KR20190041456A - 향상된 효능을 가진 세포외 소포 - Google Patents

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KR20190041456A
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캐롤라이나 메드라노
존 치들
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유나이티드 쎄러퓨틱스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 중간엽 기질 세포로부터 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단을 분리하는 방법, 및 폐 고혈압, 기관지폐 형성이상, 및 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 및 병태를 비롯한 혈관병의 치료에서의 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀의 용도를 제공한다.

Description

향상된 효능을 가진 세포외 소포
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 6월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 62/351,627호를 우선권으로 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
본 출원은 엑소좀(exosome)을 비롯한 강한(potent) 세포외 소포(extracellular vesicles)의 분리 방법, 및 폐동맥 고혈압(PAH)을 비롯한 폐 고혈압, 및 미토콘드리아 기능장애와 관련된 병태 및 질병의 치료에서 세포외 소포 또는 엑소좀의 용도에 관한 것이다.
폐 고혈압은 폐 혈관계에서의 증가된 압력을 특징으로 하는 진행성이고 종종 치명적인 질병이다. 폐 순환의 증가하는 수축은 우심에 대한 스트레스 증가를 유도하며, 이것은 우심부전으로 발달할 수 있다. 정의에 의할 경우, 만성 폐 고혈압의 경우에 평균 폐 동맥압(mPAP)은 안정시에 >25 mmHg 또는 운동 동안 >30 mmHg (정상 값 <20 mmHg)이다. 예를 들어, 치료되지 않은 폐동맥 고혈압은 진단 후 평균 2.8 내지 5년 내에 사망을 초래한다(Keily et al. (2013) BΜJ 346:f2028). 폐동맥 고혈압의 병리생리학은 폐 혈관의 혈관수축 및 리모델링을 특징으로 한다. 만성 PAH에서는 처음에 비근육화된(unmuscularized) 폐 혈관의 신생근육화(neomuscularization)가 있으며, 이미 근육화된 혈관의 혈관 근육은 둘레가 증가한다. 폐 동맥압의 이러한 증가는 우심에 대한 진행성 스트레스를 야기하여, 우심으로부터의 박출량 감소를 초래하고 결국에는 우심부전을 일으킨다(M. Humbert et al., J. Am. Coll . Cardiol . 2004, 43, 13S-24S). PAH는 백만명 당 1-2명의 유병률을 가진 희귀 질환이다. 환자의 평균 연령은 36세로 추정되었으며, 환자의 단지 10%만이 60세 이상이었다. 명백하게 남자 보다 여자가 더 많이 걸린다(G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med . 1991, 115, 343-349).
PAH의 발병에서는 많은 기전이 연루되어 있음이 나타났다. 중요하게는, 전체적 대사(global metabolism)의 억제가 이 질병에서의 비정상적인 미토콘드리아 글루코스 산화의 다운스트림에서 설명되었다. 미토콘드리아 기능의 감소는 다수 세포 타입의 관여, 폐 혈관 세포의 암-유사 증식 및 어팝토시스에 대한 이들 세포의 저항과 같은, PAH에서의 겉보기에 무관해보이는 많은 이상을 통합시킬 수 있다. PAH에서 미토콘드리아 기능장애의 역할을 지지하는 증거에도 불구하고, 미토콘드리아 기능의 치료적 타겟팅은 어려운 것으로 입증되었다.
따라서, 미토콘드리아 기능을 타겟팅함에 의한 것과 같은, 폐 고혈압을 치료하기 위한 개선된 치료 조성물 및 방법의 개발이 필요하다.
일 양태에서, 본 발명은 중간엽 기질 세포로부터 수득된 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을 폐 고혈압의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 폐 고혈압을 치료(예방 포함)하는 방법을 제공하며, 상기 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 그 발현 산물의 평균 양에 비하여 증가된 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 동일한 발현 산물의 평균 수준에 비하여 발현 산물의 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 100% 더 많은 발현을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 증가된 단백질(들) 발현을 가진다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 증가된 RNA(들) 발현을 가진다. 일부 실시형태에서, (a) 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어진 군으로부터 선택되며, (b) TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자는 PK이다. 일부 다른 실시형태에서, 유전자는 ATPase이다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 글루코스 산화를 정상화시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 폐 조직에서 글루코스 산화를 정상화시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 적어도 0.15 nmol/min/mL의 PK 활성을 가진다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 3-주 만성 저산소증 노출을 겪고 PBS로 처리된 대조군 마우스에 비하여, 3-주 만성 저산소증 노출을 겪은 마우스의 우심실 수축기압(RVSP)을 적어도 10%만큼 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 24-시간 저산소증 노출을 겪고 PBS 대조군으로 처리된 대조군 SMC 세포 용해물에 비하여, 24-시간 저산소증 노출을 겪은 평활근 세포(SMC) 세포 용해물에 의한 O2 소비를 적어도 20%만큼 증가시킬 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 중간엽 기질 세포로부터 수득된 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 그 발현 산물의 평균 수준에 비하여 증가된 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 증가된 단백질(들) 발현을 가진다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 증가된 RNA(들) 발현을 가진다.
일부 실시형태에서, (a) 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어진 군으로부터 선택되며, (b) TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자는 PK이다. 일부 다른 실시형태에서, 유전자는 ATPase이다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 폐 조직에서 글루코스 산화를 정상화시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 적어도 0.15 nmol/min/mL의 PK 활성을 가진다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태는 대상에서 감소된 미토콘드리아 글루코스 산화와 관련된다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태는 프리드라이히실조증(Friedreich's ataxia), 레베르 시신경병증(Leber's Hereditary Optic Neuropathy), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre Syndrome), 젖산 산증 및 뇌졸중-유사 에피소드를 가진 미토콘드리아성 뇌병증(Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-Like Episodes), 라이 증후군(Leigh syndrome), 비만, 죽상동맥경화증, 근위축성 측색 경화증, 파킨슨병, 암, 심부전, 심근경색(MI), 알츠하이머병, 헌팅턴병, 조현병, 조울증, 취약 X 증후군(fragile X syndrome), 및 만성 피로 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 중간엽 기질 세포의 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 배양 배지의 다른 성분으로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 적어도 일부를 분리하는 단계; (c) 다른 세포외 소포 또는 엑소좀 집단으로부터, (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 그 발현 산물의 평균 양에 비하여 증가된 세포외 소포 또는 엑소좀 집단을 분리하는 단계를 포함하는, 폐 고혈압을 치료하거나 예방할 수 있는 세포외 소포 또는 엑소좀을 분리하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 중간엽 기질 세포의 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 배양 배지의 다른 성분으로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 적어도 일부를 분리하는 단계; (c) 분자 크기에 기초하여 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단을 분리하는 단계; (d) 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단으로 저산소증-노출 마우스를 처리하는 단계; (e) 산소정상상태 마우스, 저산소증-노출 마우스 및 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증 노출 마우스의 우심실 수축기압(RVSP)을 측정하는 단계; (f) RVSP에 기초하여 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단을 확인하는 단계를 포함하는, 폐 고혈압을 치료하거나 예방할 수 있는 세포외 소포 또는 엑소좀을 분리하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은, 만일 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증-노출 마우스의 RVSP 대 저산소증-노출 마우스의 RVSP의 비가 0.85 이하이면, 강한 것이다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 델타 RVSP가 5 mmHg 미만이면 강한 것이며, 상기 델타 RVSP는 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증-노출 마우스의 RVSP - 산소 정상 상태 마우스의 RVSP이다.
일부 실시형태에서, 단계 c에서, 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단은 인지질 검출에 의해 분리된다.
일부 실시형태에서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 그 발현 산물의 평균 양에 비하여 증가된다. 일부 실시형태에서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 증가된 단백질(들) 발현을 갖는다. 일부 실시형태에서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 증가된 RNA(들) 발현을 갖는다.
일부 실시형태에서, (a) 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어진 군으로부터 선택되며, (b) TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자는 PK이다. 일부 실시형태에서, 유전자는 ATPase이다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 중간엽 기질 세포의 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 배양 배지의 다른 성분으로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 적어도 일부를 분리하는 단계; (c) 분자 크기에 기초하여 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단을 분리하는 단계; (d) 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단으로 저산소증-노출 마우스를 처리하는 단계; (e) 산소정상상태 마우스, 저산소증-노출 마우스 및 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증 노출 마우스의 우심실 수축기압(RVSP)을 측정하는 단계; (f) RVSP에 기초하여 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단을 확인하는 단계를 포함하는, 기관지폐 형성이상을 치료하거나 예방할 수 있는 세포외 소포 또는 엑소좀을 분리하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법의 단계 (b)는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 배양 배지의 다른 성분으로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 부분을 분리한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에서 개시된 임의의 방법에 따라 수득된 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 약 100 nm의 평균 직경을 가진다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 FLOT 및/또는 ANXA2를 발현한다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은, 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 mir204의 평균 양에 비하여, mir204의 증가된 발현을 가진다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은, 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 CD105, GAPDH, DLST, 및/또는 ATP5A1의 평균 양에 비하여, CD105, GAPDH, DLST, 및/또는 ATP5A1의 증가된 발현을 함유하는 MSC로부터 분비된다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 SORCS1, FHIT 및/또는 ANKRD30BL의 평균 양에 비하여, SORCS1, FHIT 및/또는 ANKRD30BL의 증가된 RNA 발현을 가진다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 MHCII 오염물이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 피브로넥틴이 실질적으로 없다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에서 개시된 임의의 방법에 따라 수득된 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을, 기관지폐 형성이상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 기관지폐 형성이상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 면역조절 능력을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 IL-6 및/또는 TNFα 발현을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 혈관신생을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 고산소증-유도된 어팝토시스를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 사이토크롬 C 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 미토콘드리아 대사를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 관 형성을 회복시킨다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 GLUD1 및/또는 PDH 유전자 발현을 상향조절한다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 PDK4 유전자 발현을 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 SIRT4 유전자 발현을 하향조절한다.
일부 실시형태에서, 폐 고혈압 및/또는 기관지폐 형성이상을 치료하거나 예방하는 방법은 추가로 대상에게 실데나필을 투여하는 것을 포함한다.
제공된 도면은 개시된 주제를 예시하지만 제한하지 않는다.
도 1a-1c는 MSC 배양 배지로부터 엑소좀의 분리 및 마우스에서 만성 저산소증-유도된 PAH의 예방에서 그들의 효능을 보여준다. 도 1a는 크기 배제 크로마토그래피에 기초하여 분리된 상이한 엑소좀 집단을 보여준다. 도 1b는 인지질 농도 검출 및 A280 크로마토그램에 의해 분리된 엑소좀의 오버레이(overlay)를 보여준다. 도 1c는 저산소증-유도된 PAH를 가진 마우스의 처리에서 분리된 엑소좀의 효과를 보여준다. 강한 엑소좀 집단(녹색 점으로 나타난 EXM2)은 마우스에서 만성 저산소증-유도된 PAH를 예방한 반면, 다른 엑소좀 집단(적색 점으로 나타난 EXM1)은 그렇지 못했다.
도 2a-2c는 강한 엑소좀 집단의 확인을 도시한다. 도 2a는 저산소증 치료 그룹과 저산소증 대조군 사이에서 RVSP 배수 변화에 대해 플럿팅된 엑소좀 집단의 피루베이트 키나제 활성을 보여준다. 도 2b는 델타 RVSP에 대해 플럿팅된 엑소좀 집단의 피루베이트 키나제 활성을 보여준다. 적색 점은 RVSP에서 유의한 개선을 유도한 강한 엑소좀 집단을 나타낸다. 청색 점은 저산소증 유도된 PAH 마우스의 치료에서 강하지 않은 엑소좀 집단을 나타낸다. 도 2c는 상자 그림(box and whisker plot)으로 그래프화된 강한 엑소좀 집단의 피루베이트 키나제 활성을 보여준다.
