CN110022887A - 具有增强效力的细胞外囊泡 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从间充质基质细胞中分离有效的细胞外囊泡或外泌体群的方法，以及分离的细胞外囊泡或外泌体在治疗血管病变中的用途，包括肺动脉高压、支气管肺发育不良，以及与线粒体功能障碍相关的疾病和病症。

Description

具有增强效力的细胞外囊泡
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月17日提交的美国临时专利申请No.62/351,627的优先权，通过引用将该临时专利申请全部并入本申请。
背景技术
本申请涉及分离有效的细胞外囊泡(包括外泌体)的方法，以及细胞外囊泡或外泌体在治疗肺动脉高压[包括动脉性肺动脉高压(PAH)]和与线粒体功能障碍相关的病症和疾病中的用途。
肺动脉高压是一种进行性且通常会致命的疾病，其特征在于肺血管系统中的压力增加。肺循环的收缩增加导致右心的压力增加，这可能发展成右心衰竭。根据定义，慢性肺动脉高压患者的平均肺动脉压(mPAP)在静息时>25mmHg或在运动期间>30mmHg(正常值<20mmHg)。例如，未经治疗的动脉性肺动脉高压在被诊断后在平均2.8至5年内导致死亡(Keily et al.(2013)BMJ 346:f2028)。动脉性肺动脉高压的病理生理学的特征在于血管收缩和肺血管的重塑。在慢性PAH中，最初未肌肉化的肺血管存在新肌肉化，并且已经肌肉化的血管的血管肌肉周长增加。由此导致的肺动脉压升高导致右心进行性压力，其导致右心输出减少，最终右心衰竭(M.Humbert et al.,J.Am.Coll.Cardiol.2004,43,13S-24S)。PAH是一种罕见疾病，患病率为百万分之一至二。患者的平均年龄估计为36岁，只有10％的患者的年龄超过60岁。女性受到的影响明显多于男性(G.E.D’Alonzo et al.,Ann.Intern.Med.1991,115,343-349)。
PAH的发病机理涉及许多机制。重要的是，已经发现在该疾病中异常线粒体葡萄糖氧化的下游对整体代谢的抑制。减少的线粒体功能可以统一PAH中许多明显不相关的异常，例如多种细胞类型的参与、肺血管细胞的癌样增殖，以及这些细胞对细胞凋亡的抗性。尽管有证据支持线粒体功能障碍在PAH中的作用，但线粒体功能的治疗靶向已被证明是困难的。
因此，需要开发用于治疗肺动脉高压的改进的治疗组合物和方法，例如通过靶向线粒体功能。
总结
在一个方面，本公开提供了治疗(包括预防)肺动脉高压的方法，其包括向需要其的一受试者施用从间充质基质细胞获得的分离的细胞外囊泡或外泌体，其中与在从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中表达产物的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体包含具有增加表达的一种或多种表达产物的细胞外囊泡或外泌体，所述的一种或多种表达产物选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。在一些实施方案中，与从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中的相同表达产物的平均量相比，所述细胞外囊泡或外泌体表达增加了包含至少10％、20％、30％、50％或100％更多的表达产物。
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有增加表达的、一种或多种基因的蛋白质，所述一种或多种基因选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有增加表达的、一种或多种基因的RNA，所述一种或多种基因选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因、(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。
在一些实施方案中，(a)所述糖酵解途径中的基因选自由PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组，(b)所述TCA循环中的基因选自由MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组，以及(c)所述电子传递链中的基因选自由ETFA、ATP酶、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox 6c1和Cox10构成的群组。
在一些实施方案中，所述的基因为PK。在一些其他实施方案中，所述的基因为ATPase。
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体使受试者中的葡萄糖氧化正常化。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体使受试者的肺组织中的葡萄糖氧化正常化。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有至少0.15nmol/min/mL的PK活性。
在一些实施方案中，与经历三周慢性缺氧暴露并用PBS对照治疗的对照小鼠相比，分离的细胞外囊泡或外泌体能够将经历三周慢性缺氧暴露的小鼠的右心室收缩压(RVSP)降低至少10％。
在一些实施方案中，与经受24小时的低氧暴露并用PBS对照治疗的对照平滑肌细胞(SMC)细胞裂解物相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体能够将经历24小时缺氧暴露的SMC细胞裂解物的O2消耗增加至少20％。
在另一方面，本发明提供了一种治疗与线粒体功能障碍相关的一疾病或病症的方法，包括向需要其的一受试者施用从间充质基质细胞获得的分离的细胞外囊泡或外体，其中与从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中的表达产物的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体包含具有增加表达的一种或多种表达产物的细胞外囊泡或外泌体，所述的一种或多种表达产物选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有增加表达的一种或多种基因的蛋白质，所述一种或多种基因选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有增加表达的一种或多种基因的RNA，所述一种或多种基因选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。
在一些实施方案中，(a)所述糖酵解途径中的基因选自由PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组，(b)所述TCA循环中的基因选自由MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组，以及(c)所述电子传递链中的基因选自由ETFA、ATPase、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox 6c1和Cox10构成的群组。
在一些实施方案中，所述的基因为PK。在一些其他实施方案中，所述的基因为ATPase。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体使受试者肺组织中的葡萄糖氧化正常化。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有至少0.15nmol/min/mL的PK活性。
在一些实施方案中，与线粒体功能障碍相关的疾病或病症与受试者中线粒体葡萄糖氧化减少有关。在一些实施方案中，与线粒体功能障碍相关的疾病或病症为选自由弗里德赖希氏共济失调、Leber's遗传性视神经病变、卡恩斯-塞尔综合征、具有乳酸酸中毒和中风样发作的线粒体脑肌病、Leigh综合征、肥胖症、动脉粥样硬化、肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病、癌症、心力衰竭、心肌梗塞(MI)、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症、双相障碍、脆性X综合征和慢性疲劳综合症构成的群组。
另一方面，本发明提供了一种分离能够治疗或预防肺动脉高压的细胞外囊泡或外泌体的方法，所述包括以下步骤：(a)提供包含细胞外囊泡或外泌体的间充质基质细胞的一培养基；(b)将至少一部分所述细胞外囊泡或外泌体与所述培养基的其他成分分离；(c)从其他细胞外囊泡或外泌体群体中分离出一细胞外囊泡或外泌体群体，其中，与在从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中的表达产物的平均量相比，所述群体具有增加表达的一种或多种表达产物，所述一种或多种表达产物选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。
另一方面，本公开提供了一种分离能够治疗或预防肺动脉高压的细胞外囊泡或外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含细胞外囊泡或外泌体的间充质基质细胞的一培养基；(b)将至少一部分所述细胞外囊泡或外泌体与所述培养基的其他成分分离；(c)根据分子大小分离不同的细胞外囊泡或外泌体群；(d)用不同的细胞外囊泡或外泌体群治疗缺氧暴露小鼠；(e)测量常氧小鼠，缺氧暴露小鼠和用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的右心室收缩压(RVSP)；(f)基于RVSP鉴定有效的一外囊泡或外泌体群体。
在一些实施方案中，如果用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的RVSP与暴露于缺氧的小鼠的RVSP的比率为0.85或更低，则所述细胞外囊泡或外泌体群是有效的。
在一些实施方案中，如果ΔRVSP小于5mmHg，则所述细胞外囊泡或外泌体群是有效的，其中ΔRVSP是用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的RVSP减去常氧小鼠的RVSP。
在一些实施方案中，在步骤c中，通过磷脂检测分离不同的细胞外囊泡或外泌体群。
