CN103648509B - 与间充质干细胞外来体相关的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含间充质干细胞(MSC)来源之外来体的组合物，以及在具有某些肺疾病(包括炎性肺疾病)的对象中使用所述组合物的方法。

Description

与间充质干细胞外来体相关的方法和组合物
相关申请
本申请要求2011年3月11日提交的题为“METHODS AND COMPOSITIONS RELATINGTO MESENCHYMAL STEM CELL EXOSOMES”的美国临时专利申请(序列号61/451,981)的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
联邦政府资助的研究
本发明在由国家心肺和血液研究所授予的资助号R01HL055454和R01HL085446的政府支持下完成。政府享有本发明的一些权益。
发明背景
与足月儿或近足月儿相比，早产儿患有或有风险发生某些慢性肺(或呼吸系统)疾病(或病症)的比率较高。由于婴儿的肺和呼吸能力受到损害，这些疾病常常是致命的。早产儿存活率的增加导致这种肺疾病的发病率增加。炎症是多种肺疾病的关键病理生理特征，所述肺疾病包括肺部高血压(pulmonary hypertension，PH或PAH)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)和婴儿的慢性肺疾病(也被称为支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)。早产儿存活率的增加导致BPD及其相关并发症(包括继发性PH、哮喘)发病率的增加，以及在生命的第一年中再住院率的增加。BPD是早产的常见并发症(Kinsella等，Lancet，2006，367：1421-1431；Stenmark and Abman，Annu RevPhysiol，2005，67：623-661)，并且在一些研究中，其可影响多达35-40％的在＜29孕周出生的早产儿。造成其的原因包括机械性损伤，氧中毒，感染，以及所导致的肺部炎症和发育肺的损伤。控制BPD的尝试涉及温和通气(gentle ventilation)策略和使用抗炎剂如皮质类固醇。然而，这些治疗获得的成功有限并且具有不可接受的副作用(Baveja和Christou，Semin Perinatol，2006，30：209-218)。这些慢性肺疾病的长期影响也是需要关注的问题，包括持续的肺损伤和神经发育延迟。PH是BPD的严重并发症，并与高死亡率相关。它也与其他形式的肺疾病如COPD相关。最近，PH被认为是血吸虫病通过涉及炎症的机制的主要并发症之一。血吸虫病在世界的一些地区具有很高的患病率，并与继发性PH高度相关，潜在地显著增加了这种血管疾病在世界范围内的发病率。
发明概述
本发明提供了包含间充质干细胞(MSC)来源之外来体的组合物，以及使用其治疗和/或预防肺疾病的方法。
在一个方面，本发明提供了组合物，其包含配制为用于气管内施用或通过吸入施用的分离的间充质干细胞(MSC)外来体。在一个方面，本发明提供了组合物，其包含配制为用于静脉内施用的分离的间充质干细胞(MSC)外来体。
在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含分离的间充质干细胞(MSC)外来体和肺表面活性剂。
在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含分离的间充质干细胞(MSC)外来体和肺皮质类固醇。肺皮质类固醇可以是甲基泼尼松龙(methylprednisolone)，尽管其不限于此。
在另一些方面中，本发明提供了气溶胶化的分离的间充质干细胞(MSC)外来体以及包含气溶胶化的分离的MSC外来体的组合物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防肺疾病的分离的间充质干细胞(MSC)外来体的组合物。在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防肺疾病的药物组合物，其包含分离的间充质干细胞(MSC)外来体。
在另一个方面，本发明提供了用作治疗或预防肺疾病之药物的分离的间充质干细胞(MSC)外来体的组合物。
在另一个方面中，本发明提供了方法，其包括向患有或有风险发生肺疾病的对象施用有效量的分离的间充质干细胞(MSC)外来体。
在又一个方面中，本发明提供了分离的间充质干细胞(MSC)外来体在对象中治疗或预防的肺疾病的用途，或者分离的间充质干细胞(MSC)外来体在制备用于治疗或预防肺疾病的药物中的用途。
在又一个方面中，本发明提供了在用于治疗或预防肺疾病的方法中使用的分离的间充质干细胞(MSC)外来体，所述方法包括向患有或有风险发生肺疾病的对象施用有效量的分离的MSC外来体。
在另一个方面中，本发明提供了方法，其包括向患有或有风险发生肺疾病的对象施用有效量的分离的间充质干细胞(MSC)外来体。
如下所述，多种实施方案同样地适用于本发明的多个方面。在一些实施方案中，肺疾病是炎性肺疾病。在一些实施方案中，炎性肺疾病为肺部高血压、哮喘、支气管肺发育不良(BPD)、变态反应或特发性肺纤维化。在一些实施方案中，肺疾病是肺血管疾病。在一些实施方案中，肺疾病是急性肺损伤。在一些实施方案中，急性肺损伤急性肺损伤与脓毒症相关或者是通气机引起的(ventilator-induced)急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
在一些实施方案中，所述对象患有或很可能发生血吸虫病。
在一些实施方案中，所述对象是新生儿。在一些实施方案中，所述对象是婴儿。在一些实施方案中，所述对象的年龄是3至18岁。在一些实施方案中，所述对象是成体。在任意这些实施方案中，所述对象可以是早产的。在一些实施方案中，所述对象在35孕周前出生。在一些实施方案中，所述对象在26孕周前出生。
在一些实施方案中，分离的MSC外来体与第二药剂一起使用。在一些实施方案中，所述第二药剂是类固醇、抗氧化剂或吸入的一氧化氮。在一些实施方案中，所述类固醇是皮质类固醇。在一些实施方案中，所述皮质类固醇是甲基泼尼松龙。在一些实施方案中，所述抗氧化剂是超氧化物歧化酶。
在一些实施方案中，分离的MSC外来体在出生一小时内施用。在一些实施方案中，分离的MSC外来体在出生1个月内施用。
在一些实施方案中，将分离的MSC外来体静脉内施用。在一些实施方案中，将分离的MSC外来体施用至对象的肺或气管。在一些实施方案中，将分离的MSC外来体通过吸入施用。在一些实施方案中，将分离的MSC外来体以气溶胶(aerosol)施用。在一些实施方案中，将分离的MSC外来体使用喷雾器施用。在一些实施方案中，将分离的MSC外来体使用气管内的管施用。
在一些实施方案中，分离的MSC外来体与肺表面活性剂一起施用或者配制。在一些实施方案中，所述肺表面活性剂是分离的天然表面活性剂。在一些实施方案中，肺表面活性剂是牛肺或猪肺来源的。在一些实施方案中，肺表面活性剂是合成的表面活性剂。
在一些实施方案中，将分离的MSC外来体重复地施用至对象。在一些实施方案中，将分离的MSC外来体施用至对象两次。在一些实施方案中，将分离的MSC外来体连续地施用至对象。
在一些实施方案中，分离的MSC外来体来源于脐带血MSC。在一些实施方案中，分离的MSC外来体来源于骨髓MSC。
在一些实施方案中，分离的MSC外来体对所述对象是自体的。在一些实施方案中，分离的MSC外来体是对所述对象是同种异体(allogeneic)的。
在一些实施方案中，对象没有接受细胞或器官移植。
因此，在另一个方面，本发明提供了配制为递送至肺的药物组合物，其包含有效量的分离的人间充质干细胞(MSC)外来体和肺表面活性剂，其用于患有或有风险发生肺疾病的人对象，其中所述对象的年龄小于4周。类似地，本发明提供了使用所述MSC外来体的方法，其包括向患有或有风险发生肺疾病的人对象施用配制为递送至肺的有效量的分离的人间充质干细胞(MSC)外来体和肺表面活性剂，其中所述对象的年龄小于4周。本发明类似地提供了配制为递送至肺的有效量的分离的人间充质干细胞(MSC)外来体和肺表面活性剂在患有或有风险发生肺疾病的人对象中的用途，其中所述对象的年龄小于4周。在一些实施方案中，分离的人MSC外来体是从人脐带分离的(例如，华顿氏胶质(Wharton′s Jelly))。在一些实施方案中，人对象是在37孕周前出生的。在一些实施方案中，人对象已经被施用氧或已经在通气机(ventilator)上。在一些实施方案中，人对象患有或有风险发生支气管肺发育不良。在一些实施方案中，支气管肺发育不良是非炎性的。在一些实施方案中，分离的人MSC外来体在出生1天内施用。在一些实施方案中，分离的人MSC外来体在出生1小时内施用。
在另一个方面，本发明提供了特性与分离的MSC外来体相似或相同的合成MSC外来体，包含这样的合成MSC外来体的组合物及其使用方法。本发明设想合成MSC外来体可与分离的MSC外来体以相同的方式配制和使用。合成外来体可包含1、2、3、4、5、6、7种或全部8种以下蛋白质：触珠蛋白(haptoglobin)(Acc.No.q61646)、半乳凝素-3-结合蛋白(galectin-3-binding protein)(Acc.No.q07797)、血小板反应蛋白-2(thrombospondin-2)(Acc.No.q03350)、乳黏着蛋白(lactadherin)(Acc.No.q21956)、脂肪细胞增强子结合蛋白1(adipocyte enhancer-binding protein1)(Acc.No.q640n1)、波形蛋白(vimentin)(Acc.No.p20152)、蛋白酶体亚基α型2(Acc.No.p49722)和淀粉样βA4蛋白(Acc.No.p12023)。这些外来体可以如本文对分离的MSC外来体所述的进行配制，包括配制用于鼻内或气管内施用或吸入。可将它们与肺表面活性剂或其它治疗剂一起配制或施用。
本发明的这些和其它方面以及实施方案将在本文中更详细地进行描述。
附图简述
图1.来自BM-MSC的分泌因子是抗炎的。BM-MSC-CM对低氧诱导的肺巨噬细胞浸润的影响(A)。将用载剂或BM-MSC-CM或MLF-CM注射的小鼠(n＞8)暴露于低氧(8.5％O2)48小时，并且收集来自低氧小鼠以及年龄匹配的常氧(normoxic，Nmx)对照组小鼠的BALF。BALF中肺泡巨噬细胞的数目通过Kimura染色计数。来自低氧和常氧对照组小鼠的无细胞BALF中蛋白质的比较免疫印迹分析(B)。合并来自相同组(n＞8)单独小鼠的等效体积无细胞BALF，并且通过使用对MCP-1(顶部)和HIMF/FIZZ1(底部)特异的抗体通过western印迹来分析来自合并的BALF的等效体积的蛋白质。MCP-1和HIMF的相对强度表示为对来自相同印迹的IgA信号的归一化。
