CN110314160A - 小檗胺在制备预防和治疗糖尿病肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小檗胺在制备预防和治疗糖尿病肾病药物中的应用。本发明具体涉及小檗胺在糖尿病肾病的预防中的应用，表明了小檗胺能够显著降低或提升糖尿病肾病的相关病理指标，同时能够有效的保护肾脏组织的形态以及功能，推测可通过抗炎、防止肾脏组织纤维化等达到保护肾脏作用。

Description

小檗胺在制备预防和治疗糖尿病肾病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体为小檗胺在预防和治疗糖尿病肾病中的新用途。

背景技术

伴随人类社会的不断进步，人们生活逐渐变得丰富多彩，生活质量日渐提高，人类社会对全球环境产生了深远的影响。近些年来，糖尿病已经成为危害人类生命健康稳定的重大病症之一。糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种由遗传变异、免疫功能紊乱和环境等多种因素引起的代谢综合征，其基本特征是持久的慢性高血糖，临床上的病症表现为多饮、多食、多尿、体重下降的“三多一少”症状。糖尿病根据发病机制分为I型糖尿病与II型糖尿病，国内的II型糖尿病病人数量在不断的增长，占较大的比例。I型糖尿病是一种自身免疫性疾病，主要由T淋巴细胞介导，胰岛β细胞被攻击导致破坏，并发炎症，导致系统本身胰岛素分泌绝对不足而发病，常见于青少年与儿童，需使用胰岛素进行终身治疗。II型糖尿病，又称为非胰岛素依赖性糖尿病，主要表现为胰岛素功能障碍及胰岛素抵抗，与肥胖症有着不可分割的联系。遗传因素同样是两类糖尿病发病机制中不可忽略的重要因素。

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)，又称为糖尿病肾小球硬化症，糖尿病高血糖症状促进了机体微血管产生病变进而导致肾小球发生硬化。慢性肾小球肾炎是导致终末期肾病的主要发病原因之一，糖尿病肾病已经成为第二大发病原因。目前临床上对于治疗DN的方法中，主要是控制患者的血糖血压、纠正机体血脂代谢的不正常、降低胰岛素抵抗效应、使用血管紧张素转换酶抑制剂以及血管紧张素受体阻断剂降低肾脏蛋白尿的产生，进一步保护肾脏组织的正常功能，这些能够显著改善患者的生活质量以及身体的耐受性。虽然已经在临床上对患者能够减缓蛋白尿以及保护肾功能、改善生活质量，一定程度降低了糖尿病肾病的病死率，但是如何更好的治疗、预防DN的发生，仍旧是一个世界性的临床难题，需要积极的研发新的药物和临场治疗方案。因此，研究开发治疗或预防糖尿病并发症——糖尿病肾病的药物具有巨大的市场前景。

西医药物治疗糖尿病肾病的一线用药为血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)类药物，另外还可配合一些抗凝及改善微循环等药物，所用的药物及其疗效均十分有限，且常伴有不良反应(血管神经性水肿、体位性眩晕、胃肠道反应等)。

传统中药由于安全性和毒副作用等方面的优势而受到人们的青睐。小檗胺是从小檗科小檗属植物黄连、三颗针、细叶小檗等中药植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，它有抗心律失常、抗肿瘤、促进白细胞增生等药理作用。临床上，小檗胺适用于化疗、放疗、及慢性苯中毒引起的白细胞减少。口服盐酸小檗碱片的不良反应较少，偶有恶心、呕吐、皮疹和药热，长期服用有可能会引起便秘，停药后消失副作用消失。另外，小檗胺属于叔胺碱，碱性较小檗胺弱，因此表现出更好的肠道吸收率。然而小檗胺在肾病方面的应用还未见报道。

