CN103073648A - 一种提高金针菇多糖抗氧化活性的方法 - Google Patents

一种提高金针菇多糖抗氧化活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种提高金针菇多糖抗氧化活性的制备方法。本发明采用控制酶解法来调控金针菇多糖的分子量分布，金针菇粉碎后，通过除杂、热水浸提、除蛋白、浓缩和乙醇分级沉淀分离获得金针菇多糖，再用酶法进行控制降解以使金针菇多糖的分子量降到19000-30000Da。采用此法所制备的金针菇多糖，适宜于工业化生产，所得多糖提取率比传统水提法提高2.5-3.5倍，且具有明显的抗氧化活性。在DPPH·自由基体系中，金针菇多糖的IC50为1.69-2.12mg/mL，同时ORAC值最高达923μmolTrolox/g。

Description

一种提高金针菇多糖抗氧化活性的方法
技术领域
本发明涉及金针菇深加工技术，具体涉及提高金针菇多糖抗氧化活性的方法。 
背景技术
金针菇是世界上著名的食用菌、药用菌和观赏菌，是仅次于蘑菇、香菇，而属于第3位的食用菌。目前，金针菇已被广泛应用于食品、调味品以及保健品行业中。多糖是金针菇中重要的生物活性物质，相关研究表明，金针菇多糖是一类主要以β-(1, 3)糖苷键连接的葡聚糖，具有抑制肿瘤、抗癌、降血糖、降血脂和增强机体免疫力等作用。目前，金针菇多糖已被开发应用于功能性食品、生物医药、饲料等方面。如华南理工大学（中国专利申请号200610036622.5）公开了一种具有提高全身免疫机能、抑制肿瘤细胞增殖功效的高活性金针菇多糖-肽-Fe2+鳌合物；天圣制药集团股份有限公司（中国专利申请号201010042031）公开了一种具有促进智力发育、提高记忆力的含金针菇多糖和香菇多糖的双菇多糖配制品及其制法和用途；王星丽（中国专利申请号200910001855）公开了一种具有降血脂、减肥美体的金针菇多糖保健胶囊；鞍山保健饮品制造公司（中国专利申请号1992109861）公开了一种具有激发智力潜能、提高记忆力的金针口服液和制法及用途。北京琥珀光华医药科技开发有限公司（中国专利申请号200610057191.0）公开了一种用于治疗多种疾病，并具有免疫调节功能，以及明显抗肝癌、抗肝炎作用的以金针菇多糖为活性成分的药物组合物注射制剂。张永亮（中国专利申请号200910192559）公开了一种可以提高动物的抗病能力、促进动物生长的复合多糖饲料添加剂。 
虽然金针菇多糖具有多种保健功效，但目前因其提取率低、活性低而限制了其应用。因此如何提高金针菇多糖的提取率，提高其活性是其大规模应用的前提。目前公开的专利文献中主要是采用液体深层培养法制备金针菇多糖。如南京泽朗医药科技有限公司（中国专利申请号200810155913）公开了一种包括斜面菌种活化、摇瓶种子培养、液体深层发酵、连续发酵、超滤膜分离并浓缩、醇沉等步骤制备金针菇多糖的方法；江苏省江大绿康生物工程技术研究有限公司（中国专利申请号200710131811）公开了一种深层液体发酵法生产富硒金针菇粗多糖原粉的方法。以上方法制备的金针菇多糖不仅得率低，活性低，而且工序复杂，操作繁琐且不可控。因此，本发明公开一种通过控制酶解法调控金针菇多糖分子量分布的制备方法，以达到提高其多糖得率和抗氧化活性的目的。 
发明内容
本发明的目的是提供一种通过控制酶解法调控金针菇多糖分子量分布，以提高其多糖提取率和抗氧化活性的制备方法，填补目前国内外关于应用酶解法调控多糖分子量分布提高其功效的技术空白。 
本发明的目的通过如下技术方案予以实现： 
一种提高金针菇多糖抗氧化活性的方法，其包括如下步骤：
（1）金针菇洗净，晾干后粉碎得金针菇干；
（2）在金针菇干中加入3-6倍质量的95%乙醇，加热使液体微沸，回流2-4小时；除杂、过滤，除醇，取滤渣，得金针菇粉；
（3）在金针菇粉中加入20-30倍质量的蒸馏水，于90-100℃下提取1-3小时，过滤，重复提取2次，分离金针菇渣得提取液；
（4）在提取液中加入Sevag试剂，剧烈振荡30-60分钟，然后静置10分钟，离心，重复除蛋白3-8次得到脱蛋白的提取液；
（5）将脱蛋白的提取液进行真空浓缩，至原来体积的1/7~1/3，得浓缩液；加入乙醇，混合均匀后，在0-4℃下静置6-12小时，过滤，除去上层清液部分，得金针菇粗多糖；
（6）在金针菇粗多糖中加入水解酶，在45-60℃下水解2-6小时，沸水浴灭酶15分钟，离心，过滤，冷冻干燥，得金针菇精制多糖。
上述提高金针菇多糖抗氧化活性的方法中，步骤（1）所述金针菇粉碎为粉碎至20-80目。 
上述提高金针菇多糖抗氧化活性的方法中，步骤（4）所述Sevag试剂的加量为提取液体积的3-5倍。 
上述提高金针菇多糖抗氧化活性的方法中，步骤（5）所述乙醇添加量满足混合均匀后乙醇最终浓度为70-85%（v/v）。 
上述提高金针菇多糖抗氧化活性的方法中，步骤（6）所述水解酶为果胶酶、木瓜蛋白酶、胰酶中的一种。 
上述提高金针菇多糖抗氧化活性的方法中，步骤（6）所述水解酶的添加量为1000-3000U/100g。 
上述提高金针菇多糖抗氧化活性的方法中，步骤（6）获得的金针菇精制多糖分子量为19000-30000Da。 
上述提高金针菇多糖抗氧化活性的方法中，所述Sevag试剂中氯仿与丁醇的体积比为5:1。 
本发明采用了以上技术方案，具有如下的优点和有益效果： 
1、本发明提供了一种通过控制酶解法调控金针菇多糖分子量分布，以提高其多糖提取率和抗氧化活性的制备方法，填补目前国内外关于应用酶解法调控多糖分子量分布提高其功效的技术空白。
2、本制备方法实现了金针菇多糖分子量分布的可控性，可有效降低金针菇多糖的分子量，增加溶解性，使其在体内更易被吸收，更有效地发挥功效，应用范围更广。 
3、通过本方法所制备的金针菇多糖，适宜于工业化生产，所得多糖提取率比传统水提法提高2.5-3.5倍，且具有明显的抗氧化活性。在DPPH·自由基体系中，金针菇多糖的IC50为1.69-2.12mg/mL，同时ORAC值最高达923μmolTrolox/g。 
附图说明
图1a~图1c为实施例1、2、3中所制备的金针菇多糖的分子量分布图。 
图2为实施例1、2、3中所制备的金针菇多糖的提取率结果图。 
图3为实施例1、2、3中所制备的金针菇多糖对DPPH自由基清除活性结果图。 
图4为实施例1、2、3中所制备的金针菇多糖ORAC值结果图。 
  
