CN103436571A - 一种提高百合多糖活性的酶法修饰制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法，属于农产品功能成分制备技术领域。采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法对百合多糖(403.3kDa)进行生物修饰(即酶法可控降解)。修饰后经分离纯化，产物百合多糖的分子量为8.0kDa～70.0kDa。采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖及其修饰产物体外免疫调节活性。修饰后的百合多糖活性显著提高，与底物相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5～77.2％。百合多糖的分子量过高或过低，其活性都较低。本发明创立了提高百合多糖免疫活性的方法，生物修饰后的百合多糖在医药和功能食品领域更具应用价值。
Description
技术领域
本发明属于农产品功能成分制备技术领域，涉及一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法。
背景技术
百合是国家卫生部审批通过的首批药食两用品之一，不仅在临床上有着广泛的应用，而且还具有很好的保健作用，百合多糖是百合的主要功能因子之一。研究表明百合多糖具有增强免疫，抗肿瘤等生物活性。通过超声波辅助热水浸提法，我们从百合中提取一种百合多糖，分子量为403.3kDa，主要由甘露糖、葡萄糖按1∶1的摩尔比通过β-1，4糖苷键组成(含有少量1→2或1→6键型)，还含有微量的阿拉伯糖和少量硫酸基团。采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖免疫调节活性，发现该百合多糖活性较低，主要原因可能是其分子量过大，粘度较高所致。因此，通过对百合多糖化合物结构进行改造，降低分子量，寻找活性更强的百合多糖修饰产物的研究具有重要意义。
对于化合物的分子修饰，可采用物理、化学或生物(酶法)。相对于物理或化学方法，采用酶法对百合多糖进行降解具有专一性强，反应可控，产物分子量分散度小等优点。β-甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖。β-葡聚糖酶能专一性作用于β-葡聚糖的β-1，4和β-1，3糖苷键产生低聚糖。但是，我们前期的实验表明两种酶单独作用于百合多糖时效率较低。因为两种酶有着相似的最适作用温度和pH，因此我们将两种酶以一定的用量比复合应用于百合多糖的降解，获得较好的作用效果。
本发明采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法对百合多糖进行可控降解修饰，通过反应条件控制，以期获得系列高活性的百合多糖修饰产物。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于针对百合多糖活性低的问题，提供一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法。
技术方案
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法对百合多糖(403.3kDa)进行生物修饰，酶作用条件为：底物百合多糖浓度30～40g/L；β-甘露聚糖酶浓度500～900U/L，β-葡聚糖酶250～450U/L；pH5.5～6.5(PBS缓冲液)；温度40～55℃；时间0.5～1.0h。
反应结束后去除酶及产物分离制备方法为：反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物，百合多糖修饰产物的分子量是8.0kDa～70.0kDa。
采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖及修饰产物体外免疫调节活性，修饰后的百合多糖活性显著提高，与底物相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5～77.2％。
本发明技术与产品具有如下的有益效果：采用酶法对百合多糖进行降解修饰具有专一性强，反应可控，产物分子量分散度小等优点；通过可控降解修饰，修饰产物的免疫活性明显提高，生物修饰后的百合多糖可广泛应用于医药和功能食品领域。
具体实施方式
研究中所用的酶活力及生产公司如下：β-甘露聚糖酶(10000U/g)，禾本生物工程有限公司；β-葡聚糖酶(50000U/g)，上海工硕生物技术有限公司。
实施例1
按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰：底物百合多糖浓度30/L；β-甘露聚糖酶浓度500U/L，β-葡聚糖酶250U/L；pH5.5(PBS缓冲液)；温度40℃；时间0.5h。反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量：70.0kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5％。
实施例2
按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰：底物百合多糖浓度35/L；β-甘露聚糖酶浓度600U/L，β-葡聚糖酶300U/L；pH6.0(PBS缓冲液)；温度45℃；时间40min。反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量：50.3kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加45.2％。
实施例3
按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰：底物百合多糖浓度40/L；β-甘露聚糖酶浓度700U/L，β-葡聚糖酶350U/L；pH6.5(PBS缓冲液)；温度45℃；时间50min。反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量：40.5kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加55.0％。
实施例4
按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰：底物百合多糖浓度35/L；β-甘露聚糖酶浓度800U/L，β-葡聚糖酶400U/L；pH6.0(PBS缓冲液)；温度50℃：时间45min。反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量：30.5kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加77.2％。
实施例5
按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰：底物百合多糖浓度30/L；β-甘露聚糖酶浓度850U/L，β-葡聚糖酶425U/L；pH6.5(PBS缓冲液)；温度50℃；时间50min。反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量：18.3kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加60.8％。
实施例6
按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰：底物百合多糖浓度30/L；β-甘露聚糖酶浓度900U/L，β-葡聚糖酶450U/L；pH6.5(PBS缓冲液)；温度55℃；时间1h。反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量：8.0kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加50.8％。
Claims (6)
1.一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法，其特征在于采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法对百合多糖(403.3kDa)进行生物修饰(即酶法可控降解)，通过反应条件控制，获得系列高免疫活性百合多糖修饰产物。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于复合酶的作用条件为：底物百合多糖浓度30～40g/L；β-甘露聚糖酶浓度500～900U/L，β-葡聚糖酶250～450U/L；pH5.5～6.5(PBS缓冲液)；温度40～55℃；时间0.5～1.0h。
3.根据权利要求1～2所述的方法，在复合酶中，β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶用量比为2∶1(U/U)。
4.根据权利要求1～3所述的方法，其特征在于反应结束后去除酶及产物分离制备方法为：反应结束后，将溶液加热至100℃，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4℃，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物，百合多糖修饰产物的分子量范围是8.0kDa～70.0kDa。
5.根据权利要求1～4所述的方法，其特征在于采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖及修饰产物体外免疫调节活性，修饰后的百合多糖活性显著提高，与底物相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5～77.2％。百合多糖的分子量过高或过低，其活性都较低。
6.根据权利要求1～5所述的方法，其特征在于百合多糖、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶，pH，温度及作用时间优选组合为35g/L、800U/L和400U/L、6.0(PBS缓冲液)、50℃和45min。在此作用条件下，百合多糖修饰产物的分子量为30.5kDa。与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加77.2％。
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