图2.从无细胞BM-MSC条件培养基分离外来体。通过超滤和尺寸排阻色谱分离BM-MSC-CM或MLF-CM中的外来体。BM-MSC-CM中1.6％(重量/重量)的蛋白质与外来体相关，来自尺寸排阻色谱的级分中的外来体通过电子显微镜可视化(A-D)。为了验证来自BM-MSC-CM的外来体分离，通过30,000倍放大的负染色电子显微镜分析空隙体积的级分(ve＝V0)(A)和柱子的空隙体积和总体积之间的级分(v0，＜ve＜vt)(B)。从BM-MSC-CM(C)或MLF-CM(D)分离的外来体的形态和大小分布相同。针对外来体相关蛋白质的Western印迹分析(E-F)。使用针对CD63、14-3-3s、膜突蛋白、巨噬细胞集落刺激因子(mCSF)、骨桥蛋白(OPN)和Dicer的抗体在western印迹中测定各样品中的3μg蛋白质。使用35μg BM-MSC全细胞溶胞产物的蛋白质作为阳性对照。
图3.MEX抑制低氧引起的急性肺部炎症。将注射载剂或MEX或BM-MSC-CM的无外来体级分或FEX的小鼠(n＞7)暴露于低氧(8.5％O2)48小时，并且收集低氧小鼠和年龄匹配的常氧老鼠的BALF。来自每个小BALF中的肺泡巨噬细胞的数量通过Kimura染色计算(A)。来自低氧和常氧对照小鼠的无细胞BALF中蛋白质的比较免疫印迹分析(B)。合并来自相同组(n＞7)中单独小鼠的等效体积的无细胞BALF，并且使用对MCP-1(顶部)和HIMF/FIZZ1(底部)特异的抗体通过western印迹分析来自等效体积的合并的BALF的蛋白质。MCP-1和HIMF的相对水平表示为对来自相同印迹的IgA信号的归一化。
图4.MEX的单次和多次施用对源自低氧的肺部炎症的时程作用。将在第0天注射载剂(A)或MEX(B)的小鼠暴露于低氧(8.5％O2)指定的时间。对于多次注射实验中，将在第0天接受MEX的小鼠暴露于低氧4天。在第4天第二次注射相同剂量的MEX，随后再暴露于低氧指定的天数(C)。在低氧条件的选定时期收集BALF，并对来自单个小鼠之BALF中肺泡巨噬细胞的数量进行计数。合并相同组(n＞7)中单独小鼠的等效体积的无细胞BALF，并且使用对MCP-1和HIMF特异的抗体通过western印迹分析来自合并BALF的10％(体积体积)的蛋白质(D)。
图5.MEX抑制低氧引起的PAH。将注射一次或两次载剂(在第0天和第4天)或MEX(在第0天和/或第4天)、或FEX(在第0天和第4天)的小鼠(n＞7)暴露于低氧(8.5％O2)3周(A)。在实验期结束时测量低氧和常氧对照小鼠的RSVP(B)和富尔顿指数(Fulton’s Index)(C)。对来自各组的随机选定小鼠(n＝4)的石蜡包埋肺切片进行α-SMA免疫染色，以突出肺部动脉血管壁(D)。图像的原始放大倍数：400X。从每个组选择具有20至30μm直径的小肺动脉以测量管壁厚度，管壁厚度用血管总面积的百分比表示。数据表示为平均值±SEM(n＝40至50动脉/组)。
图6、MSC来源外来体的纯化。外来体经Sephacryl S-400凝胶过滤柱色谱进行纯化。将带负电的荧光50nm纳米颗粒施加到S-400柱上并且使用与纯化外来体相同的条件洗脱(A)。从外来体纯化，将等效体积的每种级分在10％变性聚丙烯酰胺凝胶(B)和1.2％琼脂糖凝胶电泳(C)二者上分离。用抗-CD81抗体染色琼脂糖凝胶的印迹(D)。
图7.MSC来源外来体和无外来体级分的比较生物化学分析。在12％变性聚丙烯酰胺凝胶(A)上分离外来体级分(M)和无外来体级分(MF)二者合并物中的等效蛋白量。用胶体蓝染色用外来体级分和无外来体级分二者的合并物中等效蛋白质量以及不存在(左、B)或存在(右、B)0.5％SDS的情况下50nm的纳米颗粒上样的1.2％琼脂糖凝胶。使用溴化乙锭(对核酸)(左、C)或胶体蓝(对蛋白质)(右、C)染色用外来体级分和无外来体级分二者的合并物中等效蛋白质量上样的1.2％琼脂糖凝胶电泳。使用抗-CD81和抗-SPP-1抗体(D)免疫染色在1.2％琼脂糖凝胶和12％变性聚丙烯酰胺凝胶二者上分离的上样有外来体级分和无外来体级分二者的合并物中等效蛋白质量的凝胶的印迹。M，外来体级分合并物；MF，无外来体级分合并物；N，带负电荧光50nm纳米球。
图8.肺中低氧诱导的HIMF/FIZZ-1/Retnlα分泌。将小鼠暴露于单压(monobaric)低氧(8.5％O2)指定的时间段。合并来自同一组中各单独小鼠的经体积(A)和数量(B)归一化的BAL中的蛋白质，并且在14％聚丙烯酰胺凝胶上分离。使用特异性抗体通过western印迹分析评价HIMF、溶菌酶和IgA的水平。
图9.MSC来源外来体在肺中抑制低氧诱导的HIMF/FIZZ-1/Retnlα分泌。将通过尾静脉注射10μg的MEX(M)或载剂(V)的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)指定的时间段。合并来自同一组中各单独小鼠的经体积(A)和数量(B)归一化的BAL中的蛋白质，并且在14％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。使用特异性抗体通过western印迹分析评价HIMF、溶菌酶和IgA的水平。
图10.MSC来源外来体在肺中抑制低氧诱导的HIMF/FIZZ-1/Retnlα分泌。将通过尾静脉注射10μg的MEX(M)或载剂(V)的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)指定的时间段。在14％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离来自每个单独小鼠的10μg BAL蛋白(A、B)。合并来自同一组中各单独小鼠的经数量归一化的BAL中的蛋白质，并且在14％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离(C)。使用特异性抗体通过western印迹分析评价HIMF、溶菌酶和IgA的水平。
图11.MSC来源外来体在肺组织中抑制低氧诱导的HIF2α上调。将通过尾静脉注射10μg MEX或载剂的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)指定的时间段。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自个体肺组织匀浆的等效量的蛋白质。使用特异性抗体通过western印迹分析检测HIF2α和肌动蛋白的水平(A、B)。HIF2α/肌动蛋白的相对强度通过光密度分析(C)进行了评价。**，P＜0.01相对常氧(n＝4±SD，单因素ANOVA)；##，P＜0.01相对载剂(低氧，2天)(n＝4±SD，单因素ANOVA)。
图12.MSC来源外来体在肺组织中抑制低氧诱导的NFkB p65活化。将通过尾静脉注射10μg MEX或载剂的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)指定的时间段。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自个体肺组织匀浆的等效量蛋白质。使用特异性抗体通过western印迹分析检测p65、磷酸化p65(S536)和肌动蛋白的水平(A、B)。P-p65/肌动蛋白的相对强度通过光密度分析(C)进行了评价。**，P＜0.05相对常氧(n＝4±SD，单因素ANOVA)；##，P＜0.01相对载剂(低氧，2天)(n＝4±SD，单因素ANOVA)。
图13.MSC来源外来体在肺组织中抑制低氧诱导的STAT3活化。将通过尾静脉注射10μg MEX或载剂的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)2天。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自个体肺组织匀浆的等效量蛋白质。使用特异性抗体通过western印迹分析检测STAT3、磷酸化STAT3(Y705)和肌动蛋白的水平(A)。P-STAT3/STAT3的相对强度通过光密度分析进行了评价(B)。**，P＜0.01相对常氧(n＝4±SD，单因素ANOVA)；##，P＜0.01相对载剂(n＝4±SD，单因素ANOVA)。
图14.MSC来源外来体在肺组织中抑制低氧诱导的STAT3活化。将通过尾静脉注射10μg MEX或载剂的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)指定的时间段。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自个体肺组织匀浆的等效量蛋白质。使用特异性抗体通过western印迹分析检测磷酸化STAT3(Y705)和肌动蛋白的水平(A、B)。P-STAT3/肌动蛋白的相对强度通过光密度分析进行评价(C)。***，P＜0.001相对常氧或载剂(低氧、7天)或MEX(低氧，2和7天)(n＝4±SD，单因素ANOVA)；###，P＜0.001相对载剂(低氧、2天)(n＝4±SD，单因素ANOVA)；ns常氧相对MEX(低氧、2天)(n＝4±SD，单因素ANOVA)。
图15.MSC来源外来体在肺组织中抑制低氧诱导的HIMF上调。将通过尾静脉注射10μg MEX或载剂的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)7天。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自个体肺组织匀浆的等效量蛋白质。使用特异性抗体通过western印迹分析检测HIMF和肌动蛋白的水平(A)。HIMF/肌动蛋白的相对强度通过光密度分析进行了评价(B)。**，P＜0.01相对常氧(n＝4±SD，单因素ANOVA)；#，P＜0.05相对载剂(n＝4±SD，单因素ANOVA)；MEX与常氧之间统计学不显著(n＝4±SD，单因素ANOVA)。
图16.MSC来源外来体在肺组织中抑制低氧诱导的HIMF上调。将通过尾静脉注射10μg MEX或载剂的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)指定的时间段。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自个体肺组织匀浆的等效量蛋白质。使用特异性抗体通过western印迹分析检测HIMF和肌动蛋白的水平(A、B)。HIMF/肌动蛋白的相对强度通过光密度分析进行了评价(C、D)。***，P＜0.001相对常氧(n＝4±SD，单因素ANOVA)；**，P＜0.01相对常氧(n＝4±SD，单因素ANOVA)；#，P＜0.05相对载剂(n＝4±SD，单因素ANOVA)。