在一些实施方案中，与从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中的表达产物的平均量相比，所述有效的细胞外囊泡或外泌体群体具有增加表达的一种或多种表达产物，所述一种或多种表达产物选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。在一些实施方案中，所述有效的细胞外囊泡或外泌体群体具有增加表达的一种或多种基因的蛋白质，所述一种或多种基因选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。在一些实施方案中，所述有效的细胞外囊泡或外泌体群体具有增加表达的一种或多种基因的RNA，所述一种或多种基因选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，以及(c)电子传递链中的基因。
在一些实施方案中，(a)所述糖酵解途径中的基因选自由PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组；(b)所述TCA循环中的基因选自由MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组，以及(c)所述电子传递链中的基因选自由ETFA、ATP酶、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox 6c1和Cox10构成的群组。
在一些实施方案中，所述的基因为PK。在一些实施方案中，所述的基因为ATPase。
在另一方面，本公开提供了一种分离能够治疗或预防支气管肺发育不良的细胞外囊泡或外泌体的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含细胞外囊泡或外泌体的间充质基质细胞的一培养基；(b)将至少一部分所述细胞外囊泡或外泌体与所述培养基的其他成分分离；(c)根据分子大小分离不同的细胞外囊泡或外泌体群；(d)用不同群体的细胞外囊泡或外泌体治疗缺氧暴露小鼠；(e)测量常氧小鼠、缺氧暴露小鼠和用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的右心室收缩压(RVSP)；(f)基于RVSP鉴定有效的细胞外囊泡或外泌体群。
在一些实施方案中，所述方法的步骤(b)通过分子排阻层析法将一部分细胞所述外囊泡或外泌体与所述培养基的其他组分分离。
在另一个方面，本公开提供了一种根据本公开中描述的任何方法获得的包含分离的细胞外囊泡或外泌体的组合物。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体的平均直径约为100nm。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体表达FLOT和/或ANXA2。在一些实施方案中，与所述间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中mir204的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体的mir204表达增加。在一些实施方案中，与所述间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中CD105、GAPDH、DLST和/或ATP5A1的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体的、分泌自MSC的CD105、GAPDH、DLST和/或ATP5A1的表达增加。在一些实施方案中，与所述间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中的SORCS1、FHIT和/或ANKRD30BL的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体中SORCS1、FHIT和/或ANKRD30BL的RNA表达增加。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体基本上不含MHCII污染物。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体基本上不含纤连蛋白。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗或预防支气管肺发育不良的方法，其包括向需要其的受试者施用根据本公开中描述的任何方法获得的分离的细胞外囊泡或外泌体。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体增加所述受试者的免疫调节能力。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体降低所述受试者中的IL-6和/或TNFα表达。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体促进所述受试者的血管生成。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体减少所述受试者中高氧诱导的细胞凋亡。在一些实施方案中所述分离的细胞外囊泡或外泌体降低所述受试者中细胞色素C水平。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体增加所述受试者的线粒体代谢。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体恢复所述受试者中的管形成。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体上调所述受试者中的GLUD1和/或PDH基因表达。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体下调所述受试者中的PDK4基因表达。在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体下调所述受试者中的SIRT4基因表达。
在一些实施方案中，治疗或预防肺高血压和/或支气管肺发育不良的所述方法还包括向所述受试者施用西地那非。
附图说明
所提供的附图为举例说明，但不限制所公开的主题。
图1A-1C显示从MSC培养基中分离外泌体及其在预防小鼠中慢性缺氧诱导的PAH中的效力。图1A显示基于尺寸排阻层析分离的不同外泌体群。图1B显示通过磷脂浓度检测和A280色谱分离的外泌体的重叠。图1C显示了分离的外泌体在用缺氧诱导的PAH治疗小鼠中的作用。有效的外泌体群体(EXM2，显示为绿点)预防小鼠慢性缺氧诱导的PAH，而其他外泌体群(EXM1，显示为红点)则不预防小鼠慢性缺氧诱导的PAH。
图2A-2C描述了有效的外泌体群的鉴定。图2A显示根据缺氧治疗组和缺氧对照之间的RVSP倍数变化绘制的外泌体群的丙酮酸激酶活性。图2B显示了根据ΔRVSP绘制的外泌体群的丙酮酸激酶活性。红点代表诱导RVSP显著改善的有效外泌体群。蓝点代表在治疗缺氧诱导的PAH小鼠中非有效的外泌体群。图2C显示了以箱线图表示的有效外泌体群的丙酮酸激酶活性。
图3A-3B阐明了不同外泌体群的蛋白质组学分析。图3A显示在有效的外泌体群中，参与糖酵解、TCA循环和电子传递链的蛋白质具有增加的表达水平。图3B显示有效外泌体群(EXM2)和非有效外泌体群(EXM1)的丙酮酸激酶的蛋白质印迹分析。
图4显示不同外泌体群的RNAseq分析。结果表明，有效的外泌体群含有富集的参与糖酵解、TCA循环和电子传递链的基因，这表明了外泌体群用于基因重编程以增加葡萄糖氧化(a)的潜能。
图5A-5B显示暴露于常氧或4％O2缺氧24小时后外泌体治疗的SMC细胞裂解物中的耗氧量测定。图5A显示按照PBS对照归一化的斜率计算的的耗氧量。图5B显示按照PBS对照归一化的曲线下面积计算的消耗量。图5A和5B的结果显示，外泌体不显著改变暴露于常氧的SMC中的细胞O2消耗。另一方面，外泌体治疗诱导低氧胁迫下O2消耗的增加，这表明线粒体的功能增加。
图6A-6C阐明急性缺氧暴露后SMC裂解物的微阵列分析结果。图6A显示缺氧暴露后糖酵解中ENO1基因的表达增加，其通过外泌体治疗恢复正常。图6B显示缺氧暴露后TCA循环中PDHB和ACLY基因表达的增加，其通过外泌体治疗恢复正常。图6C显示缺氧暴露后，电子传递链中NDUFAF3、ATP2B4、ATP5H、ATP91基因表达的增加，其通过外泌体治疗恢复正常。
图7A-7D显示急性缺氧暴露后SMC裂解物的代谢组学分析。图7A显示糖酵解中代谢物水平的倍数变化。图7B显示TCA循环中代谢物水平的倍数变化。图7C显示电子传递链中代谢物水平的倍数变化。图7D比较使用外泌体治疗和不使用外泌体治疗暴露于缺氧的活SMC中ATP的产生(#表示与常氧相比p≤0.05；$表示与缺氧相比p≤0.05；*表示与常氧相比p≤0.1，且与缺氧相比p≤0.1)。结果显示了缺氧暴露后糖酵解、TCA循环和能量代谢中代谢物的积累，原因是通过这些途径的通量减少。外泌体治疗增加了通过这些途径的通量，这表明外泌体治疗增加了葡萄糖氧化并使SMC对急性缺氧的应激反应正常化。
图8A-8E显示暴露于缺氧后SMC裂解物的分析。图8A显示暴露于24小时缺氧后SMC裂解物中介质LDH的活性。图8B显示暴露于24小时缺氧后SMC裂解物中柠檬酸介质的水平。图8C显示暴露于慢性缺氧2周后SMC裂解物中介质LDH的活性。图8D显示暴露于慢性缺氧2周后SMC裂解物中的柠檬酸介质的水平。图8E显示暴露于慢性缺氧2周后SMC裂解物中丙酮酸脱氢酶活性亚基(PDHE1α)、PDHE1α抑制剂丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)和ATPase的蛋白表达(#表示与常氧相比p≤0.05；$表示与缺氧相比p≤0.05；*表示与常氧相比p≤0.1，与缺氧相比p≤0.1)。结果表明外泌体治疗使急性和慢性缺氧暴露后的线粒体功能正常化。
图9显示了用于外泌体治疗的建议模型。特别是，肺动脉高压抑制线粒体葡萄糖氧化，导致全局线粒体功能降低。外泌体治疗通过糖酵解(1)、TCA循环以及线粒体内的电子传递链(2)中急性的蛋白质整合和/或酶的慢性基因上调使葡萄糖氧化正常化，并提高线粒体能力。
图10显示了在没有渗滤步骤(蓝色)和有渗滤步骤(橙色)的情况下产生的外泌体的色谱图的比较。蓝色色谱图的A280读数远高于橙色色谱图，表明与渗滤样品相比，样品中的蛋白质含量更高。渗滤步骤类似于缓冲液交换，在达到所需浓度的外泌体后，渗滤步骤包括将PBS缓冲液加入储液器中以维持体积，同时继续使其从泵运行至TFF盒式过滤器。PBS将逐渐取代条件培养基。为了实现尽可能完全的交换，对渗余物进行7次总体积渗透。该步骤有助于去除渗余物中的一些杂质，而不影响外泌体。用FLOT-1蛋白质印迹验证外泌体的存在。该图显示渗滤步骤有助于去除杂质，如通过减少总蛋白质和磷脂的量并保留外泌体所示。
