CN105412153B - 间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了间充质干细胞来源的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒(HCV)药物中的应用。本发明的外泌体主要通过以下方法制备：分离培养的人间充质干细胞；条件培养基的收集；外泌体的提取、浓缩和纯化。本发明通过体外建立的细胞来源的丙型肝炎病毒(HCVcc)模型、HCV易感靶细胞人肝癌细胞系Huh7，对人间充质干细胞来源的外泌体的抗HCV活性进行了检测。实验结果显示，人脐带、骨髓以及外周血来源间充质干细胞分泌的外泌体具有显著的抗HCV活性，能显著抑制病毒RNA在细胞中的水平，同时实验数据提示，外泌体处理后的细胞均明显上调具有抗病毒活性的4种microRNAs(Let‑7f,miR‑145,miR‑199a and miR‑221)。本发明为抗HCV治疗提供了新的来源和方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)中的外泌体提取制备的方法及其在防治丙型肝炎病毒中的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有治疗效果的一种前体祖细胞(Jung Y,Bauer G,Nolta JA.Concise review:Induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells:progress toward safe clinical products.Stemcells.2012；30:42-47)。报道显示，它能缓解炎症，调节免疫反应及促进组织再生(Shi M,Zhang Z,Xu R,et al.Human mesenchymal stem cell transfusion is safe andimproves liver function in acute-on-chronic liver failure patients.Stem cellstranslational medicine.2012；1:725-731)。目前，MSC作为治疗方法已经进入两个2/3期和四个3期临床试验中。人脐带间充质干细胞是通过非侵入手段从人脐带组织中获得的，具有可长期传代特性的MSC(Chen W,Liu J,Manuchehrabadi N,et al.Umbilical cord andbone marrow mesenchymal stem cell seeding on macroporous calcium phosphatefor bone regeneration in rat cranial defects.Biomaterials.2013；34:9917-9925)。人骨髓、外周血分离的MSC也是通过医疗过程中，从剩余的医疗样本中所提取的细胞。
近期研究显示，MSC的许多功能都是通过旁分泌的外泌体发挥作用(Kordelas L,Rebmann V,Ludwig AK,et al.MSC-derived exosomes:a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.Leukemia.2014；28:970-973)。外泌体是由脂质双分子膜构成的50-100nm的小囊泡，其中含有与其来源和功能密切相关的蛋白质、脂质及核酸,其中核酸以microRNA为主。外泌体可通过与细胞膜融合的方式，将生物学活性物质从供体细胞传递至受体细胞，发挥其生物学功能(Mesenchymal stem cell exosome:a novelstem cell-based therapy for cardiovascular disease.Regenerativemedicine.2011；6:481-492)。因其外有细胞来源的脂质膜包裹，其内的生物学成分的稳定性及活性得到较好的保护。近几年研究显示，外泌体既可携带感染性物质，也能传递保护性分子(Kalamvoki M,Du T,Roizman B.Cells infected with herpes simplex virus1export to uninfected cells exosomes containing STING,viral mRNAs,andmicroRNAs.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America.2014；111:E4991-4996；Madison MN,Jones PH,Okeoma CM.Exosomesin human semen restrict HIV-1transmission by vaginal cells and blockintravaginal replication of LP-BM5murine AIDS virus complex.Virology.2015；482:189-201)。但关于间充质干细胞分泌外泌体的抗丙型肝炎病毒的作用，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供以间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法，及其在防治丙型肝炎中的应用。
