CN105920051A - 一种金针菇提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种金针菇提取物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及活性物质领域，尤其涉及一种金针菇提取物及其制备方法与应用。本发明提供方法制得的金针菇提取物中主要包括多糖、蛋白质、维生素和矿物质。经体外实验证明，本发明提供的金针菇提取物能抑制体外α糖苷酶的活力。体内试验表明，金针菇提取物可以明显降低2型糖尿病大鼠的血糖，调节血脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗，降低血清游离脂肪酸水平，增加肝糖原、肌糖原储备，修复受损胰腺，有明显的治疗2型糖尿病作用。

Description

一种金针菇提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及活性物质领域，尤其涉及一种金针菇提取物及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病是种由遗传和后天环境因素共同作用而形成的以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病。临床以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，中医称其为“消渴症”。随着生活水平提高，糖尿病的发病率逐年上升，己成为继癌症、心脑血管疾病之后的第3位严重危害人类健康的慢性疾病。糖尿病有两种类型，即，1型，胰岛素依赖性糖尿病，是源于多种因素引起的自身免疫机制紊乱所导致的胰岛β细胞破坏、胰岛素分泌缺乏，多发于儿童及青少年。2型，即非胰岛素依赖性糖尿病，是源于胰岛β细胞功能低下，胰岛素相对缺乏，95％以上的糖尿病患者属于2型。2型的病因复杂，一般认为，β细胞功能障碍和胰岛素抵抗主要的病理生理机制。
通过抑制α-葡萄糖苷酶可抑制食物分解为单糖，减少食物的降解和吸收，从而有效地降低糖尿病人餐后血糖浓度峰值，有效的控制餐后血糖。
血糖升高是糖尿病最基本临床表现，血脂代谢紊乱与2型糖尿病之间的关系极为密。正常生理条件下，脂肪分解产生的FFA由脂肪细胞释出进入血循环，FFA升高与胰岛素抵抗产生有着密切的联系。HOMA-IR是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标。胰岛素敏感指数(ISI)评价胰岛素敏感性水平的另一指标。HOMA-β是用于评价个体的胰岛β细胞功能的指标。因此，糖原对维持血糖的相对恒定十分重要。血糖升高时，可在肝脏中合成糖原，血糖降低时，肌、肝糖原则分解为葡萄糖以补充血糖。
金针菇属于天然食用菌，具有多种生物活性。虽然治疗2型糖尿病的传统西药较多，但副作用和依赖性也较大。因此，从天然的食物中开发新型的降糖药物是治疗2型糖尿病的新方向。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种金针菇提取物及其制备方法与应用。本发明提供的金针菇提取物对α糖苷酶具有良好的抑制作用。
本发明提供的金针菇提取物的制备方法，包括：金针菇以水提、醇沉制得金针菇提取物；
水提的水与金针菇的体积-质量比为7mL～25mL：1g；
水提的温度为45℃～90℃，时间为25min～6h；
醇沉采用体积分数为90％的乙醇；
醇沉的时间为8h～16h，温度为10℃～30℃。
作为优选，水提采用超声波辅助提取，提取的温度为45℃，时间为25min；超声波的功率为600W～650W。
优选的，超声波功率为625W。
作为优选，水提采用水浴加热提取，提取的温度为90℃，时间为6h。
作为优选，水与金针菇的体积-质量比为7mL：1g。
作为优选，水浴金针菇的体积-质量比为25mL：1g。
作为优选，醇沉的时间为12h，温度为20℃。
作为优选，金针菇提取前经干燥、粉碎。
优选的，干燥金针菇采用热风干燥的方式。
优选的，干燥金针菇的温度为50℃～70℃。
更优选的，干燥金针菇的温度为60℃。
优选的，金针菇粉碎至300目。
作为优选，水提与醇沉之间还包括活性炭脱色和浓缩的步骤；
优选的，活性炭脱色的温度为45℃～60℃，时间为1h～3h；
优选的，浓缩至原体积的1/4～1/5。
浓缩的方式为水浴加热浓缩，浓缩的温度为45℃～60℃。
优选的，活性炭脱色的温度为45℃或60℃，时间为2h。
作为优选，醇沉制得的金针菇提取物还经过干燥和/或托蛋白的步骤。
作为优选，干燥的方式为水浴蒸干或冷冻干燥。
优选的，水浴蒸干的温度为60℃。
作为优选，脱蛋白采用sevag法。
一些实施例中，本发明提供的金针菇提取的提取方法为：