图11A-11B显示了外泌体产生分析。图11A显示12个样品的FLOT-1蛋白质印迹分析。图11B显示外泌体的尺寸分布，其中值直径约为100nm。
图12显示示例性外泌体产生的补充分析和评估，包括色谱图、NTA、FLOT-1蛋白质印迹和ANXA2蛋白质印迹。
图13A-13C显示了有效外泌体的分析。图13A显示了COM1(大量和非有效的外泌体群)和COM2(少量和有效的外泌体群)的色谱图。图13B显示了与缺氧对照相比，来自每种制剂的总蛋白相对于RVSP(在缺氧诱导的肺高压的动物模型中)绘制的图。结果表明，当更多蛋白质存在于大量的非有效部分中时，所得制剂是有效的。图13C显示了总蛋白与饥饿前喂食天数的关系图。结果显示在饥饿前1天，阳性δ蛋白(指定有效制剂)均被一致地喂养。
图14显示了mir204(在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用的含有约22个核苷酸的小的非编码RNA分子)的散点图。COM1具有更高的循环阈值(CT)数值，其对应于更低的miRNA和更低的效力。相比之下，COM2增加了mir204的表达。
图15A-15D显示外泌体的效力与亲本MSC细胞中CD105蛋白表达(图15A)、GAPDH基因表达(图15B)、DLST基因表达(图15C)和ATP5A1基因表达(图15D)正相关。结果表明细胞代谢健康与外泌体效力直接相关。
图16A-16B显示支气管肺发育不良(BPD)患者的肺发育中断。图16A显示BPD的不同阶段的X射线照片。图16B显示小鼠模型中的肺泡损伤。
图17显示体外高氧模型以及有效的外泌体群体介导的炎性抑制。肺泡细胞接种24小时后将其并转换至0.1％FBS培养基，并在常氧培养箱中用有效的外泌体群(unexisome)诱导3小时，然后在高氧培养室中铺板培养48小时。
图18显示，有效的外泌体群(unexisome)基于暴露于高氧胁迫的细胞中IL-6表达降低(高氧导致IL-6释放)来增加免疫调节能力。“#”表示与常氧对照相比外泌体治疗的重要性。“*”表示与高氧对照相比外泌体治疗的重要性。
图19显示，有效的外泌体群(unexisome)基于暴露于高氧胁迫的细胞中TNFα表达降低(高氧导致TNFα释放)而增加免疫调节能力。“*”表示与高氧对照相比外泌体治疗的重要性。
图20显示如通过增加的吸光度所表明的，对应于增加的细胞数量，有效的外泌体群(unexisome)在高氧下具有抗凋亡作用。“*”表示与高氧对照相比外泌体治疗的重要性。
图21显示对应于减少的细胞凋亡，有效的外泌体群(unexisome)减少了细胞色素C从暴露于高氧胁迫的细胞中释放。*表示与高氧对照相比外泌体治疗的重要性。
图22A显示常氧细胞、暴露于高氧胁迫的细胞和用有效外泌体治疗的细胞的荧光图像。图22B显示外泌体(COM2)治疗恢复在高氧中的管形成。
图23显示平滑肌细胞(SMC)慢性缺氧模型的示意图。SMC在PAH和缺氧中转变为增殖性、非凋亡表型，导致肺中血管和动脉增厚，造成更高的压力并最终损害PAH中的心脏/阴性症状。将SMC在常氧、4％氧和4％氧与外泌体一起培养。在培养期间，用有效的外泌体每周两次、持续两周治疗细胞。通过微阵列基因表达(IPA)和/或全局代谢组学分析所得的SMC。
图24显示通过通路内的中间代谢物的全局代谢物分析，外泌体上调了在慢性缺氧中的氨基酸代谢。
图25显示外泌体上调了在慢性缺氧中的丙酮酸和谷氨酸代谢。
图26显示外泌体上调了在慢性缺氧中的GLUD1基因表达。
图27显示外泌体下调了在慢性缺氧中的PDK4。
图28显示外泌体下调了在慢性缺氧中的SIRT4。在体外PAH模型中，SIRT4基因抑制了2种代谢酶GLUD1和PDH。在体外PAH模型中，外泌体治疗下调了SIRT4基因，同时外泌体治疗上调了GLUD1和PDH。SIRT4被认为是外泌体治疗的靶标。
图29显示外泌体通过在缺氧中上调被下调的基因来恢复TCA循环功能(TCA循环中9种酶中的6种被下调)。
图30显示SIRT4与外泌体治疗之间的关系。
图31显示有效外泌体在恢复TCA循环中的推定机制。特别地，缺氧通过(1)上调SIRT4和PDK4来抑制TCA循环功能，所述SIRT4和PDK4均抑制PDH并因此抑制丙酮酸进入TCA循环(2)上调SIRT4，其抑制GLUD1并因此抑制谷氨酰胺进入TCA循环。有效的外泌体(unexisome)降低了SIRT4和PDK4，从而增加进入TCA循环的谷氨酰胺和丙酮酸的通量。
图32显示与超离心或梯度分离相比，使用尺寸排阻色层析分离有效的外泌体群(COM2)，前者不仅分离非理想尺寸的外泌体，而且分离蛋白质和非有效微泡污染物。
图33显示外泌体的TEM成像。结果表明，与超速离心样品相比，分离的有效外泌体具有更均匀的尺寸和更清晰的图像。
图34显示分离的有效外泌体不含MHCII污染。相反，来自ZenBio的市售外泌体含有MHCII污染。
图35A-35B显示，基于丽春红染色，分离的有效外泌体不含纤连蛋白和其他蛋白质污染物。图35A显示分离的外泌体不含污染性蛋白质纤连蛋白，而ZenBio市售的超速离心制剂具有纤连蛋白污染。图35B显示通过超速离心分离的外泌体含有纤连蛋白污染，浓缩的细胞培养基也是如此。通过尺寸排阻色谱分离的外泌体不含纤连蛋白污染物以及能够被丽春红染色的其他蛋白质污染物。
图36显示有效群体和污染物微泡的RNAseq聚类分析。结果表明，有效的外泌体(COM2)与污染的微泡处于不同的聚类。它们富含SORCS1、FHIT和ANKRD30BL。
图37显示有效外泌体(COM2)与非有效外泌体(COM1)中的GAPDH表达。结果表明，有效的外泌体具有较低的CT值，对应于较高的GAPDH表达水平。
图38显示用有效的外泌体群(Unexisome)治疗BPD小鼠模型的体内研究程序。
图39A-39C显示了体内研究中使用的外泌体的表征。图39A显示外泌体的浓度为1.2×108个颗粒/mL。图39B显示基于蛋白质印迹分析，FLOT1存在于外泌体中。图39C显示外泌体的代表性TEM成像。
图40A-40B显示外泌体拯救了BPD相关的肺泡发育简单化。图40A显示与常氧(NRMX)相比，用有效的外泌体治疗拯救了高氧(HYRX)介导的肺泡发育简单化的增加。图40B示出了平均衬管截距的量化，其代表平均空气空间直径的替代。
图41显示用有效的外泌体(Unexisome)治疗BPD诱导的、继发于BPD的PAH的PAH小鼠模型的体内研究方法。
图42A-42C显示外泌体拯救了慢性肺泡发育简单化。图42A显示常氧下的细胞、缺氧下的细胞和用华通胶(Wharton's jelly)衍生的外泌体和骨髓衍生的外泌体治疗的细胞图像。图42B显示外泌体拯救了BPD相关PAH小鼠模型中的肺泡发育简单化。图42C显示外泌体减少适度肺纤维化，如BPD相关PAH小鼠模型中隔膜区域中的胶原沉积所示。
图43A-43D显示外泌体拯救了PAH肺血管重塑，其通过α-平滑肌肌动蛋白染色(A和B)和与PAH(C)相关的压力变化显示。与常氧(NRMX)对照相比，PV循环显示高氧(HYRX)小鼠的显著变化，表明肺病和空气潴留的肺气肿样特征。外泌体在这种转变中显示出显著的拯救作用，表明肺功能得到改善。
图44A显示了治疗缺氧诱导的PAH小鼠模型的体内研究方法。图44B显示MSC外泌体预防小鼠中的PAH。
图45A显示了用外泌体和西地那非的组合治疗Sugen(VEGF受体激动剂)和缺氧诱导的PAH小鼠模型的体内研究方法。图45B显示外泌体和西地那非的联合疗法在小鼠模型中拯救了PAH。
图46显示鉴定PAH中外泌体介导的作用机制的方法。
图47显示外泌体在PAH的Sugen/缺氧模型中上调氨基酸代谢。
详细说明
一些MSC细胞外囊泡或外泌体(例如骨髓MSC细胞外囊泡或外泌体)可以增强葡萄糖氧化并使线粒体功能正常化。因此，这些细胞外囊泡或外泌体可赋予PAH和与线粒体功能障碍相关的疾病或病症的治疗益处。本发明人分离了有效的细胞外囊泡或外泌体群，其有效地预防了小鼠中的缺氧诱导的PAH。有效的细胞外囊泡或外泌体群的蛋白质组学和RNAseq分析显示它们在糖酵解途径、TCA循环和电子传递链中含有更高的基因表达水平。特别地，有效的细胞外囊泡或外泌体中丙酮酸激酶(PKM2)和ATPase的表达水平增加，它们相应的酶活性也增加。本发明人还发现，肺动脉平滑肌细胞(SMC)暴露于急性缺氧导致参与糖酵解、TCA循环和电子传递链的多个基因的上调。在缺氧挑战之前，用有效的细胞外囊泡或外泌体群治疗SMC使这些遗传特征标准化。此外，基于全局代谢组学分析，有效的细胞外囊泡或外泌体群体增强了缺氧暴露的SMC中的糖酵解和ATP产生。不希望受理论的束缚，细胞外囊泡或外泌体的有效群体可通过基因重编程和关键途径(例如糖酵解途径、TCA循环和/或电子传递链)内的蛋白质整合来改善靶细胞中的线粒体功能(见图9)。
在一些实施方案中，本发明的细胞外囊泡或外泌体增加PDH和GLUD1的表达，并因此增加进入TCA循环的通量。不希望受理论的束缚，所述细胞外囊泡或外泌体的有效群体可通过抑制SIRT4来增加PDH和GLUD1的表达，其中SIRT4是PDH和GLUD1的已知抑制剂。因此，在一些实施方案中，所述细胞外囊泡或外泌体增加TCA循环功能。
预期本发明可用于治疗肺动脉高压，包括PAH、以及治疗与线粒体功能障碍相关的疾病和病症。
A.定义
除非另有说明，否则“一个”表示“一个或多个”。
除非另外明确定义，否则本申请使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
除非另有说明，否则本公开中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员公知的标准程序。这些技术的描述和解释贯穿下述文献，例如，J.Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook etal.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour LaboratoryPress(1989)，T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:A PracticalApproach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNACloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and 1996)，以及F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub。Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今所有更新)，Ed Harlow andDavid Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，(1988)以及J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols inImmunology，John Wiley&Sons(包括所有更新，直到现在)，并通过引用并入本申请。