本专利将利用间充质干细胞来源的外泌体的特有的microRNA表达水平，提供其在肝炎药物研发、保肝食品和保健品中的应用，为microRNA的靶向治疗提供新的思路。
本发明的第一方面，提供了以脐带、骨髓以及外周血间充质干细胞分泌的外泌体。
其中间充质干细胞，可选自新鲜脐带、骨髓以及外周血培养的人间充质干细胞，详细步骤参照实施例1。也可以通过美国ScienCell公司购得。
本发明的第二方面，提供了上述间充质干细胞分泌的外泌体的制备方法。步骤如下：
A.脐带、骨髓以及外周血间充质干细胞的分离及传代培养；
B.条件培养基的储备，所述的条件培养基，为将去除血清的干细胞培养基加入间充质干细胞，48-96h的培养上清液；
C.外泌体的提取、浓缩与纯化。
其中，步骤A较优的是：取新生儿的新鲜脐带，经DMEM反复冲洗后，浸泡于含有1％青霉素、链霉素的L-DMEM中；10分钟后，将组织取出并用组织剪剪成约1mm的组织块；将组织块放入含有10％胎牛血清的L-DMEM培养基中，5％CO2、37℃、95％湿度条件下进行培养；约1周后可见脐带间充质干细胞爬出生长，将组织块去除，以0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。或将获得的新鲜骨髓或者外周血样本通过Ficoll梯度离心去除单核细胞，随后将细胞重悬于10％胎牛血清的α-最小必需培养基中，5％CO2、37℃、95％湿度条件下进行培养；两天后更换培养基将未贴壁的细胞去除，并传代培养。
步骤B较优的是：将去除外泌体的干细胞培养基(制备方法请参照实施例1)加入培养的间充质干细胞中，收取48-96h培养上清液，即为条件培养基。可将培养上清液暂时冻存于-80℃冰箱，待收集至一定体积后(＞150ml)用来提取外泌体；
步骤C较优的是：条件培养基于4℃300g，10min离心除去细胞碎片；条件培养基依次在4℃、500g、10min及4℃、2000g、10min条件下离心去除死细胞及细胞碎片等杂质；随后培养基通过0.22μm滤膜过滤；将过滤后的液体在4℃、105×g、180min进行超速离心，得到含有间充质干细胞分泌的外泌体沉淀，加入200μl PBS洗涤；再次4℃、105×g、120min超速离心，即得浓缩、纯化的外泌体。
本发明的第三方面提供了上述间充质干细胞来源的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用。
进一步地，本发明提供了间充质干细胞分泌的外泌体在制备保肝或预防丙型肝炎病毒感染的食品或保健品中的应用。
将本发明所述的间充质干细胞分泌的外泌体用于体外抗丙型肝炎病毒(HCV)感染，详细步骤参照实施例2。
本发明经实验证明，间充质干细胞分泌的外泌体具有显著的抗HCV感染，明显下调HCV RNA水平，为临床治疗丙型肝炎开辟新的途径。
本发明的优点在于：
本发明为间充质干细胞分泌的外泌体提供了一种制备抗HCV药物的用途。通过体外建立的细胞培养来源的丙型肝炎病毒(HCVcc)，及易感靶细胞人肝癌Huh7细胞，对间充质干细胞分泌的外泌体的抗HCV活性进行了体外实验。结果显示，间充质干细胞来源的外泌体具有显著的抗HCV活性，能显著抑制病毒RNA水平。进一步实验数据提示，此外泌体的抗病毒活性主要是通过其包裹的高表达的4种具有抗HCV活性的microRNAs(Let-7f,miR-145,miR-199a and miR-221)起效的，可用于制备抗HCV的药物。本发明不仅为间充质干细胞分泌的外泌体提供了新的用途，也为寻找新型抗HCV药物提供了来源；
附图说明
图1间充质干细胞分泌的外泌体的Nanosight鉴定图，白色箭头代表外泌体颗粒。A为鉴定样品中颗粒直径的大小，B为鉴定样品中颗粒散射图。
图2间充质干细胞分泌的外泌体的Western Blot检测CD81、CD63的图。
图3实时定量PCR检测间充质干细胞分泌的外泌体对HCVcc感染靶细胞后胞内HCVRNA表达的影响。
图4免疫荧光检测间充质干细胞分泌的外泌体对HCVcc感染靶细胞后胞内病毒NS5A蛋白表达的影响。
图5间充质干细胞分泌的外泌体与Huh7细胞孵育后，细胞内具有抗HCV活性的miRNA的表达水平。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照工具书(著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：间充质干细胞分泌的外泌体提取纯化及鉴定
一、去外泌体血清培养基的制备
