PT2578081E - Composições, métodos e dispositivos para o tratamento de doenças hepáticas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E DISPOSITIVOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS HEPÁTICAS"

Esta invenção foi realizada com apoio governamental através dos fundos Nos. R01 DK43371, K18 DK076819, e K08 DK66040 atribuídos pelo Instituto Nacional de Saúde. 0 governo apresenta certos direitos relativamente à invenção.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com composições e métodos para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com a degeneração hepática.

ANTECEDENTES TÉCNICOS DA INVENÇÃO A insuficiência hepática é a incapacidade do figado para realizar a sua normal função metabólica e de sintese como parte de uma fisiologia normal. A insuficiência hepática aguda pode ocorrer em tão pouco quanto 48 horas, e tipicamente coincide com a perda ou disfunção de 80-90% das células do figado. A insuficiência hepática é uma condição associada a risco de vida que exige um urgente cuidado médico. A insuficiência hepática aguda apresenta uma prevalência estimada de 2000 casos por ano e uma taxa de mortalidade de aproximadamente 80 por cento.

Em muitos casos, o transplante ortóptico de figado é o único tratamento eficaz para a insuficiência hepática aguda. 0 uso de tais transplantes, contudo, é limitado devido à escassez de dadores, elevado custo, e o requerimento de uma imunossupressão para o resto da vida. Assim, existe uma clara necessidade de tratamentos alternativos para o tratamento de insuficiência hepática.

SUMÁRIO A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na surpreendente descoberta que terapia baseada em células estaminais mesenquimatosas (MSC) fornece um auxilio a nivel trófico ao figado lesado. Assim, a administração de meio condicionado para MSC (CM-MSC) , ou o uso de dispositivos hepáticos bioartificiais (BAL) com MSCs, pode ser usado para tratar sujeitos com doença hepática. A presente invenção fornece um dispositivo de auxilio hepático extracorporal compreendendo uma população purificada de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs).

Adicionalmente aqui descritos estão métodos de preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de doença hepática. Nalguns exemplos, os métodos incluem o fornecimento de uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs), cultivando essas MSCs indiferenciadas num meio, p.ex., a cerca de 80% confluência, p.ex., usando desde cerca de 1 x 102 células/cm2 a 1 x 104 células/cm2, p.ex., por um periodo de tempo suficiente para uma quantidade desejada de fatores ativos serem produzidos, p.ex., 6, 12, 18, 24, 36, ou 48 horas, p.ex., 12-48 horas, 12-36 horas, 24-36 horas, p.ex., 24 horas, obtendo o meio (Meio condicionado para MSC (CM-MSC) ), dividindo o meio usando técnicas conhecidas de fracionamento, p.ex., através da aplicação de uma ou mais de (1) carga, (2) tamanho, e/ou (3) ligação a sulfato de heparina, selecionado uma fração do meio que é capaz de uma ou mais ações de promoção da proliferação de hepatócitos e/ou inibição da morte de hepatócitos, e opcionalmente, formulação da fração desejada para administração a um mamífero, p.ex., para administração sistémica, p.ex., por administração intravenosa. Preferencialmente, as MSCs são mantidas em cultura num estado indiferenciado. Em geral, o CM-MSC e as frações relacionadas serão considerados como estando desprovidas de células. Nalguns exemplos, a composição é concentrada em 25-vezes. Nalguns exemplos, a composição inclui um meio de cultura de tecidos desprovido de soro ou PBS. Os métodos podem incluir a liofilização da composição.

Também aqui descritas estão composições farmacêuticas incluindo CM-MSC ou uma fração ativa relacionada, p.ex., produzida por um método aqui descrito. A presente invenção compreende dispositivos de auxílio hepático extracorporais compreendendo uma população purificada de MSCs indiferenciadas. Nalgumas formas de realização, os dispositivos também incluem uma população de hepatócitos primários. Assim, a invenção fornece sistemas para o tratamento de sangue ou plasma provenientes de um mamífero. Os sistemas incluem um biorreator extracorporal (EB) incluindo um compartimento para o tratamento do fluído e um compartimento celular, e uma barreia seletivamente permeável separando o compartimento de tratamento de fluído e o compartimento celular, onde o compartimento células compreende uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs). Além das MSCs, o compartimento celular pode também incluir uma população de hepatócitos primários. A barreira seletivamente permeável pode ser, por exemplo, um conjunto de fibras ocas, ou uma membrana plana; barreiras adequadas são conhecidas no estado da técnica.

Em geral, o EB também inclui uma entrada de fluído biológico e uma saída de fluído biológico, onde a comunicação entre a entrada e saída de fluído biológico permitem a comunicação de fluído entre o compartimento de tratamento de fluído e a corrente sanguínea do mamífero.

Os sistemas irão preferencialmente também incluir uma ou uma variedade de bombas para a circulação do sangue ou plasma, p.ex., do sujeito através do compartimento de tratamento de fluído do EB e novamente para o sujeito.

Os sistemas podem também incluir um cartucho de ultrafiltração em comunicação do fluído com o sujeito e/ou com o compartimento de tratamento de fluído, de tal forma que o sangue do sujeito se encontra separado nos componentes ultrafiltrado/plasma e componentes celulares, e o UF/Plasma é circulado através do compartimento de tratamento do EB enquanto que os componentes celulares do sangue são devolvidos ao sujeito.