도 3a-3b는 상이한 엑소좀 집단의 단백질체 분석을 예시한다. 도 3a는 강한 엑소좀 집단에서, 증가된 발현 수준을 가진 단백질이 당분해, TCA 사이클 및 전자 수송 사슬에 관련됨을 보여준다. 도 3b는 강한 엑소좀 집단(EXM2) 및 강하지 않은 엑소좀 집단(EXM1) 둘 모두의 피루베이트 키나제의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 4는 상이한 엑소좀 집단의 RNAseq 분석을 보여준다. 결과는 강한 엑소좀 집단이 당분해, TCA 사이클 및 전자 수송 사슬에 관련된 유전자가 농축되어 함유되어 있음을 증명하였으며, 이것은 강한 엑소좀 집단이 글루코스 산화 (a)를 증가시키기 위한 유전적 재프로그래밍의 가능성을 제안한다.
도 5a-5b는 산소 정상 상태 또는 4% O2 저산소증에 24시간 노출된 후 엑소좀 처리된 SMC 세포 용해물에서의 O2 소비 분석을 도시한다. 도 5a는 PBS 대조군에 정규화된 기울기로서 계산된 O2 소비를 보여준다. 도 5b는 PBS 대조군에 정규화된 곡선하 면적으로서 계산된 O2 소비를 보여준다. 도 5a 및 5b의 결과는 엑소좀이 산소 정상 상태-노출 SMC에서 세포 O2 소비를 유의하게 변화시키지 않음을 보여준다. 반면에, 엑소좀 처리는 저산소증 스트레스하에서 O2 소비의 증가를 유도하며, 이것은 미토콘드리아 기능의 증가를 나타낸다.
도 6a-6c는 급성 저산소증 노출 후 SMC 용해물의 마이크로어레이 분석의 결과를 보여준다. 도 6a는 저산소증 노출 후 당분해에서 ENO1 유전자 발현의 증가를 보여주며, 이것은 엑소좀 처리에 의해 정상화된다. 도 6b는 저산소증 노출 후 TCA 사이클에서 PDHB 및 ACLY 유전자 발현의 증가를 보여주며, 이것은 엑소좀 처리에 의해 정상화된다. 도 6c는 저산소증 노출 후 전자 수송 사슬에서 NDUFAF3, ATP2B4, ATP5H, ATP91 유전자 발현의 증가를 보여주며, 이것은 엑소좀 처리에 의해 정상화된다.
도 7a-7d는 급성 저산소증 노출 후 SMC 용해물의 대사체학 분석을 보여준다. 도 7a는 당분해에서 대사물 수준의 배수 변화를 보여준다. 도 7b는 TCA 사이클에서 대사물 수준의 배수 변화를 보여준다. 도 7c는 전자 수송 사슬에서 대사물 수준의 배수 변화를 보여준다. 도 7d는 엑소좀 처리가 있는 경우와 없는 경우에 저산소증에 노출된 살아있는 SMC에서 ATP 생산의 비교를 보여준다. (#은 산소 정상 상태에 비하여 p≤0.05를 의미하며; $는 저산소증에 비하여 p≤0.05를 의미하며; *는 산소 정상 상태에 비하여 p≤0.1 및 저산소증에 비하여 p≤0.1을 의미한다). 결과는 이들 경로를 통한 감소된 유동으로 인해, 저산소증 노출 후 당분해, TCA 사이클 및 에너지 대사에서 대사물의 축적을 나타냈다. 엑소좀 처리는 이들 경로를 통한 유동을 증가시켰으며, 이것은 엑소좀 처리가 글루코스 산화를 증가시키며 급성 저산소증에 대한 SMC 스트레스 반응을 정상화시킴을 나타낸다.
도 8a-8e는 저산소증 노출 후 SMC 용해물의 분석을 보여준다. 도 8a는 24 시간 저산소증 노출 후 SMC 용해물에서 배지 LDH의 활성을 보여준다. 도 8b는 24 시간 저산소증 노출 후 SMC 용해물에서 배지 시트레이트의 수준을 보여준다. 도 8c는 만성 2주 저산소증 노출 후 SMC 용해물에서 배지 LDH의 활성을 보여준다. 도 8d는 만성 2주 저산소증 노출 후 SMC 용해물에서 배지 시트레이트의 수준을 보여준다. 도 8e는 만성 2주 저산소증 노출 후 SMC 용해물에서 피루베이트 데하이드로게나제 활성 서브유닛(PDH E1α), PDH E1α 억제제 피루베이트 데하이드로게나제 키나제(PDK), 및 ATPase의 단백질 발현을 보여준다. (#은 산소 정상 상태에 비하여 p≤0.05를 의미하며; $는 저산소증에 비하여 p≤0.05를 의미하며; *는 산소 정상 상태에 비하여 p≤0.1 및 저산소증에 비하여 p≤0.1을 의미한다). 결과는 엑소좀 처리가 급성 및 만성 저산소증 노출 후 미토콘드리아 기능을 정상화시킴을 보여준다.
도 9는 엑소좀 처리를 위한 제안된 모델을 보여준다. 구체적으로, 폐 고혈압은 미토콘드리아 글루코스 산화를 억제하고, 전체적 미토콘드리아 기능의 감소를 유도한다. 엑소좀 처리는 당분해 (1) 및 미토콘드리아내의 TCA 사이클과 전자 수송 사슬 (2)에서의 효소의 급성 단백질 통합 및/또는 만성 유전적 상향조절 둘 모두에 의해 글루코스 산화를 정상화시키고 미토콘드리아 능력을 개선한다.
도 10은 정용여과 단계 없이(청색) 그리고 정용여과 단계에 의해(오렌지색) 생산된 엑소좀의 크로마토그램의 비교를 보여준다. 청색 크로마토그램은 오렌지색 크로마토그램 보다 훨씬 높은 A280 판독값을 가져서, 정용여과된 샘플에 비하여 샘플내의 더 많은 양의 단백질을 제안한다. 정용여과 단계는 버퍼 교환과 유사하며, 이것은 원하는 엑소좀 농도에 도달하면, 펌프를 TFF 카세트 필터로 계속 러닝시키는 한편 부피를 유지하기 위하여 저장소내로 PBS 버퍼를 추가하는 것을 포함한다. 점진적으로, PBS는 조정 배지(conditioned media)를 대체할 것이다. 가능한 교환을 완전하게 이루기 위하여, 7회의 총 부피 정용여과를 농축물로 수행하였다. 이 단계는 엑소좀에 영향을 주지 않고 농축물내의 불순물의 일부를 제거하는 것을 돕는다. 엑소좀의 존재는 FLOT-1 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 이 도면은 정용여과 단계가 엑소좀을 보유하는 한편 감소된 총 단백질 및 인지질의 양에 의해 나타난 대로 불순물 제거를 돕는 것을 보여준다.
도 11a-11b는 엑소좀 생산 분석을 보여준다. 도 11a는 12 샘플의 FLOT-1 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 도 11b는 엑소좀의 크기 분포를 보여주며, 이것은 약 100 nm의 중앙 직경을 갖는다.
도 12는 크로마토그램, NTA, FLOT-1 웨스턴 블롯 및 ANXA2 웨스턴 블롯을 비롯한, 예시적인 엑소좀 생산의 보충 분석 및 평가를 보여준다.
도 13a-13c는 강한 엑소좀의 분석을 보여준다. 도 13a는 COM1(크고 강하지 않은 엑소좀 집단) 및 COM2(작고 강한 엑소좀 집단)의 크로마토그램을 보여준다. 도 13b는 저산소증 대조군에 비하여 각 제제로부터의 (저산소증-유도된 폐 고혈압의 동물 모델에서) RVSP에 대한 총 단백질의 그래프를 보여준다. 결과는 더 많은 단백질이 크고 강하지 않은 분획에 머무를 경우, 생성되는 제제는 강함을 보여준다. 도 13c는 결핍시키기 전에 공급된 일수에 대한 총 단백질의 그래프를 보여준다. 결과는 양성 델타 단백질(강한 제제를 나타냄)이 모두 일관되게 결핍 전 1일 공급되었음을 나타낸다.
도 14는 mir204(약 22 뉴클레오티드를 함유한 작은 비-코딩 RNA 분자는 RNA 사일런싱 및 유전자 발현의 전사후 조절에서 기능함)의 그래프를 보여준다. COM1은 더 낮은 miRNA 및 더 낮은 효능에 상응하는 더 높은 사이클 역치(CT) 값을 가진다. 대조적으로, COM2는 증가된 mir204 발현을 가진다.
도 15a-15d는 엑소좀의 효능이 부모 MSC 세포에서 CD105 단백질 발현(도 15a), GAPDH 유전자 발현(도 15b), DLST 유전자 발현(도 15c), 및 ATP5A1 유전자 발현(도 15d)에 긍정적으로 상관됨을 보여준다. 결과는 세포 대사 건강이 엑소좀 효능과 직접적으로 상관됨을 보여준다.
도 16a-16b는 기관지폐 형성이상(BPD) 환자의 파괴된 폐 발달을 보여준다. 도 16a는 BPD의 상이한 단계의 방사선 이미지를 보여준다. 도 16b는 마우스 모델에서 폐포 손상을 보여준다.
도 17은 언엑시좀(unexisome)-매개 염증 억제 뿐만 아니라 고산소성 인 비트로 모델을 보여준다. 폐포 세포가 24시간 동안 접종되고, 0.1% FBS 배지로 전환되고 3시간 동안 산소 정상 상태 인큐베이터에서 강한 엑소좀 집단(언엑시좀)으로 프라이밍되고, 48시간 동안 고산소성 항온처리 챔버에서 플레이팅되었다.
도 18은 강한 엑소좀 집단(언엑시좀)이 고산소성 스트레스(고산소증은 IL-6 방출을 야기함)에 노출된 세포에서 감소된 IL-6 발현에 기초하여 면역조절 능력을 증가시킴을 보여준다. "#"은 산소 정상 상태 대조군에 비하여 엑소좀 처리의 유의성을 나타낸다. "*"은 고산소증 대조군에 비하여 엑소좀 처리의 유의성을 나타낸다.
도 19는 강한 엑소좀 집단(언엑시좀)이 고산소성 스트레스(고산소증은 TNFα 방출을 야기함)에 노출된 세포에서 감소된 TNFα 발현에 기초하여 면역조절 능력을 증가시킴을 보여준다. "*"은 고산소증 대조군에 비하여 엑소좀 처리의 유의성을 나타낸다.
도 20은 강한 엑소좀 집단(언엑시좀)이 증가된 세포수에 상응하는 증가된 흡광도에 의해 나타난 대로, 고산소증하에서 항-어팝토시스 효과를 가짐을 보여준다. "*"은 고산소증 대조군에 비하여 엑소좀 처리의 유의성을 나타낸다.
도 21은 강한 엑소좀 집단(언엑시좀)이 고산소성 스트레스에 노출된 세포로부터의 사이토크롬 C 방출을 감소시킴을 보여주며, 이것은 감소된 세포 어팝토시스에 상응한다. "*"은 고산소증 대조군에 비하여 엑소좀 처리의 유의성을 나타낸다.
도 22a는 산소 정상 상태 세포, 고산소성 스트레스에 노출된 세포, 및 강한 엑소좀으로 처리된 세포의 형광 이미지를 보여준다. 도 22b는 엑소좀(COM2) 처리가 고산소증에서 관 형성을 회복시킴을 보여준다.
도 23은 평활근 세포(SMC) 만성 저산소증 모델의 도식을 보여준다. SMC는 PAH 및 저산소증에서 증식성의 비-어팝토시스 표현형으로 전환하고, 폐에서 혈관과 동맥이 두꺼워지도록 하여, 더 높은 압력 및 결국에는 심장에의 손상/PAH에서 부정적 증상을 야기한다. SMC는 산소 정상 상태, 4% 산소, 및 엑소좀과 함께 4% 산소에서 배양되었다. 배양 기간 동안, 세포는 2주 동안 매주 2회 강한 엑소좀으로 처리되었다. 생성된 SMC는 마이크로어레이 유전자 발현(IPA) 및/또는 전체적 대사체학에 의해 분석되었다.