发明内容

本发明的目的是将小檗胺应用于糖尿病肾病的预防和治疗。

本发明采用的技术方案是：小檗胺单用或与其他治疗肾病的药物联用在制备预防和治疗肾病药物中的应用。

小檗胺的结构式如下所示：

进一步的，所述肾病为糖尿病并发症引起的糖尿病肾病。

进一步的，所述糖尿病为I型或II型糖尿病。

进一步的，所述小檗胺在制备降低血肌酐、血尿素氮和尿蛋白总量药物中的应用。

进一步的，所述小檗胺在制备降低糖尿病肾病中肾脏内炎症因子的表达量药物中的应用。

进一步的，所述小檗胺在制备抑制细胞外基质(ECM)分泌、防止肾脏细胞纤维化药物中的应用。

本发明的有益效果是：小檗胺作为上市药物，属于叔胺碱，呈弱碱性肠道吸收好，具有安全性高，毒副作用低的优点，且已形成良好的稳定剂型。本发明通过灌胃给药方式给予各组相应药物45天，对各组小鼠体重、空腹血糖值、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白总量和24h尿量等生理生化指标进行测定，取部分肾脏和胰腺组织制作石蜡组织切片并通过HE染色进行组织变化研究，通过Western blot分析肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β(TGF-β)在肾脏中的表达情况，研究表明小檗胺能够显著降低或提升了糖尿病肾病的相关病理指标，同时能够有效的保护肾脏组织的形态以及功能，推测可通过抗炎、防止肾脏组织纤维化等达到保护肾脏作用。本发明为小檗胺提供了一种新的药用用途，缩短了在预防和治疗II型糖尿病肾病新药研发的时间，节省了相关新药研发的经费。

附图说明

图1是正常组与糖尿病小鼠空腹血糖值。

图2是正常组与糖尿病小鼠OGTT实验血糖变化曲线。

图3是正常组与糖尿病小鼠模型组甘油三酯测定结果。

图4是正常组与糖尿病小鼠模型组高密度脂蛋白胆固醇测定结果。

图5是正常组与糖尿病小鼠模型组血尿素氮测定结果。

图6是正常组与糖尿病小鼠模型组血肌酐测定结果。

图7是各组小鼠给药45天空腹血糖变化趋势。

图8是各组小鼠给药第45天空腹血糖测定结果。

图9是各组小鼠给药第45天24h尿量。

图10是各组小鼠给药第45天24h尿蛋白总量。

图11是各组小鼠给药第45天甘油三酯测定结果。

图12是各组小鼠给药第45天高密度脂蛋白胆固醇测定结果。

图13是各组小鼠给药45天血尿素氮变化趋势。

图14是各组小鼠给药第45天血尿素氮变。

图15是各组小鼠给药45天血肌酐变化趋势。

图16是各组小鼠给药第45天血肌酐。

图17a是正常组小鼠肾脏给药第45天不同视野下肾脏组织切片HE染色结果。

图17b是模型组小鼠肾脏给药第45天不同视野下肾脏组织切片HE染色结果；

图17c是小檗胺(70mg/kg)给药组肾脏给药第45天不同视野下肾脏组织切片HE染色结果；

图17d是小檗胺(140mg/kg)给药组肾脏给药第45天不同视野下肾脏组织切片HE染色结果；

图17e是小檗胺(280mg/kg)给药组肾脏给药第45天不同视野下肾脏组织切片HE染色结果；

图17f是罗格列酮给药组肾脏给药第45天不同视野下肾脏组织切片HE染色结果；

图18a是小檗胺与罗格列酮对II型糖尿病肾病小鼠肾脏TNF-α的表达量影响的WesternBlot结果。

图18b是小檗胺与罗格列酮对II型糖尿病肾病小鼠肾脏TNF-α的表达影响的WesternBlot结果的柱状分析图。

图19a是小檗胺与罗格列酮对II型糖尿病肾病小鼠肾脏TGF-β的表达量影响WesternBlot结果。

图19b是小檗胺与罗格列酮对II型糖尿病肾病小鼠肾脏TGF-β的表达量影响WesternBlot结果的柱状分析图。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例

方法：将合格小鼠随机分为正常对照组、II型糖尿病肾病模型组、小檗胺低、中、高剂量组(70mg/kg、140mg/kg、280mg/kg)、罗格列酮(70mg/kg)组，灌胃给予小檗胺、罗格列酮以及等量的蒸馏水45天，在给药第0、15、30、45天每组通过剪尾采血测定空腹血糖值、眼眶取血测定高密度脂蛋白、甘油三酯、血肌酐、血尿素氮。给药第45天后，将各组小鼠转移至代谢笼中，收集24h尿液，测定尿蛋白总量。称量各组小鼠体重，脱颈处死小鼠，解剖，收集各组小鼠肾脏制作组织切片，并进行HE染色。