Os sistemas aqui descritos podem ser usados em métodos de tratamento de doença hepática num sujeito. Os métodos incluem a identificação do sujeito possuindo uma doença hepática; fornecer um sistema para o tratamento de sangue ou plasma de um mamífero que inclui um biorreator extracorporal (EB) incluindo um compartimento de tratamento de fluído e um compartimento celular, e uma barreira seletivamente permeável separando o compartimento de tratamento de fluído e o compartimento celular, onde o compartimento celular inclui uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs) (e opcionalmente uma população de hepatócitos primários); e expondo o plasma ou sangue do sujeito a MSCs no EB.

Os sistemas podem também ser usados em métodos para o tratamento de sangue ou plasma de um sujeito possuindo uma doença hepática. Os métodos incluem a identificação de um sujeito possuido uma doença hepática, fornecimento de um sistema como aqui descrito; remoção de sangue ou plasma do paciente; introdução do sangue ou plasma num compartimento de tratamento de fluido do EB; e passagem do fluxo do sangue ou plasma através do compartimento de tratamento de fluido, assim tratando o sangue ou plasma.

Aqui descritos estão métodos de tratamento de doença hepática num sujeito. Em alguns exemplos, estes métodos incluem identificação do sujeito com sua necessidade relacionada de tratamento, e administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica incluindo CM-MSC ou uma fração ativa relacionada, p.ex., produzida por um método aqui descrito. 0 sujeito pode ser identificado, por exemplo, através da avaliação do nivel de marcador sérico na função hepática. Os métodos pdoem incluir a seleção de um sujeito com base na presença de uma doença hepática, p.ex., como determinado através da avaliação de um nivel de marcador sérico de função hepática.

Um número de marcadores séricos da função hepática são conhecidos do estado da técnica, incluindo, mas não estando limitados a, lactato desidrogenase (LDH) , fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina sérica, albumina e/ou globulinas.

Em certos exemplos, o tratamento continua até que o nivel de um marcador sérico de função hepática no sujeito se encontre na gama normal como determinado pelo médico do sujeito, p.ex., por um período de tempo suficiente para melhorar um sintoma ou melhorar um parâmetro clínico da função hepática, p.ex., um período de tempo selecionado por um clínico ou profissional de saúde. Nalguns exemplos, a doença hepática a ser tratada é insuficiência hepática aguda. Nalguns exemplos, a insuficiência hepática aguda é insuficiência hepática fulminante. Nalguns exemplos, a doença hepática a ser tratada é fibrose hepática. Nalguns exemplos, a composição é administrada usando uma técnica intravenosa com bólus.

Adicionalmente agui descritos estão outros métodos para o tratamento de doença hepática num sujeito. Estes métodos incluem identificação de um sujeito com sua necessidade de tratamento, fornecendo um sistema incluindo um biorreator extracorporal (EB), incluindo uma população purificada de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs) , e expondo o plasma ou sangue do sujeito às MSCs no EB. Nalguns Exemplos, o tratamento pode continuar durante um período de tempo suficiente para melhorar um sintoma ou melhorar um parâmetro clínico da doença hepática, p.ex., um tempo selecionado por um médico ou um profissional de saúde. Nalguns exemplos, o sujeito é identificado através da avaliação do nível de um marcador sérico de função hepática, p.ex., lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina sérica, albumina, e/ou globulinas. Nalguns exemplos, o dispositivo de auxílio hepático pode também incluir uma população purificada de hepatócitos primários.

Também aqui descritos estão métodos para identificação de um componente biologicamente ativo para o tratamento de uma doença hepática, por (i) obtenção de uma amostra de um meio contendo fatores secretados de uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas purificadas (MSC), (ii) obtenção de uma fração do meio usando métodos de fracionamento conhecidos do estado da técnica, (iii), análise da capacidade da fração para promover a proliferação de hepatócitos ou a inibição da morte de hepatócitos, p.ex., in vitro ou in vivo, (iv) seleção de uma fração do meio que é capaz de promover a proliferação de hepatócitos ou inibir a morte de hepatócitos, (v) repetição opcional dos passos (i) a (iv), e (vi) identificação de uma ou mais moléculas presentes na fração selecionada. Nalguns exemplos, frações distintas são obtidas de acordo com um ou mais fatores de tamanho ou carga. Nalguns exemplos, a amostra do meio é uma fração de ligação a sulfato de heparina do meio. 0 termo "insuficiência hepática aguda" inclui, mas não está limitado a, condições referidas pelos termos insuficiência hepática hiperaguda, insuficiência hepática aguda, insuficiência hepática subaguda, e insuficiência hepática fulminante (FHF).

Por "tratar" entende-se a redução de um ou mais sintomas de doença hepática, p.ex., através da promoção de uma melhoria na função hepática como avaliado usando um ou mais marcadores séricos da função hepática (p.ex., lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina sérica, albumina e globulinas), e, assim, o melhoramento de pelo menos um sintoma, p.ex., um sintoma associado com perda de células parênquimatosas num órgão, por exemplo, no figado.

Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para produzir um resultado benéfico ou desejado. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que alcança o efeito terapêutico desejado, p.ex., o melhoramento de um sintoma ou o melhoramento de um parâmetro clinico de uma doença, p.ex., uma doença hepática. Esta quantidade pode ser a mesma ou diferentes de uma quantidade profilaticamente eficaz, que é a quantidade necessária para prevenir o surgimento da doença ou de sintomas da doença.

Uma "fração ativa" é uma fração que pode promover a proliferação de hepatócitos ou inibir a morte de hepatócitos, p.ex., numa cultura de hepatócitos primários.

Como aqui usados, os termos "paciente", "sujeito", e "indivíduo" são usados intercambiavelmente para se referirem a um mamifero, incluindo, sem limitação, humanos, animais de criação, animais de desporto, animais domésticos, primatas, cavalos, cães, gatos, ratos, e ratinhos. Nalguns exemplos o sujeito é um mamifero não-humano, p.ex., um animal experimental ou um sujeito veterinário.

Exceto quanto indicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados apresentam o mesmo significado que aquele comummente entendido por uma pessoa habilitada no estado da técnica a que esta invenção pertence. Métodos e materiais são aqui descritos para uso na presente invenção; outros, métodos e materiais adequados conhecidos no estado da técnica podem também ser usados. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. Em caso de conflito, a presente descrição, incluindo definição, sobrepor-se-ão.

