检测结果
样品名称 LL-37(pg/mL) SD p value(VS NC)
BC 289.6811 17.2053 /
NC 321.0409 23.3404 0.0001##
PC 337.8812 26.8017 0.0002**
H2 358.1956 22.0524 0.0001**
结果如图4所示：用t-test方法进行统计分析时，#表示与BC对比，p<0.05；##表示与BC对比，p<0.01；*表示与NC对比，p<0.05；**表示与NC对比，p<0.01
与空白对照组(BC)相比，UVB造模组(NC)的LL-37分泌水平极显著升高(p<0.01)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与NC组相比，PC组LL-37分泌水平极显著升高(p<0.01)，表明本次阳性对照检测有效。
与NC组相比，灵芝桦树茸发酵液在0.0313mg/mL时对抗菌肽LL-37的分泌有极显著促进作用(p<0.05)。

Claims (7)

1.灵芝桦树茸发酵物制备上调抗菌肽的护肤品的用途；所述抗菌肽指人抗菌肽LL-37；所述灵芝桦树茸发酵物指将灵芝培养物接种至添加了桦树茸的固体培养基中发酵所得的产物；所述灵芝培养物指，将灵芝菌株接入固体培养基传代培养所得的灵芝菌丝再接入液体培养基中培养所得的灵芝菌种子液；所述灵芝菌丝再接入液体培养基中培养指，第四代培养的灵芝菌丝接入液体培养基中进行第一级培养所得培养物再接入液体培养基中进行第二级培养即得灵芝菌种子液。
2.根据权利要求1所述灵芝桦树茸发酵物制备上调抗菌肽的护肤品的用途，其特征在于，所述添加了桦树茸的固体培养基中桦树茸的添加量为5-20g/L。
3.根据权利要求1所述灵芝桦树茸发酵物制备上调抗菌肽的护肤品的用途，其特征在于，所述发酵指28℃、150r/min恒温培养7d。
4.根据权利要求1所述灵芝桦树茸发酵物制备上调抗菌肽的护肤品的用途，其特征在于，所述第一级培养指25℃、150r/min恒温培养7天。
5.根据权利要求1所述灵芝桦树茸发酵物制备上调抗菌肽的护肤品的用途，其特征在于，所述第二级培养指28℃、150r/min恒温培养7天。
6.根据权利要求1所述灵芝桦树茸发酵物制备上调抗菌肽的护肤品的用途，其特征在于，所述液体培养基包括：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，其余为水。
7.根据权利要求1所述灵芝桦树茸发酵物制备上调抗菌肽的护肤品的用途，其特征在于，所述固体培养基指所述液体培养基中加入琼脂粉15g/L。
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