도 24는 경로 내의 중간 대사물의 전체적 대사물 분석에 의해 엑소좀이 만성 저산소증에서 아미노산 대사를 상향조절함을 보여준다.
도 25는 엑소좀이 만성 저산소증에서 피루베이트 및 글루타메이트 대사를 상향조절함을 보여준다.
도 26은 엑소좀이 만성 저산소증에서 GLUD1 유전자 발현을 상향조절함을 보여준다.
도 27은 엑소좀이 만성 저산소증에서 PDK4를 하향조절함을 보여준다.
도 28은 엑소좀이 만성 저산소증에서 SIRT4를 하향조절함을 보여준다. SIRT4 유전자는 인 비트로 PAH 모델에서, 2가지 대사 효소, GLUD1 및 PDH를 억제한다. SIRT4 유전자는 인 비트로 PAH 모델에서, 엑소좀 처리에 의해 하향조절되는 한편, GLUD1 및 PDH는 엑소좀 처리에 의해 상향조절된다. SIRT4는 엑소좀 처리를 위한 타겟일 것으로 생각된다.
도 29는 엑소좀이 저산소증에서 하향조절된 유전자(TCA 사이클에서 9개 효소 중 6개가 하향조절됨)를 상향조절함으로써 TCA 사이클 기능을 회복함을 보여준다.
도 30은 SIRT4와 엑소좀 처리 사이의 관계를 보여준다.
도 31은 TCA 사이클의 회복에서 강한 엑소좀의 제안된 기전을 보여준다. 구체적으로, 저산소증은 (1) 둘 모두가 PDH를 억제하며 따라서 TCA 사이클내로의 피루베이트 진입을 억제하는 SIRT4와 PDK4를 상향조절하고, (2) GLUD1을 억제하고 따라서 TCA 사이클내로의 글루타민 진입을 억제하는 SIRT4를 상향조절함으로써 TCA 사이클 기능을 억제한다. 강한 엑소좀(언엑시좀)은 SIRT4 및 PDK4 둘 모두를 감소시켜, TCA 사이클내로의 글루타민과 피루베이트 유동을 증가시킨다.
도 32는 비-이상적 크기의 엑소좀 뿐만 아니라 단백질 및 강하지 않은 미세소포 오염물을 분리하는 초원심분리 또는 구배 분리에 비하여, 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 강한 엑소좀 집단(COM2)의 분리를 보여준다.
도 33은 엑소좀의 TEM 영상화를 보여준다. 결과는 분리된 강한 엑소좀이 초원심분리된 샘플에 비하여 더 균질한 크기와 더 명확한 이미지를 가짐을 보여준다.
도 34는 분리된 강한 엑소좀이 MHCII 오염이 없음을 보여준다. 대조적으로, 젠바이오(ZenBio)로부터의 시판되는 엑소좀은 MHCII 오염을 함유한다.
도 35a-35b는 폰소 염색에 기초할 때 분리된 강한 엑소좀이 피브로넥틴 및 다른 단백질 오염이 없음을 보여준다. 도 35a는 분리된 엑소좀이 오염성 단백질 피브로넥틴이 없는 한편, 젠바이오 시판 초원심분리된 제제는 피브로넥틴 오염을 가짐을 보여준다. 도 35b는 초원심분리에 의해 분리된 엑소좀이 농축된 세포 배양 배지가 그러한 것처럼 피브로넥틴 오염을 함유하였음을 보여준다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리된 엑소좀은 피브로넥틴 오염물 뿐만 아니라 폰소에 의해 염색될 수 있는 다른 단백질 오염물이 없다.
도 36은 강한 집단 및 오염물 미세소포의 RNAseq 클러스터링(clustering) 분석을 보여준다. 결과는 강한 엑소좀(COM2)이 오염성 미세소포로부터 차등적으로 클러스터링됨을 보여준다. 그들은 SORCS1, FHIT 및 ANKRD30BL에서 농축된다.
도 37은 강한 엑소좀(COM2) 대 강하지 않은 엑소좀(COM1)에서의 GAPDH 발현을 보여준다. 결과는 강한 엑소좀이 GAPDH의 더 높은 발현 수준에 상응하는 더 낮은 CT 값을 가짐을 보여준다.
도 38은 BPD 마우스 모델을 강한 엑소좀(언엑시좀)으로 처리하는 인 비보 연구의 절차를 보여준다.
도 39a-39c는 인 비보 연구에서 사용된 엑소좀의 특성을 보여준다. 도 39a는 엑소좀의 농도가 1.2 x 108 입자/mL임을 보여준다. 도 39b는 웨스턴 블롯 분석에 기초할 때 FLOT1이 엑소좀에 존재함을 보여준다. 도 39c는 엑소좀의 대표적인 TEM 영상화를 보여준다.
도 40a-40b는 엑소좀이 BPD-관련 폐포 단순화를 구조하였음을 보여준다. 도 40a는 강한 엑소좀을 이용한 처리가 산소 정상 상태(NRMX)에 비하여 고산소증(HYRX)-매개 폐포 단순화 증가를 구조함을 보여준다. 도 40b는 평균 선형 절편의 정량을 보여주며, 이것은 평균 공기 공간 직경의 대용을 나타낸다.
도 41은 BPD에 이차적인 PAH의 BPD-유도된 PAH 마우스 모델을 강한 엑소좀(언엑시좀)으로 처리하는 인 비보 연구의 절차를 보여준다.
도 42a-42c는 엑소좀이 만성 폐포 단순화를 구조하였음을 보여준다. 도 42a는 산소 정상 상태, 저산소증 하의 세포, 및 와튼 제대교질(Wharton's jelly) 유래 엑소좀 및 골수 유래 엑소좀으로 처리된 세포의 이미지를 보여준다. 도 42b는 엑소좀이 BPD-관련 PAH 마우스 모델에서 폐포 단순화를 구조하였음을 보여준다. 도 42c는 BPD-관련 PAH 마우스 모델에서 중격 영역에서의 콜라겐 침착에 의해 나타난 대로 심하지 않은 폐 섬유증을 감소시켰음을 보여준다.
도 43a-43d는 엑소좀이 α-평활근 액틴 염색(a 및 b) 및 PAH와 관련된 압력 변화(c)에 의해 입증된 대로 PAH 폐 혈관 리모델링을 구조하였음을 보여준다. PV-루프는 산소 정상 상태(NRMX) 대조군에 비교할 때 폐 질병의 폐기종-유사 특징 및 에어 트래핑(air trapping)을 나타내는, 고산소증(HYRX) 마우스에서의 유의한 변화를 입증한다. 엑소좀은 이 변화에서 유의한 구조를 나타내어, 개선된 폐 기능을 나타낸다.
도 44a는 저산소증-유도된 PAH 마우스 모델 치료의 인 비보 연구를 위한 절차를 보여준다. 도 44b는 MSC 엑소좀이 마우스에서 PAH를 예방함을 보여준다.
도 45a는 수젠(Sugen)(VEGF 수용체 아고니스트) 및 저산소증-유도된 PAH 마우스 모델을 엑소좀과 실데나필의 조합으로 치료하는 인 비보 연구의 절차를 보여준다. 도 45b는 마우스 모델에서 엑소좀과 실데나필의 조합 치료법이 PAH를 역전시켰음을 보여준다.
도 46은 PAH에서 엑소좀-매개된 작용 기전의 확인을 위한 절차를 보여준다.
도 47은 엑소좀이 PAH의 수젠/저산소증 모델에서 아미노산 대사를 상향조절함을 보여준다.
일부 MSC 세포외 소포 또는 엑소좀(예를 들어, 골수 MSC 세포외 소포 또는 엑소좀)은 글루코스 산화를 향상시키고 미토콘드리아 기능을 정상화시킬 수 있다. 따라서, 이들 세포외 소포 또는 엑소좀은 PAH 및 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태에서 치료 효과를 부여할 수 있다. 본 발명자들은 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단을 분리하였으며, 이것은 마우스에서 저산소증-유도된 PAH를 효과적으로 방지하였다. 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단의 단백질체학 및 RNAseq 분석은 그들이 당분해 경로, TCA 사이클 및 전자 수송 사슬의 유전자의 더 높은 발현 수준을 함유함을 보여준다. 구체적으로, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀은 피루베이트 키나아제(PKM2) 및 ATPase의 발현 수준 및 그들의 상응하는 효소 활성이 증가되어 있다. 본 발명자들은 또한 급성 저산소증에의 폐 동맥 평활근 세포(SMC)의 노출이 당분해, TCA 사이클 및 전자 수송 사슬에 관련된 다수 유전자의 상향 조절을 유도함을 발견하였다. 저산소증 공격 이전에 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단으로 SMC를 처리하면 이들 유전적 특징을 정상화시켰다. 또한, 전체적 대사체학 분석에 기초할 때, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 저산소증-노출된 SMC에서 당분해와 ATP 생산을 향상시킨다. 이론에 구애됨없이, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 당분해 경로, TCA 사이클 및/또는 전자 수송 사슬과 같은 핵심 경로내에서 유전적 재프로그래밍과 단백질 통합 둘 모두를 통해 타겟 세포에서 미토콘드리아 기능을 개선할 수 있다(도 9 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포외 소포 또는 엑소좀은 PDH 및 GLUD1의 발현을 증가시키며, 따라서 TCA 사이클내로의 유동을 증가시킨다. 이론에 구애됨없이, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 PDH와 GLUD1 둘 모두의 공지의 억제제인 SIRT4의 억제에 의해 PDH와 GLUD1의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀은 TCA 사이클 기능을 증가시킨다.
본 발명은 PAH를 비롯한 폐 고혈압의 치료 및 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병과 병태의 치료에서 적용될 수 있는 것으로 생각된다.
A. 정의
달리 특정되지 않으면, 부정 관사 "a" 또는 "an"은 "하나 이상"을 의미한다.
달리 구체적으로 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해된다.
달리 나타내지 않으면, 본 발명에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 그러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), 및 F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트를 포함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트를 포함)와 같은 출처의 문헌을 통해 개시되고 설명되며, 참고로 본원에 포함된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "대상"(본 명세서에서 "환자"로도 불림)은 인간을 비롯한 온혈 동물, 바람직하게는 포유동물을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 대상은 영장류이다. 더욱 더 바람직한 실시형태에서, 대상은 인간이다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 혈관병의 적어도 하나의 증상을 감소, 완화 또는 제거하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 혈관병의 적어도 하나의 증상의 출현 또는 존재를 중단시키거나 방해하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "발현"은 하나 이상의 유전자의 RNA 발현 및/또는 단백질 발현 수준을 의미한다. 즉, 용어 "발현"은 RNA 발현 또는 단백질 발현을 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "저산소증"은 대기 O2 농도, 20% 미만의 산소(O2) 농도를 가진 상태를 말한다. 일부 실시형태에서, 저산소증은 0% 내지 10%, 0% 내지 5% 02; 5% 내지 10%, 또는 5% 내지 15%인 O2 농도를 가진 상태를 말한다. 일 실시형태에서, 저산소증은 약 10% 02의 산소 농도를 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "산소 정상 상태"는 산소의 정상 대기 농도, 약 20% 내지 21% 02를 가진 상태를 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "분리하는" 또는 "분리된"은 세포 배양물 또는 배지로부터 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀의 맥락에서 사용될 경우, 사람의 손에 의해 그 원래 환경으로부터 떨어져 존재하는 세포외 소포 또는 엑소좀을 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "세포외 소포"는 엑소좀을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "세포외 소포 또는 엑소좀 집단"은 뚜렷한 특징을 가진 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단을 말한다. 용어 "세포외 소포 또는 엑소좀 집단" 및 "세포외 소포 또는 엑소좀"은 뚜렷한 특징을 가진 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단을 지칭하기 위하여 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "중간엽 기질 세포"는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 중간엽 줄기 세포는 골수, 혈액, 치아 속질 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모공, 장, 폐, 림프절, 흉선, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 진피, 및 골막에서 발견되는 세포이다. 중간엽 줄기 세포는 중배엽, 내배엽 및 외배엽과 같은 상이한 생식 계열로 분화할 수 있다. 따라서, 중간엽 줄기 세포는 지방, 뼈로 이루어진, 연골로 된, 탄력성, 근육성 및 섬유성 결합 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 세포 타입으로 분화할 수 있다. 구체적인 계통-실행(lineage-commitment) 및 중간엽 줄기 세포에 의해 진입되는 분화 경로는 역학적 영향 및/또는 성장 인자, 사이토카인 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 상태와 같은 내인성 생물활성 인자를 비롯한 다양한 영향에 의존한다. 따라서 중간엽 줄기 세포는 결국에는 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 생성할 줄기 세포이거나 전구 세포인 딸 세포를 생성하기 위하여 분열하는 비-조혈 전구 세포이다.