将胎牛血清在4℃、150000g、12小时离心，以去除血清中的外泌体。将不含外泌体的血清配成干细胞培养基。
二、间充质干细胞分泌的外泌体的提取及纯化
在间充质干细胞的培养基更换为之前制备的去外泌体血清培养基，收取48-96h培养上清液，可暂冻存于-80℃冰箱保存。待条件培养基收集到一定体积(约＞150ml)后于4℃300g，10min离心除去细胞碎片；条件培养基依次在4℃、500g、10min及4℃、2000g、10min条件下离心去除死细胞及细胞碎片等杂质；随后培养基通过0.22μm滤膜过滤；将过滤后的液体在4℃、105×g、180min进行超速离心，得到含有间充质干细胞分泌的外泌体沉淀，加入200μl PBS洗涤；再次4℃、105×g、120min超速离心，即得浓缩、纯化的外泌体。其可长期保存于-80℃冰箱。
三、间充质干细胞分泌外泌体的鉴定
1)Nanosight：取50微升样品注射入专用管道(图1)。A显示了样品颗粒峰值为119nm，符合外泌体具有代表性的大小；B图显示了鉴定样品中颗粒散射图，箭头标记的为典型外泌体的颗粒。结果证明了分离纯化的样品为外泌体。
2)western-blot检测外泌体的特异表达的蛋白CD81、CD63(图2)。实验结果显示，uMSC外泌体样品裂解液高表达CD81和CD63，而uMSC裂解液、去外泌体上清及对照培养基并不表达这两个外泌体的特异表达的蛋白。结果证明了分离纯化的样品为外泌体。
实施例2：间充质干细胞分泌的外泌体对丙型肝炎病毒感染的作用
一、检测间充质干细胞分泌的外泌体对HCVcc感染Huh7细胞的影响
1)细胞系Huh7，人肝癌细胞株(详见：Yimin Tong,Yongzhe Zhu,Xueshan Xia,Yuan Liu,et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis CVirus Infection,J.Virology,2011；85(6):2793–2802；Jin Zhong,Pablo Gastaminza,Guofeng Cheng,et al.Robust hepatitis C virus infection in vitro,PNAS,2005；102(26):9294-9299)。
2)HCVcc的制备：
a.病毒扩增：取500μl JFH-1HCVcc(105ffu/ml)，感染种于6cm培养皿中的Huh7.5.1细胞，次日换液，随后根据细胞生长密度传代培养，观察细胞生长状态。待病毒快速增殖导致的细胞病变效应(CPE)出现后，收集第7～14天的培养上清，取适量用于病毒滴度测定，其余8,000rpm离心5min弃细胞碎片后分装保存于-80℃冰箱备用。
b.病毒滴度测定：将Huh 7.5.1细胞(1×104细胞/孔)种于96孔板中，12h后，每孔加入100μl经10倍梯度稀释的HCVcc上清液，孵育6h后更换新鲜培养液继续培养48h。免疫荧光法检测HCV阳性细胞，一抗用1:1000稀释的抗HCV NS5A抗体，二抗为1:500稀释的抗兔的488荧光染料。在荧光显微镜下观察发光细胞，并记录最后一个可观察到绿色荧光阳性细胞的孔内绿色荧光阳性细胞数及相应的稀释梯度，计算出focus forming unit/ml(ffu/ml)数值，代表HCVcc滴度。
3)间充质干细胞分泌的外泌体抗HCVcc感染Huh7细胞的活性检测：
将Huh7细胞隔夜种于96孔板中，将50μg/ml的外泌体加入到培养基中，同时加入相应浓度的HCVcc(MOI＝0.01/0.1/1/10)。37℃孵育6小时后更换培养基，并加入50μg/ml的外泌体继续培养；48h后通过免疫荧光及定量PCR检测外泌体对HCVcc感染靶细胞的影响。引物序列如下：
HCV qPCR上游引物：CTGCCCATCCACTGAGACATA(如SEQ ID NO：1所示)；
HCV qPCR下游引物：AGCTTGGGGTCATGGCAAAC(如SEQ ID NO：2所示)；
GAPDH qPCR上游引物：AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG(如SEQ ID NO：3所示)；
GAPDH qPCR下游引物：GCTGTCACCTTCACCGTTCC(如SEQ ID NO：4所示)。
去除外泌体的细胞上清及空白作为相应对照(图3、4)。结果显示，MSC外泌体在不同浓度HCVcc感染时都有明显的抑制效果，能有效地下调HCV RNA水平和HCV非结构蛋白(NS5A)的表达量。结果证明了MSC外泌体具有显著的抑制HCV感染靶细胞的抗病毒活性。
二、间充质干细胞分泌的外泌体处理后，细胞中具有抗病毒活性的4种miRNAs(Let-7f,miR-145,miR-199a and miR-221)的表达
将间充质干细胞分泌的外泌体与细胞孵育24小时，随后利用Trizol(Invitrogen)提取上述细胞的总RNA，以总RNA为模板，miRNA特异性引物(吉玛公司合成)，进行逆转录，随后通过qPCR的方法检测细胞内miRNA表达情况。