图17.MSC来源外来体保护长期低氧引起的右心肥大。将通过尾静脉注射10μg MEX(M)或载剂(V)的小鼠暴露于单压低氧(8.5％O2)3周(A)。处理单个鼠的心然后测量RV/(LV+S)比值(B)。***，P＜0.001相对常氧(n＝9，单因素ANOVA)；###，P＜0.001相对载剂(n＝11，单因素ANOVA)；MEX和常氧之间统计上不显著(单因素ANOVA)。
图18.MSC外来体经FPLC(快速蛋白液相色谱)纯化的高分辨率谱。上图：MSC外来体纯化的快速蛋白质液相色谱。基质：HiPrep Sephracyl S-400。流动相磷酸盐缓冲盐水，300mM。流速：0.5ml/分钟。将浓缩的条件培养基加到柱上并且由A280监测洗脱的蛋白质。分离的MSC外来体(MEX)在65.5ml洗脱。将直径50纳米的纳米颗粒的分子大小标准与MSC外来体共同洗脱。下图：洗脱的级分被应用到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并且随后对总蛋白染色。MEX级分作为高MW形式迁移，有别于条件培养基中的大量蛋白(bulk protein)。
图19.小鼠或人源的MEX抑制STAT3低氧活化。(A)用10μg MEX制备物处理来自个体动物肺的总蛋白提取物。右图：低氧暴露2天在小鼠肺中通过磷酸化Tyr-705(pY-STAT3)导致STAT3活化，这被鼠源MEX的处理预防。右图：STAT3活化的定量。对于所有的组，n＝4，单因素ANOVA：**，P＜0.01相对常氧。**，P＜0.01相对PBS中。(B)将人肺动脉内皮细胞(hPAEC)的原代培养物暴露于低氧(1％O2，5小时)表现出强STAT3活化，STAT3活化在由人脐带基质MSC分泌的MEX(hUC-MEX)之存在下被有效抑制。经hUC-MSC(hUC-ExD-CM)条件化的培养基的微囊泡耗竭级分对STAT3的活化没有影响。
图20.MEX处理在肺中抑制低氧诱导的miR-17微小RNA超家族并且增加抗增殖miR-204的水平。用10μg MEX制剂处理来自动物的全部小鼠肺中的微小RNA水平。低氧暴露7天的miR水平通过qPCR进行评估，并且表示为相对于常氧组的平均值。(A)选择代表miR-17至92、miR-106b至25和miR-106a至363簇的miR。(B)选择已报道的参与低氧信号转导的miR。(C)肺小动脉特异性miR-204的基础水平在MEX处理后上调。点代表独立动物中的表达水平。NRX：常氧；HPX：低氧。对于所有的组，n＝4，单因素ANOVA：**，P＜0.01；P＜0.001相对常氧。§，P＜0.001相对PBS。
图21.综合本研究结果的非限制性假设的图解。低氧转变了肺中免疫介体的Th1/Th2的平衡，导致替换性活化的肺泡巨噬细胞并在早期阶段诱导肺上皮细胞中HIMF的表达。HIMF对血管的有丝分裂作用需要Th2细胞因子，如IL-4。朝向增殖的转变的后果包括STAT3信号转导的低氧活化和微小RNA的miR-17家族的上调。使用MEX处理干扰肺中的早期低氧信号，抑制炎症和HIMF转录上调二者。另外，MEX处理可直接上调miR-204的水平，从而打破STAT3-miR-204-STAT3的前馈回路(feed-forward loop)，将平衡转变为朝向抗增殖状态。
图22.对来自人华顿氏胶质(WJ)MSC之外来体特异的标记物。Western印迹分析来自与下列来源的50nm级分(E1)：UC：非条件化MSC生长培养基。MPD UC：微颗粒耗竭生长培养基。在＝通过聚乙二醇沉淀去除生长基中的外来体标记物。hMEX：来自WJ MSC的外来体。hFEX：来自人皮肤成纤维细胞的外来体。四跨膜蛋白(tetraspanins)CD9和CD81在外来体级分中富集。
图23.mMEX在小鼠肺成纤维细胞中抑制HIFla的低氧上调和STAT3的磷酸化。如所示的，在存在或不存在小鼠骨髓MSC来源外来体(mMEX)的条件下，将小鼠肺成纤维细胞暴露于低氧。通过western印迹测定低氧诱导因子(HIF)的稳定性和STAT3经磷酸化的活化(P-STAT3)。
图24.将使用来自小鼠骨髓来源MSC的外来体(mMEX，1μg/ml)或来自小鼠肺成纤维细胞的外来体(mFEX，1μg/ml)处理的hPAEC暴露于1％O26小时。STAT3(P-STAT3)的低氧活化、总STAT3和HIF2a的稳定性由western印迹确定。NRx：常氧。PBS：低氧对照。
图25.将使用来自华顿氏胶质MSC的外来体(hMEX，1μg/ml)或来自人真皮成纤维细胞(hFEX，1μg/ml)的外来体处理的人PAEC暴露于1％O26小时。通过western印迹测定sSTAT＝3活化(P-STAT3)和总STAT3。NRX：常氧。PBS：低氧对照。
发明详述
本发明部分基于以下出乎意料的发现，来自于间充质干细胞的外来体对一些肺疾病(包括但不限于炎性肺疾病)提供治疗效果。
本发明广泛地涉及源自间充质干细胞(MSC)的外来体(可互换地称为间充质干细胞外来体或MSC外来体)的组合物，以及使用其治疗和/或预防一些肺疾病(包括但不限于炎性肺疾病)的方法。
外来体和外来体的制备
本发明的外来体(exosome)是从间充质干细胞释放的膜(即脂质双层)囊泡。其直径范围为约30nm至100nm。通过电子显微镜，外来体呈现出杯形形态。他们在约100,000×g沉降并且在蔗糖中的浮力密度为约1.10至约1.21g/ml。外来体可被称为微囊泡或纳米裳泡。
外来体可以包含一些蛋白质和/或核酸(包括RNA类，例如miRNA)。可以在外来体中表达的蛋白质包括Alix、TSG101、CD63、CD9、CD81、膜突蛋白(moesin)、HSP70、Dicer、M-CSF、骨桥蛋白(osteopontin)，和一种或更多种列于表1的蛋白质(包括2、3、4、5、6、7或8种这些蛋白质与任意上述蛋白质的任意组合)。在一些实施方案中，外来体(包括下面讨论的合成外来体)包含miRNA、Dicer、M-CSF、骨桥蛋白和表1的一种或更多种蛋白质(包括表1中所有的蛋白质)。
本发明的一些方面涉及分离的外来体。如本文所用，分离的外来体是与其自然环境物理上分离的外来体。分离的外来体可以从其天然存在的组织或细胞(包括间充质干细胞)整体或部分地物理分离的。在本发明的一些实施方案中，分离的外来体的组合物可以不含细胞例如间充质干细胞，或者其可以不含或基本不含条件培养基(conditioned media)。在一些实施方案中，分离的外来体可以以比未经操作之条件培养基中存在的外来体更高的浓度提供。
外来体可以从间充质干细胞培养的条件培养基中分离。从间充质干细胞收获外来体的方法在实施例中提供。简单地说，这种方法涉及，首先在标准条件下培养间充质干细胞直到它们达到约70％汇合度，然后在无血清培养基中培养细胞24小时，随后收集条件培养基并进行差速离心(400×g10分钟和12000×g10分钟)以除去细胞和细胞碎片。然后将澄清的条件培养基通过使用100kDa MWC0滤器(Millipore)的超滤浓缩，然后在12000×g再次离心10分钟。然后通过以下使用尺寸排阻色谱分离外来体：将浓缩的条件培养基上样到PBS平衡的Chroma S-200柱(Clontech公司)，用PBS洗脱，并收集350-550微升的级分。鉴定包含外来的级分并可能地进行合并。使用标准的Bradford测定(Bio-Rad)测量蛋白浓度。富集的外来体制备物的等分试样可在-80℃下储存。
也可以通过在100,000×g下超速离心澄清的条件培养基来纯化外来体。它们也可以通过超速离心成蔗糖垫(cushion)来纯化。已经在J Immunol Methods2002；270：211-226中描述了用于从树突状细胞纯化外来体的GMP方法。
外来体也可以使用设定孔径的尼龙膜滤器通过差异过滤纯化。通过大孔径的第一过滤将保留细胞部分和碎片。通过较小孔径的随后过滤会保留外来体并且从更小尺寸的污染物中纯化它们。
本发明还考虑使用具有本文所述分离的MSC外来体的一些或全部特点的合成外来体。这些合成的外来体将在体外合成(而不是来自或分离自MSC或MSC-CM)。它们可以是具有一种或更多种(包括2、3、4、5、6、7、8种或更多种列于表1或图22中的)蛋白质的合成脂质体。它们可包含或可不包含编码一种或更多种(包括2、3、4、5、6、7、8种或更多种)这些蛋白质的核酸。脂质体合成在本领域是已知的，并且脂质体可以从商业来源购买。应当理解的是，涉及来自或分离自MSC或MSC-CM的外来体的多种本文所述组合物、制剂、方法和用途也在合成外来体的情况中被考虑。
本发明考虑了外来体的立即使用或替代的外来体的短期和/或长期储存，例如，使用前在冷冻保存状态下储存。冷冻介质中通常包含蛋白酶抑制剂，由于它们在长期储存过程中提供了外来体的完整性。在-20℃下冷冻不是优选的，因为其与外来体活性的损失增加相关。在-80℃下快速冷冻是更优选的，因为这保留了活性(参见例如KidneyInternational(2006)69，1471-1476)。可以使用对冷冻介质的添加剂，以加强外来体生物活性的保存。这样的添加剂与用于冷冻保存完整细胞的添加剂是相似的，并且可包括但不限于DMSO、甘油和聚乙二醇。
表1
与MEX比FEX相关的特异性和富集蛋白质
*对于特定蛋白质当总MS/MS命中大于25并且序列覆盖中MEX/FEX的比大于3时给出数据。
间充质干细胞
间充质干细胞是具有分化成神经元细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、心脏组织和其他内皮细胞和上皮细胞的能力的祖细胞。(参见例如Wang，Stem Cells2004；22(7)；1330-7；McElreavey；1991Biochem Soc Trans(l)；29s；Takechi，Placenta1993March/April；14(2)；235-45；Takechi，1993；Kobayashi；Early HumanDevelopment；1998；July10；51(3)；223-33；Yen；Stem Cells；2005；23(1)3-9)。这些细胞可以通过基因或蛋白表达来通过表型限定。已将这些细胞表征为表达以下的一种或更多种(并且因此对其为阳性)：CD13、CD29、CD44、CD49a、b、c、e、f、CD51、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD102、CD105、CD106、CDw119、CD120a、CD120b、CD123、CD124、CD126、CD127、CD140a、CD166、P75、TGF-bIR、TGF-bIIR、HLA-A、B、C、SSEA-3、SSEA-4、D7和PD-L1。这些细胞还被表征为不表达(并且因此对其为阴性)CD3、CD5、CD6、CD9、CD10、CD11a、CD14、CD15、CD18、CD21、CD25、CD31、CD34、CD36、CD38、CD45、CD49d、CD50、CD62E、L、S、CD80、CD86、CD95、CD117、CD133、SSEA-1和ABO。因此，间充质干细胞可以根据其分化潜能来在表型和/或功能方面被表征。