본 발명의 일부 실시형태는 넓게는 중간엽 기질 세포 세포외 소포 또는 엑소좀에 관련되며, 이것은 상호교환가능하게 중간엽 기질 세포 세포외 소포 또는 엑소좀, 또는 MSC 세포외 소포 또는 엑소좀, 또는 세포외 소포 또는 엑소좀으로 불린다.
B. 혈관병
혈관병은 폐 고혈압, 예를 들어, 폐동맥 고혈압(PAH), 말초 혈관 질병(PVD), 중증 하지 허혈(critical limb ischemia)(CLI), 관상 동맥 질병 및 당뇨성 혈관병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
폐 고혈압, 예를 들어, 폐동맥 고혈압(PAH)은 폐 순환에서 압력이 증가하여 결국에는 심부전 및 사망을 야기하는 병태를 말한다. 많은 원인과 병태가 PAH와 관련되는 것으로 밝혀졌지만, 그들 중 다수는 공통적인 몇몇 근본적인 병리생리학적 특징을 공유한다. 이들 과정 중에서 한 가지 특징은 모든 혈관 벽의 내부 세포층인 내피의 기능장애이며, 내피는 정상적으로는 혈관 수축(vessel tone)을 조절하고 응혈 형성을 복구하고 억제하는 많은 물질의 생산과 대사를 책임진다. PAH의 상황에서, 내피 기능장애는 유해한 물질의 과다 생산 및 보호성 물질의 손상된 생산을 유도할 수 있다. 이것이 PAH의 발생에서 주요 사건인지 또는 다운스트림 캐스캐이드의 일부인지는 아직 알려지지 않았으나, 어느 경우이든, 이것은 질병을 특징짓는 진행성 혈관수축 및 혈관 증식에서의 한 인자이다. 본 발명은 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을 이용하여, PAH를 비롯한 폐 고혈압을 치료하는 방법을 제공한다.
용어 말초 혈관 질병(PVD)은 말초 동맥과 정맥 내에서의 손상, 기능장애 또는 폐색을 말한다. 말초 동맥 질병은 가장 일반적인 형태의 PVD이다. 말초 혈관 질병은 가장 일반적인 동맥 질병이며 미국에서 매우 흔한 병태이다. 이것은 50세를 넘는 사람들에서 대부분 발생한다. 말초 혈관 질병은 당뇨병을 가진 사람 뿐만 아니라, 50세를 넘는 사람들에서 장애의 주요 원인이다. 미국에서 약 천만명의 사람들이 말초 혈관 질병을 가지고 있으며, 이것은 50세를 넘는 사람의 약 5%에 해당한다. 이 병태를 가진 사람의 수는 인구가 고령화하면서 증가할 것으로 예상된다. 남자는 여자보다 말초 혈관 질병을 가질 가능성이 약간 더 높다.
진행된 말초 동맥 폐색으로 인한, 중증 하지 허혈(CLI)은 안정시에 감소된 혈류 및 산소 전달을 특징으로 하며, 안정시에 근육 통증 및 치유되지 않는 피부 궤양 또는 괴저를 야기한다(Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest. 31 :651-666 (2001); Dormandy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31 :S1-S296 (2000)). 중증 하지 허혈은 1년에 백만명 당 500 내지 1000명에서 발생하는 것으로 추정된다("Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia", Circulation 84(4 Suppl.) IV 1-26 (1991)). 중증 하지 허혈을 가진 환자에서, 절단은 관련된 그 이환률, 사망률 및 기능적 영향에도 불구하고, 종종 불능화 증상에 대한 해결책으로서 권고된다(M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993); M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)). 중증 하지 허혈을 위한 적절한 의학적 치료법은 없다(Circulation 84(4 Suppl.): IV 1-26 (1991)).
관상 동맥 질병(죽상동맥경화증)은 하나 이상의 관상 동맥이 플라크의 축적을 통해 점진적으로 폐색되는, 인간에서의 진행성 질병이다. 이 질병을 가진 환자의 관상 동맥은 종종 부분적으로 폐색된 동맥을 개방시켜 놓기 위하여 풍선 혈관성형 또는 스텐트의 삽입에 의해 치료된다. 궁극적으로는, 이들 환자는 큰 비용과 위험성을 가지고서 관상 동맥 우회로 조성술을 받는 것이 필요하다.
기관지폐 형성이상(BPD)은 미성숙 유아의 만성 폐 질병이다. 이것은 장기적인 폐 염증, 폐포 수의 감소 및 두꺼워진 폐포 격막, 말단 혈관의 "전정"을 가진 비정상적인 혈관 성장, 및 제한된 대사 및 항산화 능력을 특징으로 한다. 미국에서는 매년 14,000개의 새로운 BPD 케이스가 있다. 중요하게는, BPD의 진단은 종종 PAH, 폐기종, 천식, 심혈관 이환율 및 신생아 사망률 증가, 신경발달 손상 및 뇌성마비 증가, 젊은 성인에서 폐기종을 비롯한 다른 추가 병태를 유도한다. 현재, BPD를 위한 표준 치료법은 없다. 일부 BPD 환자는 부드러운 환기 및 코르티코스테로이드로 치료되지만, 이들 치료는 신경 결과 또는 사망에 효과를 나타내지 않는다. BPD의 주요 위험은 출생 후 24-28주의 유아에서 존재하며, 이것은 낭상 발달의 초기에 해당한다. 고위험 유아는 1.3 내지 2.2 파운드이다.
일 양태에서, 본 발명의 엑소좀은 BPD를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 폐의 면역조절 능력을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 폐에서 혈관신생을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 폐의 미토콘드리아 대사를 증가시킨다.
C. 미토콘드리아 기능장애
미토콘드리아는 많은 대사적 변화 및 조절 기능을 책임지는 세포내 소기관이다. 그들은 진핵 세포에 의해 이용되는 ATP의 다수를 생산한다. 그들은 또한 산화 스트레스를 야기하는 자유 라디칼과 활성 산소종의 주요 공급원이다. 결과적으로, 미토콘드리아 결함은 특히, 높은 에너지 수준 요구를 가진 신경 및 근육 조직을 손상시킨다. 따라서, 운동 장애, 심근병증, 근육병, 실명, 및 귀먹음 형태에서 에너지 결함이 원인으로 나타났다(DiMauro et al. (2001) Am. J. Med. Genet. 106, 18-26; Leonard et al. (2000) Lancet.355, 299-304). 미토콘드리아 기능장애는 증가된 젖산 생산, 감소된 호흡 및 ATP 생산에 관련될 수 있다. 미토콘드리아 기능장애는 산화성 스트레스의 결과로 나타날 수 있다.
본 발명은 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 미토콘드리아 기능장애는 대상에서 감소된 미토콘드리아 글루코스 산화와 관련될 수 있다.
일부 실시형태에서, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태는 프리드라이히실조증, 레베르 시신경병증, 컨스-세이어 증후군, 젖산 산증 및 뇌졸중-유사 에피소드를 가진 미토콘드리아성 뇌병증, 라이 증후군, 비만, 죽상동맥경화증, 근위축성 측색 경화증, 파킨슨병, 암, 심부전, 심근경색(MI), 알츠하이머병, 헌팅턴병, 조현병, 조울증, 취약 X 증후군, 및 만성 피로 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
D. 미토콘드리아 에너지 생산
진핵 유기체의 세포는 세포 과정을 수행하기 위하여 에너지를 요구한다. 그러한 에너지는 주로 아데노신 5'-트리포스페이트("ATP")의 포스페이트 결합에 저장된다. (1) 당분해; (2) TCA 사이클(크렙스 사이클 또는 시트르산 사이클로도 불림); 및 (3) 산화성 인산화를 비롯한, 진핵 유기체에서 에너지를 생성하는 일부 경로가 있다. ATP가 합성되기 위하여, 탄수화물이 먼저 단당류(예를 들어, 글루코스)로 가수분해되고, 지질은 지방산과 글리세롤로 가수분해된다. 유사하게, 단백질은 아미노산으로 가수분해된다. 그러면 이들 가수분해된 분자의 화학 결합에서의 에너지가 방출되고 많은 이화 경로를 통해 ATP 분자를 형성하기 위하여 세포에 의해 이용된다.
살아있는 유기체를 위한 에너지의 주요 공급원은 글루코스이다. 글루코스의 분해에서, 글루코스 분자의 화학 결합에서의 에너지가 방출되고 ATP 분자를 형성하기 위해 세포에 의해 이용될 수 있다. 이것이 발생하는 과정은 여러 단계로 이루어진다. 첫번째는 당분해로 불리며, 여기서는 글루코스 분자가 피루브산으로 불리는 두 개의 더 작은 분자로 분해된다.
당분해에서는, 글루코스와 글리세롤이 당분해 경로를 통해 피루베이트로 대사된다. 이 과정동안, 두 개의 ATP 분자가 생성된다. 두 개의 NADH 분자가 또한 생산되며, 이것은 추가로 전자 수송 사슬을 통해 산화될 수 있으며 추가의 ATP 분자의 생성을 야기할 수 있다.
당분해는 글루코스(및 다른 단당류)를 2개의 피루베이트 분자로 분해하는 많은 효소-촉매된 단계를 동반한다. 대신에, 이 경로는 총 2 ATP 분자의 생성을 유도한다. 당분해 경로로부터 생성된 피루베이트 분자는 시토졸로부터 미토콘드리아로 들어간다. 그 후 분자는 TCA 사이클로의 진입을 위하여 아세틸 조효소 A(아세틸-CoA)로 전환된다. TCA 사이클은 아세틸 조효소-A와 옥살로아세테이트가 결합하여 시트레이트를 형성하는 것으로 이루어진다. 형성된 시트레이트는 그 후 일련의 효소-촉매된 단계를 통해 분해되어 추가의 ATP 분자를 생성한다.
미토콘드리아 기질에서 TCA 사이클로부터 방출된 에너지는 NADH(복합체 I) 및 FADH2(복합체 II)로서 미토콘드리아 전자 수송 사슬에 들어간다. 이들은 ATP 생산에 관련된 다섯 가지 단백질 복합체 중 첫번째 두 가지이며, 이들 복합체 모두는 내부 미토콘드리아 막에 위치된다. (NADH-특이적 데하이드로게나제를 이용한 산화에 의해) NADH로부터 그리고 (석시네이트 데하이드로게나제를 이용한 산화에 의해) FAD3/4로부터 유래된 전자는 호흡 사슬을 따라 아래로 이동하여, 미토콘드리아 기질로부터 막간 공간으로(즉, 내부 미토콘드리아 막을 통해) 양성자의 능동 수송을 추진함으로써 별도의 단계에서 그들의 에너지를 방출한다. 호흡 사슬에서의 전자 운반체는 플라빈, 단백질-결합 철-황 센터, 퀴논, 사이토크롬 및 구리를 포함한다. 복합체 사이에서 전자를 전달하는 두 분자가 있다: 조효소 Q (복합체 I→ III, 및 복합체 II→ III) 및 사이토크롬 c(복합체 III→ IV). 호흡 사슬에서 최종 전자 수용체는 (3/4이며, 이것은 복합체 IV에서 3/4 O로 전환된다.