如本申请所用，术语“受试者”(在本申请中也称为“患者”)包括恒温动物，优选哺乳动物，包括人。在优选的实施方案中，所述受试者为灵长类动物。在进一步更优选的实施方案中，所述受试者为人。
如本申请所用，术语“治疗”包括减少、减轻或消除血管病变的至少一种症状。
如本申请所用，术语“预防”包括阻止或阻碍血管病变的至少一种症状的出现或存在。
如本申请所用，术语“表达”意指一种或多种基因的RNA表达和/或蛋白质表达水平。换句话说，术语“表达”可以指RNA表达或蛋白质表达。
如本申请所用，术语“缺氧”是指氧气(O2)浓度低于大气O2浓度，20％的条件。一些实施方案中，缺氧是指O2浓度为0％～10％、0％～5％、5％～10％，或5％～15％的情况。在一个实施方案中，缺氧是指氧气浓度为约10％O2。
如本申请所用，术语“常氧”是指具有正常大气氧浓度的条件，约20％～21％O2。
如本申请所用，术语“分离”或“分离的”，当用于从细胞培养物或培养基分离的细胞外囊泡或外泌体的语境中时，是指通过人工使其不存在于原生环境的细胞外囊泡或外泌体。
如本申请所用，术语“细胞外囊泡”包括外泌体。
如本申请所用，术语“细胞外囊泡或外泌体群”是指具有明显特征的细胞外囊泡或外泌体群。术语“细胞外囊泡或外泌体群”和“细胞外囊泡或外泌体”可互换使用，指具有明显特征的细胞外囊泡或外泌体群。
如本申请所用，术语“间充质基质细胞”包括间充质干细胞。间充质干细胞是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰腺、脑、肾脏、肝脏、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨骼、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞。间充质干细胞能够分化成不同的种系，例如中胚层、内胚层和外胚层。因此，间充质干细胞能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪、骨质、软骨、弹性材料(elastic)、肌肉和纤维结缔组织。通过间充质干细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于各种影响，包括机械影响和/或内源生物活性因子，例如生长因子、细胞因子和/或由宿主组织建立的局部微环境条件。因此，间充质干细胞是非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，所述子细胞是干细胞或是前体细胞，其在时间上将不可逆地分化以产生表型细胞。
本发明的一些实施方案广泛涉及间充质基质细胞的细胞外囊泡或外泌体，其可互换地称为间充质基质细胞的细胞外囊泡或外泌体、或MSC细胞外囊泡或外泌体，或细胞外囊泡或外泌体。
B.血管病变
血管病变包括但不限于肺动脉高压，例如动脉性肺动脉高血压(PAH)、外周血管疾病(PVD)、严重肢体缺血(CLI)、冠状动脉疾病和糖尿病性血管病变。
肺动脉高压，例如动脉性肺动脉高血压(PAH)是指肺循环中的压力增加，最终导致心力衰竭和死亡的病症。尽管发现许多原因和条件与PAH有关，但它们中的许多共同具有几种基本的病理生理学特征。这些过程中的一个特征是内皮功能障碍，内皮即所有血管壁的内部细胞层，其通常负责调节血管张力和修复并抑制凝块形成的大量物质的产生和代谢。在PAH的情况下，内皮功能障碍可导致有害物质的过量产生和保护性物质的减产。这是否是PAH发展的主要事件或下游级联的一部分仍然未知，但在任何一种情况下，它都是该疾病的特征进行性血管收缩和血管增生的一个因素。本发明提供了使用分离的细胞外囊泡或外泌体治疗肺高压(包括PAH)的方法。
术语外周血管疾病(PVD)是指外周动脉和静脉内的损伤、功能障碍或阻塞。外周动脉疾病是最常见的PVD形式。周围血管疾病是动脉中最常见的疾病，并且在美国是非常常见的病症。它主要发生在50岁以上的人群中。外周血管疾病是50岁以上人群以及糖尿病患者中残疾的主要原因。美国约有1000万人患有外周血管疾病，相当于50岁以上人群的5％左右。随着人口老龄化，患病人数预计会增加。男性患外周血管疾病的可能性略高于女性。
由于晚期外周动脉闭塞导致的严重肢体缺血(CLI)的特征在于静息时血流量减少和氧气输送减少，导致静息时肌肉疼痛和皮肤溃疡或坏疽无法愈合(Rissanen et al.,Eur.J.Clin.Invest.31:651-666(2001)；Dormandy and Rutherford,J.Vasc.Surg.31:S1-S296(2000))。据估计，一年内每百万人有500至1000个人患严重肢体缺血(“SecondEuropean Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia”,Circulation 84(4Suppl.)IV 1-26(1991))。在患有严重肢体缺血的患者中，截肢虽然具有相关的发病率、死亡率和功能影响，但通常被推荐作为对抗致残症状的解决方案(M.R.Tyrrell et al.,Br.J.Surg.80:177-180(1993)；M.Eneroth et al.,Int.Orthop.16:383-387(1992))。对于严重的肢体缺血没有最佳的药物治疗(Circulation 84(4Suppl.):IV 1-26(1991))。
冠状动脉疾病(动脉粥样硬化)是人类的进行性疾病，其中一个或多个冠状动脉由于斑块的积聚逐渐闭塞。通常通过球囊血管成形术或插入支架来支撑以打开部分闭塞的动脉来治疗患有这种疾病的患者的冠状动脉。最终，这些患者需要在极大的代价和风险下进行冠状动脉搭桥手术。
支气管肺发育不良(BPD)是早产儿的慢性肺病。其特征在于肺部炎症延长、肺泡数量减少和肺泡间隔增厚、伴远端血管“削减”的血管生长异常，以及代谢和抗氧化能力有限。美国每年有14,000例新的BPD病例。重要的是，BPD的诊断常常导致其他进一步的病症，包括PAH、肺气肿、哮喘、心血管疾病发病率和新生儿死亡率增加、神经发育障碍和大脑性麻痹的增加，以及青年人肺气肿。目前，没有标准的BPD治疗方法。针对一些BPD患者进行温和通气和皮质类固醇治疗，但这些治疗对神经的结果或死亡没有影响。BPD的主要风险存在于出生后24-28周之间的婴儿中，这对应于囊状发育开始的时期。高风险婴儿的体重为1.3～2.2磅。
在一个方面，本发明的所述外泌体可用于治疗BPD。在一些实施方案中，所述外泌体增加肺的免疫调节能力。在一些实施方案中，所述外泌体促进肺中的血管生成。在一些实施方案中，所述外泌体增加肺的线粒体代谢。
C.线粒体功能障碍
线粒体是细胞内负责许多代谢转化和调节功能的细胞器。它们产生真核细胞使用的大量ATP。它们也是引起氧化应激的自由基和活性氧的主要来源。因此，线粒体缺陷是破坏性的，特别是对具有高能量水平需求的神经和肌肉组织。因此，能量缺陷与运动障碍、心肌病、肌病、失明和耳聋有关(DiMauro et al.(2001)Am.J.Med.Genet.106,18-26；Leonardet al.(2000)Lancet.355,299-304)。线粒体功能障碍可能涉及乳酸生成增加、呼吸减少和ATP产量减少。线粒体功能障碍可以表现为氧化应激的后果。
本发明提供了治疗与线粒体功能障碍有关的疾病或病症的方法。线粒体功能障碍可能与受试者中线粒体葡萄糖氧化减少有关。
在一些实施方案中，与线粒体功能障碍相关的疾病或病症选自由弗里德赖希氏共济失调、Leber's遗传性视神经病、卡恩斯-塞尔综合征、伴乳酸酸中毒和中风样发作的线粒体脑肌病、Leigh综合征、肥胖症、动脉粥样硬化、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、癌症、心力衰竭、心肌梗塞(MI)、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症、双相情感障碍、脆性X综合征和慢性疲劳综合症构成的群组。
D.线粒体能量产生
真核生物中的细胞需要能量来进行细胞过程。这种能量主要储存在5'-三磷酸腺苷(“ATP”)的磷酸键中。在真核生物中存在某些产生能量的途径，包括：(1)糖酵解；(2)TCA循环(也称为Krebs循环或柠檬酸循环)；(3)氧化磷酸化。为了合成ATP，首先将碳水化合物水解成单糖(例如葡萄糖)，并将脂质水解成脂肪酸和甘油。同样，蛋白质被水解成氨基酸。然后，细胞释放并利用这些水解分子的化学键中的能量，通过许多分解代谢途径形成ATP分子。
生物体的主要能量来源是葡萄糖。在分解葡萄糖时，葡萄糖分子的化学键中的能量被释放并且可以被细胞利用以形成ATP分子。发生这种情况所需的过程包括几个阶段。第一种叫做糖酵解，其中葡萄糖分子被分解成两个叫做丙酮酸的较小分子。
在糖酵解中，葡萄糖和甘油通过糖酵解途径代谢成丙酮酸。在此过程中，产生两个ATP分子。还产生两个NADH分子，其可以通过电子传递链进一步氧化并导致产生另外的ATP分子。
糖酵解涉及许多将葡萄糖(和其他单糖)分解成2个丙酮酸分子的酶催化步骤。最终，该途径会产生总共2个ATP分子。由糖酵解途径产生的丙酮酸分子从细胞质进入线粒体。然后将分子转化为乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)以进入TCA循环。TCA循环包括乙酰辅酶-A与草酰乙酸的键合以形成柠檬酸盐。然后通过一系列酶催化步骤将形成的柠檬酸盐分解以产生另外的ATP分子。
从线粒体基质中的TCA循环释放的能量以NADH(复合物I)和FADH2(复合物II)进入线粒体电子传递链。这些是参与ATP生成的五种蛋白质复合物中的前两种，它们都位于线粒体内膜中。来自NADH(通过用NADH特异性脱氢酶氧化)和FAD3/4(通过用琥珀酸脱氢酶氧化)的电子沿着呼吸链向下行进，通过驱动质子从线粒体基质到膜间隙(即通过线粒体内膜)的主动转运、以不连续的步骤释放它们的能量。呼吸链中的电子载体包括黄素、蛋白质结合的铁-硫中心、醌类、细胞色素和铜。有两个分子在复合物之间转移电子：辅酶Q(复合物I→III和复合物II→III)和细胞色素c(复合物III→IV)。呼吸链中的最终电子受体是3/4，其在复合物IV中转化为3/4O。
本发明的一些实施方案涉及细胞外囊泡或外泌体，其具有增加表达的、在糖酵解、TCA循环和/或电子传递链中的至少一种基因或蛋白质。在一些实施方案中，所述基因选自由以下表1所示的基因构成的群组。
在一些实施方案中，所述糖酵解途径中的基因选自由PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组
在一些实施方案中，所述TCA循环中的基因选自由MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组