可以从多种来源(包括但不限于骨髓、血液、骨膜、真皮、脐带血液和/或基质(例如，华顿氏胶质)以及胎盘)收集间充质干细胞。用于收集间充质干细胞的方法更详细地描述于实施例中。对于可以在本发明中使用的其他收集方法也可以参考美国专利No.5486359。
在本发明的方法中考虑使用的间充质干细胞(因此以及外来体)可以源自待处理的相同对象(并且因此将被称为对所述对象是自体的)，或其可源自优选地相同物种的不同对象(并且因此将被称为对于所述对象是同种异体的)。
如本文所用，应理解除非另有说明，本发明的一些方面和实施方案涉及细胞以及细胞群。因此，当涉及细胞时，应理解除另有说明外细胞群也被考虑在内。
如本文所用，分离的间充质干细胞是已与其自然环境物理上分离的间充质干细胞，包括与其自然环境的一种或更多种组分物理分离。因此，分离的细胞或细胞种群涵盖已被体外或离体操作的细胞或细胞群。例如，分离的间充质干细胞可以是这样的间充质干细胞，其已经与收获所述间充质干细胞的组织中的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，并且甚至更优选至少80％的细胞物理上分离。在某些情况下，分离的间充质干细胞存在于这样的群体中，其中至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的间充质干细胞在表型和/或功能上与本文所限定的相同。优选地，在分离的制备物中间充质干细胞与其他细胞的比例与起始细胞群相比增加。
间充质干细胞可以使用在本领域中公知的方法分离，例如，从骨髓单核细胞、脐带血、脂肪组织、胎盘组织、基于他们对组织培养塑料的粘附。例如，可以从市售的骨髓穿刺物中分离间充质干细胞。细胞群中间充质干细胞的富集可以用在本领域中已知的方法(包括但不限于FACS)来实现。
市售的培养基可用于间充质干细胞的生长、培养和维持。这样的培养基包括但不限于Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)。这样的培养基中可用于间充质干细胞生长、培养和维持的组分包括但不限于氨基酸、维生素、碳源(天然和非天然)、盐、糖、源自植物的水解产物、丙酮酸钠、表面活性剂、氨、脂质、激素或生长因子、缓冲剂、非天然氨基酸、糖前体、指示剂、核苷和/或核苷酸、丁酸类物质(butyrate)或有机物、DMSO、源自动物的产物、基因诱导物、非天然糖、细胞内pH值的调节剂、甜菜碱或渗透调节剂、微量元素、矿物质、非天然维生素。可以用来补充市售组织培养基的其他组分包括例如，动物血清(如胎牛血清(FBS)、小牛血清(FCS)、马血清(HS))，抗生素(例如，包括但不限于，青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素B、杀稻瘟菌素、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽，平阳霉素(bleomycin)、头孢菌素、氯四环素、博来霉素(zeocin)和嘌呤霉素)和谷氨酰胺(例如，L-谷氨酰胺)。间充质干细胞的存活和生长也依赖于适当有氧环境、pH和温度的维持。间充质干细胞可以使用本领域中已知的方法进行维持(参见例如Pittenger等，Science，284：143-147(1999))。
对象
本发明的方法可以在任何可能从中受益的对象中进行，包括人对象，农业牲畜(如牛，猪等)，参赛动物(如马)，伴侣动物(如狗，猫等)等。在本发明的多个方面中，人对象是优选的。在某些方面，使用人对象和人MSC外来体。
所述对象可以是患有可以使用本发明的外来体治疗的肺疾病(或病症)的那些，或他们可以是有风险发生这样的疾病(或病症)的那些。这些对象包括新生儿，特别是以低胎龄出生的新生儿。如本文所用，人新生儿是指从出生时间到约4周龄的人。如本文所用，人婴儿是指从约4周龄至约3岁的人。如本文所用，低胎龄指在给定物种的正常妊娠期之前发生出生(或分娩)。在人中，完整的妊娠期为约40周并且可从37周至多于40周。在人中低胎龄相当于早产，被定义为在37孕周前发生的出生。因此，本发明考虑了预防和/或治疗在37孕周前出生的对象，包括在甚至更短的妊娠期(例如，36孕周前、35孕周前、34孕周前、33孕周前、32孕周前、31孕周前、30孕周前、29孕周前、28孕周前、27孕周前、26孕周前，或25孕周前)出生的那些。通常这样的早产婴儿将被视作新生儿治疗，但本发明考虑了他们的治疗，甚至超出了新生儿阶段直至童年和/或成年。一些对象可对某些形式的肺疾病(如肺部高血压)有遗传倾向，并且这些对象也可以根据本发明治疗。
预防和治疗疾病的方法
本发明考虑了某些肺疾病的预防和治疗。预防疾病意指降低疾病显现的可能性和/或延迟疾病发作。治疗疾病意指疾病的症状减少或消除。
本发明旨在预防和/或治疗多种肺(lung)(或肺部(pulmonary))疾病。这些疾病包括炎性肺疾病，例如但不限于肺部高血压(PH)(其也被称为肺动脉高血压(PAH)、哮喘、支气管肺发育不良(BPD)、变态反应、结节病和特发性肺纤维化。这些疾病还包括肺血管疾病，其可以不具有炎性成分。可以根据本发明治疗的另一些肺部病症包括与脓毒症或通气相关的急性肺损伤。后一病症的一个实例是发生在年龄较大儿童和成体中的急性呼吸窘迫综合征。
肺部高血压是特征为肺部动脉血压远高于正常水平的肺疾病。症状包括气短、胸痛(尤其是在体力活动期间)、虚弱、疲劳、昏厥、头晕目眩(light headedness)(特别是在运动过程中)、眩晕、异常心音和杂音、颈静脉充血、腹部、腿和踝中流体滞留，以及甲床青蓝色。
支气管肺发育不良是折磨已被给氧或在通气机上的新生儿或早产新生儿(尤其是出生非常早例如32孕周前的那些))的病症。它也被称作新生儿慢性肺疾病。BPD的起因包括机械性损伤例如由于通气，氧中毒例如由于氧治疗，以及感染。疾病随时间可由非炎性发展为炎性。症状包括皮肤青蓝、慢性咳嗽、快速呼吸、气短。患BPD的对象更易受到感染，例如呼吸道合胞病毒感染。患BPD的对象可发生肺部高血压。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(也被称为呼吸窘迫综合征(RDS)或成体呼吸窘迫综合征)是由肺损伤或急性疾病引起的病症。损伤肺可由通气、创伤、烧伤、和/或吸气引起。急性疾病可以是感染性肺炎或脓毒症。其被认为是急性肺损伤的严重形式，并且其通常是致命的。其特征为肺炎症、换气受损、以及释放炎性介质、血氧不足(hypoxemia)、以及多器官衰竭。ARDS也可以被定义为在胸部X射线中双侧浸润的存在下动脉氧分压(PaO2)对吸入氧(FIO2)的比例低于200mmHg。PaO2/FiO2比例低于300mmHg并且双侧浸润表示急性肺损伤，这通常是ARDS的前兆。ARDS的症状包括气短、呼吸急促和由于低氧水平的精神混乱。
特发性肺纤维化的特征为未知原因的肺疤痕化或增厚。其最常发生于50-70岁的人。其症状包括气短、经常咳嗽(通常干咳)、胸痛和活动水平下降。
在某些情况下预防和/或治疗可涉及单独使用MSC外来体或与一种或更多种第二药剂一起使用。对象也可经受机械干预，如具有或不具有外源性输氧的通气。
对于新生儿并且尤其是低胎龄新生儿，本发明考虑了在出生4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时、或1小时内施用MSC外来体。在一些重要的情况下，在出生1小时内施用MSC外来体。
本发明还考虑了甚至在没有指示肺部疾病(例如但不限于BPD)的症状的情况下施用MSC外来体。
本发明还考虑了MSC外来体的重复施用，包括二、三、四、五次或更多次地施用MSC外来体。在某些情况下，可连续施用MSC外来体。重复或连续施用可在数小时(例如，1-2、1-3、1-6、1-12、1-18或1-24小时)，数天(例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6天或1-7天)或数周(例如，1-2周、1-3周或1-4周)的时间中进行，这取决于被治疗病症的严重程度。如果施用是重复的但非连续的，施用之间的时间可以是数小时(例如、4小时、6小时、或12小时)，数天(例如、1天、2天、3天、4天、5天、或6天)，或数周(例如、1周、2周、3周、或4周)。施用之间的时间可以是相同的或者可以是不同的。例如，如果疾病的症状出现恶化，可更频繁地施用MSC外来体，并且一旦症状稳定或消失，则可以以较低的频率施用MSC外来体。
在一些重要的情况下，在出生24小时内至少施用一次MSC外来体，然后在出生1周内至少再施用一次。甚至更优选地，在出生1小时内至少施用一次MSC外来体，然后在出生3-4天内至少再施用一次。
在某些情况下，可进行低剂量MSC外来体的重复静脉内施用。与本发明一致地，已经发现当将低剂量的MSC外来体静脉内施用给鼠对象时，在每2-4天施用MSC外来体时达到最大活性。在这些实验中，向平均20g的小鼠施用100ng的MSC外来体，对应于每千克5微克的剂量。当使用更高剂量(如10微克/20克小鼠或0.5毫克/千克)时，单次静脉内施用足以达到长期保护。因此，本发明考虑了MSC外来体低剂量形式的重复施用，以及MSC外来体高剂量形式的单次施用。低剂量形式的范围可为1-50微克/千克(不限于此)，而高剂量形式的范围可为51-1000微克每千克(不限于此)。应理解，根据疾病的严重程度，对象的健康状况和施用途径等，本发明考虑了单次或重复施用高或低剂量的MSC外来体。
施用、药物组合物、有效量
可在可药用制剂(或可药用组合物)中(通常在与可药用载体相组合时)使用(例如，施用)MSC外来体。这样的制剂可以常规地含有可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、以及可以任选地包含其他(即，第二)治疗剂。
可药用载体是可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与携带或运送预防或治疗性活性剂。每种载体必须在与制剂中的其它成分相容并且不损害对象的意义上是“可接受的”。可以作为可药用载体的材料的一些例子包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二元醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸缓冲溶液；和其他在药物制剂中使用的无毒相容性物质。
第二治疗剂。外来体可与一种或更多种第二治疗剂一起施用。如本文所用，治疗剂是指可用于预防、治疗和/或处理肺疾病(例如本文中讨论的那些)的任何药剂。这些包括但不限于表面活性剂、吸入一氧化氮、二甲磺酸阿米三嗪(almitrine bismesylate)、免疫调节剂和抗氧化剂。免疫调节剂的一些实例包括类固醇和皮质类固醇，例如但不限于甲基泼尼松龙。抗氧化剂的一些实例包括但不限于超氧化物歧化酶。
用于治疗或处理某些肺疾病(包括但不限于肺部高血压)的某些第二治疗剂包括氧气、抗凝血剂如华法令(warfarin)(香豆定(Coumadin))；利尿剂例如腹安酸(furosemide)或螺内酯(spironalactone)钙通道阻滞剂；钾例如正性肌力药(inotropic agent)如地高辛；血管扩张剂如硝苯吡啶(nifedipine)或地尔硫卓(diltiazem)内皮素(endothelin)受体拮抗剂如波生坦(bosentan)和安立生坦(ambrisentan)前列环素类似物如依前列醇(epoprostenol)曲前列尼尔钠(treprostinilsodium)和伊洛前列素(iloprost)以及PDE-5抑制剂如西地那非(sildenafil)和他达拉非(tadalafil)。
表面活性剂(Surfactant)。MSC外来体可与肺表面活性剂一起施用。肺表面活性剂是用于保持肺气道开放(例如，通过防止肺泡壁互相粘附)的脂蛋白混合物。肺表面活性剂可包括磷脂如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰甘油(PG)；胆固醇；和蛋白质如SP-A、B、C和D。肺表面活性剂可以源自天然来源，例如牛或猪的肺组织。实例包括AlveofactTM(来自母牛肺灌洗)，CurosurfTM(来自切碎的猪肺)，InfasurfTM(来自小牛肺灌洗)，以及SurvantaTM(来自切碎的母牛肺，具有包括DPPC，棕榈酸和三棕榈精的其他组分)。肺表面活性剂也可以是合成的。例子包括ExosurfTM(包含DPPC以及十六烷醇和泰洛沙泊)，PumactantTM或人工肺扩张化合物(Artificial Lung Expanding Compound，ALEC)(包含DPPC和PG)，KI-4(包含DPPC，棕榈酰-油酰磷脂酰甘油，棕榈酸，和模拟SP-B的合成肽)，VenticuteTM(包含DPPC、PG、棕榈酸和重组SP-C)。肺表面活性剂可从商业供应商获得。
有效量。以有效量施用本发明的制剂。有效量是单独引发所期望结果的试剂量。绝对量将取决于多种因素，包括选择用于施用物质，施用是以单剂量还是多剂量，以及个体患者的参数包括年龄、身体状况、体型、重量，和疾病阶段。这些因素对本技术领域普通技术人员而言是公知的，并且可以以不超出常规实验的方式应对。
施用途径。MSC外来体可通过有效递送到肺的任何途径施用。全身性施用途径例如静脉内团注(bolus injection)或连续输注是合适的。更直接的途径例如鼻内施用、气管内施用(例如通过插管)和吸入(例如通过气溶胶(aerosol)经口或鼻)也被本发明考虑在内，并且在某些情况下特别是在需要快速作用时可以是更合适的。如本文所用，气溶胶是液体在气体中以小颗粒分散的混悬剂，它包括含有这种颗粒的细雾或喷雾。如本文所用，气溶胶化是通过将液体混悬剂转化为小颗粒或液滴来制备气溶胶的过程。其可使用气溶胶递送系统如加压包或喷雾器来进行。喷雾器包括空气喷射(即，气动的)、超声、和振动网喷雾器，例如使用合适的抛射剂，例如但不限于二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。除了喷雾器，其他的肺部递送设备包括但不限于定量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。可配制含有冻干外来体和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的用于吸入器或吹入器中的如明胶胶囊和药筒。
当期望全身性递送外来体时，可将其配制为用于通过注射肠胃外施用，包括例如通过团注或连续输注。注射用制剂可以以单位剂量形式提供，例如，在安瓿中或在多剂量容器中，具有或不具有添加的防腐剂。
组合物可采取如水溶性混悬剂、溶液或在油或水性载剂中的乳剂的形式，并且可包含配置试剂例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射混悬液可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，该混悬剂也可包含合适的稳定剂或增加溶解度的试剂。或者，该外来体可以是冷冻干燥的或其他粉末或固体形式以在使用前用合适的载剂(例如，无菌无热原水)构成。
应当理解待施用至被根据本发明治疗的患者的其他试剂可以经任何合适的途径施用，包括口服施用、鼻内施用、气管内施用、吸入、静脉内施用等。本技术领域普通技术人员将知晓对于该第二药剂的常用施用途径。
药盒
本发明还涵盖经包装和标签化的药物产品。该制品或药盒包含在适当的器皿或容器(如玻璃瓶或塑料安瓿或其他密封的容器)中的合适单位剂量形式。单位剂量形式应该适合于肺部递送，例如通过气溶胶。优选地，制品或药盒还包含关于如何使用(包括如何施用该药物产品)的说明。该说明还可以包含建议医生、技术人员或对象如何适当地预防或治疗目的疾病或异常的信息材料。换句话说，制品包含指示或建议用于包括但不限于实际剂量、监测程序以及其他监测信息的剂量方案的说明。
与任何药物产品一样，设计包装材料和容器以在储存和运输过程中保护产品的稳定性。
该药盒可包含在无菌水性混悬剂中的MSC外来体，其可以直接使用或者可以用生理盐水稀释用于静脉内注射或在喷雾器中使用，或用表面活性剂稀释或与其组合用于气管内施用。因此，该药盒还可含有稀释溶液或试剂，如盐水或表面活性剂。该药盒还可以包含肺部递送设备(如喷雾器)或一次性组件例如口部部件(mouthpiece)、鼻部部件(nosepiece)或掩罩(mask)。
实施例
概述
低氧(hypoxia)在肺中导致炎症反应，其表现为巨噬细胞的替换性活化以及促炎性介质的升高，其对随后低氧性肺部高血压(HPH)的发生是至关重要的。间充质基质细胞(MSC)移植在疾病的实验模型中预防肺炎症、血管重塑和右心衰竭，并且抑制HPH。在这项研究中，我们旨在研究使得MSC在HPH中具有保护性的旁分泌机制。
我们对小鼠MSC条件培养基进行分级来鉴定在体内影响低氧信号转导的生物活性成分，并且确定在HPH鼠模型中，外来体(分泌的膜微囊泡)抑制巨噬细胞的低氧性肺部流入(influx)以及促炎性介质和促增殖介质(包括单核细胞趋化蛋白-1和低氧诱导促有丝分裂因子)的诱导。MSC外来体(MEX)的静脉内递送预防血管重塑和HPH的发生。低剂量MEX的多次施用完全抑制早期低氧炎性反应并改善肺部高血压和右心室病理。发现单次高剂量的MEX足以预防长期低氧引起的血管重塑和PH发生。相比之下，成纤维细胞来源的外来体和移除MEX的培养基没有效果。MEX抑制转录因子3的信号转导子和活化子(signal transducersand activators of transcription3，STAT3)的低氧活化并上调微小RNA(microRNA)簇的miR-17超家族，而增加肺中miR-204的水平，miR-204是在人PH中表达降低的关键微小RNA。通过人脐带MSC产生的MEX在分离的人PAEC中抑制STAT3信号转导，这表明MEX对低氧STAT3活化有直接作用。
本研究表明MEX对肺产生多效的保护作用，并可以通过抑制低氧诱导的特异性STAT3介导之过度增殖途径来预防PH。
材料与方法
骨髓来源的间充质干细胞的分离。如之前所述，从5-7周龄的FVB/s小鼠的股骨和胫骨分离骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)。简单地说，剪切每个胫骨和股骨的端部以暴露骨髓，并且将骨插入适合的离心管中。在400×g下离心管1分钟收集骨髓。将沉淀通过2l号针在3mLα-最低必需培养基(α-MEM)中重悬，随后经70μm尼龙网过滤器过滤。将骨髓细胞放置在Ficoll-Paque(Amersham)密度梯度上，离心并铺板。在培养中维持塑料粘附细胞，每2至3天更换培养基。经过2至3代后，按照发表的方案和国际细胞治疗协会(ISCT)指南1进行免疫耗竭(immunodepletion)。在荧光活化细胞分选仪(MoFlo)中使用适当的荧光标签化抗体(BD Biosciences)选择对CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45和CD79α抗原阴性的细胞，进一步繁殖，然后如上所述选择对CD73、CD90、CD105、c-kit和Sca-1抗原阳性的细胞。所有试剂均购自Sigma。7至12代的分离细胞可用于条件培养基生产和外来体的分离。也可以在生产条件培养基或外来体之前冷冻保存分离的和/或培养的细胞。
原代小鼠肺成纤维细胞的分离。根据标准方法获得原代小鼠肺成纤维细胞(MLF)的培养物。
MSC条件培养基(MSC-CM)的制备。将冷冻保存的MSC在完全培养基(添加了10％FBS(Hyclone)，10％马血清(Hyclone)和5mM L-谷氨酰胺(Gibco)的αMEM(Invitrogen)中铺板，然后在标准培养条件下孵育。从培养物经24小时产生无血清MSC-CM，将其通过差速离心澄清(400×g下10分钟，12,000×g下20分钟)。通过使用100kDa MWCO过滤设备(Millipore)超滤将无血清MSC-CM浓缩250倍，然后通过在12,000×g下离心20分钟进一步澄清。
经Sephacryl S-400凝胶过滤色谱法纯化外来体。将MSC-CM的250×浓缩物加在使用PB2XS缓冲液(补充300mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4))预平衡的S-400柱(14×300nm，Pharmacia)上，并使用恒定流速洗脱(0.4ml/分钟)。将来自各级分的等效体积(0.8ml)施加在变性10％聚丙烯酰胺凝胶或非变性(native)1.2％琼脂糖凝胶上，随后使用针对CD81的特异性抗体(Santa Cruz)和针对SPP-1(骨桥蛋白)的特异性抗体(R＆DSystems)进行免疫染色。合并对CD81和SPP-1都呈阳性的在非变性琼脂糖凝胶中具有较高迁移的级分，并将其用作外来体制剂(图1)。合并的外来体可以立即使用或在液氮中速冻然后保存于-80℃。
电子显微镜分析。将纯化的外来体吸附到碳涂层网格，所述碳涂层网格已通过曝露于辉光放电30秒制成亲水性的。除去过量的液体并且用0.75％的甲酸双氧铀染色外来体30秒。去除多余的甲酸双氧铀后，在JEOL1200EX透射电子显微镜中检测网格，图像用AMT2KCCD相机记录。
外来体的蛋白质组学分析。在12％变性PAGE上分离30μg外来体蛋白质，随后使用测序级胰蛋白酶(Promega)消化。在哈佛微化学和蛋白质分析机构通过在Thermo LTQ-Orbitrap质谱仪上进行毛细反相HPLC纳米电镀串联质谱(μLC/MS/MS)进行序列分析。随后将所得的肽MS/MS谱使用哈佛微化学机构开发的算法SEQUEST和程序与物种特异性序列相关联。