(一)通过生化指标对小檗胺抗糖尿病作用的药效学考察

糖尿病小鼠模型的建立：

图1是II型糖尿病肾病模型小鼠的空腹血糖值变化。4周龄昆明小鼠通过灌胃高糖脂肪乳4周，与正常对照组比较，体重明显上升，体型肥胖。通过两次腹腔注射STZ后，空腹血糖值≥11.1mmol/L的小鼠视为II型糖尿病模型组。在给药前过夜禁食12h后，测定正常对照组与模型组小鼠各项血液生理指标并作统计学分析。由图1可见，模型组小鼠空腹血糖值(16.9mmol/L)与正常对照小鼠的空腹血糖值(6.0mmol/L)具有显著性差异，模型组小鼠血糖值远远高于正常对照组小鼠。

图2是II型糖尿病肾病模型小鼠的口服糖耐量变化。在口服糖耐量实验(OGTT)过程中，正常对照组与模型组的小鼠在灌胃给予2g/kg的20％葡萄糖溶液后，血糖均呈上升趋势，且在30min时达到顶峰(对照组达到11.5，模型组达到26.8mmol/L)，且在30min后开始下降。正常对照组小鼠的血糖值在60min时降至接近空腹血糖值(7.8mmol/L)，在120min时恢复至正常水平(6.6mmol/L)。而模型组小鼠灌胃给予葡萄糖溶液后，血糖上升幅度明显大于正常对照组，且120min内未能恢复到起始水平(16.7mmol/L)，说明模型组小鼠的糖耐受性大大下降，机体产生了胰岛素抵抗，导致胰岛素降血糖能力大大下降。

图3、4分别是模型组与正常组小鼠的甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。为通过眼眶取血，离心分离得到各组小鼠血浆样本进行测定的结果。如图所示，模型组小鼠的TG(图3)和HDL-C(图4)指标分别达到1.39mmol/L、0.70mmol/L相对于正常对照组小鼠的TG(0.82mmol/L)和HDL-C(1.51mmol/L)，其各项指标均有显著性差异，实验结果表明II型糖尿病小鼠模型的建立成功。

图5、6是II型糖尿病肾病模型小鼠的生化指标变化，分别为血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)指标数值。结果表明：其中模型组的BUN和Scr含量已达到11.4mmol/L、11.9mmol/L与正常组小鼠的BUN(6.91mmol/L)和Scr(7.25mmol/L)比较，显著性增高，说明II型糖尿病小鼠发病同时伴有肾病并发症，并且II型糖尿病小鼠肾病模型建立成功。

1、空腹血糖值的变化

图7是各组小鼠给药45天空腹血糖变化趋势。图8是各组小鼠给药第45天空腹血糖测定结果。

实验结果表明，正常对照组小鼠空腹血糖值无明显变化，II型糖尿病肾病模型组小鼠空腹血糖值持续上升，对给药第45天后空腹血糖值进行差异显著性比较，II型糖尿病肾病模型组空腹血糖值达到29.6mmol/L与正常对照组7.6mmol/L相比，差异极其显著。小檗胺三个剂量组均能够显著缓解II型糖尿病肾病模型小鼠血糖持续上升，且具有剂量依赖性。对给药45天后空腹血糖值进行差异显著性比较，低剂量组空腹血糖值达21.9mmol/L与II型糖尿病肾病模型组的空腹血糖值29.6mmol/L相比，差异达极显著水平；中剂量组空腹血糖值达到20.4mmol/L与高剂量组17.1mmol/L、II型糖尿病肾病模型组29.6mmol/L相比，差异达极其显著水平。罗格列酮组空腹血糖值达18.4mmol/L与II型糖尿病肾病模型组29.6mmol/L相比，同样差异达极其显著水平，药效介于小檗胺中、高剂量组之间。

2、尿量及尿蛋白的变化

图9是各组小鼠给药第45天24h尿量。根据24h尿量，II型糖尿病肾病模型组小鼠的尿量明显高于其它组别，达到9.50mL。正常对照组24h尿量为0.60mL与给药组尿量接近。低、中、高剂量组，24h尿量分别达到1.63mL、1.40mL、1.07mL。小檗胺三个剂量组均可以显著地降低24h尿量，且效果明显强于罗格列酮组(24h尿量为3.60mL)。

图10是各组小鼠给药第45天24h尿蛋白总量。在尿蛋白总量各方面，II型糖尿病肾病模型小鼠尿蛋白总量达到4.5mg明显高于正常对照组1.21mg。小檗胺三个剂量组均可以显著地降低尿蛋白总量，低、中、高剂量组，尿蛋白总量分别达到1.24mg、0.94mg、0.82mg，且效果明显好于罗格列酮组(尿蛋白总量为2.75mg)。

