CN104666344A - 间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了间充质干细胞外泌体在肺纤维化治疗中的应用，采用间充质干细胞的外泌体治疗小鼠的肺纤维化，可明显提高小鼠成活率，减轻BLM导致的肺纤维化肺部病变，降低小鼠肺组织病理学评分，间充质干细胞的外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中将有广阔的应用前景。

Description

间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用

技术领域

本发明涉及间充质干细胞外泌体的用途，具体是间充质干细胞外泌体在肺纤维化治疗中的应用。

背景技术

肺纤维化(Pulmonary Fibrosis，PF)，也称为弥漫性肺实质性疾病，是由各种不同原因引起的累及肺间质、肺泡、细支气管的肺部弥漫性疾病，严重危害人类的健康，其病因复杂，临床治疗效果差。特发性肺间质纤维化和非特异性间质性肺炎是最为常见的两种类型，尤其是特发性肺间质纤维化对目前包括糖皮质激素和细胞毒性药物在内的治疗几乎无反应，预后差，平均5年生存率仅为30～50％。肺纤维化多在40～50岁发病，男性多发于女性。呼吸困难是肺纤维化最常见症状。轻度肺纤维化时，呼吸困难常在剧烈活动时出现，因此常常被忽视或误诊为其他疾病。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难。其他症状有干咳、乏力，部分患者有杵状指和发绀。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失。当大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液，患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力，严重者最后可致死亡。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)是一种具有高度自我更新能力与多向分化潜能的多能干细胞，实验研究已证实MSC可分化成为：骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经样细胞、心肌细胞、支持造血干细胞的基质细胞等多种细胞，目前已应用于临床治疗心肌损伤性疾病、神经损伤性疾病等，然而其治疗机制尚不明确。MSC具有较强的黏附性，低密度培养时能够迅速贴壁，且具有快速增殖的能力。细胞贴壁后，细胞形态呈长的扁平的梭形，类似成纤维细胞，传代后细胞形态无明显变化。迄今尚未发现MSC的特异性表面标志，MSC均匀稳定的抗原标记包括：SH2(+)、SH3(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD71(+)、CD90(+)、CD106(+)、CD120a(+)、CD124(+)，不表达造血细胞表面标志CD34、CD45、CD14。MSC在体外不同的微环境诱导下可向不同的组织细胞分化。MSC具有独特的免疫学特性，免疫原性低且具有免疫抑制作用。

外泌体(exosomes)是多种活细胞以出芽方式分泌的直径约为20～140nm的小囊泡体，能分泌外泌体的细胞有T细胞、B细胞、树突细胞、肥大细胞和肿瘤细胞等。来源于不同组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，而且还包含其行使功能的关键分子，在免疫监视、炎症反应及癌症发生发展等许多生理和病理过程中有重要的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种间充质干细胞外泌体的新应用，即在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用。

进一步地，所述间充质干细胞来源于脐带。

进一步地，所述间充质干细胞由以下方法制备而得：从脐带中分离提取间充质干细胞，然后经过原代培养和传代培养得到。

进一步地，所述间充质干细胞由以下方法制备而得：在无菌条件下，将脐带剪成小段，充分洗涤，去除动静脉，将脐带小段剪碎，置于培养皿中，以Wharton胶直接与皿底贴壁，加入含FBS和青链双抗的低糖DMEM培养液，置于CO₂培养箱内培养，然后添加培养液，3d后更换培养液，每隔3d换液一次，待间充质干细胞融合达70～80％后，用胰酶消化，进行传代培养。

进一步地，所述间充质干细胞外泌体由以下方法制备而得：将间充质干细胞种植于培养皿中，当细胞融合达60～80％，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养48～72h后，收集细胞上清，离心去除细胞或细胞碎片，用试剂盒提取得到外泌体。

进一步地，所述间充质干细胞外泌体由P3代间充质干细胞培养获得。

一种治疗肺纤维化的药物制剂，所述药物制剂包括前述间充质干细胞外泌体。

进一步地，所述药物制剂还包括药用载体、辅料或稀释剂，本领域技术人员可以通过本领域专业书籍获知这些在药学上可接受的药用载体、辅料或稀释剂。

进一步地，所述药物制剂中间充质干细胞外泌体的浓度为1ug/ml。

进一步地，所述药物制剂通过气管内给药。

本发明通过实验证明MSC外泌体可进入靶细胞：用活细胞染色剂CM-Dil分别标记MSC外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体，加入贴壁培养的正常人肺成纤维细胞，24小时后，用荧光显微镜观察外泌体进入细胞的情况，结果发现红色荧光标记的MSC外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体均能成功进入到人肺成纤维细胞中。