在一些实施方案中，所述电子传递链中的基因选自由ETFA、ATPase、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox6c1和Cox10构成的群组。
在一些实施方案中，所述的细胞外囊泡或外泌体具有增加表达的PK基因。
在一些实施方案中，所述的细胞外囊泡或外泌体具有增加表达的ATPase。
在一些实施方案中，所述的细胞外囊泡或外泌体具有增加表达的PK基因和ATPase。
E.从间充质基质细胞分离的细胞外囊泡
本发明的细胞外囊泡或外泌体可以为，例如从间充质基质细胞释放的膜(例如，脂质双层)囊泡。它们的直径可以为，例如约30nm～100nm。通过电子显微镜，细胞外囊泡或外泌体可以显示为杯状形态。它们可以，例如在约100,000×g沉淀并且在蔗糖中的浮力密度约为1.10g/ml至约1.21g/ml。
间充质基质细胞可以从许多来源收获，包括但不限于骨髓、血液、骨膜、真皮、脐带血和/或基质(例如，华通胶)和胎盘。在实施例中更详细地描述了用于收获间充质基质细胞的方法。对于可用于本发明的其他收获方法，也可参考美国专利No.5,486,359，该专利通过引用并入本申请。
预期用于本发明所述方法的所述间充质基质细胞以及所述细胞外囊泡或所述外泌体可以从待治疗的相同受试者(因此将被称为受试者的自体同源)获得，或者它们可以是从不同的受试者获得，优选相同物种的受试者(因此将被称为对受试者的同种异体)。
如本申请所用，应理解，除非另有说明，否则本发明的方面和实施方案涉及细胞以及细胞群体。因此，应理解，在列举细胞的情况下，除非另有说明，否则还应考虑细胞群。
本发明的一些方面涉及分离的细胞外囊泡或外泌体。如本申请所用，分离的细胞外囊泡或外泌体是与其天然环境物理分离的细胞外囊泡或外泌体。分离的细胞外囊泡或外泌体可以全部或部分地与其天然所处的组织或细胞环境(包括间充质基质细胞)物理分离。在本发明的一些实施方案中，分离的细胞外囊泡或外泌体的组合物可以不含细胞，例如间充质基质细胞，或者它可以不含或基本上不含条件培养基。在一些实施方案中，可以以比未被操作的条件培养基中存在的细胞外囊泡或外泌体更高的浓度提供分离的细胞外囊泡或外泌体。可从间充质基质细胞培养物的条件培养基中分离细胞外囊泡或外泌体。
通常，可以使用任何纯化和/或富集细胞外囊泡或外泌体的合适的方法，例如包括磁性颗粒、过滤、透析、超速离心、ExoQuick TM(Systems Biosciences，CA，USA)和/或层析法的方法。在一些实施方案中，通过离心和/或超速离心分离细胞外囊泡或外泌体。细胞外囊泡或外泌体也可以通过澄清的条件培养基的超速离心来纯化。它们也可以通过超速离心进入蔗糖垫层中进行纯化。该操作描述于例如，Thery et al.Current Protocols in CellBiol.(2006)3.22，其通过引用并入本申请。在一些实施方案中，通过单步尺寸排阻色谱法分离细胞外囊泡或外泌体。该操作描述于例如，Boing et al.Journal of ExtracellularVesicles(2014)3:23430，其通过引用并入本申请。在实施例中提供了从间充质基质细胞或间充质干细胞中收获细胞外囊泡或外泌体的详细方法。
本发明还考虑立即使用细胞外囊泡或外泌体，或者可选择地，短期和/或长期储存细胞外囊泡或外泌体，例如，在使用前处于冷冻保存状态。蛋白酶抑制剂通常包含在冷冻介质中，因为它们在长期储存期间保证细胞外囊泡或外泌体完整性。在-20℃下冷冻不是优选的，因为它会增加细胞外囊泡或外泌体活性的损失。在-80℃下快速冷冻是更优选的，因为它保持活性。参见例如Kidney International(2006)69,1471-1476，其通过引用并入本申请。可以使用冷冻介质的添加剂以增强细胞外囊泡或外泌体生物活性的保存。这些添加剂类似于用于冷冻保存完整细胞的添加剂，并且可包括但不限于DMSO、甘油和聚乙二醇。
F.评估细胞外囊泡或外泌体的效力
本发明提供使用右心室收缩压(RVSP)来测量细胞外囊泡或外泌体治疗对缺氧诱导的PAH小鼠模型的影响，并鉴定有效的细胞外囊泡或外泌体群。在一些实施方案中，与经历3周慢性缺氧暴露并用PBS缓冲液治疗的对照小鼠相比，所述有效的细胞外囊泡或外泌体群能够将经历三周慢性缺氧暴露的小鼠的RVSP降低至少约10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％或30％。
在一些实施方案中，通过ΔRVSP鉴定有效的细胞外囊泡或外泌体群。如本申请所用，ΔRVSP定义为用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的RVSP减去常氧小鼠的RVSP。在一些实施方案中，如果ΔRVSP小于约6、5、4、3或2mmHg，则细胞外囊泡或外泌体群是有效的。
在一些实施方案中，细胞外囊泡或外泌体群的效力的特征在于它们增加平滑肌细胞(SMC)裂解物O2消耗的能力。在一些实施方案中，与经受24小时缺氧暴露并用PBS对照治疗的对照SMC细胞裂解物相比，有效的细胞外囊泡或外泌体群能够使经受24小时缺氧暴露的SMC裂解物的O2消耗增加至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％或者40％。
在一些实施方案中，细胞外囊泡或外泌体群的效力的特征在于它们的PK活性。在一些实施方案中，有效的细胞外囊泡或外泌体群的PK活性为至少约0.15nmol/min/ml、0.16nmol/min/ml、0.17nmol/min/ml、0.18nmol/min/ml、0.19nmol/min/ml、0.20nmol/min/ml、0.21nmol/min/ml、0.22nmol/min/ml、0.23nmol/min/ml、0.24nmol/min/ml、0.25nmol/min/ml、0.3nmol/min/ml或0.4nmol/min/ml。
在一些实施方案中，细胞外囊泡或外泌体群的效力通过其LDH活性来表征。在一些实施方案中，细胞外囊泡或外泌体群的效力的特征在于它们将暴露于缺氧的SMC分泌的LDH降低至少约10％、20％、30％或40％。
在一些实施方案中，基于下表中的一个或多个标准分离本发明的所述细胞外囊泡或外泌体：
无菌 RT-PCR mir204
外观 MSC CD105
总蛋白 RT-PCR线粒体基因
粒子计数 2D凝胶电泳
总RNA RNAseq指纹图谱分析
总磷脂 体内效力试验
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体包含的mir204量比间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中mir204的平均水平高至少10％、20％、30％、50％或100％。
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体包含的CD105、GAPDH、DLST和/或ATP5A1的量比间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中CD105、GAPDH、DLST和/或ATP5A1的平均水平高至少10％、20％、30％、50％或100％。
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体包含的SORCS1、FHIT和/或ANKRD30BL的RNA表达量比间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中的SORCS1、FHIT和/或ANKRD30BL的RNA表达量的平均水平高至少10％、20％、30％、50％或100％。
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有减少的MHCII污染物或者，基本上或完全不含MHCII污染物，例如其包含的MHCII污染物的量比间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中的MHCII污染物的平均水平第至少50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。
在一些实施方案中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有降低的纤连蛋白含量或者，基本上或完全不含纤连蛋白，例如其包含的纤连蛋白量比间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中的纤连蛋白的平均水平低50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。
G.使用细胞外囊泡或者外泌体进行治疗
本发明所述方法中有用的组合物可通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉注射、子宫内注射或肠胃外施用。当施用本申请所述的治疗组合物(例如药物组合物)时，通常将其调配成单位剂量的可注射形式(例如溶液、悬浮液或乳液)。
本发明考虑了单次或重复施用细胞外囊泡或外泌体，包括两次、三次、四次、五次或多次施用细胞外囊泡或外泌体。在一些实施方案中，可连续施用所述细胞外囊泡或外泌体。根据所治疗病症的严重程度，可在数小时(例如1-2、1-3、1-6、1-12、1-18或1-24小时)、数天(例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6天或1-7天)或数周(例如1-2周、1-3周或1-4周)内重复或连续施用。如果重复施用但不连续，则两次施用之间的时间可以为几小时(例如4小时、6小时或12小时)、几天(例如1天、2天、3天、4天、5天或6天)或几周(例如1周、2周、3周或4周)。施用之间的时间可能相同，也可能不同。例如，如果疾病症状似乎有恶化的征兆，可更频繁地施用细胞外囊泡或外泌体，而一旦症状稳定或减少，可较不频繁地施用所述细胞外囊泡或外泌体。
本发明还考虑了重复施用低剂量形式的细胞外囊泡或外泌体，以及单次施用高剂量形式的细胞外囊泡或外泌体。低剂型可以为但不限于1-50微克/千克，而高剂型可以为但不限于51-1000微克/千克。应当理解，根据疾病的严重程度、受试者的健康状况和施用途径，本发明考虑了单次或重复给予低剂量或高剂量细胞外囊泡或外泌体。
所述细胞外囊泡或外泌体可以被用于(例如，施用)药学上可接受的制剂(或药学上可接受的组合物)，通常与药学上可接受的载体组合。短语“药学上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内、适于与人类和动物组织接触而没有过多毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。本申请所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。