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的具体实施作进一步说明。 
实施例1 
（1）金针菇洗净，晾干后粉碎至60目，得提取原料。
（2）在金针菇干中加入3倍95%乙醇，加热使液体微沸，回流2小时。除杂、过滤，除醇，取滤渣，得金针菇粉。 
（3）在提取原料中加入20倍蒸馏水，于90℃下提取1小时，过滤，重复提取1次，分离金针菇渣得提取液。 
（4）在提取液中加入3倍Sevag试剂（氯仿:丁醇=5:1）以除去蛋白，剧烈振荡30分钟，然后静置10分钟，离心，重复除蛋白3次。 
（5）将提取液进行真空浓缩，至原来体积的1/7，得浓缩液。然后加入乙醇，使乙醇最终浓度为80%（v/v），混合均匀后，在0-4℃下静置6小时，过滤，除去上层清液部分，得金针菇粗多糖。 
（6）在金针菇多糖中加入果胶酶1000U/100g，在45℃下水解4小时，沸水浴灭酶15分钟，离心，过滤，冷冻干燥，得金针菇精制多糖。 
测定所得金针菇多糖的分子量分布、提取率、DPPH自由基清除活性、ORAC值。 
实施例2 
（1）金针菇洗净，晾干后粉碎至80目，得提取原料。
（2）在金针菇干中加入5倍95%乙醇，加热使液体微沸，回流3小时。除杂、过滤，除醇，取滤渣，得金针菇粉。 
（3）在提取原料中加入25倍蒸馏水，于95℃下提取2小时，过滤，重复提取1次，分离金针菇渣得提取液。 
（4）在提取液中加入4倍Sevag试剂（氯仿:丁醇=5:1）以除去蛋白，剧烈振荡45分钟，然后静置10分钟，离心，重复除蛋白3次。 
（5）将提取液进行真空浓缩，至原来体积的1/5，得浓缩液。然后加入乙醇，使乙醇最终浓度为75%（v/v），混合均匀后，在0-4℃下静置10小时，过滤，除去上层清液部分，得金针菇粗多糖。 
（6）在金针菇多糖中加入木瓜蛋白酶2000U/100g，在50℃下水解3小时，沸水浴灭酶15分钟，离心，过滤，冷冻干燥，得金针菇精制多糖。 
    测定所得金针菇多糖的分子量分布、提取率、DPPH自由基清除活性、ORAC值。 
实施例3 
（1）金针菇洗净，晾干后粉碎至60目，得提取原料。
（2）在金针菇干中加入6倍95%乙醇，加热使液体微沸，回流4小时。除杂、过滤，除醇，取滤渣，得金针菇粉。 
（3）在提取原料中加入30倍蒸馏水，于100℃下提取3小时，过滤，重复提取1次，分离金针菇渣得提取液。 
（4）在提取液中加入5倍Sevag试剂（氯仿:丁醇=5:1）以除去蛋白，剧烈振荡60分钟，然后静置10分钟，离心，重复除蛋白3次。 
（5）将提取液进行真空浓缩，至原来体积的1/3，得浓缩液。然后加入乙醇，使乙醇最终浓度为85%（v/v），混合均匀后，在0-4℃下静置12小时，过滤，除去上层清液部分，得金针菇粗多糖。 
（6）在金针菇多糖中加入胰酶3000U/100g，在60℃下水解6小时，沸水浴灭酶15分钟，离心，过滤，冷冻干燥，得金针菇精制多糖。 
测定所得金针菇多糖的分子量分布、提取率、DPPH自由基清除活性、ORAC值。 
  