3、甘油三酯、HDL-C含量的变化

图11是各组小鼠给药第45天甘油三酯测定结果。结果表明，II型糖尿病肾病小鼠甘油三酯水平达到1.40mmol/L明显高于正常对照组0.98mmol/L。小檗胺三个剂量组均可降低II型糖尿病肾病小鼠的甘油三酯，且具有剂量依赖性。低、中、高给药剂量组甘油三酯水平分别为0.88mmol/L、0.80mmol/L、0.72mmol/L，且其作用明显好于罗格列酮组(甘油三酯水平为0.93mmol/L)。

图12是各组小鼠给药第45天高密度脂蛋白胆固醇测定结果。结果表明，II型糖尿病肾病小鼠HDL-C(0.15mmol/L)明显低于正常对照组(0.38mmol/L)。小檗胺低、中、高剂量组HDL-C分别达到0.28、0.37、0.54mmol/L，其中的中、高剂量组可以显著增加II型糖尿病肾病小鼠的HDL-C含量，具有剂量依赖性，且其作用明显好于罗格列酮组(0.24mmol/L)。

综合以上实验结果可以得出：小檗胺具有较强的抗II型糖尿病作用，并表现出一定的计量依赖性，其中、高剂量的抗糖尿病作用要好于70mg/kg的罗格列酮。

(二)通过生化指标对小檗胺抗糖尿病肾病作用的药效学考察

1、血尿素氮含量的变化

图13是各组小鼠给药45天血尿素氮变化趋势。图14是各组小鼠给药第45天血尿素氮变。由实验结果表明，II型糖尿病肾病模型组小鼠的血尿素氮持续上升，在第45天可达到12.5mmol/L。给药45天后，小檗胺低、中、高量组BUN含量分别达到8.41mmol/L、8.15mmol/L、6.90mmol/L，三个剂量组均可以显著降低小鼠血尿素氮水平，且具有剂量依赖性。由图14可知，给药45天后，高剂量组的效果要明显好于罗格列酮组(BUN含量为8.08mmol/L)。

2、血肌酐含量的变化

图15是各组小鼠给药45天血肌酐变化趋势。图16是各组小鼠给药第45天血肌酐。实验结果表明，II型糖尿病肾病模型组小鼠的血肌酐持续上升，在第45天达到40.6μmol/L。小檗胺低、中、高量组的BUN含量在第45天分别达到20.1、19.0、14.2μmol/L，小檗胺三个剂量组均可以显著降低小鼠血肌酐水平，且具有剂量依赖性，表明降低血肌酐的能力均显著超过了罗格列酮(BUN含量达到31.6μmol/L)。

综合以上实验结果可以得出：小檗胺具有较强的抗II型糖尿病肾病作用，并表现出一定的计量依赖性。其抗血肌酐上升能力尤其突出，低、中、高三个剂量组的抗糖尿病肾病作用均显著超过罗格列酮(70mg/kg)。

(三)通过肾脏组织解剖对小檗胺预防糖尿病肾病作用的药效学考察

1、肾脏组织结构的变化

图17a～图17f为给药第45天各组小鼠不同视野下肾脏组织切片HE染色结果。实验结果表明，正常对照组小鼠的肾组织肾小管排列紧密，肾小管上皮细胞排列规则，形态正常，肾小球毛细血管界限清晰，组织未见明显异常(图17a)。如图17b所示，II型糖尿病肾病模型小鼠的肾小管管腔扩张(箭头a所示)；髓质靠近尿道上皮处及肾小管间质可见较多炎性细胞灶性浸润(箭头b所示)，并可见少量肾小管间质淤血(箭头c所示)。