引物序列如下：
Let-7f逆转录引物：GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACaacta(如SEQ ID NO：5所示)；
miR-145逆转录引物：GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACaggga(如SEQ ID NO：6所示)；
miR-199a逆转录引物：GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACtaacc(如SEQ ID NO：7所示)；
miR-221逆转录引物：GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACgaaac(如SEQ ID NO：8所示)。
通用qPCR上游引物：AGTGCGAACTGTGGCGAT(如SEQ ID NO：9所示)；
Let-7f qPCR特异性引物：GCGCTGAGGTAGTAGATTGTAT(如SEQ ID NO：10所示)；
miR-145qPCR特异性引物：CCGTCCAGTTTTCCCAGGAA(如SEQ ID NO：11所示)；
miR-199a qPCR特异性引物：CCGACAGTAGTCTGCACATTG(如SEQ ID NO：12所示)；
miR-221qPCR特异性引物：GGCAGCTACATTGTCTGCTGG(如SEQ ID NO：13所示)。
实验结果如图5所示，发现具有抗丙型肝炎病毒活性的4种miRNAs(Let-7f,miR-145,miR-199a and miR-221)的表达在外泌体处理后明显上调，而空白对照和去外泌体上清则并不能上调这4种miRNA水平。结果证明了MSC外泌体能显著上调细胞内具有抗HCV活性的miRNA的水平。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (5)
1.间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用；所述的外泌体的制备方法如下：
A．脐带间充质干细胞的分离及培养与传代；
B．间充质干细胞传代培养后用去除了外泌体血清的干细胞培养基进行培养，48-96h后收取培养上清液，及储备；
C．外泌体的提取、浓缩与纯化：
步骤B中收取48-96h的培养上清液作为条件培养基，依次在4℃、500g、10min及4℃、2000g、10min条件下离心去除杂质；随后条件培养基通过0.22μm滤膜过滤；将过滤后的液体在4℃、105×g、180min进行超速离心，得到含有间充质干细胞分泌的外泌体沉淀，加入200μl PBS洗涤；再次4℃、105×g、120min超速离心，即得纯化的外泌体。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用，其特征在于，所述的步骤A为：
将获得的新鲜脐带，经DMEM反复冲洗后，浸泡于含有1%青霉素与链霉素的L-DMEM中；10分钟后取出将其用组织剪剪成1mm的组织块；将组织块放入含有10％胎牛血清的L-DMEM培养基中，5％CO2、37℃、95%湿度条件下进行培养；1周后可见脐带间充质干细胞爬出生长，将组织块去除，以0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用，其特征在于，所述的步骤B为：
间充质干细胞用去除了外泌体血清的干细胞培养基进行培养，48-96h后收取培养上清液，可暂存于-80℃冰箱，待收集的培养上清到一定体积后进行外泌体的抽提。
4.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞分泌的外泌体在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用，其特征在于，所述的药物是抗丙型肝炎病毒药物。
5.间充质干细胞分泌的外泌体在制备保肝或预防丙型肝炎病毒感染的食品或保健品中的应用；所述的外泌体的制备方法如下：
A．脐带间充质干细胞的分离及培养与传代；
B．间充质干细胞传代培养后用去除了外泌体血清的干细胞培养基进行培养，48-96h后收取培养上清液，及储备；
C．外泌体的提取、浓缩与纯化：
步骤B中收取48-96h的培养上清液作为条件培养基，依次在4℃、500g、10min及4℃、2000g、10min条件下离心去除杂质；随后条件培养基通过0.22μm滤膜过滤；将过滤后的液体在4℃、105×g、180min进行超速离心，得到含有间充质干细胞分泌的外泌体沉淀，加入200μl PBS洗涤；再次4℃、105×g、120min超速离心，即得纯化的外泌体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |