KR101591071B1 - 감잎으로부터 면역 증강 활성이 있는 다당류의 신속 분리 방법 - Google Patents

감잎으로부터 면역 증강 활성이 있는 다당류의 신속 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 감잎으로부터 면역 증강 활성이 있는 다당류의 신속 분리 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 (a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; (f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 감잎 유래 고면역활성 다당에 관한 것이다.
본 발명의 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법은, 다당 혼합물로부터 특정 다당의 분리 및 정제를 위해 행해오던 기존의 방법들보다 신속하고 효율적으로, 면역증강활성이 있는 람노갈락투로난을 분리하는 효과가 뛰어나다.

Description

감잎으로부터 면역 증강 활성이 있는 다당류의 신속 분리 방법{Rapid isolation method for preparation of immuno-stimulating polysaccharides from persimmon leaves}
본 발명은 감잎으로부터 면역 증강 활성이 있는 다당류의 신속 분리 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 (a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; (f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 감잎 유래 고면역활성 다당에 관한 것이다.
펙틴(pectin)을 포함한 펙틴물질들은 고등식물의 1차 세포벽과 중엽에 주로 존재하는 다당류로써 식물 세포벽의 구성다당류 중 가장 복잡한 형태로 존재하고 있다. 펙틴 물질은 과거 D-galacturonic acid (galA)가 α-1,4 결합으로 연결된 고분자 물질(α-D-1,4-polygalacturonic acid)로, 구성 galA의 carboxyl기가 methylester화 되어 있거나 염형태, 혹은 free acid형태를 가지고 있다고 알려져 왔으나 실제로 자연계에 존재하는 펙틴은 이보다 훨씬 복잡한 구조를 가지고 있다고 보고되고 있는데 전체분자의 많은 부분은 homogalacturonan으로 구성되어 있지만 여기에 다양한 oligo- 및 polysaccharide로 분지된 rhamnogalacturonan I (RG-I) 및 RG-II가 공유적으로 결합되어 있는 것으로 보고되어 있다. 이들의 구조는 Albersheim 등에 의해 비교적 상세히 밝혀져 보고되고 있는데 RG-I의 경우, GalA와 rhamnose (Rha)로 구성된 [-4)-a-D-GalA-(1,2)-a-L-Rha-(1]n의 이당류가 반복되어 연결된 backbone (rhamnogalacturonan core)에 arabinan, galactan, arabinogalactan 및 oligosaccharide류가 Rha를 경유하여 고도로 분지된 구조를 가지고 있다. 또한 RG-II는 a-1,4 결합으로 연결된 homogalacturonan을 주쇄로 하고, 여기에 일반 다당류에서는 거의 관찰되지 않는 2-methylfucose (2-Me-Fuc), 2-methylxylose (2-Me-xyl), apiose (Api), aceric acid (AceA), KDO (2-keto-3-deoxyocturosonic acid) 및 DHA (3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)와 galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), rhamnose (Rha), arabinose (Ara) 등을 구성당으로 하는 oligosaccharide가 아주 복잡한 형태로 분지되어 존재하고 있으며 RG-I에 비해 크기가 작은 다당으로 알려져 있다. 구성된 식물체 다당에서 보이는 각종 약리활성은 주로 pectin류에 존재하는 rhamnogalacturonan(RG)의 구조적 차이와 밀접한 관련이 있다고 보고되고 있다.
감(persimmon, Diospyros kaki Thumb)은 우리나라를 비롯한 동북아시아에서 널리 재배되고 있으며, carotenoid, pectin, polyphenol과 같은 영양 및 건강 성분들에 대한 인식으로, 최근 남부 유럽에서도 재배가 확산되고 있는 과실이다. 그러나 감잎은 제한된 양만이 차 등으로 가공될 뿐 대부분 낙엽 형태로 폐기되며, 이용도가 매우 낮은 농산 부산물이다. 따라서 감잎을 이용하여 고부가가치 기능성 소재로의 개발은 부산물 활용 및 농가소득 증대라는 측면에서 큰 의의가 있다고 할 수 있다. 최근 감잎에 관한 생리활성 연구로 항산화 및 아토피성 피부염 개선 효과, 체지방 감량 및 지질대사 조절 효과, 미백 및 항노화 효과, 항고혈압 및 혈관 이완 등이 보고된 바 있으며, 감잎의 항암효과, 돌연변이 유발 억제 및 암세포 증식 억제 효과, 위암 세포주에서 항암효과 등도 보고된 바 있다. 하지만 감잎의 생리활성에 대한 연구는 대부분 flavonoid나 tannin을 대상으로 진행되어 왔으며, 감잎에 존재하는 다당류에 대한 연구나 그들이 갖는 기능성에 관한 연구는 극히 미진한 실정이다.
일반적으로 다당의 혼합물로부터 특정 분자량과 생물활성을 소유한 다당을 선택적으로 분리하는 과정은 분리원리가 상이한 여러 단계의 column chromatography, ultrafiltration 등을 필수적으로 거쳐야 하며, 다당이 용해되어 있는 용출 용매 중에 존재하는 완충용액 유래의 염류 및 저분자 물질을 제거할 목적으로 투석 또는 탈염과정이 요구되는 등, 많은 전처리 과정을 거쳐야 한다. 따라서 다당의 혼합물로부터 다당의 분리 정제 과정은 굉장히 복잡하고 많은 시간을 소모하고, 최종 조제물의 단가를 상승시키는 등의 문제점을 가지고 있어 이를 연구하는 연구자들이나 산업적 생산자들에게 큰 부담이 되고 있다. 어려움을 겪고 있다.
이에 본 발명의 발명자들은 감잎으로부터 고면역활성 다당인 RG-I 및 RG-II를 기존방법보다 신속하고 효율적으로 분리 및 정제할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중 에탄올 (ethanol)을 이용한 용매 분획법을 개발하였고, 상기 에탄올 분획법이 신속하고 효율적으로 RG-I 및 RG-II를 분리해냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; 및
(f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 감잎 유래 고면역활성 다당을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; 및
(f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 감잎 유래 고면역활성 다당을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
(a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
(e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; 및
(f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법을 제공한다.
(a) 단계는 감잎에 펙틴분해효소를 처리 후 침전시켜, 고형물(또는 침전물)을 제거하고 분해물(또는 상등액)을 회수하는 단계이다.
상기 감잎은, 감잎의 원형을 회손하지 않고 그대로 사용하거나, 당업자가 의도하는 공정 속도 및 공정(제조) 효율을 고려하여 전처리 과정을 수행한 후 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 감잎은 감잎을 건조한 후 분말화하여 사용될 수 있다. 상기 감잎의 건조 및 분말화 방법은 당업자에게 공지된 식물 건조분말화 방법이라면 제한되지 않으며, 예를 들어 감잎을 40℃ 내지 60 ℃ 에서 열풍건조한 뒤, 1 내지 40 mesh 의 입자로 분말화 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계에서는 당업자의 필요에 따라 감잎 또는 감잎 분말을 탈색하는 단계를 임의로 추가할 수 있다. 감잎 분말을 탈색하기 위한 용매로는 인체에 무해하여 그 사용이 허가된 탈색 용매라면 그 종류가 제한되지 않으며. 바람직하게는 에탄올, 아황산칼륨, 아황산나트륨, 이산화황, 과산화벤조 일 수 있고, 가장 바람직하게는 에탄올이다.
펙틴(pectin) 또는 펙틴물질(pectic substance)들은 고등식물의 1차 세포벽과 중엽(middle lamella)에 주로 존재하는 다당류로써 매우 복잡한 구조를 가지고 있다고 보고되어 있다. 펙틴은 전체 분자의 많은 부분이 homogalacturonan으로 구성되어 있지만(Kwon MH et al., Food Sci. Ind.;30:30-43,1997), 여기에 다양한 oligo- 및 polysaccharide로 분지된 rhamnogalacturonan(람노갈락투로난)-I(RG-I) 및 rhamnogalacturonan-II(RG-II)가 공유적으로 결합되어 있는 것으로 알려져 있다(Kim JM et al., Biochem. Bioph. Res. Co.;344:765-771,2006).
펙틴분해효소는 펙틴의 분해에 관계하는 효소를 의미하는 것으로, 펙틴 분해에 관계하는 효소류는 펙티나아제[펙틴 가수분해 효소(pectinase, EC 3.2.1.15) 또는 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase, EC 3.2.1.15)와 펙틴에스테라아제(pectinesterase, EC 3.1.1.11)로 대별할 수 있다. 펙티나아제(pectinase)는 에스테르화도가 높은 펙틴의 주 사슬 안쪽에서 임의로 가수분해하는 엔도형 폴리메틸갈락투로나아제(polymethyl galacturonase)와 그 말단에서 가수분해하는 엑소형 폴리메틸 갈락투로나아제(polymethyl galacturonase), 그리고 에스테르화도가 낮은 펙트산(pectic acid)을 안쪽에서 임의로 가수분해하는 엔도형 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase)와 그 말단에서 분해하는 엑소형 폴리갈락투로나아제의 4종으로 세분할 수 있으며 펙틴에스테라아제는 메틸에스테르기를 가수분해하는 효소이다. 펙틴과 펙트산에 엔도형으로 작용하여 비환원 말단의 C4, C5 간에 불포화 결합을 갖는 당을 생성하는 분해효소로 메틸에스테르화된 기질에 작용하는 펙틴 분해효소(pectin lyase, 4.2.2.10)와 유리의 펙트산에 작용하는 펙트산 분해효소(pectatelyase, EC 4.2.2.2) 등도 있다.
본 발명의 펙틴분해효소는 펙틴을 분해하는 활성을 나타내는 것이면 특별한 제한은 없으나, 예를 들어 Macerozyme R-10™, Pectinex Ultra SPL™, Pectinex 3XL™, pectinex 100L™, Pectolyase Y-23™, Cytolase PCL5™, Rapidase™, Rapidase C80 max™, Rapidase press™, viscozyme L™, Rohament™ 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으며, 바람직하게 Rapidase C80 max™일 수 있다.
펙틴분해효소는 당업자가 의도하는 반응 속도 및 효과에 따라 알맞게 그 처리 용량을 설정할 수 있으며, 감잎 분말 중량 대비 0.01 내지 10%(v/w) 만큼 첨가하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 0.5 내지 5%(v/w) 이고, 가장 바람직하게는 1 내지 3%(v/w)일 수 있다.
펙틴분해효소를 처리하는 상기 감잎 분말은 증류수로 5배 내지 30배(w/v), 더욱 바람직하게는 10배 내지 20배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다. 상기 펙틴분해효소의 처리는 1 내지 5일 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 2 내지 4일 일 수 있다. 상기 (a) 단계는 효소 처리 후, 잔존 펙틴분해효소를 90 내지 110℃에서 10 내지 60분동안 가열하여 효소를 불활성화하는 공정을 추가로 포함 할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당성분의 용출을 증가시키며, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성, 침전시킴으로서 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.
본 발명의 용어‘고형물’이란 액체상에 분산되지 않은 고체 성분 물질을 의미하는 것으로, 바람직하게 상분리에 의한 침전물을 의미한다. 상기‘상분리’란 하나의 상을 형성하고 있는 물질계가 온도, 압력, 조성 등의 변수의 변화로 두 상으로 갈라지는 현상을 의미하며, 기체상-액체상, 액체상-고체상 등의 상분리를 의미한다. 또한 본 명세서에서‘상분리’는 ‘층분리’와 동일한 의미로 사용될 수 있고, 실질적으로 하나의 성분에 의해 형성된 층이 실질적으로 다른 성분에 의해 형성된 층 상에 위치하거나 배열되는 것을 의미할 수 있다. 상기‘실질적으로 하나의 성분에 의해 형성된 층’은 하나의 층에 하나의 성분만 존재하거나, 하나의 성분이 그 이외의 성분 대비 풍부한(rich)것을 의미할 수 있다. 본 발명의 상분리 또는 고형물 제거방법은 당업자에게 공지된 상분리 방법이라면 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 침전 방법일 수 있다. 상기‘침전(precipitation)’이란 액체 속에 존재하는 작은 고체가 액체 바닥에 가라앉아 쌓이는 일을 의미하는 것으로, 여과, 원심분리 등을 포함하는 일반적인 고형물 분리를 의미한다.
본 발명의 침전 방법은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 원심분리 방법일 수 있다. 상기 ‘원심분리(centrifugation)’란 회전에 의한 원심력을 이용해서 액체나 기체 중의 고체입자와 액체방울을 분리하는 조작을 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 각 단계의 시료를 원심분리기(centrifugal separator)로 2000rpm 에서 10분간 처리하여 침전물과 상등액을 분리하였다.
본 발명의 각 단계에서 회수된 침전(물)은 동일 농도 및 부피의 해당 알코올을 가하여 세척하는 과정을 추가로 실시할 수 있으며, 상기 세척은 1 내지 5회 일 수 있다.
상기 상분리 및 침전에 대한 내용은 후술하는 (b) 내지 (h) 단계에서 모두 동일하게 적용된다.
(b) 단계는 (a) 단계에서 회수한 분해물에 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올을 첨가(현탁)한 후 침전시켜, 침전물을 분리 및 수득하는 단계이다.
에탄올(ethanol, 에틸알코올)은 휘발성과 가연성을 가진 무색의 액체로, 사슬모양의 탄화수소 중 탄소의 수가 2개인 에테인(ethane)에서 수소 원자 하나가 하이드록시기로 치환된 알코올이다. 본 발명에 있어서, 상기 에탄올은 탄소수 1 내지 6의 저가 알콜 중의 어느 하나와 치환되어 사용될 수 있다. 본 발명에서 에탄올은, 100% 에탄올과 물(증류수)을 특정 부피비율(v/v)로 혼합 및 희석하여 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 에탄올 농도는 전체 용액의 부피에 대한 알콜 부피 비율로서 나타낸다. 상기 ‘물’은 증류수(1차 증류수, distilled water) 또는 탈이온수(3차 증류수, Deionized water)일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 에탄올 첨가량은 이에 제한되지 않으나 70%(v/v) 내지 95%(v/v)의 범위로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 농도로 제공될수 있고, 바람직하게 75%내지 85%일 수 있으며, 가장 바람직하게 80%일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 에탄올 처리 시간은 1시간 내지 48시간일 수 있으며, 가장 바람직하게 24시간 일 수 있다.