본 발명의 일부 실시형태는 당분해, TCA 사이클, 및/또는 전자 수송 사슬에서 적어도 하나의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현을 갖는 세포외 소포 또는 엑소좀에 관련된다. 일부 실시형태에서, 유전자는 하기 표 1에 의해 나타난 유전자 그룹으로부터 선택된다.
Figure pct00001
일부 실시형태에서, 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀은 PK의 증가된 발현을 가진다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀은 ATPase의 증가된 발현을 가진다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀은 PK 및 ATPase의 증가된 발현을 가진다.
E. 중간엽 기질 세포로부터 분리된 세포외 소포
본 발명의 세포외 소포 또는 엑소좀은 예를 들어, 중간엽 기질 세포로부터 방출되는 막(예를 들어, 지질 이중층) 소포일 수 있다. 그들은 예를 들어, 직경이 약 30 nm 내지 100 nm 범위일 수 있다. 전자 현미경에 의해, 세포외 소포 또는 엑소좀은 컵모양 형태를 갖는 것으로 나타날 수 있다. 그들은 예를 들어, 약 100,000 x g에서 침강할 수 있으며 약 1.10 내지 약 1.21 g/ml의 수크로스에서의 부력 밀도를 가질 수 있다.
중간엽 기질 세포는 골수, 혈액, 골막, 피부, 제대혈 및/또는 기질(예를 들어, 와튼 제대교질), 및 태반을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 공급원으로부터 수집될 수 있다. 중간엽 기질 세포의 수집 방법은 실시예에서 보다 상세히 개시된다. 또한 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 수집 방법을 위하여, 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 5,486,359호를 참조할 수 있다.
본 발명의 방법에서의 사용을 위해 고려되는 중간엽 기질 세포 및 따라서 세포외 소포 또는 엑소좀은 치료될 동일한 대상으로부터 수득될 수 있거나(따라서 대상에게 자가조직으로 불림), 또는 그들은 상이한 대상, 바람직하게는 동일한 종의 대상으로부터 수득될 수 있다(따라서 대상에게 동종이계로 불림).
본 명세서에서 사용될 때, 본 발명의 양태 및 실시형태는 달리 나타내지 않으면 세포 및 세포 집단에 관련됨이 이해되어야 한다. 따라서, 세포가 언급될 경우, 달리 나타내지 않으면 그것은 세포 집단 또한 고려되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일부 양태는 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을 말한다. 본 명세서에서 사용될 때, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 그의 자연 환경으로부터 물리적으로 분리된 것이다. 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포를 비롯하여 그것이 자연적으로 존재하는 조직 또는 세포 환경으로부터, 전체적으로 또는 부분적으로 물리적으로 분리될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀의 조성물에는 중간엽 기질 세포와 같은 세포가 없을 수 있거나, 또는 조정 배지(conditioned media)가 없거나 실질적으로 없을 수 있다. 일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 조작되지 않은 조정 배지에서 존재하는 세포외 소포 또는 엑소좀보다 더 높은 농도로 제공될 수 있다. 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포 배양물로부터의 조정 배지로부터 분리될 수 있다.
일반적으로 세포외 소포 또는 엑소좀을 정제 및/또는 농축하기 위한 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 자기 입자, 여과, 투석, 초원심분리, 엑소퀵(ExoQuick)™(미국 캘리포니아주 소재의 시스템즈 바이오사이언시즈(Systems Biosciences)), 및/또는 크로마토그래피를 포함하는 방법이 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀은 원심분리 및/또는 초원심분리에 의해 분리된다. 세포외 소포 또는 엑소좀은 또한 정화된 조정 배지의 초원심분리에 의해 정제될 수 있다. 그들은 또한 수크로스 쿠션 내로의 초원심분리에 의해 정제될 수 있다. 프로토콜은 예를 들어, 참고로 본원에 포함되는 Thery et al. Current Protocols in Cell Biol. (2006) 3.22에서 개시된다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀은 단일 단계 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리된다. 프로토콜은 예를 들어, 참고로 본원에 포함되는 Boing et al. Journal of Extracellular Vesicles (2014) 3: 23430에서 개시된다. 중간엽 기질 세포 또는 중간엽 줄기 세포로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 수집을 위한 상세한 방법은 실시예에서 제공된다.
본 발명은 또한 세포외 소포 또는 엑소좀의 즉시 사용 또는 다르게는 예를 들어, 사용 전에 저온보존 상태에서 세포외 소포 또는 엑소좀의 단기- 및/또는 장기 저장을 고려한다. 프로테이나제 억제제는 장기 저장 동안 그들이 세포외 소포 또는 엑소좀 온전성을 제공하므로 전형적으로 동결 배지에 포함된다. -20℃에서의 동결은, 세포외 소포 또는 엑소좀 활성의 소실 증가와 관련되므로 바람직하지 않다. -80℃에서의 신속한 동결은 활성을 보존하므로 더욱 바람직하다. 예를 들어, 참고로 본원에 포함되는 Kidney International (2006) 69, 1471-1476을 참고한다. 동결 배지에의 첨가제가 세포외 소포 또는 엑소좀 생물 활성의 보존을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 첨가제는 본래의 세포의 저온보존을 위해 사용되는 것과 유사할 것이며 DMSO, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
F. 세포외 소포 또는 엑소좀의 효능의 평가
본 발명은 저산소증 유도된 PAH 마우스 모델에 대한 세포외 소포 또는 엑소좀 처리의 효과를 측정하기 위하여 그리고 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단을 확인하기 위하여 우심실 수축기압(RVSP)을 이용하는 것을 제공한다. 일부 실시형태에서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 3주 만성 저산소증 노출을 겪은 마우스의 RVSP를, 3-주 만성 저산소증 노출을 겪고 PBS 버퍼로 처리된 대조군 마우스에 비하여 적어도 약 10%, 12.5%, 15%, 17.5%, 20%, 22.5%, 25%, 27.5%, 또는 30% 만큼 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 델타 RVSP에 의해 확인된다. 본 명세서에서 사용될 때, 델타 RVSP는 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증-노출 마우스의 RVSP - 산소 정상 상태 마우스의 RVSP로 정의된다. 일부 실시형태에서, 만일 델타 RVSP가 약 6, 5, 4, 3, 또는 2 mmHg 미만이면 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단은 강하다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단의 효능은 평활근 세포(SMC) 용해물에 의한 O2 소비를 증가시키는 그들의 능력을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 24-시간 저산소증 노출을 겪고 PBS 대조군으로 처리된 대조군 SMC 세포 용해물에 비하여, 24-시간 저산소증 노출을 겪은 SMC 용해물에 의한 O2 소비를 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 만큼 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단의 효능은 그들의 PK 활성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 적어도 약 0.15 nmol/min/ml, 0.16 nmol/min/ml, 0.17 nmol/min/ml, 0.18 nmol/min/ml, 0.19 nmol/min/ml, 0.20 nmol/min/ml, 0.21 nmol/min/ml, 0.22 nmol/min/ml, 0.23 nmol/min/ml, 0.24 nmol/min/ml, 0.25 nmol/min/ml, 0.3 nmol/min/ml, 또는 0.4 nmol/min/ml의 PK 활성을 가진다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단의 효능은 그들의 LDH 활성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단의 효능은 저산소증-노출된 SMC에 의해 분비되는 LDH를 적어도 약 10%, 20%, 30%, 또는 40% 만큼 감소시키는 그들의 능력을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포외 소포 또는 엑소좀은 하기 표에서의 하나 이상의 기준에 기초하여 분리된다.
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일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 mir204의 평균 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 100% 더 많은 mir204의 양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 CD105, GAPDH, DLST, 및/또는 ATP5A1의 평균 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 100% 더 많은 CD105, GAPDH, DLST, 및/또는 ATP5A1의 양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 SORCS1, FHIT 및/또는 ANKRD30BL의 RNA 발현의 평균 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 100% 더 많은 SORCS1, FHIT 및/또는 ANKRD30BL의 RNA 발현 양을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 MHCII 오염물의 평균 수준보다 적어도 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 적은 MHCII 오염물의 양을 포함하는 것과 같이, 감소된 MHCII 오염물을 갖거나 MHCII 오염물이 실질적으로 또는 완전히 없다.
일부 실시형태에서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 피브로넥틴의 평균 수준보다 적어도 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 적은 피브로넥틴의 양을 포함하는 것과 같이, 감소된 피브로넥틴 함량을 갖거나 피브로넥틴이 실질적으로 또는 완전히 없다.
G. 세포외 소포 또는 엑소좀을 이용한 치료
본 발명의 방법을 위해 유용한 조성물은 특히, 카테터 투여, 전신 주사, 국소화 주사, 정맥내 주사, 자궁내 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소화 주사를 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 치료 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 투여할 경우, 그것은 일반적으로 단위 투여량 주사용 형태(예를 들어, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼)로 제형화될 것이다.
본 발명은 세포외 소포 또는 엑소좀의 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 더 많은 투여를 비롯한, 세포외 소포 또는 엑소좀의 단일 또는 반복 투여를 고려한다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포 또는 엑소좀은 연속적으로 투여될 수 있다. 반복 또는 연속 투여는 치료되는 병태의 심각성에 따라 몇 시간(예를 들어, 1-2, 1-3, 1-6, 1-12, 1-18, 또는 1-24 시간), 몇 일(예를 들어, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6 일 또는 1-7 일) 또는 몇 주(예를 들어, 1-2 주, 1-3 주 또는 1-4 주)의 기간에 걸쳐 발생할 수 있다. 만일 투여가 반복되지만 연속적이 아니면, 투여 사이의 시간은 시간(예를 들어, 4 시간, 6 시간, 또는 12 시간), 일(예를 들어, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 또는 6 일), 또는 주(예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 또는 4 주)일 수 있다. 투여 사이의 시간은 동일하거나 상이할 수 있다. 예로서, 만일 질병의 증상이 악화되는 것으로 나타나면, 세포외 소포 또는 엑소좀은 더 자주 투여될 수 있으며, 그 후 일단 증상이 안정화되거나 감소되면, 세포외 소포 또는 엑소좀은 덜 자주 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 세포외 소포 또는 엑소좀의 저 투여량 형태의 반복 투여 및 세포외 소포 또는 엑소좀의 고 투여량 형태의 단일 투여를 고려한다. 저 투여량 형태는 제한없이, 1-50 마이크로그램/킬로그램 범위일 수 있는 한편, 고 투여량 형태는 제한없이 51-1000 마이크로그램/킬로그램 범위일 수 있다. 그중에서도 질병의 심각성, 대상의 건강, 및 투여 경로에 따라, 저 또는 고 용량 세포외 소포 또는 엑소좀의 단일 또는 반복 투여가 본 발명에 의해 고려된다.
세포외 소포 또는 엑소좀은 전형적으로 약학적 허용 담체와 조합될 경우, 약학적 허용 제제(또는 약학적 허용 조성물)에서 사용될 수 있다(예를 들어, 투여될 수 있다). "약학적 허용"이라는 어구는 철저한 의학적 판단의 범위 내에서, 과다한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증없이, 합리적인 이득/위험 비율에 비례하여, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 말한다. 본 명세서에서 사용될 때 "약학적-허용 담체"라는 어구는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매, 캡슐화 물질과 같은, 약학적-허용 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다.
그러한 제제는 일상적으로 약학적 허용 농도의 염, 완충제, 보존제, 양립성 담체를 함유할 수 있으며, 선택적으로는 다른 (즉, 이차) 치료제를 포함할 수 있다. 약학적 허용 담체는 예방적 또는 치료적 활성제를 운반하거나 수송하는데 관련된, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은, 약학적 허용 물질, 조성물 또는 비히클이다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 양립성이며 대상에게 손상을 주지않는다는 의미에서 "허용성"이어야 한다. 약학적 허용 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예를 들어, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어, 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예를 들어, 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; 완충제, 예를 들어, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 무발열원 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; 포스페이트 버퍼 용액; 및 약학 제형에 이용되는 다른 비독성 양립성 물질을 포함한다.
본 발명의 제제는 유효량으로 투여된다. 유효량은 원하는 결과를 단독으로 자극하는 작용제의 양이다. 절대량은 투여를 위해 선택된 물질, 투여가 단일 용량 또는 다중 용량인지 여부, 및 연령, 신체 상태, 크기, 체중 및 질병 단계를 비롯한 개별 환자 파라미터를 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이다. 이들 인자는 당업자에게 잘 알려져 있으며 일상적인 실험으로 해결될 수 있다.
본 발명은 또한 포장되고 라벨링된 약학 제품을 포함한다. 이러한 제조 물품 또는 키트는 완전 밀봉되는 유리 바이알 또는 플라스틱 앰퓰 또는 다른 용기와 같은 적절한 그릇 또는 용기 내의 적절한 단위 투약 형태를 포함한다. 단위 투약 형태는 예를 들어, 에어로졸에 의해 폐 전달하기에 적합해야 한다. 바람직하게는, 제조 물품 또는 키트는 추가로 약학 제품을 어떻게 투여하는 지를 비롯한 사용 방법에 대한 설명서를 포함한다. 설명서는 추가로 의료 실무자, 기술자 또는 대상에게 어떻게 문제의 질병 또는 장애를 적절하게 예방하거나 치료하는지에 대해 조언하는 정보성 물질을 함유할 수 있다. 즉, 제조 물품은 실제 용량, 모니터링 절차 및 다른 모니터링 정보를 포함하지만 이에 제한되지 않는 사용하기 위한 투약 계획을 표시하거나 제안하는 설명서를 포함한다.
임의의 약학 제품에서처럼, 포장 재료 및 용기는 보관 및 선적 동안 제품의 안정성을 보호하도록 설계된다. 키트는 직접 사용될 수 있거나 정맥내 주사 또는 네뷸라이저에서의 사용, 또는 기관내 투여를 위한 계면활성제를 이용한 희석 또는 조합을 위해 생리식염수로 희석될 수 있다. 키트는 따라서 또한 염수 또는 계면활성제와 같은 희석제 용액 또는 작용제를 함유할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 개시된 방법과 조성물을 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 완전한 설명을 당업자에게 제공하고자 하는 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1- 엑소좀 집단의 분리
본 실시예는 세포 배양 배지로부터 엑소좀의 분리를 보여준다.
여과: 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 수득된 조정된 배지를 0.2um 필터를 가진 5L 사르토리우스(Sartorius)-스테디움(stedium) 플렉스보이(Flexboy)® 백에 수집하였다. 수집된 조정된 배지를 필터 라인을 통해 퍼내어 임의의 세포, 죽은 세포 및 세포 파편을 빨리 제거하였다. 조정된 배지를 140ml 루어-록(luer-lok) 주사기를 이용하여 25mM HEPES 및 1OmM EDTA 버퍼로 보충하였다.
접선 유동 여과(Tangential flow filtration): 조정된 배지를 함유한 5L 플렉스보이® 백을, 플렉스보이 백에 부착되고 접선 유동 여과(TFF) 저장소의 상부에 연결된 샘플 라인에 의해 접선 유동 여과(TFF) 시스템에 연결시켰다. 단일 1OOkDa MWCO 0.1m2 하이드로사르트(Hydrosart)® 카세트를 가진 사르토리우스 사르토콘 슬라이스(Sartorius Sartocon Slice) TFF를 이용하였다. 카세트의 온전함을 측정하기 위하여 각 TFF 실시의 시작과 마지막에 물 온전함 테스트(water integrity test)를 수행하였다. 그 후 1L의 PBS로 시스템을 프라이밍시켰다. 배지 샘플을 그 후 저장소내로 중력 급유하였다. TFF를 600 LMH에서 실행시켰다. 5L 부피의 초기 배지를 100 mL로 농축(50X 농축)시켰다. 농축물을 수집하고 0.22um 필터를 이용하여 여과하였다. 여과된 액체를 10 mL 분액 샘플로 분할하여 -80℃에서 동결시켰다.
분별법: 샘플을 대략 10분 동안 37℃에서 해동시켰다. 모든 샘플을 150ml 코닝 병에서 함께 모았다. XK 50/100 컬럼을 세파로즈 CL-2B 수지(지이(GE))를 이용하여 패킹하였다. XK 50/100 컬럼을 AKTA Aant 150(지이)에 연결시켰다. 샘플을 샘플 라인을 통해 컬럼내로 도입하였다. 일단 모든 샘플이 컬럼에 도입되면, 용리 단계를 시작하였다(설정: 4.6 ml/min의 유속). 0.2 CV의 빈 컬럼이 용리되었으며, 그 후 분획 수집기가 1 분/분획의 속도로(각 분획에서 4.6 ml) 분획을 수집하기 시작하였다. 0.6CV가 용리될 때까지 분획을 수집하였다(엑소좀은 0.3CV-0.4CV 사이에서 용리되었다). PBS를 전체 실험을 위해 사용하였다. 분획 샘플을 후드하에서 뚜껑을 닫고 4℃에서 저장하였다.
정용여과: 샘플은 선택적으로 바람직하게는 TFF 단계 후 그리고 버퍼 교환과 유사한 분별 단계 전에 정용여과 단계를 거칠 수 있다. 일단 원하는 농도의 엑소좀이 도달되면, PBS 버퍼를 저장소를 통해 샘플에 추가하여 부피를 유지하면서 TFF 카세트 필터로의 펌프를 실행하였다. 점진적으로, PBS는 조정된 배지를 대체하였다. 가능한 완전한 교환을 이루기 위하여, 농축물로 7회의 총 부피 정용여과를 수행하였다. 이 단계는 엑소좀에 영향을 주지 않고 농축물내의 불순물의 일부를 제거하는 것을 돕는다. 엑소좀의 존재는 FLOT-1 웨스턴 블롯으로 확인하였으며, 이것은 총 단백질 및 인지질의 양이 감소되었음을 보여준다.
인지질 농도의 측정: 엑소좀 검출을 위하여 인지질 시그널링을 이용하였다. 요약하면, 분별 후, 20uL의 각 엑소좀 제제 및 80uL의 반응 혼합물(시그마(Sigma))을 흑색 투명-바닥 96-웰 플레이트(뉴욕주 코닝 소재의 코닝(Corning))내로 옮기고 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 형광 강도는 플루오스타 오메가(FLUOstar Omega) 마이크로플레이트 판독기(독일 오텐베르그 소재의 비엠지 랩테크(BMG Labtech))를 이용하여 530/585nm에서 측정하였다. 나타난 엑소좀 생산 실시에서, A280 크로마토그램과 인지질 둘 모두를 엑소좀 검출을 위하여 이용하였다.
도 1c에 나타난 대로, 인지질 시그널링은 엑소좀 검출을 위한 A280 크로마토그램으로 잘 덮인다.
실시예 2 - 마우스 모델에서 폐동맥 고혈압(PAH)의 치료
(우심실 수축기압의 증가로 나타난 대로) PAH를 유도하기 위하여 마우스를 3주 만성 저산소증에 노출시켰다. 엑소좀 처리는 저산소증 노출 전에 1회 꼬리 정맥 주사로 이루어졌다.
실시예 3 - 강한 엑소좀 집단의 확인
강한 엑소좀 집단을 확인하기 위하여, 각 엑소좀 제제를 PKM2 항체(매사추세츠주 댄버스 소재의 셀 시그널링(Cell Signaling))를 이용하여 피루베이트 키나제 단백질 발현에 대해 분석하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 웨스(WES)™ 기계(캘리포니아주 산호세 소재의 프로테인심플(ProteinSimple))를 이용하여 모세관 전기영동 면역분석을 수행하였다. 요약하면, 4.2uL의 샘플을 마스터 형광 혼합물(프로테인심플)과 1:5로 혼합하였다. 그 후 샘플을 5분 동안 95℃에서 가열하고 얼음에 두었다. 일차 PKM2 항체를 항체 희석제(프로테인심플)에서 1:15로 희석하였으며 독점 항-토끼 이차 항체(프로테인심플)를 이용하였다. 독점 퍼옥사이드 및 루미놀-S(프로페인심플)를 1:1로 혼합하여 화학발광 기질을 제조하였다. 샘플, 차단 시약, 일차 항체, 이차 항체, 화학발광 기질 및 세척 버퍼를 제공된 마이크로플레이트내의 지정된 웰내에 로딩하였다. 플레이트를 5분 동안 1,000g에서 회전시켜 웰내의 기포를 회피하였다. 플레이트와 모세관 카트리지를 웨스 기계내로 로딩하였다. 플레이트 로딩 후, 완전히 자동화된 전기영동 및 면역검출이 모세관 시스템에서 일어났다. 웨스 표준 실시 설정을 이용하여 단백질을 분리하였다. 데이터는 내장 컴파스(Compass) 소프트웨어(프로테인심플)로 분석되어, 샘플 당 피크 분자량 시그널 및 곡선하 면적 값을 제공하였다.
피루베이트 키나제 활성: 피루베이트 키나제는 포스포에놀피루베이트(PEP)로부터 ADP로의 포스페이트의 전달을 촉매하여 한 분자의 피루베이트와 한 분자의 ATP를 생성하는, 당분해의 효소이다. 피루베이트 키나제는 앱캠(abcam) 키트 (ab83432)에 의해 측정되며 여기서는 PEP와 ADP가 PK에 의해 촉매되어 피루베이트와 ATP를 생성한다. 생성된 피루베이트는 피루베이트 옥시다제에 의해 산화되어 (λ = 570 nm에서) 색상을 생성한다. 색상 강도는 피루베이트 양에 비례하므로, PK 활성이 측정될 수 있다. PK 활성은 동적 분석을 생성한다. 데이터 분석은 하기 식을 이용하여 이루어질 수 있다:
PK 활성 = (피루베이트 x 희석 인자)/(T2-T1) x 웰 부피
이때 T2-T1은 시점 2 - 시점 1에서의 시간(분)이다. 피루베이트(nmol)는 피루베이트 표준 곡선을 이용하여 계산된다(이때 피루베이트는 T2에서의 최종 피루베이트 농도 - T1에서의 초기 피루베이트 농도로서 계산됨). 이 수는 블랭크 보정이 필요하다. 활성 측정이 선형 범위 내에 발생하는 것이 중요하다. 데이터세트는 다수 시점에서 분석될 수 있다. 선택된 최상의 방식은 곡선을 보고 선형 범위 내에 속하는 적어도 2 분 간격의 데이터 지점을 선택하는 것이다. 플레이트 내의 모든 샘플이 동일한 방식으로 분석된다. 이 실험에서는, T1= 2 분, T2 = 4 분이 선택되었으며, 이들 두 시점이 선형 범위 내에 있었기 때문이다.
다음으로, 피루베이트 키나제 활성을 저산소증 대조군에 비하여 각 엑소좀 제제 처리 조건의 인 비보 RVSP 배수 변화에 대해 그렸다. 이것은 피루베이트 키나제 활성을 엑소좀 처리에서의 RVSP의 배수 개선에 비교할 수 있도록 한다. 도 2a를 참조한다. 피루베이트 키나제 활성을 또한 델타 RVSP에 대해 도시하였다. 델타 RVSP는 엑소좀 조건으로 처리된 저산소증 - 산소 정상 상태 대조군이다. 도 2b를 참조한다. 적색 점은 RVSP에서 유의한 개선을 유도한 강한 엑소좀 집단을 나타낸다. 청색 점은 저산소증 유도된 PAH 마우스의 치료에서 강하지 않은 엑소좀 집단을 나타낸다. 이들 가장 강한 엑소좀 집단의 피루베이트 키나제 활성을 그 후 상자 그림으로 그래프를 그렸다. 도 2c를 참조한다. 따라서, (c)의 그래프는 본 발명자들의 가장 강한 엑소좀 제제의 피루베이트 키나제 활성 범위를 나타낸다.