这些制剂通常可以含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体，并且可以任选地包含其他(即，二级)治疗剂。药学上可接受的载体为药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及携带或运输预防或治疗活性剂。每种载体必须是“可接受的”，即与制剂的其他成分相容并且对受试者无害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇类，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中使用的其他无毒相容物质。
本发明的制剂以有效量施用。有效量是单独引发所需结果的药剂量。绝对量将取决于多种因素，包括选择用于施用的材料、施用是单剂量还是多剂量，以及个体患者参数，包括年龄、身体状况、大小、体重和疾病的阶段。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且仅可以通过常规实验来解决。
本发明还包括包装的和标记的药物产品。该制品或试剂盒包括在适当的容器或容器中(例如玻璃小瓶或塑料安瓿或其它密封的容器)的适当的单位剂型。单位剂型应适合于肺部递送，例如通过气溶胶递送。优选地，所述制品或试剂盒还包括关于如何使用的说明，包括如何施用药物产品。所述说明书还可以包含向医疗从业者、技术人员或受试者建议如何适当地预防或治疗所述疾病或病症的信息材料。换句话说，制品包括指示或建议使用的施用方案的说明，包括但不限于实际剂量、监测程序和其他监测信息。
与任何药用物品一样，包装材料和容器被设计用于在储存和运输过程中保护产品的稳定性。试剂盒可包括在无菌水悬浮液中的MSC细胞外囊泡或外泌体，其可直接使用或可用生理盐水稀释以用于静脉内注射或用于喷雾器，或者，稀释或与表面活性剂组合用于气管内施用。因此，试剂盒还可含有稀释剂溶液或试剂，例如盐水或表面活性剂。
实施例
以下实施例旨在向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本申请所述的方法和组合物的完整披露和描述，而不是限制性的。
实施例1分离外泌体群
该实施例展示了从细胞培养基中分离外泌体。
过滤：将从间充质干细胞(MSC)获得的条件培养液收集在具有0.2μm过滤器的5LSartorius-袋中。将收集的条件培养液泵送通过过滤器管线以快速消除任何细胞、死细胞和细胞碎片。然后使用140ml luer-lok注射器向条件培养液补充25mMHEPES和10mM EDTA缓冲液。
切向流过滤：将含有条件培养液的袋连接到切向流过滤(TFF)系统，通过连接到Flexboy袋的样品管线连接到TFF储液器的顶部。使用具有单个100kDa MWCO0.1m2 盒的Sartorius Sartocon Slice TFF。在每次TFF运行的开始和结束时进行水完整性测试以测量盒的完整性。然后用1L PBS引发该系统。然后将介质样品通过重力进料到储器中。TFF以600LMH运行。将5L体积的初始培养液浓缩至100mL(50×浓度)。收集渗余物并使用0.22μm过滤器过滤。将滤液分成10mL等分试样并在-80℃冷冻。
级分：将样品在37℃下解冻约10分钟。将所有样品合并在150ml康宁瓶中。使用Sepharose CL-2B树脂(GE)填装XK 50/100柱。将XK 50/100柱连接到AKTA Aant 150(GE)。通过样品管将样品引入柱中。将所有样品引入柱后，开始洗脱步骤(设定：流速为4.6ml/min)。洗脱出0.2CV的空柱，然后级分收集器开始以每个级分1分钟的速率收集级分(每个级分4.6ml)。收集级分直至洗脱出0.6CV(外泌体在0.3CV-0.4CV之间洗脱)。PBS用于整个实验。将级分样品盖在罩下并于4℃储存。
渗滤：样品可任选地进行渗滤步骤，优选在TFF步骤之后、分馏步骤之前，其类似于缓冲液交换。一旦达到所需浓度的外泌体，就通过贮存器将PBS缓冲液加入样品中以保持体积，同时继续使其从泵运行至TFF盒式过滤器。PBS逐渐取代条件培养液。为了实现尽可能完全的交换，对渗余物进行7次总体积渗滤。该步骤有助于去除保留物中的一些杂质，而不影响外泌体。通过FLOT-1蛋白质印迹验证外泌体的存在，其显示总蛋白质和磷脂的量减少。
测量磷脂浓度：磷脂信号传导用于外泌体检测。简而言之，在级分后，将20μL每种外泌体制备物和80μL反应混合物(Sigma)转移到黑色透明底96孔板(Corning,Corning,NY)中并在室温下避光保温30分钟。使用FLUOstar Omega酶标仪(BMG Labtech，Ortenberg，Germany)在530/585nm下测量荧光强度。在所示的外泌体生产中，A280色谱图和磷脂均用于外泌体检测。
如图1C所示，磷脂信号与用于外泌体检测的A280色谱图很好地重叠。
实施例2在小鼠模型中治疗动脉性肺动脉高血压(PAH)
对小鼠进行为期3周的慢性缺氧暴露以诱导PAH(显示为右心室收缩压的增加)。外泌体治疗为在缺氧暴露前进行1次尾静脉注射。
实施例3有效外泌体群的鉴定
为了鉴定有效的外泌体群，使用PKM2抗体(Cell Signaling，Danvers，MA)分析每种外泌体制剂的丙酮酸激酶蛋白表达。根据制造商的方案，使用WESTM机器(ProteinSimple，San Jose，CA)进行毛细管电泳免疫测定。简言之，将4.2μL样品与主荧光混合物(ProteinSimple)以1:5混合。然后将样品在95℃加热5分钟后置于冰上。将PKM2第一抗体在抗体稀释剂(ProteinSimple)中以1:15稀释，然后使用专有的抗兔二抗(ProteinSimple)。将专有的过氧化物和鲁米诺-S(ProteinSimple)以1:1混合以制备化学发光底物。将样品、封闭试剂、第一抗体、第二抗体、化学发光底物和洗涤缓冲液加载到所提供的微孔板中的指定孔中。将板以1,000g旋转5分钟以避免孔中出现气泡。将板和毛细管卡盒装入WES机器中。加载平板后，在毛细管系统中进行全自动电泳和免疫检测。使用WES标准运行设置分离蛋白质。使用内置的Compass软件(Proteinsimple)分析数据，提供每个样品的峰值分子量信号和曲线下面积值。
丙酮酸激酶活性：丙酮酸激酶为糖酵解中的一种酶，其催化磷酸从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转移到ADP，产生一分子丙酮酸和一分子ATP。通过abcam试剂盒(ab83432)测量丙酮酸激酶，其中PEP和ADP通过PK催化以产生丙酮酸和ATP。产生的丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化以产生颜色(λ＝570nm)。因为颜色强度与丙酮酸量成比例，所以可以测量PK活性。PK活性的产生是动力学测定。可以使用以下等式进行数据分析：
PK活性＝(丙酮酸×稀释因子)/(T2-T1)×孔体积
其中T2-T1为在时间点2的时间减去时间点1的时间(分钟)。使用丙酮酸标准曲线(其中丙酮酸计算为T2处的最终丙酮酸浓度减去T1处的初始丙酮酸浓度)计算丙酮酸(nmol)。这个数字需要空白校正。活动测量在线性范围内发生是很重要的。可以在多个时间点分析数据集。选择的最佳方法是查看曲线，并选择至少相隔2分钟的线性范围内的数据点。以相同的方式分析板内的每个样品。在该实验中，选择T1＝2分钟，T2＝4分钟，因为这两个时间点完全在线性范围内
接下来，丙酮酸激酶活性根据在每种外泌体制剂治疗条件下的体内RVSP与缺氧对照组相比的倍数变化进行作图。这允许将丙酮酸激酶活性与外泌体治疗组RVSP的倍数改善进行比较。见图2A。丙酮酸激酶活性还根据ΔRVSP变化进行作图。ΔRVSP是用外泌体条件治疗的缺氧减去常氧对照。见图2B。红点代表有效的外泌体群，其诱导RVSP的显著改善。蓝点代表在治疗缺氧诱导的PAH小鼠中无效的外泌体群。然后将这些最有效的外泌体群的丙酮酸激酶活性绘制为箱线图。见图2C。因此，(C)图表示我们最有效的外泌体制剂的丙酮酸激酶活性范围。
实施例4有效外泌体群的蛋白质组学分析和RNAseq分析
将样品外泌体送至Bioproximity(Chantilly，VA)进行蛋白质组学分析。图3(a)显示了与非有效群体相比，有效外泌体群中蛋白质表达水平增加。
将样品外泌体送至SBI进行RNAseq分析。图4显示了与非有效群体相比，有效外泌体群中基因表达水平的增加。
实施例5测量细胞外O2消耗量
abcam细胞外O2消耗测定试剂盒(ab197243)用于测量暴露于常氧或4％O2缺氧24小时后，用PBS(对照)或外泌体治疗的平滑肌细胞(SMC)裂解物的氧消耗。当细胞裂解物通过电子传递链消耗氧时，周围培养基中的氧被耗尽，其显示为磷光信号的增加。通过向每个孔中添加矿物油来保护微环境免受环境空气扩散的影响，并且通过制造商提供的O2探针的淬灭测量磷光信号。这些数据以两种方式计算：曲线下面积和随时间的斜率(制造商推荐使用斜率进行数据分析)。图5A-5B证明外泌体不显著改变暴露于常氧的SMC中的细胞O2消耗。然而，外泌体治疗诱导低氧胁迫下O2消耗的增加，这表明线粒体功能增加。
实施例6暴露于急性缺氧的SMC的微阵列分析
使用PBS对照或外泌体(EXSM)治疗平滑肌细胞(SMC)，并在常氧或缺氧(4％O2)条件下孵育24小时。分离SMC的RNA并使用全局微阵列平台送至Qiagen进行分析。图6A-6C显示急性缺氧暴露后葡萄糖代谢中基因表达增加。EXSM治疗使在(a)糖酵解、(b)TCA循环和(c)电子传递链中的响应恢复正常。这些数据表明外泌体治疗减少或消除了在缺氧胁迫期间葡萄糖氧化基因的基因上调的需要，这可能是由于通路中EXSM蛋白或基因的参与。
实施例7-暴露于急性缺氧的SMC的组织学分析
用PBS对照或外泌体(EXSM)治疗平滑肌细胞(SMC)，并在常氧或缺氧(4％O2)条件下孵育24小时。沉淀细胞裂解物并送至Metabolon(北卡罗来纳州)进行全局代谢物分析。如图7所示，SMC裂解物在急性低氧暴露后，由于通过糖酵解、TCA循环和能量代谢途径通量减少，在这些途径中显示出代谢物的积累。外泌体治疗通过(a)糖酵解和(b)TCA循环(由代谢物积累减少表示)增加了通量。这些数据表明葡萄糖氧化增加。图7A-7D显示急性缺氧暴露导致腺苷和烟酰胺核糖苷的积聚，其是ATP和NAD的构建单元。可能是由于ATP产生增加(c)，外泌体治疗导致了腺苷和烟酰胺核苷的使用。在暴露于急性缺氧(d)的活SMC上测量ATP产生，证实了EXSM介导ATP的产生增加。
实施例8其他方法
小鼠模型：将C57BL/6小鼠圈养在缺氧帐篷中，氧气水平控制在10％氧气，持续三周以诱导肺动脉高压。对于外泌体治疗组，在缺氧暴露前3小时将单剂量注射到尾静脉中。