免疫印迹分析。在用于表征外来体的实验中，将3μg来自外来体级分或无外来体级分的蛋白质在12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，然后转移到0.45μm PVDF膜(Millipore)上。用5％脱脂乳封闭后，用多克隆山羊抗CD63(Santa Cruz)、抗CD81(Santa Cruz)、抗mCSF(R&Dsystems)、抗骨桥蛋白(R&D systems)，多克隆兔抗膜突蛋白(moesin)(Abcam)、抗14-3-3家族(Abcam)，以及单克隆抗Dicer(Abcam)与合适的缀合过氧化物酶的二抗检测特异信号。作为对照，平行使用BM-MSC提取物的35μg蛋白。对于BALF中的蛋白质分析，合并来自同一组中单个小鼠的等效体积的无细胞BALF，随后经20％三氯乙酸(TCA)沉淀过夜。在1×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液中重悬蛋白质沉淀，随后在变性三(羟甲基)甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上分离。转移至0.2μm PVDF膜(Millipore)后，用含有0.1％吐温20(Sigma)的PBS中5％的脱脂乳封闭印迹1小时，然后使用1：1000稀释的兔多克隆抗单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)抗体(Abcam)、抗低氧诱导有丝分裂因子(HIMF/FIZZl/Relmα)抗体(Abcam)、抗白介素10(Abcam)和抗白介素-6(IL-6)抗体(Santa Cruz)在4℃下孵育过夜。为了检测作为加样对照的小鼠免疫球蛋白A(IgA)，使用1：5000稀释的山羊抗小鼠IgA抗体(Abcam)。使用1：50,000稀释的过氧化物酶缀合的抗兔二抗(Santa Cruz)通过增强的化学发光剂(Pierce)或Lumi-LightPLUS(Roche)可视化免疫反应性条带。
动物和低氧暴露。8周龄FVB雄性小鼠从Charles River实验室(Wilmington，MA)获得或在波士顿儿童医院的动物机构饲养。将各组小鼠暴露在8.5％氧气的Plexiglas室(OxyCycler,BioSpherix，Redfield，NY)已进行可变试验阶段。调整通气以消除CO2，从而使得其不超过5,000ppm(0.5％)(平均1,000至3,000ppm)。通过通气和经空气净化器的活性炭过滤除去氨。所有动物方案经儿童医院动物保护和使用委员会批准。
低氧引起的急性肺炎症小鼠模型。通过左侧颈静脉向小鼠注射条件培养基(40μg/kg)或外来体(4μg/kg)或无外来体的条件培养基(4μg/kg)。作为对照，平行注射50μlPBS或培养基。注射3小时后，将小鼠连续暴露于单压低氧(monobaric hypoxia)(8.5％O2)并且持续确定的试验时间。在时间进程实验中，低氧暴露后第4天在右侧颈静脉进行MEX的另外注射。
低氧诱导的PAH小鼠模型。将在第0天和低氧暴露后第4天被注射外来体或对照的小鼠持续暴露于低氧整3周，然后用戊巴比妥(50mg/kg，腹腔内)麻醉。使用闭胸法和PowerLab系统(ADInstruments，Colorado Springs，CO)如前所述2测量右心室收缩压(RVSP)。压力测量后，用PBS灌注肺并用4％多聚甲醛膨胀(inflated)以固定肺结构。然后将固定的肺用石蜡包埋并切片用于免疫组织化学分析。立刻分析心脏进行富尔顿指数测量(右心室重量与左心室加隔膜重量的比值，RV/[LV+S])，右心室肥厚的评估)。
支气管肺泡灌洗和肺泡巨噬细胞计数。用2,2,2-三溴乙醇(250mg/kg，腹膜内)麻醉动物并且对其进行气管插管和钝端针安装。通过PBS的连续施用(0.8ml、0.8ml、0.8ml和0.9ml)收集支气管肺泡灌洗流体(BALF)，回收约3ml的单个BALF。在400×g下离心5分钟收集BALF中的细胞，在Kimura染色溶液中重悬以选择性地计数BALF中的总肺泡巨噬细胞。
免疫组织化学分析。将肺组织切片在二甲苯中脱石蜡并在切片上再水化。封闭组织一小时后，通过与稀释度为1：125的单克隆抗小鼠α-SMA抗体(Sigma)在4℃孵育过夜进行免疫组织化学分析。使用甲醇中的3％H2O2(Sigma)灭活内源性过氧化物酶后，根据制造商说明书(Vector laboratories，Burlingame，CA)进行二抗和过氧化物酶染色。通过在400×放大倍数下捕获的切片中直径小于30μm的血管中的α-SMA染色来评估血管壁的厚度。
从人脐带华顿氏胶质中分离人MSC。根据稍作修改的已发表方法(Mitchell，K.E.等，2003，Stem Cells21：50-60；和Penolazzi，L.等，2011，J Cell Physiol)分离人脐带华顿氏胶质来源的MSC(hUC-MSC)。无菌的冷PBS冲洗脐带两次，纵向切开，并移除动脉和静脉。刮出软凝胶组织，精细切碎(2至3mm2)，并直接放置在100mm培养皿中(每个培养皿15片)，培养皿具有补充10％胎牛血清(Hyclone)，2mM L-谷氨酰胺，以及青霉素/链霉素的DMEM/F12(1：1)(Invitrogen)，在37℃下5％CO2的潮湿气氛中孵育5天。除去组织和培养基后，将板用PBS洗涤3次，培养贴壁的细胞并且每周更换3次新鲜培养基。在70-80％汇合时，收集细胞并使用针对CD34(Miltenybiotec)和CD45(Miltenybiotec)的PE缀合抗体进行染色。使用抗PE微珠(Miltenybiotec)和MSCS柱(Miltenybiotec)根据制造商说明书进行免疫耗竭。进一步培养CD34和CD45阴性群体，并使用MoFlo流式细胞仪(Beckman Coulter)通过一组对人MSC表征特异的荧光标记抗体(BD Biosciences)根据表达MSC标志物(CD105、CD90、CD44和CD73)与不存在CD11b、CD19和HLA-DR进行选择。
条件培养基的制备。为了从血清来源的微囊泡中排除污染物，通过在100000×g下超速离心18小时澄清用于增殖细胞培养物和收集条件培养基的血清。MSC在补充了10％(体积/体积)胎牛血清(FBS，Hyclone)和10％(体积/体积)马血清(Hyclone)的α-MEM培养基中培养。MLF在补充有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺(GIBCO)的Dulbecco基本必需培养基(DMEM，Invitrogen)中培养。将70％汇合的培养物用PBS洗涤两次，并用补充了2mM L-谷氨酰胺的无血清培养基在标准培养条件下孵育24小时。收集条件培养基，通过差速离心(400×g下5分钟，2000×g下10分钟，和13,000×g下30分钟)除去细胞和碎片。随后通过0.2μm的过滤单元过滤澄清的条件培养基并使用Ultracel-100K(Millipore)离心过滤装置浓缩至蛋白质浓度范围为0.1至0.5mg/ml。通过Bradford测定(Bio-Rad)确定条件培养基中的蛋白质水平。
体外低氧。人PAEC购自GIBCO并且在补充了LSGS(Invitrogen)的M200培养基中培养。80％汇合时，在存在或不存在外来体级分(1μg/ml)或hUC-MSC条件培养基的外来体耗竭(depleted)级分(1μg/ml)的条件下，在inVivo2工作站(Ruskin Technology,Bridgend，UK)中将细胞暴露于1％O2下5小时。裂解细胞并且在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离全细胞溶胞产物中的蛋白质，随后通过western印迹分析磷酸-STAT3和STAT3(CellSignaling)。
外来体的分离。将50μ/的浓缩条件培养基施加在用含20mM磷酸钠(pH7.4)和300mMNaCl的缓冲液预平衡的CHROMA SPIN S-1000柱(Clontech)上。通过重力依次收集每个级分(0.1ml)。对于大规模制备，使用AKTA纯化层析系统(GE Healthcare，NJ)注射1.5ml澄清和浓缩的条件培养基到在上述缓冲液中预平衡的16/60Hiprep Sephacryl S-400HR柱上。在流速为0.5ml/分钟的条件下收集级分(1ml)。使用直径为50nm的聚苯乙烯纳米球(Phosphorex，Fall Rive发MA)作为大小参照，并且合并与这一标准保留体积相应的洗脱级分并进行进一步分析。
蛋白质提取和免疫印迹。在420×g离心BALF(3ml)10分钟，使用无细胞BALF上清液进行蛋白质分析。合并同一组中单个动物的等体积BALF标本(1ml)，经20％三氯乙酸(Sigma)沉淀蛋白质过夜。将等效于各蛋白质沉淀30％的级分溶解于1×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液中，在15％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。转移至0.2μm PVDF膜(Millipore)后，用5％脱脂乳封闭印迹并使用1：1000稀释的兔多克隆抗单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)抗体(Abcam)、抗低氧诱导有丝分裂因子(HIMF/FIZZl/RELMα)抗体(Abcam)在4℃下孵育过夜。使用1：5000稀释的山羊抗小鼠IgA抗体(Abcam)检测小鼠免疫球蛋白A。使用1：20,000稀释的过氧化物酶缀合的抗兔二抗(Santa Cruz)通过增强的化学发光试剂(Pierce)或LUMI-LightPLUS(Roche)可视化免疫反应条带。
对于来自全肺组织的蛋白质的分析，将冷冻肺组织经Polytron在含2mM苯甲烷磺酰氟(Sigma)的冷PBS中切5秒，3000×g离心3分钟。通过每次3000×g离心3分钟用含有2mMPMSF的冷PBS洗涤切碎的组织粒两次，将白色的经清洁的组织片用含蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo)的RIPA缓冲液裂解。在10至20％梯度凝胶(Invitrogen)上分离40μg的肺组织提取物。在免疫印迹中使用的抗体是抗MCP-1、HIMF、IL-6、血管内皮生长因子(Abcam)、总STAT3和磷酸-STAT3(Y705)(Cell Signaling)的。上样对照使用小鼠β-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma)。
在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离外来体制备物，然后转移到0.45μm的PVDF膜(Millipore)上。使用山羊多克隆抗CD63抗体(1：1000；Santa Cruz)，多克隆兔抗CD81(1：1000，Santa Cruz)和单克隆抗Dicer(1：1000，Abcam)。为了可视化特异蛋白质条带，使用与上述相同的ECL试剂。使用来自NIH的ImageJ程序进行适当背景消减后的通过光密度分析的定量。