图1a、图1b、图1c分别为实施例1、2、3所得金针菇的分子量分布图。从图中可以看出，所得金针菇多糖的分子量分布控制在19000-30000Da之间。
图2为实施例1、2、3所得金针菇多糖的提取率结果图。从图中可以看出，与传统水提法相比，采用本发明的制备方法可以提高金针菇多糖的提取率2.8-3.2倍。 
图3为实施例1、2、3所得金针菇多糖的DPPH自由基清除活性结果图。从图中可以看出，采用本发明的制备方法可以提高金针菇多糖的DPPH自由基清除活性1.8-2.3倍。 
图4 为实施例1、2、3所得金针菇多糖的ORAC值结果图。从图中可以看出，采用本发明的制备方法可以提高金针菇多糖的氧化自由基吸收能力2.5-2.8倍。 

Claims (8)

1.一种提高金针菇多糖抗氧化活性的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）金针菇洗净，晾干后粉碎得金针菇干；
（2）在金针菇干中加入3-6倍质量的95%乙醇，加热使液体微沸，回流2-4小时；除杂、过滤，除醇，取滤渣，得金针菇粉；
（3）在金针菇粉中加入20-30倍质量的蒸馏水，于90-100℃下提取1-3小时，过滤，重复提取2次，分离金针菇渣得提取液；
（4）在提取液中加入Sevag试剂，剧烈振荡30-60分钟，然后静置10分钟，离心，重复除蛋白3-8次得到脱蛋白的提取液；
（5）将脱蛋白的提取液进行真空浓缩，至原来体积的1/7~1/3，得浓缩液；加入乙醇，混合均匀后，在0-4℃下静置6-12小时，过滤，除去上层清液部分，得金针菇粗多糖；
（6）在金针菇粗多糖中加入水解酶，在45-60℃下水解2-6小时，沸水浴灭酶15分钟，离心，过滤，冷冻干燥，得金针菇精制多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述金针菇粉碎为粉碎至20-80目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）所述Sevag试剂的加量为提取液体积的3-5倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5）所述乙醇添加量满足混合均匀后乙醇最终浓度为70-85%（v/v）。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（6）所述水解酶为果胶酶、木瓜蛋白酶、胰酶中的一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（6）所述水解酶的添加量为1000-3000U/100g。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（6）获得的金针菇精制多糖分子量为19000-30000Da。
8.根据权利要求1~7任一项所述的方法，其特征在于所述Sevag试剂中氯仿与丁醇的体积比为5:1。
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