Outras caracteristicas e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e figuras, assim como das reivindicações anexas.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1 é um gráfico de barras apresentando a incorporação de bromodesóxiuridina (5-bromo2-desóxiuridina, BrdU) de SCs ativas como uma função do rácio MSC:SC. A proliferação de SCs ativadas é inibida pela cocultura indireta com MSCs. Os dados representam o valor médio de duas experiências realizadas em triplicado. As barras de erro são o desvio padrão. *p<,05 comparativamente com SCs sozinhos (MSC:SC = 0). FIG. 2 é uma imagem de um gel de agarose RT-PCR representativo mostrando niveis de expressão de Mrna IL-10. GADPH serviu como um controlo interno para análise RT-PCR. FIG. 3 é um gráfico de barras representado os resultados de ELISA médios provenientes de duas experiências independentes, cada uma das quais foi realizada em triplicado. As barras de erro correspondem ao desvio padrão. **p<,01 comparativamente com MSCs não-estimuladas. FIG. 4 é um gráfico de barras mostrando a secreção de citocinas em monocultura e cocultura direta de SCs e MSCs (rácio 1:1) . As concentrações de IL-6 e TNF-a foram medidas por ELISA com anticorpos específicos para espécies após 2 dias de cultura. Os resultados correspondem à média de duas experiências realizadas em triplicado. As barras de erro correspondem ao desvio padrão. FIG. 5 é um gráfico de barras representando a medição por ELISA da secreção de IL-10 após 2 dias de monocultura ou cocultura direta 1:1 de MSCs e SCs. FIG. 6 é um gráfico de barras representando a secreção de IL-10 como uma função do número de MSC após 4 dias de cocultura indireta 1:1 com SCs ativadas, determinado por RT-PCR. Os resultados correspondem à média de duas experiências independentes realizadas em triplicado. As barras de erro correspondem ao desvio padrão. **p<,01 comparativamente com SCs sozinhos (MSC:SC = 0). FIG. 7 é um gráfico de barras representando a inibição da secreção de IL-10 por MSCs em cocultura direta (1:1) com SCs ativadas após tratamento com um anticorpo neutralizante anti-IL6. Os resultados correspondem à média de duas experiências independentes realizadas e triplicado. As barras de erro correspondem ao desvio padrão. **p<,01 comparativamente com a ausência de anticorpo. FIG. 8 é um gráfico de barras representando a secreção do Fator de Crescimento de Hepatócitos (HGF) após 2 dias de monocultura ou cocultura direta 1:1 de SCs e MSCs. Os resultados correspondem à média de duas experiências realizadas em triplicado. FIG. 9 é um modelo esquemático dos efeitos parácrinos de fatores derivados de MSCs em SCs ativadas. Fatores autócrinos sintetizados por SCs não são representados neste modelo. A libertação de IL-6 por SCs ativadas pode levar à secreção de IL-10 por MSCs. Niveis induzidos de IL-10, conjuntamente com TNF-α secretado constitutivamente, inibem a proliferação de SC e sintese de colagénio. O efeito marginal de IL-10 na proliferação de SC é denotado pelo tamanho de letra inferior. SCs sofrem apoptose após cocultura com MSCs devido aos niveis aumentados de HGF. FIG. 10 é uma análise de sobrevivência de Haplan-Meier de ratinhos Gal-N após tratamento com CM-MSC. * p = 0,017 (Log Rank). CM-MSC, meio condicionado para células estaminais mesenquimatosas; FHF, insuficiência hepática fulminante; Gal-N, D-galactosamina. FIGs. 11A-11F são gráficos de barras representando os niveis sistémicos de (11A) IL-Ιβ; (11B) TNF-α; (11C) IL - 6; (11D) IL-2; (HE) IL-lra; e (11F) IL-10 após exposição a Gal-N. Os dados representados correspondem à média ± desvio padrão de experiências realizadas em triplicado. * p<0,05, ** p<0,001. FIG. 12A é um gráfico de barras representando avaliações determinadas por exames histológicos semiquantitativos como descritos no Exemplo 6. Os dados representados são a média ± erro padrão da média de 10 áreas de alta incidência avaliadas ao acaso no animal. Barra sólida = 100 ym. * p = 0,024, ** p = 0, 004 . FIG. 12B é um gráfico de barras representando a quantificação de células imunes infiltrantes por análise digital de imagem. Os dados representados correspondem à média ± desvio padrão da média de 10 áreas de alta incidência avaliadas ao acaso no animal. Barra sólida = 100 ym. * p = 0,024, ** p = 0,004. FIG. 13 é um gráfico de barras representando os resultados da quantificação de núcleos TUNEL-positivos usando análise digital de imagens. Os dados são reportados como média ± erro padrão da média para 10 áreas de alta incidência avaliadas ao acaso no animal. * p = 0,009. FIG. 14 é um gráfico de barras representando a apoptose em hepatócitos primários murinos usando cultura in vitro. Os dados estão representados como a média ± desvio padrão. * p = 0,005. FIG. 15 é um gráfico de barras representando núcleos PCNA-reativos que foram quantificados por análise digital de imagens. Os dados são reportados como a média ± erro padrão da média para 10 áreas avaliadas ao acaso no animal. * p = 0,04. FIG. 16 é um gráfico de barras representando os resultados da quantificação de mudanças na expressão genética por PCR em tempo real (RT-PCR) após tratamento com CM-MSC. Abreviatura são: oncostatina M (OSM); recetor adrenérgico α-1β (AR); fator de crescimento transformante-α (TGF-a); fator de crescimento de hepatócitos (HGF); fator de necrose tumoral-a (TNF-a); fator de crescimento epidérmico (EGF); interleucina 6 (IL-6); fator associado a células estaminais (SCF); fator de crescimento semelhante ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF); e metaloproteinase 3 tecidular (TIMP3). FIG 17A é um gráfico de barras representando a quantificação de hepatócitos BrdU-positivos por análise digital de imagens. Os dados representados correspondem à média ± desvio padrão de duas experiências independentes em duplicado. * p<0,05, ** p<0,01; ns = não significante. FIG. 17B é um gráfico de barras representando a secreção de albumina. Os dados representados correspondem à média ± desvio padrão de duas experiências independentes em duplicado. * p<0,05, ** p<0,01; ns = não significante. FIG. 17C é um gráfico de barras representando a sintese de ureia. Os dados são representados como a média ± desvio padrão de duas experiências independentes em duplicado. * p<0,05, ** p<0,01; ns = não significante. FIG. 18 é um gráfico de linhas representando os resultados da análise de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratos administrados com Gal-N e tratados com transplantes ou lisados celulares. Os pontos temporais das intervenções estão acima denotados nos gráficos de sobrevivências. Os resultados correspondem a dados cumulativos de duas experiências independentes ((N = 8 para cada grupo) usando diferentes grupos de MSCs. Valor-P determinado pelo Teste Log Rank. FIG. 19A é um gráfico de linhas representando a análise de sobrevivência Kaplan-Meier de ratos administrados com Gal-N e tratados com CM-MSC concentrado. FIG. 19B é um gráfico de barras representando a resposta face à dosagem da sobrevivência animal 72 horas após indução de insuficiência hepática como função da massa de MSC da qual CM-MSC foi derivado. Os controlos recebendo veiculo ou meio condicionado para fibroblastos (CM-fibroblastos). Os pontos temporais das intervenções estão acima representados nos gráficos de sobrevivência. Os resultados para ambos os painéis correspondem a dados cumulativos de duas experiências independentes usando diferentes grupos de CM-MSC (N = 8 para cada grupo) . Valor-P determinado pelo Teste Log Rank. FIG. 20 é uma representação esquemática de um circuito extracorporal exemplificativo. Brevemente, os circuitos foram iniciados com plasma de rato Sprague-Dawley esterilizado e heparinizado, que foi filtrado imediatamente antes de uso. O rato foi administrado sistemicamente com 100 U heparina (0,1 ml) através da linha venosa 5 minutos antes do inicio da perfusão. As linhas arterial e venosa foram subsequentemente ligadas ao circuito extracorporal. O sangue arterial foi bombeado a 0,55-0,85 ml/minuto através de tubagem de silicone #13 MASTERFLEX (Cole-Palmer Instrument Co.) por uma bomba peristáltica digital de velocidade variável (Cole-Palmer Instrument Co.). Um separador de plasma (MICROKROS, material da membrana: ésteres misturados de celulose, tamanho do poro da membrana: 0,2 um, área de superfície da membrana: 16 cm2; Spectrum Laboratories Inc., Laguna Hills, CA) foi colocado imediatamente depois da bomba. O plasma separado foi bombeado através de BAL por meios de uma segunda e uma terceira bomba peristática a uma velocidade de fluxo de 0,1 ml/minuto. O plasma separado e os componentes sanguíneos remanescentes foram reunidos antes de entrarem num borbulhador. O sangue reconstituído é devolvido ao animal através da cânula venosa. Durante a perfusão, a heparina (41,5 U/mL) com 5% de solução de dextrose foi administrada continuamente através da linha venosa a uma velocidade de 0,2 ml/hora via uma bomba de infusão via seringa. Nesta configuração. O volume morte do sistema de perfusão inteiro foi de 12 ml, dos quais, 6 ml foram contabilizados para o BAL. O fluxo de gás de oxigenação (21% 02, 5% CO2, 74% N2) foi estabelecido através da câmara acima da membrana interna do BAL. FIGs. 21A-21B são gráficos de barras apresentando dados recolhidos de estudos com biorreatores extracorporais (EB). Os animais foram tratados com EB-MSC, usando um biorreator adaptado a fibroblastos-3T3 (EB-fibroblastos) e um biorrector acelular (EB-celular) como controlo. Biomarcadores séricos de lesão hepática, aspartato aminotransferase (AST, 21A) e alanina aminotransferase (ALT, 21B) antes e 24 horas após tratamento com um EB-MSC (n = 5) ou um EB- acelular (n = 3). Devido à mortalidade, n = 1 no grupo acelular após tratamento. Valor-P determinado por análise do Teste T de Student. FIG. 21C é um gráfico de linhas representando os resultados da análise de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratos administrados com Gal-N e tratados com EBs. Pontos temporais das intervenções estão denotados acima dos gráficos de sobrevivência. Cada resultado apresentado foi proveniente de uma experiência independente proveniente de diferentes grupos de MSCs. Valor-P determinado pelo Teste Log Rank. FIG 22A é uma ilustração esquemática do design experimental de um estudo de transferência adotiva. Ratos lesados com Gal-N foram tratados com um veiculo ou com CM-MSC seguido por infusão de leucócitos marcados com In111. FIG. 22B é um gráfico de barras ilustrando a contagem de leucócitos e diferenças. 0 sangue total foi recolhido após canulação e analisada quanto às células de sangue periférico usando um citómetro de fluxo comercialmente disponível (glóbulos brancos (WBC); neutrófilos (NE); linfócitos (LY); monócitos (MO) ; basófilos (BA); eosinófilos (EO). FIG. 22C é um gráfico de barras representando a distribuição in vivo de leucócitos radiomarcados após tratamento sub-letal com Gal-N. FIG. 23A-C mostra que CM-MSC é composto por elevados niveis de quimiocinas que se correlacionam com um beneficio em termos de sobrevivência visivel em FHF. CM-MSC desprovido de soro foi analisado usando um array de anticorpos para 174 proteínas especificas. FIG. 23A é um gráfico de barras mostrando os resultados da análise de densiometria no array de anticorpos marcados. Os dados são apresentados como a intensidade de marcação relativamente ao controlo negativo e normalizados ao controlo positivo. FIG. 23B é um gráfico circular mostrando a análise de grupos de proteínas secretadas por MSCw baseadas na sua função reportada. CM-MSC foi fracionado ao longo de uma coluna heparina-agarose numa fração ligada a heparina e noutra fração não-ligada a heparina. FIG. 23C é um gráfico de linhas representando os resultados da análise de sobrevivência Kaplan-Meier de ratos administrados com Gal-N e tratados com (+) heparina CM-MSC e (-) heparina CM-MSC. Pontos temporais de intervenção são denotados acima dos gráficos de sobrevivência. Resultados para (C) são dados cumulativos de duas experiências independentes usando diferentes grupos de CM-MSC (N = 8 por cada grupo). Valor-P determinado pelo Teste Log Rank. FIG. 24 é um gráfico de barras da síntese de ureia em hepatócitos cultivados com fibroblastos NIH-3T3-J2 com crescimento limitado e suplementados durante 14 dias com 5 ng/ml de SDF-la ou AMD3100, um antagonista CXCR4. Os dados representam média ± desvio padrão da média (S.E.M) de duas experiências independentes realizadas em triplicado. FIGs. 25 e 26 são ilustrações esquemáticas de exemplos de sistemas hepáticos bioartificiais. FIG 27 é uma ilustração esquemática de um biorreator de fibras ocas. FIG. 28 é uma ilustração esquemática de uma secção transversal na linha A-A através do biorreator de fibras ocas representado na Fig. 27. FIG. 29 é uma ilustração esquemática de um biorreator de prato plano ou de dois compartimentos.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na surpreendente descoberta que células estaminais mesenquimatosass (MSCs), e agentes secretados por estas, fornecem um auxílio a nível trófico ao fígado lesado. Sem pretender ficar ligado a esta teoria, acredita-se que este efeito terapêutico é um resultado da inibição da morte hepatocelular e a estimulação da regeneração hepatocelular. Assim, métodos de tratamento que incluem administração parentérica de um meio condicionado para MSC desprovido de células na sua composição, ou o uso de dispositivos hepáticos artificiais incluindo MSCs, podem ser usados para tratar sujeitos com doença hepática, como aqui descrito.

Pelo menos em parte, os dados aqui apresentados demonstram que MSCs, e agentes por elas secretados, são capazes de modelar a função de células de Ito ativadas via mecanismos parácrinos, tratando uma condição inflamatória, e fornecendo um auxilio trófico ao figado lesado por inibição da morte hepatocelular e estimulação da regeneração hepatocelular. Concordantemente, a terapia baseada em MSCs, como aqui descrita, é útil no tratamento de qualquer condição aguda e/ou crónica, incluindo condições autoimunes e inflamatórias, nas quais a inibição de morte celular e estimulação da reparação tecidular seriam benéficas. Tais condições incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, doença hepática (p.ex., fibrose, cirrose, insuficiência hepática aguda, insuficiência hepática fulminante (FHF), e qualquer outra doença hepática degenerativa), lesão isquémica (p.ex., enfarte agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral), insuficiência renal, pancreatite aguda, e doenças autoimunes. Terapia baseada em MSC pode também ser benéfica em qualquer condição ou distúrbio em que a ação de moléculas secretadas troficamente são benéficas.

Terapia de MSCs

Como aqui descritas, MSCs e agentes por estas secretados, p.ex., numa composição de um meio condicionado para MSCs, podem ser usados para tratar doenças hepáticas ou distúrbios envolvendo a perda ou dano de células hepáticas parênquimatosas num sujeito. Em geral, a etiologia dessas doenças ou distúrbios podem derivar de uma resposta inflamatória local ou sistémica. Contudo, outras doenças hepáticas ou distúrbios associados com a perda ou dano de células hepáticas parênquimatosas estão também incluídas.

Como aqui descrito, MSCs e agentes por estas secretados, p.ex., numa composição de um meio condicionado para MSCs, são particularmente úteis no tratamento de insuficiência hepática aguda num sujeito, por exemplo, FHF. Nalguns exemplos, um sujeito será selecionado para tratamento usando as composições e métodos aqui descritos baseados num diagnóstico positivo para doença hepática. A doença hepática pode ser diagnosticada usando métodos conhecidos do estado da técnica, por exemplo, usando um ou mais ensaios de função hepática aqui descritos, ou baseados num julgamento de um profissional de saúde.

Nalguns exemplos, o tratamento é realizado usando administração de uma composição de um meio condicionado para MSC, ou uma fração ativa relacionada. Nalgumas formas de realização, o tratamento é realizado usando um biorreator extracorporal adaptado para MSC (EB-MSC)

Isolamento de MSC Células estaminais mesenquimatosas (MSCs) são também referidas no estado da técnica como células estaminais da medula óssea, células estaminais do tecido adiposo, células estaminais do cordão umbilical, e células tronco embrionárias derivadas da placenta. MSCs podem ser isoladas usando métodos conhecidos do estado da técnica, p.ex., de células mononucleadas da medula óssea, sangue do cordão umbilical, tecido adiposo, tecido da placenta, com base na sua aderência ao material plástico de cultura de tecidos. Por exemplos, MSCs podem ser isoladas de aspirados da medula óssea disponíveis comercialmente (ver Exemplo 1). Purificação de MSCs pode ser obtida usando métodos conhecidos do estado da técnica, p.ex., os métodos aqui descritos, incluindo mas não estando limitados a FACS.

Nalguns exemplos, uma preparação de MSC irá incluir uma solução. Esta solução pdoe conter estes componentes requeridos para auxiliar a sobrevivência e crescimento de MSC. Tais componentes estão rotineiramente presentes em meios de cultura de tecidos disponíveis comercialmente, por exemplo, meio de Dulbecco modificado pro Eagle (DMEM). Tais componentes incluem, por exemplo, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono (natural e não-natural), sais, açúcares, hidrolisados derivados de plantas, piruvato de sódio, surfatantes, amónia, lipidos, hormonas ou fatores de crescimento, agentes tamponizantes, aminoácidos não-naturais, precursores de açúcares, indicadores, nucleósidos e/ou nucleótidos, butirato ou compostos orgânicos, DMSO, produtos derivados de animais, indutores genéticos, açúcares não-naturais, reguladores do pH intracelular, betaina ou osmoprotetores, oligoelementos, minerais, vitaminas não-naturais. Componentes adicionais que podem ser usados para suplementar um meio de cultura de tecidos disponível comercialmente incluem, por exemplo, soro animal (p.ex., soro fetal bovino (FBS), soro fetal de bezerro (FCS), soro de cavalo (HS)), antibióticos (p.ex., incluindo mas não estando limitados a penicilina, estreptomicina, sulfato de neomicina, anfotericina B, blasticidina, cloranfenicol, amoxicilina, bacitracina, bleomicina, cefalosporina, clortetraciclina, zeocina, e puromicina), e glutamina (p.ex., L-glutamina). 0 crescimento e sobrevivência de MSC também depende da manutenção do ambiente aeróbico apropriado, pH, e temperatura. Nalgumas formas de realização, a solução não irá incluir soro animal, p.ex., quando as MSCs são colocadas num dispositivo hepático bioartificial.

Nalgumas formas de realização, uma preparação de MSCs será essencialmente desprovida de células ou material celular não-MSC. Nalgumas formas de realização, uma preparação de MSCs irá conter pelo menos 80% de MSCs identificadas pelos critérios aqui descritos, p.ex., pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% MSCs. Nalgumas formas de realização, as células numa preparação de MSCs irão ser 100% MSCs. Uma população de célilas que é pelo 80% MSCs pode ser referida como uma população "purificada" de MSCs. Em geral, os métodos, composições, e dispositivos aqui descritos irão usar populações purificadas de MSCs.