微小RNA的定量。通过Chomczynski&Sacchi(1987Anal Biochem162：156-159)的方法提取肺总RNA，并且使用750ng作为模板用于使用对每个靶微小RNA特异之引物的逆转录酶(TaqMan Reverse Transcription Kit，Applied Biosystems，Foster City，CA)。每个逆转录反应还包括小核RNA sno202的引物作为内对照。在存在对所示微小RNA和内对照特异的探针的情况下使用无UNG的TaqMan univarsal master mix II(Applied Biosystems)，每20μl qPCR反应使用37.5ng cDNA(TaqMan微小RNA assay,Applied Biosystems)。在StepOne Plus平台(Applied Biosystems)上在50℃2分钟，95℃10分钟，随后进行40个循环的95℃15秒，60℃1分钟的条件下进行扩增。
结果
BM-MSC分泌抑制低氧诱导之急性炎性反应的因子。从几个肺损伤的动物模型中已经观察到BM-MSC的治疗能力。我们首先确定BM-MSC通过其旁分泌方式与低氧诱导的肺炎症相关。低氧暴露在2天内导致显著的巨噬细胞肺部积聚和促炎性介质的升高2。为了测试在这种动物模型上BM-MSC的旁分泌潜力，将接受BM-MSC条件培养基(BM-MSC-CM)或载剂或MLF条件培养基(MLF-CM)的小鼠暴露于单压低氧2天。从而，源自低氧的巨噬细胞之急性肺部流入被BM-MSC-CM处理阻断，而注射载剂或MLF-CM的小鼠表现出在肺中巨噬细胞的显著积累(图1A)，这表明BM-MSC分泌抑制源自低氧的肺炎症反应的因子，其发信号募集巨噬细胞进入肺。如已观察到的，低氧条件上调促炎性介质的肺水平，使用来自小鼠的无细胞BALF进行低氧导致的促炎性介质MCP-1和HIMF/FIZZ1的比较分析。在载剂或MLF-CM注射的小鼠中，肺中MCP-1和HIMF二者的分泌水平通过低氧暴露48小时显着增加。与此相反，这些介质通过低氧的提升在BM-MSC-CM处理的小鼠中被有效抑制(图1B)。总之，BM-MSC的分泌因子是抗炎性剂，其通过阻断低氧诱导的MCP-1和HIMF/FIZZ1在肺中上调来防止巨噬细胞的肺募集。
BM-MSC分泌外来体。我们通过包括超滤和尺寸排阻色谱的程序在BM-MSC-CM中分离了小囊泡。表2显示了在这些实验中达到的富集程度。如在图2中总结的，BM-MSC-CM中约1.6％(w/w)的分泌蛋白可与其外来体相关。分离MLF来源外来体(FEX)作为对照并进行平行分析。从电子显微镜分析得出，仅在柱的空隙体积内观察到外来体，表明尺寸排阻色谱排除小于8,000kDa的分子对富集外来体是高度选择性的(图2A、2B)。此外，来自BM-MSC-CM和MLF-CM等效级分的外来体的电子显微镜照片证实，从两种类型的细胞释放的外来体呈现典型外来体的物理参数，例如直径为30至100nm不等和双面凹的形态学特性(图2C、2D)。关于BM-MSC来源外来体(MEX)的蛋白质成分，western印迹分析表明MEX中典型外来体蛋白如CD63和膜突蛋白为阳性，并且与包括单核细胞集落刺激因子(mCSF)和骨桥蛋白(OPN/SPP1)的免疫调节蛋白高度相关。14-3-3家族的某些亚型(分子量约30kDa的小多肽，能够结合许多功能不同的信号转导蛋白)与外来体共纯化表明，14-3-3亚型的某些亚类别与MEX相关。此外，催化微小RNA在细胞质中成熟的关键处理步骤的Dicer只在外来体级分中被检测到，强烈支持微小RNA是外来体的另一组分。有趣的是注意到，mCSF和OPN以及CD63和膜突蛋白在纯化过程中获得的无外来体级分中也大量检测到，表明其水溶性亚型在无外来体级分中存在或与外来体表面的弱或低的亲和结合(图2E)。比较性western印迹分析表明，MEX相对于FEX高度富集CD63、Dicer、mCSF和骨桥蛋白，而CD81在FEX中更丰富(图2F)。因此，MEX保持典型外来体在大小和形态方面的物理特性，并且和FEX相比高度富集Dicer和免疫介体。我们进一步通过质谱进行来自两种不同细胞类型的外来体之间的比较蛋白质组学分析，以进一步研究MEX的生理作用。
BM-MSC的抗炎性作用通过其分泌的外来体介导。我们进一步研究了BM-MSC来源的外来体是否在低氧引起的急性肺部炎症实验模型中具有生理功能。将注射了纯化MEX的小鼠暴露于8.5％O2单压低氧。连续暴露于低氧48小时后，我们观察到低氧引起的巨噬细胞的肺部流入被MEX的施用有效阻止。相比之下，FEX或BM-MSC-CM的无外来体级分未阻止巨噬细胞的肺部流入(图3A)。使用免疫印迹分析研究了来自无细胞BALF的总蛋白。因低氧引起的分泌性促炎性介质如MCP-1和HIMF/FIZZ-1上调被MEX的施用完全消除，而这些没有被载剂或FEX的注射阻止(图3B)。有趣的是，BM-MSC-CM的无外来体部分未抑制低氧引起诱导的这些促炎性介质的上调。在外来体级分和无外来体级分之间蛋白质成分方面的几个其他差异表明了这样的可能性，外来体中的核酸在反应中可以是重要的。这些数据突出，特异定位于外来体上的BM-MSC来源的分泌因子通过阻断低氧诱导的上调促炎性介质MCP-1和HIMF/FIZZl的信号来有效地抑制低氧引起的肺部炎性反应。
MEX的施用消除低氧引起的肺部炎性反应。我们观察到，BM-MSC分泌消除低氧信号(其募集巨噬细胞至肺)的外来体，并且还观察到在肺中2天内的低氧暴露导致急性炎性反应。我们进一步研究了MEX单次或多次处理对肺炎性反应时程(直到低氧暴露7至11天)。在载剂注射组中通过低氧暴露2天，小鼠表现出巨噬细胞的急性肺流入和MCP-1和HIMF/FIZZ1二者肺部水平的急剧升高，其中在低氧暴露7天时炎性峰消解(resolving)。与肺泡巨噬细胞数目和MCP-1肺部水平的数量降低不同，对于7天的连续低氧暴露，HIMF/FIZZ1持续高水平，这表明MCP-1主要调节巨噬细胞的肺部流入，而HIMF/FIZZ1可在低氧的反应中扮演不同的角色(图4A、4D)。重要的是，MEX的单次注射不能够抑制在低氧条件下超过4天的低氧引起的炎性反应，所以低氧引起的肺部炎症在注射4天后开始，在第7天达到高峰，然后在第11天消解(图4B、4D)。更重要的是，在低氧暴露第4天另外注射MEX在低氧条件下持续阻滞肺部炎症直至11天(图4C)。至于通过MEX调控HIMF/FIZZ1，对于4天的低氧，MEX的单次注射能够抑制低氧引起的HIMF/FIZZ1上调。MEX的另外注射不能在7天低氧时消除HIMF/FIZZ1的上调，表明其他时间调控途径可参与该反应。总之，低氧引起的急性肺部炎症通过MEX的单次注射被暂时抑制，并且通过连续和多次施用维持能够抵消对低氧之肺部反应的抗炎性作用。
BM-MSC来源的外来体抑制低氧引起的PAH。在这项研究中，我们观察到，MCP-1和HIMF在肺中被低氧显著上调，并且低氧引起的上调被MEX处理明显减弱。因此，我们推测MEX可通过阻断PAH的两种重要介体(mediator)来防止低氧诱导的PAH。为了检验这一假设，将小鼠在接受MEX或FEX或PBS(作为对照)后暴露于低氧3周。在实验阶段结束时，测量RVSP并针对RV肥大处理心脏组织。图5B和5C表明，与年龄相匹配的常氧小鼠相比，低氧小鼠全部表现出RVSP和富尔顿指数升高。与此相反，相比于接受PBS或FEX的小鼠，获得MEX的小鼠观察到显著的改善。此外，与MEX单次注射的小鼠相比，在4天接受另外MEX注射的小鼠显示出在长期低氧下显著降低的RVSP和RV肥大，这表明MEX的重复施用改善应答于长期低氧的肺动脉压力和心室壁厚度。为了研究MEX的多次处理是否能减轻低氧引起的肺血管重塑，通过使用α-SMA抗体染色肺部血管形态计量学分析低氧肺组织切片(图5D)。确定了肺小动脉中平均血管壁厚度(medial vessel wall thickness)直径为20至30μm的百分比。与年龄匹配的常氧对照小鼠相比，在PBS或FEX处理小鼠中观察到长期低氧显著增加肺小动脉的厚度，而在对照和MEX处理小鼠中没有观察到血管壁厚度的显着差异，这表明MEX能够预防低氧诱导的肺部血管重塑的过程(图5E)。
MEX包含多种免疫调节因子。我们已经观察到MEX对低氧引起的急性肺部炎症和长期低氧导致的肺动脉高血压二者的强效果。为了研究其分子机制，我们通过高效液相色谱质谱(HPLC-MS/MS)进行了MEX和FEX的全蛋白质组学分析。在MEX中共鉴定到273个高置信度的蛋白质，并且35％的蛋白质也在FEX中被检测到。为了实现高置信度地分析出与MEX相关的大量蛋白质，我们鉴定了具有高数量(＞25)MS/MS谱和在序列覆盖(coverage)中MEX/FEX高比率(＞3)的蛋白质。8种蛋白质符合这一条件并且这些列在表1中。这些蛋白质中，3种是独特的并且5种是在MEX中高度富集的。半乳凝素-3-结合蛋白(LGALS3BP/MAC2BP)(MEX中独有的蛋白质之一)是分泌蛋白质，已被证明通过抑制哮喘标志物TH2细胞因子的转录而具有免疫调节活性34。它能够与多种细胞表面和基质上的蛋白质(包括凝集素家族，整联蛋白，层粘连蛋白和纤连蛋白)相互作用。由于已证实相互作用调节肿瘤细胞对细胞外蛋白质的粘附35，MEX表面的GAL3BP可在以下中起重要作用，即通过配体特异性方式将注入的MEX靶向受体细胞的表面。已知MEX中另一种独有蛋白质血小板反应蛋白-2作为肿瘤生长和血管发生的强内源性抑制子36并且抑制促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α的产生37。已报道乳黏着蛋白(MFGE8)(树突状细胞来源的外来体的主要成分38)在细胞死亡和凋亡中发挥作用，它特异性地识别凋亡细胞上呈现的磷脂酰丝氨酸并通过与表达整联蛋白αv和整联蛋白63的细胞结合来促进凋亡细胞的吞噬性清除39，40。在MEX的表面上，乳黏着蛋白可参与使MEX靶向其受体细胞类型。此外，已报道乳黏着蛋白也通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用参与了β淀粉样肽(Abeta)的吞噬性清除，β淀粉样肽是阿尔茨海默病中积累的老年斑的主要组分。外来体级分中Abeta的丰度可以是由于乳黏着蛋白和Abeta的直接相互作用。脂肪细胞增强子结合蛋白1(AEBP1)(也被称为主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP))在伤口愈合和能量体内平衡中发挥重要的生理作用。缺失7-16外显子的小鼠显示出伤口愈合缺陷并且AEBP1缺失(null)小鼠抵抗饮食诱导的肥胖41。表1和图22描述了在小鼠和人MEX中鉴定的多种介体。