실시예 4 - 강한 엑소좀 집단의 단백질체 분석 및 RNAseq 분석
단백질체학 분석을 위하여 샘플 엑소좀을 바이오프록시미티(Bioproximity)(버지니아주 찬틸리)에 보냈다. 강하지 않은 집단에 비하여 강한 엑소좀 집단에서 증가된 발현 수준을 가진 단백질이 도 3(a)에 나타난다.
샘플 엑소좀을 RNAseq 분석을 위하여 SBI에 보냈다. 강하지 않은 집단에 비하여 강한 엑소좀 집단에서 증가된 발현 수준을 가진 유전자가 도 4에 나타난다.
실시예 5 - 세포외 O 2 소비 측정
앱캠 세포외 O2 소비 분석 키트(ab197243)를 이용하여 산소 정상 상태 또는 4% 02 저산소증에 24시간 노출 후 PBS(대조군) 또는 엑소좀으로 처리된 평활근 세포(SMC) 용해물의 산소 소비를 측정하였다. 세포 용해물이 전자 수송 사슬을 통해 산소를 소비할 때, 산소가 주변 배양 배지에서 고갈되었으며 이것은 인광 시그널의 증가로서 나타난다. 미세환경은 각 웰에의 광유의 첨가에 의해 외기 확산으로부터 보호되며 인광 시그널은 제조사에 의해 공급된 O2 프로브의 켄칭으로서 측정된다. 이들 데이터를 두 가지 방식으로 계산하였다: 곡선 하 면적 및 시간에 따른 기울기(기울기를 이용하는 데이터 분석이 제조사에 의해 권장됨). 도 5a-5b는 엑소좀이 산소 정상 상태-노출된 SMC에서 세포 O2 소비를 유의하게 변화시키지 않음을 입증한다. 하지만, 엑소좀 처리는 저산소증 스트레스하에서 O2 소비의 증가를 유도하며, 이것은 미토콘드리아 기능의 증가를 나타낸다.
실시예 6 - 급성 저산소증에 노출된 SMC의 마이크로어레이 분석
평활근 세포(SMC)를 PBS 대조군 또는 엑소좀(EXSM)으로 처리하고 산소 정상 상태 또는 저산소증(4% 02) 상태에서 24 시간 동안 항온처리하였다. SMC의 RNA를 분리하고 전체적 마이크로어레이 플랫폼을 이용한 분석을 위하여 퀴아젠(Qiagen)으로 보냈다. 도 6a-6c는 급성 저산소증 노출 후 글루코스 대사에서의 유전자 발현의 증가가 있음을 보여준다. EXSM 처리는 (a) 당분해, (b) TCA 사이클 및 (c) 전자 수송 사슬에서 이 반응을 정상화시켰다. 이들 데이터는 가능하게는 EXSM 단백질 또는 유전자의 경로내로의 통합으로 인하여, 엑소좀 처리가 저산소증 스트레스동안 글루코스 산화 유전자의 유전적 상향-조절의 필요성을 감소시키거나 제거하였음을 제안한다.
실시예 7 - 급성 저산소증에 노출된 SMC의 대사체학 분석
평활근 세포(SMC)를 PBS 대조군 또는 엑소좀(EXSM)으로 처리하고 산소 정상 상태 또는 저산소증(4% 02) 상태에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 세포용해물을 침전시키고 전체적 대사물 분석을 위해 메타볼론(Metabolon)(노스 캐롤라이나주)으로 보냈다. 도 7에 나타난 대로, SMC 용해물은 이들 경로를 통한 감소된 유동으로 인해, 급성 저산소증 노출 후 당분해, TCA 사이클 및 에너지 대사 경로에서 대사물의 축적을 나타냈다. 엑소좀 처리는 (a) 당분해 및 (b) TCA 사이클을 통한 유동을 증가시켰다(감소된 대사물 축적에 의해 나타남). 이들 데이터는 글루코스 산화의 증가를 나타낸다. 도 7a-7d는 급성 저산소증 노출이 ATP 및 NAD의 구성 요소인 아데노신 및 니코틴아미드 리보사이드의 축적을 야기하였음을 보여준다. 엑소좀 처리는 가능하게는 증가된 ATP 생산(c)으로 인하여, 아데노신과 니코틴아미드 리보사이드 사용을 야기하였다. ATP 생산은 급성 저산소증에 노출된 살아있는 SMC에서 측정되었으며(d), ATP 생성에서 EXSM-매개된 증가를 확인하였다.
실시예 8 - 추가적인 방법
마우스 모델 : C57BL/6 마우스를 폐 고혈압을 유도하기 위하여 3주 동안 10% 산소에서 제어된 산소 수준을 가진 저산소 텐트에서 보관하였다. 엑소좀 처리를 위하여, 저산소증 노출 3시간 전에 단일-용량을 꼬리 정맥내로 주사하였다.
엑소좀 분리 및 분석: 무혈청 조정된 배지를 40 시간 기간에 걸쳐서 컨플루언트 MSC 배양물로부터 수집하였다. 조정된 배지는 접선 유동 여과를 이용하여 50X 농축시켰다. 농축물을 형광 친유성 염료 DiI과 항온처리한 후, 세파로즈 CL-2B 수지(지이 헬스케어(GE Heathcare))로 패킹된 XK 50/100 컬럼을 이용하여 분별하였다. 엑소좀-함유 분획은 DiI의 형광 검출에 의해 그리고 인지질 정량(시그마)에 의해 확인하였다. 선택된 분획에서의 RNA 시퀀싱은 시스템 바이오사이언시즈(System Biosciences)(캘리포니아주)에 의해 수행하였다. 선택된 분획에서의 단백질체학은 LC-MS/MS(버지니아주 찬틸리)를 이용하여 바이오프록시미티에 의해 수행하였다. 피루베이트 키나제 단백질 및 효소 활성은 프로테인심플 면역분석 및 비색 동적 분석(앱캠, ab83432)에 의해 각각 평가하였다.
인 비트로 모델 : 평활근 세포(SMC)를 산소 정상 상태 또는 저산소증(4% 산소)에서 24 시간 동안 PBS 또는 엑소좀으로 처리하였다. 실험 복제물을 일루미나(Illumina) 플랫폼(퀴아젠)을 이용한 마이크로어레이 분석을 위하여 또는 HD4 플랫폼(노스캐롤라이나주 RTP 소재의 메타볼론)을 이용한 대사체학 분석을 위하여 처리하였다. 산소 소비는 앱캠 세포외 O2 소비 분석 키트(앱캠, ab197243)를 이용하여 측정하였다.
폐포 세포를 24 시간동안 접종하고, 0.1% FBS 배지로 전환시키고 3 시간 동안 산소 정상 상태 인큐베이터에서 강한 엑소좀 집단으로 프라이밍시키고, 48 시간동안 고산소성 항온처리 챔버에서 플레이팅하였다(도 17).
SMC 만성 저산소증 모델 : SMC는 PAH 및 저산소증에서 증식성의 비-어팝토시스 표현형으로 전환하는 것으로 알려져 있으며, 폐에서 혈관과 동맥이 두꺼워지도록 하여, 높은 압력을 야기하고 결국에는 심장 손상/PAH에서 부정적 증상을 야기한다. SMC를 산소 정상 상태, 저산소증(4% 산소), 및 엑소좀을 가진 저산소증(4% 산소)에서 배양하였다. 배양 기간 동안, 강한 엑소좀으로 2주 동안 세포를 매주 2회 처리하였다. 생성되는 SMC를 마이크로어레이 유전자 발현(IPA) 및/또는 전체적 대사체학에 의해 분석하였다.
실시예 9 - 언엑시좀을 이용한 인 비트로 처리
언엑시좀이 면역조절 능력을 가짐이 인 비트로 실험을 통해 입증되었다. 도 18에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 고산소성 스트레스(고산소증은 IL-6 방출을 야기함)에 노출된 세포에서 감소된 IL-6 발현에 기초하여 면역조절 능력을 증가시켰다. 도 19에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 고산소성 스트레스(고산소증은 TNFα 방출을 야기함)에 노출된 세포에서 감소된 TNFα 발현에 기초하여 면역조절 능력을 증가시켰다.
언엑시좀이 항-어팝토시스 능력을 가짐이 또한 인 비트로 실험을 통해 입증되었다. 도 20에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 증가된 세포 수에 상응하는 증가된 흡광도에 의해 나타난 대로, 고산소증하에서 항-어팝토시스 효과를 나타냈다. 도 21에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 고산소성 스트레스에 노출된 세포로부터 사이토크롬 C 방출을 감소시켰다.
언엑시좀이 BPD에서 폐 혈관신생을 촉진하기 위해 사용될 수 있음이 인 비트로 실험을 통해 추가로 입증되었다. 도 22a에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 급성 고산소증 노출 상태에서 관 형성을 회복할 수 있다.
언엑시좀은 BPD-관련 PAH에서 미토콘드리아 대사를 개선하기 위해 이용될 수 있음이 인 비트로 실험을 통해 추가적으로 입증되었다. 도 24에 나타난 대로, 언엑시좀은 경로 내의 중간 대사물의 전체적 대사물 분석에 의해 만성 저산소증에서 아미노산 대사를 상향조절하였다. 도 25에 나타난 대로, 언엑시좀은 만성 저산소증에서 피루베이트 및 글루타메이트 대사를 상향조절하였다.
도 26에 나타난 대로, 언엑시좀은 만성 저산소증에서 GLUD1 유전자 발현을 상향조절하였다. 도 27에서 나타난 대로, 언엑시좀은 만성 저산소증에서 PDK4를 하향조절하였다. 도 28에 나타난 대로, 언엑시좀은 만성 저산소증에서 SIRT4를 하향조절하였다. SIRT4 유전자는 인 비트로 PAH 모델에서, 2가지 대사 효소, GLUD1 및 PDH를 억제한다. SIRT4 유전자는 인 비트로 PAH 모델에서, 언엑시좀 처리에 의해 하향조절되는 한편, GLUD1 및 PDH는 엑소좀 처리에 의해 상향조절되었다. SIRT4는 엑소좀 처리를 위한 타겟일 것으로 생각된다. 도 29에 나타난 대로, 언엑시좀은 저산소증에서 하향조절된 유전자(TCA 사이클에서 9개 효소 중 6개가 하향조절됨)를 상향조절함으로써 TCA 사이클 기능을 회복하였다.
실시예 10 - 언엑시좀을 이용한 인 비보 처리
고산소증-유도된 BPD 연구 : C57BL/6 마우스를 출생 후(PN) 제1일에서 제7일까지 75% 산소에 노출시키고, 출생 후 제7일부터 제14일까지 정상 산소 수준을 가진 실내 공기로 전환하였다. 출생 후 4일에, 단일 용량의 강한 엑소좀을 표재 관자 정맥(superficial temporal vain) 내로 주사하였다. 출생 후 7일 및 출생 후 14일에, RNA 및 조직학 분석을 수행하였다(도 38).
BPD 유도된 PAH 연구: C57BL/6 마우스를 출생 후(PN) 제1일에서 제7일까지 75% 산소에 노출시키고, 출생 후 제7일부터 제42일까지 정상 산소 수준을 가진 실내 공기로 전환하였다. 출생 후 4일에, 단일 용량의 강한 엑소좀을 표재 관자 정맥 내로 주사하였다. 출생 후 7일 및 출생 후 14일에, RNA, 조직학 및 세포측정 분석을 수행하였다. 출생 후 42일에, 조직학 및 세포측정 분석을 수행하고, 추가적인 생리학적 측정, 폐 기능 시험, 및 RV 압력 측정을 또한 수행하였다(도 38).
조합 처리: C57BL/6 마우스를 제1일부터 제29일까지 10% 산소에 노출시키고 제29일부터 제56일까지 정상 상태로 전환시켰다. 제1일에, 마우스에 세막사닙을 주사하고, 제29일부터 제56일까지, 마우스에 실데나필을 매일 2회 그리고 엑소좀을 3일 마다 한번씩 주사하였다. RVSP 수준을 측정하였다(도 45a-45b).