本发明通过实验证明：TGFβ1(Transforming Growth Factor Beta1，转化生长因子β1)刺激可导致正常人肺成纤维细胞α-SMA(α-平滑肌动蛋白)、Fibronectin(纤维连接蛋白)的表达明显升高，MSC可部分抑制TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达，MSC外泌体可较明显抑制TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达，NLF外泌体则对TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达没有影响。

本发明通过实验证明：MSC可部分抑制肺纤维化患者肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达，MSC外泌体对IPF患者肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin表达的抑制作用更强。

博来霉素(BLM)会伤害肺部、造成肺纤维化或严重的间质性肺病，已经成为当今经典的动物肺纤维化模型的诱导剂。本发明选用BLM作为诱导剂，经气管内给药诱导小鼠肺纤维化，分析小鼠成活率和肺组织病理学评分，动态观察小鼠肺组织形态学变化，实验结果表明，采用MSC外泌体治疗小鼠肺纤维化，可明显提高小鼠存活率，减轻肺纤维化的肺部病变，明显降低小鼠肺组织病理学评分。

本发明的有益效果是：

1本发明通过一系列实验证明间充质干细胞外泌体可以明显抑制肺纤维化患者肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达，在动物模型中，可明显提高小鼠存活率，减轻肺纤维化的肺部病变，降低小鼠肺组织病理学评分，因此间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中将有广阔的应用前景。

2本发明制备间充质干细胞外泌体的原料来源是脐带，其制备成本低廉，采集方便，为无创性操作，脐带来源丰富，可以进行规模化生产。

3本发明分离提取间充质干细胞外泌体的方法简单、有效。

附图说明

图1是实施例1中MSC和正常肺成纤维细胞的光镜图；

图2是实施例1中MSC和正常肺成纤维细胞的Western blot鉴定结果；

图3是实施例2外泌体进入靶细胞的荧光显微镜图；

图4是实施例2外泌体作用于TGFβ1激活的正常人肺成纤维细胞后表达α-SMA、Fibronectin的结果；

图5是实施例2外泌体作用于特发性肺纤维化患者肺成纤维细胞后表达α-SMA、Fibronectin的结果；

图6是实施例3各组小鼠的成活率图；

图7是实施例3各组小鼠的肺脏HE染色图；

图8是实施例3各组小鼠的病理学评分图。

具体实施方式

本发明中使用的仪器和试剂、材料均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。本发明所使用的方法，如HE染色、Western blot等均为本领域公知的方法，可通过教科书或相关文献的描述进行，不再赘述，本发明说明书中有描述的，参照本发明中描述的方法进行。

实施例1

间充质干细胞外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体的分离鉴定

1间充质干细胞和正常肺成纤维细胞(NLF)的分离培养及鉴定

在无菌条件下，将脐带剪成长度约1cm的小段，充分洗涤，去除脐带的动静脉，将脐带小段剪碎，置于培养皿中，以Wharton胶直接与皿底贴壁，加入少量含10wt％FBS和5wt％青链双抗的低糖DMEM培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，4h后添加培养液。3d后更换培养液，每隔3d换液一次。待MSC融合达70～80％后，用0.25％的胰酶消化，传代培养，取P3代细胞进行实验。

取肺癌癌旁5cm以上的正常肺组织置于平皿中，用PBS液清洗后，剪成1mm³左右的碎块，再用PBS液洗直至液体澄清为止。用0.25％胰蛋白酶37℃消化45min；终止消化，离心细胞。将细胞接种于培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。24h后更换培养液，以后每隔3d换液一次；待细胞融合70％左右，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，进行继代培养，取P3代细胞进行实验。

将P3代MSC和正常肺成纤维细胞置于光学显微镜下观察，成像如图1所示，细胞形态呈长的扁平的梭形。

2间充质干细胞外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体的分离

将P3代的MSC和正常肺成纤维细胞分别种植于培养皿的中，当细胞融合达60～80％，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养培养48～72h后，收集细胞上清，以2000rpm的转速离心10min，然后以10000rpm的转速离心30min，去除细胞或者细胞碎片。使用SBI公司ExoQuick exosome提取试剂盒，分别分离提取MSC外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体。

3间充质干细胞外泌体(MSC-EX)和正常肺成纤维细胞外泌体(NLF-EX)的鉴定

用Western blot鉴定MSC外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体相关蛋白CD81、CD63的表达：收集细胞提取蛋白，用BCA试剂盒计算蛋白浓度，上样，90V电泳30分钟，110V电压分离蛋白，380mA转膜2小时，5％脱脂牛奶封闭30分钟，加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜5min×3次后，加入对应HRP标记二抗，室温下孵育1h后，TBST洗膜5min×3次，然后显色，用KOADA成像系统成像，结果如图2所示，收集到的蛋白均有表达CD81和CD63，说明分离得到了间充质干细胞外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体。

实施例2

MSC外泌体可进入靶细胞并能抑制异常激活的成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达

1MSC外泌体可进入靶细胞(人肺成纤维细胞)