将金针菇粉碎后与水混合，金针菇与水的料液比为1g:7mL，在90℃恒温水浴下提取6h，倒出提取液，加入2％活性炭于60℃水浴脱色2h后，用离心机以4000r/min离心15min，抽滤，提取液于60℃水浴中浓缩，浓缩至原体积的1/4～1/5后，用体积分数为90％乙醇沉淀，室温沉淀过夜，离心得到的提取物放于蒸发皿中在60℃水浴上蒸干，获得金针菇提取物。
另一些实施例中，本发明提供的金针菇提取的提取方法为：
将金针菇于60℃干燥，压成粉末，过300目筛，与水混合，金针菇与水的水料液比为1g:25mL，45℃，625W超声波提取25min，倒出提取液，加入2％活性炭于45℃水浴脱色2h后，用离心机以4000rpm/min离心15min，抽滤，提取液于45℃水浴中浓缩，浓缩原体积的1/4～1/5后，用90％乙醇沉淀，沉淀用sevag法脱蛋白，透析袋透析，冷冻干燥，得到金针菇提取物。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物。
本发明提供方法制得的金针菇提取物中主要包括多糖、蛋白质、维生素和矿物质。经体外实验证明，本发明提供的金针菇提取物能抑制体外α糖苷酶的活力。以脂肪乳和链脲佐菌素造模，建立大鼠2型糖尿病模型，通过测定每周空腹血糖值、血脂指标，胰岛素水平、糖原和游离脂肪含量及组织病理学检测，评价金针菇提取物的体内抗2型糖尿病作用。结果表明，金针菇提取物可以明显降低2型糖尿病大鼠的血糖，调节血脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗，降低血清游离脂肪酸水平，增加肝糖原、肌糖原储备，修复受损胰腺，有明显的治疗2型糖尿病作用。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备α糖苷酶抑制剂中的应用。
实验表明，金针菇提取物对α糖苷酶的抑制率呈剂量依赖，当抑制率升至最高时，不再上升，呈下降趋势，得到抑制率在金针菇提取物的浓度为0.00625g/mL时最大，此时抑制率最大为59.14％，即在此浓度时为最佳抑制状态，抑制率最大，IC50为2.86mg/mL(相当于生药量20.72mg/mL)。
实验表明，与模型组比较，金针菇提取物组游离脂肪酸含量有所下降(P<0.05)。表明金针菇提取物可抵抗2型糖尿病对大鼠游离脂肪酸的影响。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备降低游离脂肪酸的制剂中的应用。
作为优选，本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备降低2型糖尿病患者游离脂肪酸的制剂中的应用。
实验表明，与模型组比较，金针菇提取物组TC、TG、LDL-c含量明显下降(P<0.05或P<0.01)，表明金针菇提取物可改善2型糖尿病大鼠的血脂代谢紊乱。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备降低血脂的制剂中的应用。
作为优选，本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备降低2型糖尿病患者血脂的制剂中的应用。
与模型组比较，金针菇提取物组于药后第3、4周空腹血糖值均明显降低(P<0.05或P<0.01)，提示金针菇提取物可显著改善2型糖尿病大鼠的高血糖症状。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备降低血糖的制剂中的应用。
作为优选，本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备降低2型糖尿病患者血糖的制剂中的应用。
实验表明，与模型组相比，金针菇提取物组肝糖原、肌糖原含量明显升高(P<0.05或P<0.01)，表明金针菇提取物可以提高2型糖尿病大鼠肝糖原、肌糖原储备。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备肝糖原和/或肌糖原储备促进剂中的应用。
作为优选，本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备降低2型糖尿病患者肝糖原和/或肌糖原储备促进剂中的应用。
实验表明，与模型组比较，金针菇提取物组胰岛素水平、Homa-IR明显降低(P<0.01)，ISI及Homa-β显著升高(P<0.01或P<0.05)，说明金针菇提取物能改善2型糖尿病大鼠高血糖、高胰岛素的状态，增强组织对胰岛素有效利用，改善胰岛素抵抗。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备改善胰岛素抵抗的制剂中的应用
作为优选，本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备改善2型糖尿病患者胰岛素抵抗的制剂中的应用。
实验表明，与模型对照组比较，金针菇提取物组部分胰腺腺泡周围有少量空泡，胰岛体积大，细胞核居中，胞浆较均匀，胰岛结构趋于完整。提示金针菇提取物能增加胰岛内β细胞数目，对胰岛的损伤有较好的改善作用。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备改善和/或预防胰岛损伤的制剂中的应用。
作为优选，发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备改善和/或预防2型糖尿病患者的制剂中的应用。
由于本发明提供制备方法制得的金针菇提取物能够降低2型糖尿病大鼠的血糖，调节血脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗，降低血清游离脂肪酸水平，增加肝糖原、肌糖原储备，修复受损胰腺，故而其具有防治2型糖尿病作用。
本发明提供制备方法制得的金针菇提取物在制备防治糖尿病的产品中的应用。
本发明还提供了一种防治糖尿病的产品，包括本发明提供制备方法制得的金针菇提取物。
所述防治糖尿病的产品为防治糖尿病的药物、保健品或食品。
所述防治糖尿病的药物中包括以本发明提供方法制得的金针菇提取物和药学上可接受的辅料，其剂型为口服制剂或注射剂。所述口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。所述注射剂为注射液剂或粉针剂。
所述防治糖尿病的保健品中包括以本发明提供方法制得的金针菇提取物和保健品上可接受的辅料，其剂型为口服制剂。所述口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
所述防治糖尿病的食品中包括以本发明提供方法制得的金针菇提取物和食品上可接受的配料。
本发明提供方法制得的金针菇提取物中主要包括多糖、蛋白质、维生素和矿物质。经体外实验证明，本发明提供的金针菇提取物能抑制体外α糖苷酶的活力。体内试验表明，金针菇提取物可以明显降低2型糖尿病大鼠的血糖，调节血脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗，降低血清游离脂肪酸水平，增加肝糖原、肌糖原储备，修复受损胰腺，有明显的治疗2型糖尿病作用。
附图说明
图1示空白组大鼠胰腺的形态；
图2示模型组大鼠胰腺的形态；
图3示给予实施例1金针菇多糖的大鼠的胰腺形态；
图4示给予实施例2金针菇多糖的大鼠的胰腺形态。
具体实施方式
本发明提供了一种金针菇提取物及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1金针菇提取物的制备
将清洗后的金针菇粉碎后与水混合，金针菇与水的料液比为1g:7mL，在90℃恒温水浴下提取6h，倒出提取液，加入2％活性炭于60℃水浴脱色2h后，用离心机以4000r/min离心15min，抽滤，提取液于60℃水浴中浓缩，浓缩至原体积的1/4～1/5后，用体积分数为90％乙醇沉淀，室温沉淀过夜，离心得到的提取物放于蒸发皿中在60℃水浴上蒸干，获得金针菇提取物。收率为25.31％。
实施例2金针菇提取物的制备
将清洗后的金针菇于60℃干燥，压成粉末，过300目筛，与水混合，金针菇与水的水料液比为1g:25mL，45℃，625W超声波提取25min，倒出提取液，加入2％活性炭于45℃水浴脱色2h后，用离心机以4000rpm/min离心15min，抽滤，提取液于45℃水浴中浓缩，浓缩原体积的1/4～1/5后，用90％乙醇沉淀，沉淀用sevag法脱蛋白，透析袋透析，冷冻干燥，得到金针菇提取物。收率为15.33％。
实施例3金针菇提取物体外α糖苷酶抑制作用
1.1实验方法
以4-硝基苯--D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，阿卡波糖为阳性药，96孔酶标仪为反应载体，最终反应体系为200uL，测定实施例1～2提供提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性。将加入40uL样品加于40uL 300U活度的α-葡萄糖苷酶溶液中，于37℃下反应5min，加入20uL 0.5mmol/PNPG溶液，于37℃反应30min后，用100uL 0.1mol/LNa2CO3溶液终止反应，在405nm波长处测定溶液的吸收值。在以上反应体系中筛选吸光度为0.2～0.4之间的α-葡萄糖苷酶。样品对酶活性的抑制率(％)按下式计算：
抑制率(％)＝[ABlank﹣(A0﹣A)]/ABlank×100％
式中，ABlank为不加待测样品溶液的吸收值；A0为加入待测样品反应后溶液的吸收值；A为只加待测样品溶液的吸收值。