外泌体分离和分析：在40小时内从汇合的MSC培养物中收集无血清条件培养液。使用切向流过滤将条件培养液浓缩50倍。将浓缩物与荧光亲脂性染料DiI一起温育，然后使用填充有Sepharose CL-2B树脂(GE Heathcare)的XK 50/100柱进行级分。通过DiI的荧光检测和磷脂定量(Sigma)鉴定含有外泌体的级分。使用System Biosciences(CA)进行所选级分的RNA测序。使用LC-MS/MS(Chantilly，VA)通过Bioproximity进行所选级分的蛋白质组学分析。通过ProteinSimple免疫测定和比色动力学测定(abcam，ab83432)分别评估丙酮酸激酶蛋白和酶活性。
体外模型：平滑肌细胞(SMC)在常压或缺氧(4％氧气)下用PBS或外泌体治疗24小时。使用Illumina平台(Qiagen)进行实验重复以进行微阵列分析或使用HD4平台(Metabolon，RTP，NC)进行代谢组学分析。使用abcam细胞外O2消耗测定试剂盒(abcam，ab197243)测量耗氧量。
接种肺泡细胞24小时后，将其转换至0.1％FBS培养基，并在常氧培养箱中用有效的外泌体群诱导3小时，并在高氧培养室中培养48小时(图17)。
SMC慢性缺氧模型：已知SMC在PAH和缺氧中转变为增殖性、非凋亡表型，导致肺中血管和动脉增厚，引发更高的压力并最终损害PAH中的心脏/阴性症状。SMCs在常氧下、缺氧(4％氧)下培养，或在缺氧(4％氧)下与外泌体一起培养。在培养期间，两周内、每周两次用有效的外泌体治疗细胞。通过微阵列基因表达(IPA)和/或全局代谢组学分析所得的SMC。
实施例9用unexisome进行体外治疗
已经通过体外实验证明，unexisome具有免疫调节能力。如图18所示，unexisome治疗增加了免疫调节能力，这是基于暴露于高氧胁迫的细胞中IL-6表达降低(高氧导致IL-6释放)。如图19所示，unexisome治疗增加了免疫调节能力，这是基于暴露于高氧胁迫的细胞中TNFα表达降低(高氧导致TNFα释放)。
通过体外实验还证明，unexisome具有抗凋亡能力。如图20所示，unexisome治疗在高氧下表现出抗凋亡作用，如增加的吸光度所示，对应于增加的细胞数量。如图21所示，unexisome治疗减少了暴露于高氧压力的细胞中细胞色素C的释放。
通过体外实验进一步证明，unexisome可用于促进BPD中的肺血管生成。如图22A所示，unexisome治疗可以恢复急性高氧暴露条件下的管形成。
通过体外实验还证明，unexisome可以用于改善BPD相关PAH中的线粒体代谢。如图24所示，通过对通路中的中间代谢物的全局代谢物分析，unexisome在慢性缺氧中上调氨基酸代谢。如图25所示，在慢性缺氧中，unexisome上调丙酮酸和谷氨酸代谢。
如图26所示，unexisome在慢性缺氧中上调GLUD1基因表达。如图27所示，unexisome在慢性缺氧中下调PDK4。如图28所示，unexisome在慢性缺氧中下调SIRT4。SIRT4基因在体外PAH模型中抑制2种代谢酶GLUD1和PDH。在体外PAH模型中，unexisome治疗下调SIRT4基因，而外泌体治疗上调GLUD1和PDH。SIRT4被认为是外泌体治疗的靶标。如图29所示，通过在缺氧中上调被下调的基因，unexisome恢复了TCA循环功能(TCA循环中9种酶中的6种被下调)。
实施例10用unexisome进行体内治疗
高氧诱导的BPD研究：C57BL/6小鼠从出生后(PN)的第1天至第7天接受75％氧气，并在出生后第7天至第14天切换至具有正常氧气水平的室内空气。在PN4，将单剂量的有效外泌体注射到颞浅静脉。在PN7和PN14，进行RNA和组织学分析(图38)。
BPD诱导的PAH研究：C57BL/6小鼠从出生后第1天到第7天(PN)接受75％的氧气，从出生后第7天到第42天转换到正常氧气水平的室内空气。在PN4，单剂量的有效外泌体被注射到颞浅静脉。在PN7和PN14，进行RNA、组织学和细胞学分析。在PN42，进行组织学和细胞学分析，此外还进行生理测量、肺功能测试和RV压力测量(图38)。
联合治疗：C57BL/6小鼠从第1天到第29天接受10％的氧气，从第29天到第56天转为正常状态。在第1天，给小鼠注射semaxanib，从第29天到第56天，每天给小鼠注射两次西地那非，每3天注射一次外泌体。测量RVSP水平(图45A-45B)。
如图40所示，unexisome治疗挽救了与BPD相关的肺泡简化。图40A显示，与常氧(NRMX)相比，使用有效外泌体治疗可拯救高氧(HYRX)介导的肺泡发育简单化增加。图40B显示了平均线性截距的量化，其表示平均空气空间直径的替代物。
如图42A-42C所示，unexisome治疗治疗拯救了慢性肺泡发育简单化。图42A显示了在常氧、缺氧下的细胞图像，以及用华通胶衍生的外泌体和骨髓衍生的外泌体治疗的细胞图像。图42B显示外泌体在BPD相关的PAH小鼠模型中拯救了肺泡发育简单化。图42C显示外泌体减少了适度肺纤维化，如BPD相关PAH小鼠模型中隔区胶原沉积所示。
如图43A-43D所示，通过α-平滑肌肌动蛋白染色(A和B)和与PAH相关的压力变化(C)证实了unexisome拯救了PAH肺血管重塑。与常氧(NRMX)对照相比，PV循环显示高氧(HYRX)小鼠的显著变化，表明肺病和空气潴留的肺气肿样特征。外泌体在这种转变中显示出显著的拯救，表明肺功能得到改善。
如图44A-44B所示，MSC外泌体在缺氧诱导的PAH小鼠模型中预防PAH。如图45A-45B所示，外泌体和西地那非的联合疗法逆转了Sugen/缺氧诱导的PAH小鼠模型中的PAH。如图46所示，外泌体在PAH的Sugen/缺氧模型中上调氨基酸代谢。
实施例11unexisome的表征
如图32所示，与不仅分离非理想大小的外泌体，而且分离蛋白质和非有效微泡污染物的超离心或梯度分离相比，使用尺寸排阻层析分离有效的外泌体群(COM2)导致污染显著减少。如图33所示，与超速离心的样品相比，分离的有效外泌体具有更均匀的尺寸和更清晰的图像。
如图34所示，分离的有效外泌体不含MHCII污染。相反，来自ZenBio的市售外泌体含有MHCII污染。
如图35A-35B所示，基于丽春红染色，通过尺寸排阻层析分离的分离的有效外泌体没有纤连蛋白和其他蛋白质污染，而ZenBio市售的超速离心制剂含有纤连蛋白污染。
如图36所示，在有效群体和污染微泡的RNAseq聚类分析中，有效的外泌体(COM2)与污染的微泡处于不同的聚集，并且富含SORCS1、FHIT和ANKRD30BL。如图37所示，有效的外泌体(COM2)具有比COM1更低的CT值，对应于GAPDH表达的更高表达水平。

Claims (52)

1.一种治疗肺动脉高压的方法，其包括向需要其的一受试者施用从间充质基质细胞获得的分离的细胞外囊泡或外泌体，其中与在从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中表达产物的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体包含具有增加表达的一种或多种表达产物的细胞外囊泡或外泌体，所述一种或多种表达产物选自由以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，和(c)电子传递链中的基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，与从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中相同表达产物的平均量相比，所述细胞外囊泡或外泌体包含增加了至少20％以上的表达产物的表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)糖酵解途径中的基因选自PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组，(b)TCA循环中的基因选自MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组，和(c)电子传递链中的基因选自ETFA、ATPase、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox6c1和Cox10构成的群组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因是PK。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因是ATPase。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体使所述受试者的肺组织中的葡萄糖氧化正常化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有至少0.15nmol/min/mL的PK活性。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，与经历三周慢性缺氧暴露并用PBS治疗的对照小鼠相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体能够将经受三周慢性缺氧暴露的小鼠的右心室收缩压(RVSP)降低至少10％。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，与经历24小时缺氧暴露和用PBS对照治疗的对照SMC细胞裂解物相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体能够将经历24小时缺氧暴露的SMC细胞裂解物的O2消耗增加至少20％。
10.一种治疗与线粒体功能障碍相关的一疾病或病症的方法，包括向需要其的一受试者施用从间充质基质细胞获得的分离的细胞外囊泡或外泌体，其中，与从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中的表达产物的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体包含具有增加表达的一种或多种表达产物的细胞外囊泡或外泌体，所述一种或多种表达产物选自以下构成的群组：(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，和(c)电子传递链。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，(a)糖酵解途径中的基因选自PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组，(b)TCA循环中的基因选自MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组，和(c)选择电子传递链中的基因选自ETFA、ATPase、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox 6c1和Cox10构成的群组。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述基因是PK。