도 40에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 BPD-관련 폐포 단순화를 구조하였다. 도 40a는 강한 엑소좀을 이용한 처리가 산소 정상 상태(NRMX)에 비하여 고산소증(HYRX)-매개 폐포 단순화 증가를 구조함을 보여준다. 도 40b는 평균 선형 절편의 정량을 보여주며, 이것은 평균 공기 공간 직경의 대용을 나타낸다.
도 42a-42c에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 만성 폐포 단순화를 구조하였다. 도 42a는 산소 정상 상태, 저산소증 하의 세포, 및 와튼 제대교질 유래 엑소좀 및 골수 유래 엑소좀으로 처리된 세포의 이미지를 보여준다. 도 42b는 엑소좀이 BPD-관련 PAH 마우스 모델에서 폐포 단순화를 구조하였음을 보여준다. 도 42c는 BPD-관련 PAH 마우스 모델에서 중격 영역에서의 콜라겐 침착에 의해 나타난 대로 엑소좀이 심하지 않은 폐 섬유증을 감소시켰음을 보여준다.
도 43a-43d에 나타난 대로, 언엑시좀 처리는 α-평활근 액틴 염색(a 및 b) 및 PAH와 관련된 압력 변화(c)에 의해 입증된 대로 PAH 폐 혈관 리모델링을 구조하였다. PV-루프는 산소 정상 상태(NRMX) 대조군에 비교할 때 폐 질병의 폐기종-유사 특징 및 에어 트래핑을 나타내는, 고산소증(HYRX) 마우스에서 유의한 변화를 입증한다. 엑소좀은 이 변화에서 유의한 구조를 나타내어, 개선된 폐 기능을 나타낸다.
도 44a-44b에 나타난 대로, MSC 엑소좀은 저산소증-유도된 PAH 마우스 모델에서 PAH를 예방하였다. 도 45a-45b에 나타난 대로, 수젠/저산소증-유도된 PAH 마우스 모델에서 엑소좀과 실데나필의 조합 치료법은 PAH를 역전시켰다. 도 46에 나타난 대로, 엑소좀은 PAH의 수젠/저산소증 모델에서 아미노산 대사를 상향조절하였다.
실시예 11 - 언엑시좀의 특성규명
도 32에 나타난 대로, 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 강한 엑소좀 집단(COM2)의 분리는 비-이상적 크기의 엑소좀 뿐만 아니라 단백질 및 비-강력 미세소포 오염물을 분리하는 초원심분리 또는 구배 분리에 비하여, 유의하게 감소된 오염을 야기한다. 도 33에 나타난 대로, 분리된 강한 엑소좀은 초원심분리된 샘플에 비하여 더 균질한 크기와 더 명확한 이미지를 갖는다.
도 34에 나타난 대로, 분리된 강한 엑소좀은 MHCII 오염이 없다. 대조적으로, 젠바이오로부터의 시판되는 엑소좀은 MHCII 오염을 함유한다.
도 35a-35b에 나타난 대로, 폰소 염색에 기초할 때 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리된 강한 엑소좀은 피브로넥틴 및 다른 단백질 오염이 없는 한편, 젠바이오 시판 초원심분리된 제제는 피브로넥틴 오염을 가진다.
도 36에 나타난 대로, 강한 집단 및 오염물 미세소포의 RNAseq 클러스터링 분석에서, 강한 엑소좀(COM2)은 오염성 미세소포로부터 차등적으로 클러스터링되며, SORCS1, FHIT 및 ANKRD30BL에서 농축된다. 도 37에 나타난 대로, 강한 엑소좀(COM2)은 GAPDH 발현의 더 높은 발현 수준에 해당하는, COM1보다 더 낮은 CT 값을 가진다.

Claims (52)

  1. 중간엽 기질 세포로부터 수득된 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을 폐 고혈압 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 그 발현 산물의 평균 양에 비하여 증가된 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는, 폐 고혈압을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외 소포 또는 엑소좀은 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 동일한 발현 산물의 평균 양에 비하여 발현 산물의 적어도 20% 초과의 발현을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어진 군으로부터 선택되며, (b) TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 유전자는 PK인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 유전자는 ATPase인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 폐 조직 내 글루코스 산화를 정상화시키는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 적어도 0.15 nmol/min/mL의 PK 활성을 가지는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 3-주 만성 저산소증 노출을 겪고 PBS로 처리된 대조군 마우스에 비하여, 3-주 만성 저산소증 노출을 겪은 마우스의 우심실 수축기압(RVSP)을 적어도 10%만큼 감소시킬 수 있는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 24-시간 저산소증 노출을 겪고 PBS 대조군으로 처리된 대조군 SMC 세포 용해물에 비하여, 24-시간 저산소증 노출을 겪은 SMC 세포 용해물에 의한 O2 소비를 적어도 20%만큼 증가시킬 수 있는 방법.
  10. 중간엽 기질 세포로부터 수득된 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 그 발현 산물의 평균 양에 비하여 증가된 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태를 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, (a) 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어진 군으로부터 선택되며, (b) TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 유전자는 PK인 방법.
  13. 제13항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 적어도 0.15 nmol/min/mL의 PK 활성을 가지는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 유전자는 ATPase인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 폐 조직에서 글루코스 산화를 정상화시키는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태는 대상에서 감소된 미토콘드리아 글루코스 산화와 관련되는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질병 또는 병태는 프리드라이히실조증(Friedreich's ataxia), 레베르 시신경병증(Leber's Hereditary Optic Neuropathy), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre Syndrome), 젖산 산증 및 뇌졸중-유사 에피소드를 가진 미토콘드리아성 뇌병증(Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-Like Episodes), 라이 증후군(Leigh syndrome), 비만, 죽상동맥경화증, 근위축성 측색 경화증, 파킨슨병, 암, 심부전, 심근경색(MI), 알츠하이머병, 헌팅턴병, 조현병, 조울증, 취약 X 증후군(fragile X syndrome), 및 만성 피로 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  18. a. 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 중간엽 기질 세포의 배양 배지를 제공하는 단계;
    b. 배양 배지의 다른 성분으로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 적어도 일부를 분리하는 단계;
    c. 다른 세포외 소포 또는 엑소좀 집단으로부터, (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 그 발현 산물의 평균 양에 비하여 증가된 세포외 소포 또는 엑소좀 집단을 분리하는 단계
    를 포함하는, 폐 고혈압을 치료하거나 예방할 수 있는 세포외 소포 또는 엑소좀을 분리하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은 인지질 검출에 의해 분리되는 방법.
  20. 제18항에 있어서, (a) 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어진 군으로부터 선택되며, (b) TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 유전자는 PK인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 유전자는 ATPase인 방법.
  23. a. 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 중간엽 기질 세포의 배양 배지를 제공하는 단계;
    b. 배양 배지의 다른 성분으로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 적어도 일부를 분리하는 단계;
    c. 분자 크기에 기초하여 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단을 분리하는 단계;
    d. 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단으로 저산소증-노출 마우스를 처리하는 단계;
    e. 산소정상상태 마우스, 저산소증-노출 마우스 및 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증 노출 마우스의 우심실 수축기압(RVSP)을 측정하는 단계; 및
    f. RVSP에 기초하여 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단을 확인하는 단계
    를 포함하는, 폐 고혈압을 치료하거나 예방할 수 있는 세포외 소포 또는 엑소좀을 분리하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은, 만일 상기 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증-노출 마우스의 RVSP 대 저산소증-노출 마우스의 RVSP의 비가 0.85 이하이면, 강한 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 세포외 소포 또는 엑소좀 집단은, 델타 RVSP가 5 미만이면 강한 것이며, 이때 델타 RVSP는 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증-노출 마우스의 RVSP - 산소 정상 상태 마우스의 RVSP인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 단계 c에서, 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단은 인지질 검출에 의해 분리되는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단은, (a) 당분해 경로의 유전자, (b) TCA 사이클의 유전자, 및 (c) 전자 수송 사슬의 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 산물의 발현이 중간엽 기질 세포로부터 수득된 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 발현 산물의 평균 양에 비하여 증가되는 방법.
  28. 제23항에 있어서, (a) 당분해 경로의 유전자는 PK, AGI, ALDO, ALDOA, EN03, GPI, HK2, HK3, PFK, PGM, TPI, GAPDH, ENO, 및 PGAM으로 이루어진 군으로부터 선택되며, (b) TCA 사이클의 유전자는 MDH2, OGDH, PC, PDHA1, PDHB, SDHA, SDHC, 및 SUCLG2로 이루어진 군으로부터 선택되며, (c) 전자 수송 사슬의 유전자는 ETFA, ATPase, NDUFC2, NDUFB1, NDUFS5, NDUFA8, NDUFA9, NDUFS2, SDHA, SDHC, UQCRH1, Cox 6c1, 및 Cox10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제23항에 있어서, 유전자는 PK인 방법.
  30. 제23항에 있어서, 유전자는 ATPase인 방법.
  31. a. 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 중간엽 기질 세포의 배양 배지를 제공하는 단계;
    b. 배양 배지의 다른 성분으로부터 세포외 소포 또는 엑소좀의 적어도 일부를 분리하는 단계;
    c. 분자 크기에 기초하여 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단을 분리하는 단계;
    d. 세포외 소포 또는 엑소좀의 상이한 집단으로 저산소증-노출 마우스를 처리하는 단계;
    e. 산소정상상태 마우스, 저산소증-노출 마우스 및 세포외 소포 또는 엑소좀으로 처리된 저산소증 노출 마우스의 우심실 수축기압(RVSP)을 측정하는 단계;
    f. RVSP에 기초하여 강한 세포외 소포 또는 엑소좀의 집단을 확인하는 단계
    를 포함하는, 기관지폐 형성이상을 치료하거나 예방할 수 있는 세포외 소포 또는 엑소좀을 분리하는 방법.
  32. 제23항 또는 제31항에 있어서, 단계 b의 분리는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 것인 방법.
  33. 제23항 또는 제31항에 따라 수득된 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 약 100 nm의 평균 직경을 갖는 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 FLOT 및/또는 ANXA2를 발현하는 조성물.
  36. 제33항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은, 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서의 mir204의 평균 양에 비하여, mir204의 증가된 발현을 갖는 조성물.
  37. 제33항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은, 모든 중간엽 기질 세포에서의 CD105, GAPDH, DLST, 및/또는 ATP5A1의 평균 양에 비하여, CD105, GAPDH, DLST, 및/또는 ATP5A1의 증가된 발현을 함유하는 MSC로부터 분비되는 조성물.
  38. 제33항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은, 중간엽 기질 세포의 모든 세포외 소포 또는 엑소좀에서 SORCS1, FHIT 및/또는 ANKRD30BL의 평균 양에 비하여, SORCS1, FHIT 및/또는 ANKRD30BL의 증가된 RNA 발현을 갖는 조성물.
  39. 제33항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀에 MHCII 오염물이 실질적으로 없는 조성물.
  40. 제33항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀에 피브로넥틴이 실질적으로 없는 조성물.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀을, 기관지폐 형성이상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 기관지폐 형성이상을 치료하거나 예방하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 면역조절 능력을 증가시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 IL-6 및/또는 TNFα 발현을 감소시키는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상의 혈관신생을 촉진하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 고산소증-유도된 어팝토시스(apoptosis)를 감소시키는 방법.
  46. 제44항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 사이토크롬 C 수준을 감소시키는 방법.
  47. 제41항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 미토콘드리아 대사를 증가시키는 방법.
  48. 제41항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 관 형성을 회복시키는 방법.
  49. 제41항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 GLUD1 및/또는 PDH 유전자 발현을 상향조절하는 방법.
  50. 제41항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 PDK4 유전자 발현을 하향조절하는 방법.
  51. 제41항에 있어서, 분리된 세포외 소포 또는 엑소좀은 대상에서 SIRT4 유전자 발현을 하향조절하는 방법.
  52. 제1항 내지 제17항 및 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 대상에게 실데나필을 투여하는 것을 포함하는 방법.
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