1.2数据统计方法
采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理。实验结果以均数±标准差表示，Student’s t-test进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。
1.3金针菇提取物对α糖苷酶的抑制率及IC50，实验结果如表1：
表1金针菇提取物对α糖苷酶的抑制率
通过表1，金针菇提取物对α糖苷酶的抑制率呈剂量依赖，当抑制率升至最高时，不再上升，呈下降趋势，得到抑制率在金针菇提取物的浓度为0.00625g/mL时最大，此时抑制率最大为59.14％，即在此浓度时为最佳抑制状态，抑制率最大，IC50为2.86mg/mL(相当于生药量20.72mg/mL)。
实施例4金针菇提取物治疗2型糖尿病的药效
2.1实验方法
2.1.1 2型糖尿病模型的建立
将Wistar大鼠，雄性，体重180-220g，购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心，许可证号：SCXK(吉)2013-0001。适应性饲养一周后，随机分为正常组和造模组，正常组大鼠给予蒸馏水10mL·kg-1，造模组大鼠在正常饮食基础上，每天给予脂肪乳(猪油25％，胆固醇1％，丙硫氧嘧啶1％，吐温-80 25％，1,2-丙二醇20％)，连续1个月。造模组大鼠出现血脂代谢紊乱后，各组动物禁食不禁水12h，正常组腹腔注射生理盐水，模型对照组腹腔注射链脲佐菌素STZ(临用时以0.1mol/L，pH4.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制成1％的STZ溶液。)100mg·kg-1，4h后灌胃给予造模组大鼠25％葡萄糖溶液避免低血糖反应，72h后从造模大鼠中选取空腹血糖值>11.1mmol/L的大鼠为2型糖尿病模型大鼠。
2.1.2实验分组、给药
将上述大鼠随机分为3组，即：空白组(给予水10mL·kg-1)，模型组(给予水10mL·kg-1)，金针菇提取物组1、2(分别给予实施例1～2金针菇提取物2g生药·kg-1)，灌胃给药，连续4周。2型糖尿病大鼠继续给予脂肪乳，每2天1次。
2.1.3测定指标
每周割尾取血，用血糖仪测定空腹血糖值一次(测定前禁食不禁水12h)。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药后，测定各组大鼠空白血糖值，然后于1h后腹腔注射3％戊巴比妥钠30mg·kg-1麻醉，腹主动脉采血，分离血清。采集各鼠同一部位肝脏、肌肉。采集胰腺，10％甲醛固定。集的血清，测定大鼠胰岛素(INS)含量，计算胰岛素抵抗相关指数，测定胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL-c)，低密度脂蛋白(LDL-c)含量，测定游离脂肪酸(FFA)含量；测定肝、肌糖原含量。
2.2数据统计方法
采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理。实验结果以均数±标准差表示，Student’s t-test进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2.3实验结果
2.3.1金针菇提取物对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响
模型组大鼠出现血脂代谢紊乱的基础上注射STZ后，模型组大鼠第0、1、2、3、4周血糖值与空白组相比均显著升高(P<0.01)，表明大鼠2型糖尿病模型建立成功。与模型组比较，金针菇提取物组于药后第3、4周空腹血糖值均明显降低(P<0.05或P<0.01)，提示金针菇提取物可显著改善2型糖尿病大鼠的高血糖症状，见表2。
表2金针菇提取物对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响
与空白组比较**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01
2.3.2金针菇提取物对2型糖尿病大鼠血脂的影响
与空白组比较，模型组TG、TC、LDL-c含量值均显著升高(P<0.05或P<0.01)，HDL-c含量明显下降(P<0.05)；与模型组比较，金针菇提取物组TC、TG、LDL-c含量明显下降(P<0.05或P<0.01)，表明金针菇提取物可改善2型糖尿病大鼠的血脂代谢紊乱，见表3。
表3金针菇提取物对2型糖尿病大鼠血脂的影响
与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01
2.3.3金针菇提取物对2型糖尿病大鼠胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响
与空白组相比，模型组ISI及Homa-β显著下降(P<0.01或P<0.05)，血清胰岛素水平、Homa-IR明显升高(P<0.01)；与模型组比较，金针菇提取物组胰岛素水平、Homa-IR明显降低(P<0.01)，ISI及Homa-β显著升高(P<0.01或P<0.05)，说明金针菇提取物能改善2型糖尿病大鼠高血糖、高胰岛素的状态，增强组织对胰岛素有效利用，改善胰岛素抵抗，见表4。
表4金针菇提取物对大鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响
与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01
2.3.4金针菇提取物对2型糖尿病大鼠糖原的影响
由表5可知，与空白组相比，模型组肝糖原、肌糖原含量明显减少(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比，金针菇提取物组肝糖原、肌糖原含量明显升高(P<0.05或P<0.01)，表明金针菇提取物可以提高2型糖尿病大鼠肝糖原、肌糖原储备。
表5金针菇提取物对2型糖尿病大鼠糖原含量的影响
序号 肝糖原 肌糖原
空白组 5.14±0.81 0.66±0.06
模型组 2.00±0.31** 0.31±0.05*
实施例1金针菇提取物 4.19±0.91## 0.54±0.11#
实施例2金针菇提取物 4.09±1.17## 0.49±1.13#
与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01
2.3.4金针菇提取物对2型糖尿病大鼠游离脂肪酸的影响
由表6可知，与空白组相比，模型组游离脂肪酸(FFA)含量明显升高(P<0.01)，与模型组相比，金针菇提取物组游离脂肪酸含量有所下降(P<0.05)。
表6金针菇提取物对2型糖尿病大鼠游离脂肪酸含量的影响
序号 FFA(μmol·L-1)
空白组 833.59±132.32
模型组 1101.79±125.76**
实施例1金针菇提取物 951.28±71.56#
实施例2金针菇提取物 971.09±59.51#
与空白组比较**P<0.01；与模型组比较#P<0.05
2.3.5金针菇提取物对2型糖尿病大鼠胰腺病理形态学的影响
空白组大鼠胰腺未见病理损伤改变。模型组胰岛数目减少，胰岛结构失去完整性，胰岛细胞分散，分布不均匀，胰岛内β细胞数明显减少。与模型对照组比较，给予金针菇提取物的大鼠部分胰腺腺泡周围有少量空泡，胰岛体积大，细胞核居中，胞浆较均匀，胰岛结构趋于完整。提示金针菇提取物能增加胰岛内β细胞数目，对胰岛的损伤有较好的改善作用。见图1～4。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种金针菇提取物的制备方法，其特征在于，包括：金针菇以水提、醇沉制得金针菇提取物；
所述水提的水与金针菇的体积-质量比为7mL～25mL：1g；
所述水提的温度为45℃～90℃，时间为25min～6h；
所述醇沉采用体积分数为90％的乙醇；
所述醇沉的时间为8h～16h，温度为10℃～30℃。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水提采用超声波辅助提取或水浴加热提取；
所述超声波辅助提取的温度为45℃，时间为25min；所述超声波的功率为600W～650W；
所述水浴加热提取的温度为90℃，时间为6h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水提与醇沉之间还包括活性炭脱色和浓缩的步骤；
所述活性炭脱色的温度为45℃～60℃，时间为1h～3h；
所述浓缩至原体积的1/4～1/5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醇沉之后还包括干燥和/或脱蛋白的步骤；
所述干燥的方式为水浴蒸干或冷冻干燥。
5.权利要求1～4任一项所述的制备方法制得的金针菇提取物。
6.权利要求5所述的金针菇提取物在制备α糖苷酶抑制剂、肝糖原储备促进剂和/或肌糖原储备促进剂中的应用。
7.权利要求5所述的金针菇提取物在制备降低游离脂肪酸、降低血脂和/或血糖的制剂中的应用。
8.权利要求5所述的金针菇提取物在制备改善胰岛素抵抗的制剂中的应用或在制备改善和/或预防胰岛损伤的制剂中的应用。
9.权利要求5所述的金针菇提取物在制备防治糖尿病的产品中的应用。
10.一种防治糖尿病的产品，其特征在于，包括权利要求5所述的金针菇提取物。
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