小檗胺各给药组中，70mg/kg剂量组的肾组织肾小管排列紧密，肾小管上皮细胞排列规则，形态正常，部分肾小血管周围可见较多炎性细胞灶性浸润，黑色箭头所示；组织未见其他明显异常(图17c)。140mg/kg剂量组的肾组织肾小管排列紧密，肾小管上皮细胞排列规则，形态正常，部分肾小血管周围可见少量炎性细胞灶性浸润，黑色箭头所示；组织未见其他明显异常(图17d)。280mg/kg剂量组的肾组织肾小管排列紧密，肾小管上皮细胞排列规则，形态正常，肾小球毛细血管界限清晰，组织未见明显异常(图17e)。罗格列酮组的组织皮质可见多处损伤，结构紊乱，部分肾小管萎缩(箭头a所示)；肾小管间质结缔组织增生(箭头b所示)，并伴有大量炎性细胞浸润(箭头b所示)；较多肾小管扩张，肾小管上皮细胞扁平化(箭头d所示)；少量肾小管管腔内可见坏死细胞碎片(箭头e所示)；可见少量肾小管管型(箭头f所示)；肾小球结构无明显改变(图17f)。从中可以看出，中、高剂量(140mg/kg、280mg/kg)小檗胺对肾脏组织的保护效果要明显好于罗格列酮(70mg/kg)。

2、组织病变评分

病变评分：根据病变由轻到重的程度，依次半定量为极少量或无病变为阴性“-”记0；轻度或少量“+”记1；中度或中等量“++”记2；重度或多量“+++”记3；极重度或大量“++++”记4。通过肾脏组织病变评分表也可以看出，中、高剂量(140mg/kg、280mg/kg)小檗胺对肾脏组织的保护效果要明显好于罗格列酮(70mg/kg)(表1)。

表1各组小鼠肾脏病变评分

由表1可见，II糖尿病肾病模型组小鼠的肾脏有重度的炎症表现，以及中等程度的肾小管扩张和轻度的淤血。小檗胺低、中、高三个剂量组均能够改善小鼠肾脏的炎症、肾小管扩张和淤血的现象，且肾脏病变评分均低于罗格列酮组。

(四)小檗胺预防糖尿病肾病机制

1、小檗胺不同剂量对小鼠肾脏组织TNF-α表达量的影响

图18a和图18b是小檗胺与罗格列酮对II型糖尿病肾病小鼠肾脏TNF-α的表达量影响。结果表明，II型糖尿病肾病模型组小鼠的肾脏TNF-α含量明显上升，且与正常对照组小鼠肾脏TNF-α含量具有显著性差异。小檗胺低、中、高剂量组，小鼠肾脏TNF-α含量随着剂量增高，逐渐降低。中、高剂量组与模型对照组相比具有显著差异性，含量水平与正常对照组(32.4％)相近，给药45天后低、中、高剂量组的TNF-α含量分别达到102.6％、66.6％、37.0％。小檗胺高剂量组降低小鼠肾脏TNF-α表达量的能力超过了罗格列酮组(42.6％)。由此可见，小檗胺能够显著降低II型糖尿病肾病小鼠肾脏TNF-α的表达量，且呈剂量依赖性。

2、小檗胺不同剂量对小鼠肾脏TGF-β表达量的影响

图19a和图19b是小檗胺与罗格列酮对II型糖尿病肾病小鼠肾脏TGF-β的表达量影响。结果显示，II型糖尿病肾病模型组小鼠的肾脏TGF-β表达量明显上升，其表达量设为100％，其他各组与之相比较。与正常对照组小鼠肾脏TGF-β表达量(57.3％)具有显著性差异。小檗胺低、中、高剂量组，均能显著降低II型糖尿病肾病模型小鼠肾脏TGF-β的表达量。小鼠肾脏TGF-β的表达量随着小檗胺剂量增高而逐渐降低，表现出明显的计量依赖性，给药45天后低、中、高剂量组的TGF-β的含量分别达到97.9％、55.2％、43.0％，小檗胺中、高剂量组中肾脏TGF-β的含量水平接近于正常对照组(57.3％)，且明显好于罗格列酮对照组(71.6％)。由此可见，小檗胺能够显著降低II型糖尿病肾病小鼠肾脏TGF-β的表达量，且呈剂量依赖性，中、高剂量组的处理效果显著好于罗格列酮。

Claims (6)

1.小檗胺单用或与其他治疗肾病的药物联用在制备预防和治疗肾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾病为糖尿病并发症引起的糖尿病肾病。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述糖尿病为I型或II型糖尿病。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述小檗胺在制备降低血肌酐、血尿素氮和尿蛋白总量药物中的应用。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述小檗胺在制备降低糖尿病肾病中肾脏内炎症因子的表达量药物中的应用。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述小檗胺在制备抑制细胞外基质(ECM)分泌、防止肾脏细胞纤维化药物中的应用。