상기 (b) 단계를 수행하고 난 뒤, (c) 단계를 수행하기 전에
(i) 상기 (b) 단계의 침전물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 현탁 및 침전시키는 단계;
(ii) 상기 (i)단계의 침전물을 회수하여 63%(v/v) 내지 69%(v/v) 에탄올로 현탁 및 침전시키는 단계;
(iii) 상기 (ii)단계의 침전물을 회수하여 56%(v/v) 내지 62%(v/v) 에탄올로 현탁 및 침전시키는 단계; 를 선택적으로 추가하여 수행할 수 있다. 즉, 상기 (b) 단계 후에 (i) 내지 (iii) 중의 어느 하나 또는 복수의 단계를 수행한 후 (c) 단계를 수행할 수 있다. 이때 (c) 단계는 (i) 내지 (iii) 단계를 거쳐 제조된 침전물을 이용하여 수행된다. 즉, 만일 (ii) 단계를 추가적으로 수행한다면, (ii) 단계에서 수득한 침전물에 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올을 첨가, 현탁 및 침전하여 (c) 단계를 수행하는 것을 의미한다. 본 발명은 바람직하게 (b) 단계 수행 후, 상기 (i) 내지 (iii) 단계를 모두 순차적으로 수행하고 상기 (iii) 단계에서 수득한 침전물에 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올을 첨가, 현탁 및 침전하여 (c) 단계를 수행하는 것일 수 있다.
상기 (i) 내지 (iii) 단계에서 에탄올 농도는 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 하기에 기재한 범위 내에서 사용하는 것이 바람직하다; (i) 단계에서 에탄올 농도는 70%(v/v) 내지 95%(v/v)의 범위로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 농도로 제공될 수 있고, 바람직하게 75%내지 85%일 수 있으며, 가장 바람직하게 80%일 수 있다.
(ii) 단계에서 에탄올 농도는 63%(v/v) 내지 69%(v/v)의 범위로 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%의 농도로 제공될 수 있고, 바람직하게 66%일 수 있다.
(iii) 단계에서 에탄올 농도는 56%(v/v) 내지 62%(v/v)의 범위로 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%의 농도로 제공될 수 있고, 바람직하게 60%일 수 있다.
(c) 단계는, 상기 (b) 단계 또는 (i) 내지 (iii) 단계 중 어느 하나의 단계에서 생성된 침전물에 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올을 첨가(현탁)한 후 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계이다.
상기 (c) 단계에서 에탄올 농도는 이에 제한되지 않으나 45%(v/v) 내지 55%(v/v)범위로 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%의 농도로 제공될 수 있고, 바람직하게 47% 내지 52%일 수 있으며, 가장 바람직하게 50%일 수 있다.
상기 (c) 단계에서 에탄올 처리 시간은 1분 내지 60분 일 수 있으며, 바람직하게 10분 일수 있고, 가장 바람직하게 5분 일 수 있다.
(d) 단계는 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 현탁 및 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계이다.
상기 (d) 단계에서 에탄올 농도는 이에 제한되지 않으나 40%(v/v) 내지 45%(v/v)의 범위로 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%의 농도로 제공될 수 있고, 바람직하게 41% 내지 44% 일수 있으며, 가장 바람직하게 43%일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 에탄올 처리 시간은 1분 내지 60분 일 수 있으며, 바람직하게 10분 일수 있고, 가장 바람직하게 5분 일 수 있다.
(e) 단계는 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계이다.
람노갈락투로난 2(rhamnogalacturonan-II, RG-II)는 a-1,4 결합으로 연결된 homogalacturonan을 주쇄로 하고, 여기에 일반 다당류에서는 거의 관찰되지 않는 2-methylfucose (2-Me-Fuc), 2-methylxylose (2-Me-xyl), apiose (Api), aceric acid (AceA), KDO (2-keto-3-deoxyocturosonic acid) 및 DHA (3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)와 galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), rhamnose (Rha), arabinose (Ara) 등을 구성당으로 하는 oligosaccharide가 아주 복잡한 형태로 분지되어 존재하고 있으며 RG-I에 비해 크기가 작은 다당으로 알려져 있다.
상기 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II 다당류는 상기 감잎 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스는 1 내지 5 mole%, 2-메틸자일로스는 1 내지 10 mole%, 아세릭산은 1 내지 5 mole% 인 다당으로 구성되는 것을 특징으로 하며, 또한 KDO 유사 물질인 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)가 포함되어있는 것이 특징이다. 따라서 상기 2-메틸퓨코오스, 2-메틸자일로오스, 아세릭산 및 KDO 유사 물질인 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)는 RG-II 의 지표 물질이다.
상기 (c) 및 (d) 단계의 상등액에는 람노갈락투로난 2(RG-2)가 포함된 것을 특징으로 한다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타난다. 본 발명의 일실시예에서는 증류수와 에탄올이 1:1 비율로 혼합된 용액(DIW:EtOH = 1:1, v/v)을 가하여 원심분리기로 침전시켜 각각 PLE-1(침전물) 시료 및 PLE-1s(상등액) 시료를 수득하고, 상기 PLE-1에 증류수와 에탄올이 1: 0.75 비율로 혼합된 용액(DIW:EtOH = 1: 0.75, v/v)을 가하여 원심분리기로 침전시켜 각각 PLE-0.75(침전물) 및 PLE-0.75s(상등액)을 수득하였다. 각 단계에서 수득된 PLE 획분(침전물 및 상등액)들에 대하여 분자량 측정(size­exclusion HPLC 이용) 및 구성당 조성을 확인한 결과, PLE-1s 및 PLE-0.75s에는 RG-II 가 풍부하게 들어있음을 확인하였다.
(f) 단계는 상기 (d) 단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계이다.
상기 람노갈락투로난 1(rhamnogalacturonan-I, RG-I)은 GalA와 rhamnose (Rha)로 구성된 [-4)-a-D-GalA-(1,2)-a-L-Rha-(1]n의 이당류가 반복되어 연결된 backbone (rhamnogalacturonan core)에 arabinan, galactan, arabinogalactan 및 oligosaccharide류가 Rha를 경유하여 고도로 분지된 구조를 가진다.
본 발명의 람노갈락투로난 1(RG-1)은 rhamnose, arabinose, galactose 및 galacturonic acid가 풍부하게 함유되어있는 것을 특징으로 하며, 따라서 상기 rhamnose, arabinose, galactose 및 galacturonic acid는 람노갈락투로난 1의 지표물질이다.