13.根据权利要求13所述的方法，其中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体的PK活性为至少0.15nmol/min/mL。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述基因是ATPase。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述分离的细胞外囊泡或外泌体使所述受试者的肺组织中的葡萄糖氧化正常化。
16.根据权利要求10所述的方法，其中，与线粒体功能障碍相关的疾病或病症与所述受试者中线粒体葡萄糖氧化减少相关。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，与线粒体功能障碍相关的疾病或病症选自弗里德赖希氏共济失调、Leber's遗传性视神经病变、卡恩斯-塞尔综合征、伴乳酸酸中毒和中风样发作的线粒体脑肌病、Leigh综合征、肥胖症、动脉粥样硬化、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、癌症、心力衰竭、心肌梗塞(MI)、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症、双相情感障碍、脆性X综合征和慢性疲劳综合症构成的群组。
18.一种分离能够治疗或预防肺动脉高压的细胞外囊泡或外泌体的方法，包括以下步骤：
a.提供包含细胞外囊泡或外泌体的间充质基质细胞的一培养基；
b.将至少一部分细胞外囊泡或外泌体与所述培养基的其他成分分离；
c.从其他细胞外囊泡或外泌体群体中分离一细胞外囊泡或外泌体群体，其中，与从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中的表达产物的平均量相比较，所述群体具有增加的一种或多种表达产物的表达，所述一种或多种表达产物选自(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，和(c)电子传递链中的基因。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，通过磷脂检测分离细胞外囊泡或外泌体群。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，(a)糖酵解途径中的基因选自PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组，(b)TCA循环中的基因选自MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组，和(c)选择电子传递链中的基因选自ETFA、ATPase、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox 6c1和Cox10构成的群组。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述基因是PK。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述基因是APTase。
23.一种分离能够治疗或预防肺动脉高压的细胞外囊泡或外泌体的方法，其包括以下步骤：
a.提供包含细胞外囊泡或外泌体的间充质基质细胞的一培养基；
b.将至少一部分细胞外囊泡或外泌体与培养基的其他成分分离；
c.根据分子大小分离不同的细胞外囊泡或外泌体群；
d.用不同的细胞外囊泡或外泌体群治疗缺氧暴露的小鼠；
e.测量常氧小鼠，缺氧暴露小鼠和用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的右心室收缩压(RVSP)；
f.基于RVSP鉴定有效的一细胞外囊泡或外泌体群。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，如果用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的RVSP与暴露于缺氧的小鼠的RVSP的比率为0.85或更低，则所述细胞外囊泡或外泌体群是有效的。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，如果ΔRVSP小于5，则所述细胞外囊泡或外泌体群是有效的，其中ΔRVSP是用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的RVSP减去常氧小鼠的RVSP。
26.根据权利要求23所述的方法，其中，在步骤c中，通过磷脂检测分离不同的细胞外囊泡或外泌体群。
27.根据权利要求23所述的方法，其中，与从间充质基质细胞获得的所有细胞外囊泡或外泌体中的表达产物的平均量相比，有效的细胞外囊泡或外泌体群具有增加的一种或多种表达产物的表达，所述一种或多种表达产物选自(a)糖酵解途径中的基因，(b)TCA循环中的基因，(c)，电子传递链中的基因。
28.根据权利要求23所述的方法，其中(a)糖酵解途径中的基因选自PK、AGI、ALDO、ALDOA、ENO3、GPI、HK2、HK3、PFK、PGM、TPI、GAPDH、ENO和PGAM构成的群组，(b)TCA循环中的基因选自MDH2、OGDH、PC、PDHA1、PDHB、SDHA、SDHC和SUCLG2构成的群组，和(c)选择电子传递链中的基因选自ETFA、ATPase、NDUFC2、NDUFB1、NDUFS5、NDUFA8、NDUFA9、NDUFS2、SDHA、SDHC、UQCRH1、Cox 6c1和Cox10构成的群组。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述基因是PK。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述基因是ATPase。
31.一种分离能够治疗或预防支气管肺发育不良的细胞外囊泡或外泌体的方法，其包括以下步骤：
a.提供包含细胞外囊泡或外泌体的间充质基质细胞的一培养基；
b.将至少一部分细胞外囊泡或外泌体与所述培养基的其他成分分离；
c.根据分子大小分离不同的细胞外囊泡或外泌体群；
d.用不同的细胞外囊泡或外泌体群治疗缺氧暴露的小鼠；
e.即测量常氧小鼠，缺氧暴露小鼠和用细胞外囊泡或外泌体治疗的缺氧暴露小鼠的右心室收缩压(RVSP)；
f.基于RVSP鉴定有效的一细胞外囊泡或外泌体群。
32.根据权利要求23或31所述的方法，其中步骤b中的分离是通过分子排阻层析法进行的。
33.一种组合物，其包含根据权利要求23或31所述的方法获得的分离的细胞外囊泡或外泌体。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体的平均直径为约100nm。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体表达FLOT和/或ANXA2。
36.根据权利要求33所述的组合物，其中与间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中mir204的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有增加的mir204表达。
37.根据权利要求33所述的组合物，其中与所有间充质基质细胞中的CD105、GAPDH、DLST和/或ATP5A1的平均量相比，从MSCs分泌的所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有增加的CD105、GAPDH、DLST和/或ATP5A1表达。
38.根据权利要求33所述的组合物，其中与间充质基质细胞的所有细胞外囊泡或外泌体中的SORCS1，FHIT和/或ANKRD30BL的平均量相比，所述分离的细胞外囊泡或外泌体具有增加的SORCS1，FHIT和/或ANKRD30BL的RNA表达。
39.根据权利要求33所述的组合物，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体基本上不含MHCII污染物。
40.根据权利要求33所述的组合物，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体基本上不含纤连蛋白。
41.一种治疗或预防支气管肺发育不良的方法，包括向需要其的一受试者施用根据权利要求31-40中任一项所述的分离的细胞外囊泡或外泌体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体增加所述受试者的免疫调节能力。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体降低所述受试者中的IL-6和/或TNFα表达。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体促进所述受试者的血管生成。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体减少所述受试者中的高氧诱导的细胞凋亡。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体降低所述受试者中的细胞色素C水平。
47.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体增加所述受试者的线粒体代谢。
48.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体恢复所述受试者的管形成。
49.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体上调所述受试者中的GLUD1和/或PDH基因表达。
50.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体下调所述受试者中的PDK4基因表达。
51.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的细胞外囊泡或外泌体下调所述受试者中的SIRT4基因表达。
52.根据权利要求1-17和41-51所述的方法，还包括向所述受试者施用西地那非。
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