用invitrogen公司的CM-Dil分别标记分离提取的MSC外泌体和正常肺成纤维细胞外泌体，加入贴壁培养的正常人肺成纤维细胞，24小时后，用荧光显微镜观察外泌体进入细胞的情况，结果如图3所示，红色荧光标记的MSC外泌体和肺成纤维细胞外泌体均能成功进入到人肺成纤维细胞中。

2MSC外泌体可抑制TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达

分离培养正常人肺成纤维细胞，将P3代细胞以适当密度种植于6孔板，待细胞融合达70％，饥饿细胞12小时，空白组不加入任何药品，对照组加入TGFβ15ng/ml，MSC治疗组加入TGFβ15ng/ml和10ugMSC，MSC外泌体治疗组加入TGFβ15ng/ml和10ugMSC外泌体，NLF外泌体治疗组加入TGFβ15ng/ml和10ugNLF外泌体，分别作用48小时后，收集细胞，提取蛋白，用Western blot检测α-SMA、Fibronectin的表达，结果如图4所示。

由图4可知，TGFβ1刺激可导致正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达明显升高，MSC可部分抑制TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达，MSC外泌体可较明显抑制TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达，NLF外泌体则对TGF-β1激活的正常人肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达没有影响。

3MSC外泌体可抑制特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)患者肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达

分离培养IPF患者肺成纤维细胞，将P3代细胞以适当密度种植于6孔板，待细胞融合达70％，饥饿细胞12小时，空白组不加入任何药品，MSC治疗组加入10ugMSC，MSC外泌体治疗组加入10ugMSC外泌体，分别作用48小时后，收集细胞，提取蛋白，用Western blot检测α-SMA、Fibronectin的表达，结果如图5所示。

由图5可知，MSC可部分抑制IPF患者肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin的表达，MSC外泌体对IPF患者肺成纤维细胞α-SMA、Fibronectin表达的抑制作用更强。

实施例3

气管内给予MSC外泌体可降低BLM诱导的肺纤维化的死亡率，减轻肺部病变

1BLM诱导肺纤维化小鼠模型的建立

取6周龄SPF级BALB/C小鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，喉镜直视下利用小动物气道给药，高压枪将药物导管插入气管内，空白对照组按3mg/kg的剂量注入PBS，实验对照组和两个治疗组按3mg/kg的剂量注入BLM，注药后将动物直立并旋转，使药物在肺内均匀分布。

2气管内给予MSC外泌体可降低BLM-诱导的肺纤维化的存活率

在给予BLM后第2天，MSC外泌体治疗组在小鼠气管内给予50ul浓度为1ug/ml的MSC外泌体，NLF外泌体治疗组在小鼠气管内给予50ul浓度为1ug/ml的NLF外泌体，观察记录小鼠的存活率，结果如图6所示，MSC外泌体治疗组小鼠的存活率明显高于NLF外泌体治疗组和BLM组的小鼠存活率(P<0.05)。

3气管内给予MSC外泌体可减轻BLM-诱导的肺纤维化肺部病变

在21天处死小鼠，取一侧肺组织，HE染色观察组织学改变，并进行肺组织病理学评分，结果如图7、图8所示。

由图7可知，MSC外泌体治疗组小鼠的组织学病变明显减轻，NLF外泌体治疗组和BLM组之间无差异，由图8可知，MSC外泌体治疗组小鼠的病理学评分明显低于NLF外泌体治疗组和BLM组(P<0.05)，NLF外泌体治疗组和BLM组之间无差异。

Claims (10)

1.间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞由以下方法制备而得：从脐带中分离提取间充质干细胞，然后经过原代培养和传代培养得到。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞由以下方法制备而得：在无菌条件下，将脐带剪成小段，充分洗涤，去除动静脉，将脐带小段剪碎，置于培养皿中，以Wharton胶直接与皿底贴壁，加入含FBS和青链双抗的低糖DMEM培养液，置于CO₂培养箱内培养，然后添加培养液，3d后更换培养液，每隔3d换液一次，待间充质干细胞融合达70～80％后，用胰酶消化，进行传代培养。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体由以下方法制备而得：将间充质干细胞种植于培养皿中，当细胞融合达60～80％，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养48～72h后，收集细胞上清，离心去除细胞或细胞碎片，用试剂盒提取得到外泌体。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体由P3代间充质干细胞培养获得。

7.一种治疗肺纤维化的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1～6任一项所述间充质干细胞外泌体。

8.根据权利要求7所述的治疗肺纤维化的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还包括药用载体、辅料或稀释剂。

9.根据权利要求7所述的治疗肺纤维化的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中间充质干细胞外泌体的浓度为1ug/ml。

10.根据权利要求7所述的治疗肺纤维化的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂通过气管内给药。