상기 (d) 단계에서 수득된 침전물에는 람노갈락투로난 1이 포함되어있는 것을 특징으로 한다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다. 본 발명의 일실시예에서는 PLE-1에 증류수와 에탄올이 1: 0.75 비율로 혼합된 용액(DIW:EtOH = 1: 0.75, v/v)을 가하여 원심분리기로 침전시켜 각각 PLE-0.75(침전물) 및 PLE-0.75s(상등액)을 수득하였다. 각 단계에서 수득된 PLE 획분(침전물 및 상등액)들에 대하여 분자량 측정(size­exclusion HPLC 이용) 및 구성당 조성을 확인한 결과, PLE-0.75에는 RG-I이 풍부하게 들어있음을 확인하였다.
전술한 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 람노갈락투로난 제조 방법은,
(g) 상기 (f) 단계에서 회수된 람노갈락투로난 1을 30%(v/v) 내지 35%(v/v)에탄올로 침전시키는 단계; 및
(h) 상기 (g) 단계의 상등액을 회수하여 arabino-β-3,6-galactan이 포함된 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
(g) 단계는 (d) 단계에서 수득된 침전물 또는 (f) 단계에서 회수된 람노갈락투로난 1에 에탄올을 처리(현탁)하여 침전시키고, 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계이다.
상기 (g) 단계에서 에탄올 농도는 이에 제한되지 않으나 30%(v/v) 내지 35%(v/v)범위로 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%의 농도로 제공될 수 있고, 가장 바람직하게 33%(v/v)일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 에탄올 처리 시간은 1분 내지 60분 일 수 있으며, 바람직하게 10분 일수 있고, 가장 바람직하게 5분 일 수 있다.
(h) 단계는 상기 (g) 단계의 상등액을 회수하여 arabino-β-3,6-galactan이 포함된 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계이다.
상기 (h) 단계에서 수득되는 람노갈락투로난 1은 arabino-β-3,6-galactan 잔기(residue, moiety)를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. arabino-β-3,6-galactan 잔기(residue, moiety) 는 람노갈락투로난 1의 활성에 중요한 인자이다.
상기 (d) 단계에서 수득된 침전물 또는 (f) 단계에서 회수된 람노갈락투로난 1에는 arabino-β-3,6-galactan 잔기가 포함되어있지 않은 람노갈락투로난 1이 혼재하고 있지만, 상기 (g) 및 (h) 단계를 추가적으로 수행함으로서 람노갈락투로난 1 중에서도 고활성 성분을 효율적으로 신속하게 분리할 수 있다. 이는 본 명세서 일실시예에 잘나타나있다. 본 발명의 일실시예에서는 RG-I 이 풍부하게 포함되어있는 것으로 확인된 PLE-0.75 분획에 증류수와 에탄올이 1: 0.5 비율로 혼합된 용액(DIW:EtOH = 1: 0.5, v/v)을 가하여 원심분리기로 침전시켜 각각 PLE-0.5(침전물) 및 PLE-0.5s(상등액)을 수득하였고, 상기 각 단계에서 수득된 PLE 획분(침전물 및 상등액)들에 대하여 β-glucosyl Yariv reagent를 이용한 single radial 젤 확산법을 통해 arabino-β-3,6-galactan의 존재를 확인하였다. 그 결과 PLE-0.5s에서는 arabino-β-3,6-galactan가 포함된 RG-I이 풍부하게 함유되어있지만, PLE-0.5 침전물에서는 이들이 대부분 제거된 RG-I 함유 다당이 얻어짐을 확인하였다.
전술한 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법 또는 (a) 내지 (h) 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법은 본 발명의 명세서에서 ‘에탄올 용매 분획(분리)법’이라는 용어로 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법 또는 (a) 내지 (h) 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법에서 ‘고면역활성 다당’은 전술한 람노갈락투로난 1 및 람노갈락투로난 2를 의미한다. 상기 람노갈락투로난 1 및 람노갈락투로난 2가 고(高)면역활성을 갖는다. 이는 본 발명의 실시예에 잘 나타나있다. 본 발명의 일실시예에서는, 본 발명의 에탄올 용매 분리법에 의해 얻어진 다당획분의 면역활성을 비교하기 위하여 BALB/c 마우스에 5% TG로 유도된 murine peritoneal macrophage cell을 조제하고 각각의 다당분획(PLE 침전 및 상등액 시료)시료에 의한 IL-6 생산 증진 활성을 측정하였다. 그결과 PLE 침전시료들은 활성이 높은 RG-I 및 RG-II 또는 RG-I만을 함유하고 있어 농도와 무관하게 높은 IL-6 생산 증진 효과를 보였고, PLE 상등액 시료들의 경우 RG-II가 분리되어 나오기 시작하는 PLE-1.5s와 PLE-1s에서 높은 IL-6 활성을 나타냈으며, RG-I이 풍부하게 함유된 PLE-0.5s에서는 주로 분리된 처리농도와 무관하게 높은 활성을 보임을 확인하였다.
상기 IL-6는 대식세포에 의해 유도되는 대표적인 cytokine 으로 세균 감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며, 염증 병소에서 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. IL-6는 B세포 자극인자2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 호칭된 사이토카인이다. IL-6는 B 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature, 324, 73-76, 1986), 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993).
상기 대식세포(Macrophage)는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러 가지 사이토킨을 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 한다. 항원 제시와 림프구의 비특이적 면역작용에 관계하며, 종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다.
본 발명의 상기 (a) 내지 (f) 단계 또는 (a) 내지 (h) 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법은, 바람직하게 상기 (a) 내지 (f) 단계 또는 (a) 내지 (h) 단계를 포함하는 감잎 유래 람노갈락투로난 1 또는 2의 분리 방법으로서, 여러 농도의 에탄올을 처리하여 감잎에 포함되어있는 람노갈락투로난 1 및 람노갈락투로난 2를 간편하고 신속하게 분리할 수 있는 효과가 뛰어나며, 이는 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.
본 발명의 발명자에 의한 공개특허 10-2013-0070526 및 기 출원(출원번호 : 10-2013-0036024)에서는 감잎에 포함된 다당을 얻기 위하여, 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 한 후 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 특정한 분자량 범위를 가지는 분획물을 회수하는 방법으로 감잎 유래 다당 분획물을 제조한 바 있다.
상기 기출원들에 기재된 방법은 특정 분자량의 범위를 기준으로 다당을 수득하기 때문에 RG-1 및 RG-2 (또는 RG-1 및 RG-2의 구성당들이)가 분획 속에 혼재되어있는 상태여서, RG-1 또는 RG-2를 각각 수득하고자 하는 경우에는 다시 상기 각 물질(RG-1 및 RG-2)을 이루는 구성 당의 분자량별로 선별하여 재수득하여야한다. 또한 추가적으로 알콜을 처리하는 공정이 실시될 수 있으나, 이는 단순히 저분자 물질 및 불순물 제거를 위한 통상적인 공정으로 RG-1 및 RG-2를 선택적으로 분리 및 수득하는 데는 유의미하지 못했다.
그러나 본원 발명의 상기 (a) 내지 (f) 단계 또는 (a) 내지 (h) 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법은, 여러 농도의 에탄올 처리만으로 간편하게 RG-1 또는 RG-2를 각각 선택적으로 신속 분리할 수 있는 분리 방법이다. 상기 방법을 통하여 구체적인 구성 당 및 활성 작용기에 서로 차이가 있는 RG-1 또는 RG-2를 감잎으로 부터 각각 선택적으로 신속하게 분리할 수 있다.
또한 본 발명의 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법은, 다당 혼합물로부터 특정 다당의 분리 및 정제를 위하여 쓰이던 컬럼 크로마토그래피(column chromatography), 한외여과(ultrafiltration), 투석 또는 탈염과정 등의 기존의 방법들보다 신속하고 효율적으로, 면역증강활성이 있는 람노갈락투로난 1 및 2를 분리하는 효과가 뛰어나다.
본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 감잎 유래 고면역활성 다당을 제공한다.
상기‘고면역활성 다당’은 본 발명의 제조방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로하며, 감잎에서 유래된 것으로 람노갈락투로난 1(RG-1) 및 람노갈락투로난 2(RG-2)를 모두 포함한다. 또한 상기 람노갈락투라난 1은 그 구조에 arabino-β-3,6-galactan을 포함하거나 포함하지 않는 형태를 모두 포함한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조(또는 분리)된 상기 RG-1 및 RG-2는 전술한바와 같이 고면역활성을 가지기 때문에, 면역 증강용 식품 조성물 또는 당분야의 통상의 기술자에게 공지된 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “면역 증강”은 생체 내 면역시스템의 면역 반응 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명의 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법은, 다당 혼합물로부터 특정 분자량과 생물활성을 소유한 다당을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 분리원리가 상이한 여러 단계의 column chromatography, ultrafiltration, 투석 또는 탈염과정을 복합적으로 수행하던 기존의 방법보다 신속하고 효율적으로, 면역증강활성이 있는 특정 다당류(람노갈락투로난 1 및 2)를 분리하는 효과가 뛰어나다.
도 1은 감잎에 펙틴분해효소 처리 후, 그 분해물로부터 에탄올 용매 분획법에의해 다당 분획을 제조하는 과정을 나타낸 개요도이다.
도 2는 본 발명의 에탄올 용매 분획법으로 수득된 각각의 PLE 시료(PLE-침전 및 상등액 시료)에 대하여 size­exclusion HPLC로 다당의 용출 패턴을 실험한 결과를 나타낸다(100kDa 는 RG-1 peak를 나타내고 10kDa는 RG-2 peak를 나타낸다.).
도 3은 β-glucosyl Yariv reagent를 이용하여, 각각의 PLE 시료에 대한 싱글 라디칼 젤 확산법(Single radial gel diffusion)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 도3의 실험결과를 침전환의 크기로서 수치화하여 나타낸 것으로, 각각의 PLE 시료의 다당과 β-glucosyl Yariv reagent 사이의 반응성을 나타낸다(세로축: 대조군[gum arabic] 및 실험군 시료의 종류, 가로축 : 침전환의 면적).
도 5는 쥐 복강 대식세포(murine peritoneal macrophage)에서, 각각의 PLE 시료에 의한 IL-6 생산 효과를 나타낸다(NC: 물질 미처리군, PC: 5 μg/mL lipopolysaccharide (LPS)처리한 양성대조군, A : 각 PLE 침전 시료, B: 각 PLE 상등액 시료).
도 6은 본 발명에서 새롭게 개발된 용매 분리법의 개요도로서, 면역증강효과가 있는 다당(람노갈락투로난 1 및 2)을 분리하는 방법을 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
감잎 유래 람노갈락트로난 Ⅰ 및 Ⅱ의 신속 분리 방법 및 상기 방법을 통해 분리된 람노갈락트로난 Ⅰ 및 Ⅱ의 면역활성 평가
<실험 준비>
1. 재료
본 실험에서 사용한 감잎(persimmon leaves)은 2011년 경남 거창군에서 생산되어 건조된 감잎을 구입하여 실험재료로 사용하였다.
2. 실험동물
생후 5-6주령의 자성 BALB/c를 (주)새론바이오(Seoul, Korea)에서 구입하여 3일간 적응을 거친 후 실험에 사용하였다. 마우스는 사육조에 5-10마리씩 넣어 온도 23±3℃, 습도 55-70%에서 사육하였으며 물과 사료는 자유 급식 형태로 유지하였다. 실험은 경기대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 실시하였다.
3. 분리 및 정제
감잎 (persimmon leaves) 건조분말에 약 10-20배의 증류수를 가하고 pH 5.0으로 조절한 후, Pectinase로써 시판 식품용 상업 효소 Rapidase C80 max™를 가하고 (분말의 1-3%(v/w) 첨가, 시료 중량 대비 ml/100g임) 50℃에서 약 3일간 처리하고 상등액을 회수하였다. 상등액에 최종농도가 80%가 되도록 에탄올을 첨가하여 하룻밤 방치 후, 발생한 침전물을 회수하였다. 침전물은 소량의 물에 용해하여 동결 건조하여 조다당 시료인 PLE-0를 얻었다. 조다당 PLE-0획분 건조시료 일정량에 증류수와 에탄올이 일정한 비율로 혼합된 농도별 알코올용액(DIW:EtOH, v/v, 1:4, 1:2, 1:1.5, 1:1, 1:0.75, 1:0.5)을 가하여 현탁하고 stirring 한 후, 원심분리에 의해 침전물과 상등액을 분리 하였으며, 이때 회수된 침전은 동일 부피의 해당 알코올용액을 가하여 2회 세척을 반복하고 각 침전물과 상등액을 회수, 동결건조를 거쳐 12개의 용매 분획물인 침전(PLE-4, PLE-2, PLE-1.5, PLE-1, PLE-0.75, PLE-0.5)과 상등액(PLE-4S, PLE-2S, PLE-1.5S, PLE-1S, PLE-0.75S, PLE-0.5S)을 얻었다 (도 1 참조).
4. 일반 분석방법
중성당 함량은 galactose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법으로, 산성당 함량은 galacturonic acid를 표준물질로 하여 m-hydroxybiphenyl법으로, 단백질 함량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 Bradford법으로, 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid (KDO)의 신속한 정량을 위해서는 thiobarbituric acid (TBA) 비색정량법을 실험실 여건에 맞게 변형하여 사용하였다. 한편 분자량 및 정제도 측정에 사용한 HPLC는 Superdex 75 GL (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden) column을 장착한 HPLC 1260 Infinity (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 를 사용하여 50 mM Ammonium formate를 용매로 0.5 mL/min으로 용출하였으며 refractive index detector (Agilent)로 검출하였다. 구성당 분석은 다당시료를 2 M trifluoroacetic acid (TFA)로 121℃에서 1.5시간 가수분해한 후, 각각 alditol acetate 유도체로 전환시킨 후, GC로 분석하였다. GC분석은 SP-2380 capillary column (0.2mm film, 0.25mm I.d.×30 m, Supelco, bellefonte, PA., USA)이 장착된 GC ACME 6000 series (Young-Lin Co.)를 이용하였으며 carrier gas로는 He을 사용(1 mL/min)하여 표준 온도조건 (분석온도 program : 60℃ (1 min), 60℃→220℃ (30℃/min), 220℃ (12min), 220℃→250℃ (8℃/min), 250℃ (15 min))에서 분석을 실시하였다. 한편 injector temp.와 detector temp.는 동일하게 250℃로 조정하여 분석하였다. 구성당의 mole%는 peak의 면적비, flame ionization detector(Young-Lin Co.)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
5. β-Glucosyl Yariv reagent와의 반응성
Arabino-β-3,6-galactan의 존재를 확인하기 위한 β-glucosyl Yariv reagent (Biosupplies, Parkville, Australia)와의 반응성 검토는 Holst와 Clarke의 방법에 따라 single radial 젤 확산법으로 측정하였다. β-glucosyl Yariv reagent 10 mg/mL를 함유한 0.15 M NaCl agarose 평판을 조제하고 직경 2.5 mm의 well을 만들어 표준물질인 gum arabic 1000 μg/ml 용액, 5 μL와 각 단계의 PLE 시료 10000 μg/ml 용액, 5 μL를 well에 각각 주입하였다. 이 평판을 상온에서 15시간 정치 분산시킨 후, 생성된 침전환을 관찰하여 arabino-β-3,6-galactan의 존재 유무를 관찰하였다.
6. Macrophage cytokine 생산자극 활성 측정
BALB/c mouse의 복강에 5% thioglycollate 배지 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 1 mL 주입하고 96시간 내에 유도된 macrophage를 회수한 후, PBS로 2～3회 세척하고 세포수를 2.0×105 cell/well로 조정하여 96 well plate에 100 μL씩 분주하였다. 이를 5% CO2 incubator에서 배양 (37℃, 2 hr)하여 macrophage monolayer를 형성시키고 상등액을 제거한 후, 미부착 macrophage를 Minimum assential medium (MEM)-FBS (with 10% FBS, penicillin- streptomycin), (Welgene, Deagu, Korea) 배지를 이용하여 세척하였다. 여기에 MEM-FBS을 각 well당 100 μL를 분주하고, 다양한 농도로 희석된 100μL의 PLE 시료들을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. Macrophage에 의해 유도, 분비된 배양상등액 중의 cytokine (Interleukin (IL)-6) 함량은 enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 이용, 제조사의 지침에 따라 분석하였다.
<실험 결과>
1. 감잎으로부터 다당의 분리 및 정제
2011년 경남 거창군에서 생산되어 건조된 감잎에 시판 식품용 상업 효소 Rapidase C80 max™을 처리하여 얻은 상등액에 침전에 80% EtOH를 처리, 침전물을 회수하고 동결건조하여 PLE-0를 얻었다. 조다당 PLE-0 건조시료 일정량에 증류수와 ethanol이 1:4 비율로 혼합된 알코올용액 (DIW:EtOH, v/v, 1:4)을 가하여 현탁하고 stirring 한 후, 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하였으며, 이때 회수된 침전은 동일부피의 해당 알코올용액을 가하여 2회 세척을 반복하고 각각 침전물과 상등액을 회수하여 침전물 획분을 PLE-4, 상등액 획분을 PLE-4s로 명명하였다. DIW:EtOH=1:4 처리에서 얻어진 침전물 획분 PLE-4는 도 1에 나타난 바와같이 DIW:EtOH=1:2 용액에 현탁, 용해한 후 동일 처리를 거쳐 PLE-2, PLE-2s획분을 얻었으며, 이상과 같이 DIW:EtOH=1:1.5, 1:1, 1:0.75, 1:0.5의 알코올용액을 이용한 연속적인 용매 분획에 의해 각 용매에서의 침전물 분획 (PLE-1.5, PLE-1, PLE-0.75, PLE-0.5)과 상등액 획분 (PLE-1.5s, PLE-1s, PLE-0.75s, PLE-0.5s)을 각각 획득하였다.
2. 감잎 용매분리 획분의 분자량 측정
감잎의 효소처리물 PLE-0로부터 용매 분리법에 의해 얻어진 각 획분의 분자량 분포 및 순도 여부를 확인하기 위해 Superdex 75 GL column이 장착된 HPLC를 이용하여 elution pattern을 확인한 결과 (도 2 참조), EtOH의 농도가 줄어들수록 침전물 획분에서는 저분자 물질이 제거되는 경향을 보였으며, 반대로 상등액 획분에서는 저분자 물질에서 고분자물질 쪽으로 다당이 회수되는 경향을 보였다. 이때 표준물질 (pullulan series)을 이용하여 분자량별 용출 경향을 확인한 결과, PLE-0에 존재하였던 분자량, 1,000 Da 미만의 저분자 물질은 PLE-1.5처리에 의해 거의 완전한 수준으로 제거됨을 확인할 수 있었다. 또한 PLE-1 획분에서 분자량 10 kDa의 peak (RG-II로 추정)가 급격히 소실되고 반대로 PLE-1s에서는 증가되는 결과로부터 동 처리를 행하여 상등액을 취한 경우, RG-II의 MW 10 kDa peak가 거의 소실됨과 함께 분자량 수만 Da 이상으로 추정되는 peak가 main peak로 관찰 (tailing 존재)됨으로써 PLE-0.75 처리를 행할 경우 분자량이 높은 RG-I 다당이 풍부한 획분을 조제할 수 있음을 할 수 있었으며, PLE-0.75s획분은 반대로 RG-II 다당이 풍부함이 확인되었다. PLE-0.5 획분에서는 RG-I으로 추정되는 peak가 주 다당으로 관찰됨으로써 PLE-0.5 처리를 행할 경우 거의 순수하게 RG-I 다당을 회수할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 용매 분리법을 감잎 효소분해물에 적용할 경우 PLE-1s 및 PLE-0.75s를 회수할 경우에서 RG-II가 풍부한 획분을, PLE-0.5를 회수할 경우, RG-I이 풍부한 시료를 빠르게 얻을 수 있으며 많은 시설과 시간이 요구되는 column chromatography나 한외여과 등을 거치지 않고도 특정 다당을 회수할 수 있음을 알 수 있었다.
3. 감잎 용매분리 획분의 화학적 특성
감잎에 용매 분리법으로 얻어진 상등액 획분에 대한 화학적 특성 및 구성당 조성을 확인하기 위해 alditol acetate법으로 유도체화 시킨 후, GC를 이용하여 분석한 결과, [표 1] 및 [표 2]에 나타난 바와 같이 PLE-4s부터 PLE-0.5s까지 총 14종의 구성당이 서로 다른 비율로 검출되었으며 Rha, Ara, Gal가 높은 비율로 검출 되었다. 또한 이들 획분에는 2-MeFuc, 2-MeXyl, Api, AceA 및 KDO와 DHA 등이 검출되었는데 이들은 RG-II 다당에서만 관찰되는 지표 물질로 알려져 있으므로 본 획분들에 RG-II 다당이 들어있음을 추정할 수 있다. 한편, PLE-1s에는 RG-II지표 구성당들이 가장 높은 비율로 검출되어 본 분리 방법에 의해 RG-II가 풍부한 획분을 조제할 경우, 앞서 언급한 바와 같이 PLE-1s 및 PLE-0.75s를 회수하면 가능할 것으로 판단된다. 또한 RG-I이 풍부한 다당을 회수하는데 용이할 것으로 판단된 PLE-0.5획분의 경우, 비록 RG-II의 지표구성당이 검출되었지만 RG-I에 풍부한 rhamnose, arabinose, galactose 및 galacturonic acid가 높은 비율로 검출됨으로써 본 용매 분리법이 RG-I분리에 유효함을 확인할 수 있었다.
하기의 [표 1]은 본 발명의 에탄올 용매 분획법에 의해 감잎 효소분해물로부터 수득된 각각의 PLE-침전 다당(polysaccharide) 시료들의 화학적 성질(Chemical properti)을 나타내며, [표 2]는 본 발명의 에탄올 용매 분획법에 의해 감잎 효소분해물로부터 수득된 각각의 PLE-상등액 다당(polysaccharide) 시료들의 화학적 성질을 나타낸다.
Chemical composition PLE-0 PLE-4 PLE-2 PLE-1.5 PLE-1 PLE-0.75 PLE-0.5(%)
Neutral sugar 49.5±2.4 47.6±0.6 46.6±0.9 44.8±0.3 43.6±0.6 45.9±0.4 38.4±0.6
Uronic acid 37.7±1.2 38.2±1.1 39.2±1.1 49.4±0.9 45.3±3.8 50.8±2.3 60.8±1.3
Protein 11.7±1.8 12.8±2.4 12.9±0.9 4.6±0.8 9.9±0.6 2.9±0.3 0.6±0.9
KDO-like material1 ) 1.1±0.1 1.4±0.1 1.3±0.0 1.2±0.1 1.1±0.1 0.4±0.2 0.2±0.1
Component sugar2 ) Mole(%)3)
2-Methylfucose 0.9±0.1 0.9±0.1 0.9±0.0 1.0±0.0 1.1±0.1 0.8±0.2 0.7±0.1
Rhamnose 9.6±0.3 10.9±0.5 8.9±0.2 8.4±0.1 9.3±0.7 11.3±0.6 9.6±0.0
Fucose 1.0±0.0 1.0±0.1 1.1±0.0 1.1±0.1 1.3±0.1 1.5±0.2 1.7±0.0
2-Methylxylose 0.9±0.1 0.9±0.1 1.0±0.0 1.1±0.0 1.1±0.1 0.6±0.0 0.7±0.0
Arabinose 9.9±0.0 9.1±0.7 9.3±0.1 9.2±0.5 7.8±0.9 9.2±0.6 6.3±0.5
Apiose+Xylose 3.5±0.1 3.3±0.2 3.3±0.1 3.3±0.1 3.3±0.4 3.0±0.3 4.2±0.2
AcericAcid 1.9±0.8 1.9±1.1 1.4±1.0 1.1±0.7 2.5±1.4 1.6±0.7 1.5±1.1
Mannose 1.3±0.1 1.5±0.1 1.1±0.1 0.9±0.1 0.7±0.2 0.6±0.3 0.5±0.2
Galactose 16.4±0.2 15.1±0.7 16.4±0.2 16.2±0.3 14.7±1.0 15.3±1.1 11.0±0.1
Glucose 4.1±0.0 3.1±0.0 3.0±0.2 2.5±0.1 1.9±0.3 2.0±0.4 2.1±0.2
Galacturonic Acid+Glucuronic Acid 37.7±1.2 38.2±1.1 39.2±1.1 49.4±0.9 45.3±3.8 50.8±2.3 60.8±1.3
1) KDO means 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid
2) Monosaccharides were analyzed using alditol acetates
3) Mole% was calculated from the detected total carbohydrate
Chemical composition PLE-0 PLE-4S PLE-2S PLE-1.5S PLE-1S PLE-0.75S PLE-0.5S(%)
Neutral sugar 49.5±2.4 63.9±1.5 49.4±0.7 44.8±1.5 48.0±1.0 48.5±1.2 49.3±0.2
Uronic acid 37.7±1.2 30.4±0.2 31.7±0.5 28.4±0.4 29.3±0.9 34.5±1.3 44.2±0.7
Protein 11.7±1.8 4.6±0.8 18.1±0.9 25.5±1.2 21.4±0.7 14.8±0.9 5.4±0.8
KDO-like material1 ) 1.1±0.1 1.0±0.1 0.9±0.1 1.3±0.0 1.3±0.1 2.2±0.2 1.0±0.2
Component sugar2 ) Mole(%)3)
2-Methylfucose 0.9±0.1 0.0±0.1 0.1±0.2 0.4±0.0 1.1±0.1 2.0±0.2 0.2±0.1
Rhamnose 9.6±0.3 7.80.3 13.6±0.4 9.7±0.2 9.6±1.2 10.4±0.8 10.2±0.5
Fucose 1.0±0.0 0.3±0.0 0.6±0.0 0.7±0.0 0.9±0.0 0.8±0.1 1.1±0.1
2-Methylxylose 0.9±0.1 0.0±0.0 0.1±0.2 0.5±0.0 1.1±0.1 1.8±0.1 0.2±0.0
Arabinose 9.9±0.0 26.7±1.2 7.5±0.2 8.8±0.5 10.8±0.9 10.2±0.4 11.0±1.1
Apiose+Xylose 3.5±0.1 1.7±0.1 2.9±0.1 3.3±0.0 3.3±0.4 3.4±0.3 4.2±0.3
Aceric Acid 1.9±0.8 0.9±0.4 1.2±0.7 0.2±0.7 1.5±0.8 2.1±0.6 0.3±0.2
Mannose 1.3±0.1 1.7±0.3 3.2±0.1 2.6±0.2 1.3±0.2 1.1±0.3 1.2±0.2
Galactose 16.4±0.2 10.7±0.5 10.9±1.1 11.7±0.5 15.0±2.3 15.2±1.8 17.4±0.3
Glucose 4.1±0.0 14.1±0.5 9.3±0.6 7.1±0.4 3.4±0.5 3.5±0.4 3.5±0.1
Galactononic Acid+Glucunonic Aide 37.7±1.2 30.4±0.2 31.7±0.5 28.4±0.4 29.3±0.9 34.5±1.3 44.2±0.7
1) KDO means 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid
2) Monosaccharides were analyzed using alditol acetates
3) Mole% was calculated from the detected total carbohydrate
4. 감잎 용매분리 획분과 β- glucosyl Yariv reagent 의 반응성 검토
RG-I의 경우, RG-II 및 homogalacturonan과 함께 공유적으로 결합되어 pectin 물질을 구성하고 있다고 알려져 있으며, RG-I에는 rhamnogalactunonan 주쇄에 arabinan, galactan 및 arabinogalactan이 측쇄로 복잡하게 뻗어져 나가있는 구조로 존재하며, 많은 보고에서 각종 생리 활성이 높다고 보고된 다당 영역이다. 용매 분리법에 의해 얻어진 감잎 효소처리 다당획분의 구성당 분석 결과에서 arabinose와 galactose가 높은 비율로 존재하고 있다는 사실로부터 이들 다당 획분에 arabinogalactan이 존재할 가능성이 높다고 판단되었으므로 이를 확인하기 위해 β-glucosyl Yariv reagent와의 반응성을 검토하였다. β-glucosyl Yariv reagent는 arabinogalactan 중 type II형의 arabino-β-3,6-galactan과 특이적으로 반응하여 적색 침전을 형성하는 것으로 알려져 있는데 이는 다당과 특이적으로 반응하는 유일한 발색 시약으로 알려져 있으므로 이를 이용하여 single radial 젤 확산을 시행 함으로써 arabino-β-3,6-galactan의 존재를 확인하고자 하였다. 그 결과, 도3 및 도4에 나타난 바와 같이 표준 arabino-β-3,6-galactan인 gum arabic은 농도별로 침전환이 증가하는 양상을 보여주었으며, PLE 침전물시료의 경우, PLE-4부터 PLE-1.5 까지 의존적으로 침전환이 증가하다가 PLE-1에서 약간 감소하였으며 특히 PLE-0.5 획분에서는 침전환이 급격히 소실되었다. 한편 PLE 상등액 시료의 경우, PLE-4s부터 PLE-1.5s까지는 침전환이 거의 관찰되지 않았으나 PLE-1s에서 급격히 큰 침전환을 형성하였으며 PLE-0.5s에서 약간 감소하는 경향을 보였다. 이러한 사실은 DIW:EtOH 비율이 1:1이하로 처리하고 상등액을 회수할 경우 arabino-β-3,6-galactan 측쇄 부분을 함유한 RG-I 다당을 얻을 수 있으며, PLE-0.5 침전물에서는 이들이 대부분 제거된 RG-I 함유 다당을 회수 가능함을 알 수 있었다.
5. 감잎 용매분리 획분의 macrophage 자극에 의한 cytokine 생산 활성
용매 분리법에 의해 얻어진 다당획분의 면역활성을 비교하기 위하여 BALB/c 마우스에 5% TG로 유도된 murine peritoneal macrophage cell을 조제하고 시료에 의한 IL-6 생산 증진 활성을 측정하였다. 이전 실험에서 감잎 유래의 RG-I 및 RG-II는 모두 macrophage를 자극하여 cytokine 생산을 촉진시키는 것으로 확인되었는 바, 용매 분리법에 의해 얻어진 시료들에 대해 이를 재확인하는 실험을 행하였다. 용매 분리 과정에서 얻어진 PLE 침전시료들은 도 5에 나타난 바와 같이 활성이 높은 RG-I 및 RG-II 또는 RG-I만을 함유하고 있어 농도와 무관하게 높은 IL-6 생산 증진 효과를 보인 반면, PLE 상등액 시료들의 경우, 주로 저분자 물질이 농축되어 있는 PLE-4s 및 PLE-2s에서는 상대적으로 낮을 활성을 보였다. 하지만 RG-II가 분리되어 나오기 시작하는 PLE-1.5s와 PLE-1s에서는 높은 IL-6 생산량을 보였고, RG-I이 풍부하게 함유된 PLE-0.5s에서는 주로 분리된 처리농도와 무관하게 높은 활성을 보였다.
6. 감잎 조다당으로부터 특정 면역활성 다당의 선택적 조제
이상의 결과는 도 6에 종합한 바와 같이, 감잎 유래 다당 혼합물로부터 면역활성이 우수한 RG-II가 풍부한 다당의 분리를 위해선, PLE-1s 및 PLE-0.75s을 조제하면 가능하며, 고 면역활성의 RG-I 다당을 회수하기 위해선 PLE-0.75를 조제한 후 DIW:EtOH=1:0.5 용매로 세척하여, 이중 침전획분인 PLE-0.5는 arabino-β-3,6-galactan이 제거된 RG-I 획분으로, 상등액 획분인 PLE-0.5s는 arabino-β-3,6-galactan이 함유된 RG-I획분으로 이용하면 가능할 것으로 판단된다. 따라서 본 실험에서 제안된 ethanol을 이용한 다당의 용매 분리법은 다당 혼합물로부터 화학특성 및 생물활성이 상이한 특정 다당만을 선택적으로 정제 또는 농축함에 있어 유효하며 이를 이용할 경우, 장시간의 시일과 복잡한 장비 및 비용이 소요되었던 다당의 선택분리 공정 (column chromatography, 한외여과, 투석 등)을 대체하여 효율적이고 신속한 분리 및 높은 수율과 저렴한 생산가 등 산업적 생산 요구에 만족하는 신공정으로 이용가능하다고 최종 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 본 발명은 감잎으로부터 면역 증강 활성이 있는 다당류의 신속 분리 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 (a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계; (e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; (f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 감잎 유래 고면역활성 다당에 관한 것이다.
본 발명의 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법은, 다당 혼합물로부터 특정 다당의 분리 및 정제를 위해 행해오던 기존의 방법들보다 신속하고 효율적으로, 면역증강활성이 있는 람노갈락투로난을 분리하는 효과가 뛰어나기 때문에 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (6)

  1. (a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
    (d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
    (e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; 및
    (f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 고면역활성 다당의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은
    (g) 상기 (f) 단계에서 회수된 람노갈락투로난 1을 30%(v/v) 내지 35%(v/v)에탄올로 침전시키는 단계; 및
    (h) 상기 (g) 단계의 상등액을 회수하여 아라비노-베타-3,6-갈락탄(arabino-β-3,6-galactan)이 포함된 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항의 방법으로 제조된 감잎 유래 고면역활성 다당.
  4. 제3항에 있어서, 상기 감잎 유래 고면역활성 다당은 람노갈락투로난 1 및 2 인 것을 특징으로 하는 고면역활성 다당.
  5. (a) 감잎을 펙틴분해효소로 분해하고, 고형물을 제거하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 분해물을 70%(v/v) 내지 95%(v/v) 에탄올로 침전시켜 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 침전물을 회수하여 45%(v/v) 내지 55%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
    (d) 상기 (c)단계의 침전물을 회수하여 40%(v/v) 내지 45%(v/v) 에탄올로 침전시켜 상등액과 침전물을 분리 및 수득하는 단계;
    (e) 상기 (c)단계의 상등액 및 상기 (d) 단계의 상등액을 회수하여 람노갈락투로난 2를 수득하는 단계; 및
    (f) 상기 (d)단계의 침전물을 회수하여 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 감잎 유래 람노갈락투로난 1 또는 2의 분리 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 분리방법은
    (g) 상기 (f) 단계에서 회수된 람노갈락투로난 1을 30%(v/v) 내지 35%(v/v)에탄올로 침전시키는 단계; 및
    (h) 상기 (g) 단계의 상등액을 회수하여 아라비노-베타-3,6-갈락탄(arabino-β-3,6-galactan)이 포함된 람노갈락투로난 1을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
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