小鼠或人来源的MEX介导低氧导致之STAT3活化的抑制。早期的低氧导致STAT3在小鼠肺中的活化(通过磷酸化Tyr-705)，然而对STAT3蛋白质的总水平无任何影响。这种活化被MEX处理有效抑制(图19A)。STAT3是多种细胞因子和生长因子之信号转导通路的必要转录因子，并且STAT3活化在呼吸道上皮炎性反应中发挥关键作用。更重要的是，已将持续离体STAT3活化与在PAEC以及来自具有特发性肺动脉高血压(IPAH)患者的肺动脉平滑肌细胞(Paulin，R.等，2011，Circulation123：1205-1215)中观察到的过度增殖和抗凋亡表型(Masri，F.A.等，2007，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol293：L548-554)相联系。因此，低氧STAT3活化的抑制可对MEX处理的多效性保护作用有贡献。
为了验证这种低氧信号转导抑制并非鼠来源MEX特有的性质，从人脐带基质分离MSC(hUC-MSC)(Mitchell，K.E.等.and Penolazzi，L.et al.)，并且如本文所述通过尺寸排阻色谱从hUC-MSC条件培养基制备外来体富集(hUC-MEX)和外来体耗竭(hUC-EXD-CM)级分。如图19B所示，hPAEC暴露于低氧导致STAT3通过Tyr-705磷酸化的强活化。使用hUC-MEX处理完全消除了这种反应，而微囊泡的耗竭级分并无影响。除证明STAT3活化的抑制是人和小鼠来源MEX二者的共有属性，这些结果强烈表明，在肺血管细胞中低氧信号转导的直接抑制是造成MEX处理赋予的保护的首要功能。
MEX处理在肺中抑制miR-17微小RNA超家族的低氧诱导并且增加抗增殖miR-204的水平。已报道STAT3(由VEGF或IL-6活化)在PAEC中直接调节微小RNA的miR-17至92簇(cluster)的转录，导致骨形态发生蛋白受体-2(BMPR2)的水平降低，骨形态发生蛋白受体-2是miR-17的靶标(Brock，M.等，2009，Circ Res104：1184-1191)。因此，我们研究了低氧和MEX处理对微小RNA的miR-17至92簇及其保守旁系同源(paralog)簇miR-106b至25和miR-106a至363的效果。这些微小RNA簇已经被假定促增殖，靶向参与G1/S期转换的基因阵列(Cloonan，N.等，2008，Genome Biol9：R127)以及被报道在胚胎肺形态发生中发挥重要作用(Carraro，G.，2009，Dev Biol333：238-250)。我们发现选择代表miR-17超家族的全部三个簇的微小RNA在肺中被低氧上调，并且这种转录活化被MEX处理有效的抑制(图20A)。有趣的是，参与低氧信号转导网络的微小RNA(例如miR-199a-5p，已报道的在心肌细胞中稳定HIFla的微小RNA(Rane，S.等，2009，Circ Res104：879-886)；miR-214，其与miR-199共享相同的宿主基因(Watanabe，T.等，2008，Dev Dyn237：3738-3748)，或miR-210，HIF1α直接调控下的低氧微小RNA(hypoxamir)(Chan，S.Y.等，2010，Cell Cycle9：1072-1083))的水平并没有受到MEX处理的影响(图20B)，表明了MEX对特定低氧调节信号转导通路的靶向影响。
重要的是，我们观察到MEX处理导致miR-204的肺水平增加(图20C)，miR-204为在远端肺动脉中富集的微小RNA，其被STAT3转录抑制但也在前馈调节回路中抑制STAT3的活化(Courboulin，A.等，2011，J Exp Med208：535-548)。从IPAH患者分离的PAMC的增殖和抗凋亡表型与miR-204水平负相关，并且向患PH动物的肺递送外源性miR-204改善已建立的疾病。因此，我们将这些结果解释为MEX处理的指示，通过在低氧暴露的早期阶段抑制STAT3的活化，预防促增殖的miR-17超家族在肺血管中的低氧诱导，并且在远端肺血管中阻滞STAT3-miR-204-STAT3前馈回路。这将肺血管中的平衡向趋向抗增殖的状态转变，并预防长期低氧下的血管重塑。图21是低氧信号转导通路的示意图，其被认为在由MEX调节的PH发生中有效。
综上所述，通过体积排阻色谱将MSC条件培养基分级以鉴定针对低氧引起的肺部炎症和HPH进行保护的生物活性组分。结果发现，MEX是MSC发挥功能的重要载体：MEX有效抑制巨噬细胞的低氧性肺流入并阻止促炎症和有丝分裂介体(如MCP-1，IL-6)以及低氧诱导的有丝分裂因子(HIMF；FIZZ1/RELM-a／RETNLA)在低氧的肺中上调。如通过转录信号转导和活化因子(STAT3)的抑制所证明的，低氧肺中被活化的促增殖通路也被MEX处理防止。这导致miR-204的肺水平增加，miR-204是在远端肺小动脉富集的微小RNA，其在人PH和疾病的实验模型二者中都下调(Courboulin，A.等)。也发现，低氧上调肺组织中微小RNA簇的miR-17家族成员，已证明微小RNA在STAT3的调节控制之下，并且MEX处理有效地抑制这种促增殖的信号。从人脐带来源MSC的培养基分离的MEX与小鼠MEX对低氧增殖信号转导通路具有相似的抑制效果。人MEX显著抑制在培养的hPAEC中STAT3的低氧活化。与此相反，外来体耗竭的MSC培养基在体内并无生理效应，在体外培养的细胞上也没有，这表明MEX是MSC旁分泌功能的关键效应因子。
表2.MSC来源的外来体的纯化
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等同变体
本发明并不限于在以下说明书给出或在附图中示例性说明的其申请的构造之细节和组件之安排。本发明能够有其他实施方案和以多种方式实施或进行。此外，本文所用的措辞和术语是用于描述的目的，不应该被认为是限制性的。“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和本文中其变化的使用是指涵盖其后列出的项目和其等同变体以及另外的项目。
如此描述了本发明的至少一个实施方案的几方面后，应理解多种改变、修改和改进对于本领域技术人员是容易想到的。这样的改变，修改和改进旨在成为本公开的一部分，并且旨在涵盖于在本发明的精神和范围之内。
因此，前面的说明书和附图仅是示例的方式。

Claims (45)

1.分离的人间充质干细胞(MSC)外来体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物被配制为递送至肺并且用于患有或有风险发生肺疾病之人对象，其包含有效量的分离的人间充质干细胞(MSC)外来体，其中所述对象小于4周龄，并且其中所述肺疾病是肺部高血压。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的人MSC外来体分离自人脐带。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述人对象在37孕周前出生。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述人对象已被施用氧气或者已与通气机连通。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述分离的人MSC外来体在出生1天内施用。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的人MSC外来体在出生1小时内施用。
7.分离的间充质干细胞(MSC)外来体在制备药物中的用途，所述药物用于在患有或有风险发生肺疾病的对象中治疗或预防肺疾病，其中所述肺疾病是肺部高血压。
8.权利要求7所述的用途，其中所述对象患有或可能发生血吸虫病。
9.权利要求7或8所述的用途，其中所述对象是新生儿。
10.权利要求7或8所述的用途，其中所述对象是婴儿。
11.权利要求7或8所述的用途，其中所述对象的年龄为3至18岁。
12.权利要求7或8所述的用途，其中所述对象是成体。
13.权利要求7至12中任一项所述的用途，其中所述对象是早产的。
14.权利要求7至13中任一项所述的用途，其中所述对象在35孕周前出生。
15.权利要求7至14中任一项所述的用途，其中所述对象在30孕周前出生。
16.权利要求7至15中任一项所述的用途，其中所述对象在26孕周前出生。
17.权利要求7至16中任一项所述的用途，其中所述药物与第二药剂一起使用。
18.权利要求17所述的用途，其中所述第二药剂是类固醇、抗氧化剂或吸入的一氧化氮。
19.权利要求18所述的用途，其中所述类固醇是皮质类固醇。
20.权利要求19所述的用途，其中所述皮质类固醇是甲基泼尼松龙。
21.权利要求18所述的用途，其中所述抗氧化剂是超氧化物歧化酶。
22.权利要求7至21中任一项所述的用途，其中所述药物在出生1小时内施用。
23.权利要求7至21中任一项所述的用途，其中所述药物在出生1个月内施用。
24.权利要求7至23中任一项所述的用途，其中所述药物通过静脉内施用。
25.权利要求7至23中任一项所述的用途，其中所述药物被施用至所述对象的肺或气管。
26.权利要求25所述的用途，其中所述药物通过吸入施用。
27.权利要求25所述的用途，其中所述药物在气溶胶中施用。
28.权利要求25所述的用途，其中所述药物使用喷雾器施用。
29.权利要求25所述的用途，其中所述药物使用气管内的管施用。
30.权利要求7至28中任一项所述的用途，其中所述药物与肺表面活性剂一起施用。
31.权利要求30所述的用途，其中所述肺表面活性剂是分离的天然表面活性剂。
32.权利要求30所述的用途，其中所述肺表面活性剂来源于牛肺或猪肺。
33.权利要求30所述的用途，其中所述肺表面活性剂是合成的表面活性剂。
34.权利要求7至33中任一项所述的用途，其中所述药物被重复施用至所述对象。
35.权利要求7至33中任一项所述的用途，其中所述药物被施用至所述对象两次。
36.权利要求7至33中任一项所述的用途，其中所述药物被连续地施用至所述对象。
37.前述权利要求7至36中任一项所述的用途，其中所述药物中的所述分离的MSC外来体来源于脐带血MSC。
38.权利要求7至36中任一项所述的用途，其中所述药物中的所述分离的MSC外来体来源于骨髓MSC。
39.权利要求7至38中任一项所述的方用途，其中所述药物中的所述分离的MSC外来体对于对象是自体的。
40.权利要求7至38中任一项所述的用途，其中所述药物中的所述分离的MSC外来体对于所述对象是同种异体的。
41.权利要求7至40中任一项所述的用途，其中所述对象未接受细胞或器官移植。
42.权利要求7至33中任一项所述的用途，其中所述药物经肠胃外施用。
43.权利要求42所述的用途，其中所述药物通过注射施用。
44.权利要求43所述的用途，其中所述药物通过团注施用。
45.权利要求43所述的用途，其中所述药物通过连续输注施用。
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