Como um exemplo, MSCs podem ser cultivadas usando meio de Dulbecco modificado por Eagle suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml estreptomicina, 0,1 mM aminoácidos não-essenciais e 1 ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos alcalino (Life Technologies, Rockville, MD). Após 4 dias de cultura, células hematopoiéticas não-aderentes podem ser removidas através de lavagem com PBS. Monocamadas de MSCs aderentes e depois cultivadas com mudanças de meio de 2-3 vezes por semana. As MSCs podem ser passadas usando 0,25 % tripsina/0,1 % EDTA. MSCs podem ser rotineiramente subcultivadas a uma densidade de 5xl03 células/cm2. As MSCs podem ser mantidas usando métodos conhecidos do estado da técnica (ver, p.ex., Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).

Nalgumas formas de realização, MSCs podem ser usadas de acordo com os métodos aqui descritos durantes as passagens 1-7, p.ex., durante as passagens 4-7, onde a passagem um é a primeira passagem após isolamento. No geral, MSCs em cultura não deverão ser permitidas exceder uma densidade celular superior a 80% de confluência. A confluência pode ser determinada visualmente, por exemplo, usando um microscópio ótico convencional. Alternativamente, a confluência celular pode ser determinada através da realização de contagens de células usando, por exemplo, um hemocitómetro convencional. Nalgumas formas de realização, 80% confluência corresponde a cerca de lxlO6 MSCs por frasco de cultura de 175 cm2. Nalgumas formas de realização, 80% confluência corresponde a cerca de 5xl03 células/cm2.

No geral, será desejável manter as MSCs num estado indiferenciado. O estado de diferenciação de MSCs pode ser avaliado usando métodos conhecidos do estado da técnica, p.ex., os métodos de caracterização de MSCs aqui descritos.

Caracterização de MSC

Uma preparação de MSCs (i.e., numa preparação de MSCs indiferenciadas) pode ser caracterizada antes do seu uso terapêutico para confirmar a identidade, pureza, e estado de diferenciação das células. MSCs apresentam uma morfologia fibroblastóide única e facilmente identificável e expressam um conjunto único de antigénios que reagem com os anticorpos monoclonais SH2 (CD105) e SH3 (CD73). MSCs também possuem uma capacidade única de reprodutivamente darem origem a adipócitos, osteoblastos e condrócitos in vitro (Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).

Como aqui descrita, uma preparação de MSCs (p.ex., numa preparação de MSCs indiferenciadas) pode ser caracterizada através da realização de um ou mais dos seguintes testes, que podem ser realizados in vivo ou in vitro (ver Exemplo 2) : (1) Avaliação da capacidade de uma MSC ou uma preparação de MSCs para se diferenciarem em adipócitos, osteoblastos, e condrócitos. MSCs indiferenciadas podem dar origem a todos esses tipos de células. (2) Deteção da presença ou ausência de um ou mais dos seguintes marcadores de superfície celular: CD29, CD4 4, CD7 3, CD90, CD105, CD106, CDllb, CD14, CD18, CD34, CD36, e CD45 numa MSC isolada ou numa preparação de MSCs, p.ex., usando um array. MSCs indiferenciadas expressam CD105, CD106, e CD44 e não expressam CD14, CD34, e CD45.

No geral, identificação positiva de uma preparação de MSCs (p.ex., numa preparação de MSCs indiferenciadas) requer pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% e acima, 100% de células na preparação que são positivas no teste para a expressão na superfície celular de CD105, CD106, e CD44 e negativas no teste para a expressão na superfície celular de CD14, CD34, e CD45 (i.e., CD105+; CD106+; CD4 4 + ; CD14-; CD34-; CD44-) .

Nalguns exemplos, identificação positiva numa preparação de MSCs indiferenciadas requer a realização de apenas um dos dois testes acima descritos. Contudo, ambos os testes podem ser realizados.

Nalguns exemplos, testes adicionais podem ser realizados, p.ex., antes do uso terapêutico de uma preparação de MSCs para confirmar a ausência de contaminantes incluindo, por exemplo, bactérias, virus, fungos, proteínas infeciosas, e moléculas imunológicas indesejadas. Tais testes são conhecidos do estado da técnica.

Meio Condicionado para MSCs (CM-MSC)

Uma composição CM-MSC pode ser preparada usando uma população de MSCs indiferenciadas entre as passagens 4-7, onde a passagem um é a primeira passagem após isolamento. Como aqui descrito, uma composição CM-MSC pode ser preparada usando cerca de 1 x 105 a 1 x 107 células, p.ex., cerca de 1 x 105 a 1 x 106 células, 1 x 106 a 1 x 107 células, 1 x 106 a 9 x 106 células, 1 x 106 a 8 x 106 células, 1 x 106 a 7 x 106 células, 1 x 106 a 6 x 106 células, 1 x 106 a 5 x 106 células, 1 x 106 a 4 x 106 células, 1 x 106 a 3 x 106 células, e 1 x 106 a 2 x 106 células. Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC pode ser preparada usando 2 x 106 células.

Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC é preparada usando cerca de 1 x 102 células/cm2 a 1 x 104 células/cm2, p.ex., cerca de 1 x 102 células/cm2 a 1 x 103 células/cm2, 1 x 103 células/cm a 1 x 10 células/cm ,1x10 células/cm a 9 x 103 células/cm2, 1 x 103 células/cm2 a 8 x 103 células/cm2, 1 x 103 células/cm2 a 7 x 103 células/cm2, 1 x 103 células/cm2 a 6 x 103 células/cm2, 1 x 103 células/cm2 a 5 x 103 células/cm2, 1 x 103 células/cm2 a 4 x 103 células/cm2, 1 x 103 células/cm2 a 3 x 103 células/cm2, e 1 x 103 células/cm2 a 2 x 103 células/cm2. Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC pode ser preparada usando cerca de 5 x 103 células/cm2. Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC pode ser preparada usando duas populações de 1 x 106 MSCs por 175 cm2, i.e., uma composição CM-MSC pode ser preparada usando 2 x 106 células.

Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC é preparada como se segue (ver também Exemplo 4): (1) Lavagem exaustiva de MSCs 70-80% confluentes solução-tampão fosfato salina (PBS); (2) Cultura de MSCs provenientes de (1) durante cerca de 12, 24, 36, ou 48 horas, p.ex., 24 horas num volume apropriado de meio de cultura desprovido de soro contendo DMEM, ou um equivalente relacionado, suplementado com 0,05% de albumina do soro bovino (BSA) (de notar que o volume do meio irá depender do tamanho do vaso de cultura de células) num vaso adequado, p.ex., num T175 cm2, com cada vaso/frasco a 80% confluência, equivalente a cerca de 5 x 103 células/cm2; e (3) Colheita do meio de cultura de MSC proveniente de (2). A composição CM-MSC recolhida pode ser concentrada, p.ex., usando métodos conhecidos do estado da técnica, por exemplo, unidades de ultrafiltração com um cutoff de 3 kD (AMICON Ultra-PL 3, Millipore, Bedford, MA, USA). Por exemplo, a composição CM-MSC pode ser concentrada pelo menos 2-vezes a 10-fold, 10-vezes a 20-fold, 20-vezes a 30-fold, 30-vezes a 49-vezes, e mais. Como um exemplo, uma composição CM-MSC é concentrada 25-vezes.

Nalguns exemplos, a composição CM-MSC compreende meio de cultura contendo DMEM suplementado com 0,05% albumina de soro bovino (BSA). Nalguns exemplos, a composição CM-MSC não contém qualquer soro animal. Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC compreende PBS. Alternativamente, uma composição CM-MSC é fornecida numa forma liofilizada.

Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC pode ser fracionada por tamanho ou por carga. Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC pode ser fracionada numa fração ligada a heparina e noutra fração não-ligada a heparina. Por exemplos, em experiência de fracionamento de sulfato de heparina, uma composição CM-MSC concentrada pode ser passada através de uma coluna com heparina, ou outras colunas (p.ex., uma coluna de troca iónica, de tamanho, de fase reversa ou outros métodos de separação cromatográfica de acordo com as instruções do fabricante). As frações retida e eluída podem ser recolhidas separadamente. As frações eluídas (i.e., a fração ligada a heparina), pode ser então recolhida e opcionalmente concentrada, como acima descrito.

Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 100% desprovida de material não-ligado a heparina. Métodos de tratamento

Os métodos aqui descritos podem ser usados para o tratamento de doença hepática num sujeito. Nalguns exemplos, a etiologia da doença hepática pode ser o resultado de uma resposta inflamatória local ou sistémica. Os métodos aqui descritos são de uso particular para o tratamento de FHF num sujeito. Os métodos incluem o tratamento de um sujeito diagnosticado com FHF, ou suspeito de possuir FHF, por exemplo, um sujeito que apresente a um médico os sintomas que são típicos de FHF. Nalguns exemplos, os métodos e composições aqui descritas são de uso no tratamento de fibrose hepática.

Genericamente, os métodos aqui descritos incluem (1) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição CM-MSC (ou fração ativa relacionada) a um sujeito que está em necessidade de, ou que foi determinado como estando em necessidade do referido tratamento; e/ou (2) tratamento de um sujeito identificado como estando em necessidade de, ou que foi determinado como estando em necessidade do referido tratamento com um dispositivo de auxílio hepático extracorporal ou um dispositivo de auxilio hepático contendo MSCs (p.ex., um biorreator extracorporal (EB) contendo MSCs (EB-MSCs).

Terapia CM-MSC

Os métodos aqui descritos podem incluir administração parentérica de uma composição incluindo um ou mars de (A) uma fração purificada de uma composição CM-MSC; (B) uma ou mais frações purificadas de uma composição CM-MSC; (C) frações de uma composição CM-MSC de pesos moleculares particulares, por exemplo, 1-3 kDa, 3-6 kDa, 6-50 kDa, e 50kDa e acima, incluindo combinações dessas frações; (D) uma Composição CM-MSC não-fracionada; e (E) qualquer combinação de A-D. Cada um destes elementos s°ao referidos individualmente e coletivamente como a "composição" ou a "Composição CM-MSC". Frações biologicamente ativas podem ser identificadas in vitro através da exposição de hepatócitos a estímulos apoptóticos, tais como actinomiosina D e TNF-I. O nivel de apoptose pode então ser determinado usando, por exemplo, um ensaio TUNEL de acordo com as instruções do fabricante. Frações biologicamente ativas irão inibir a apoptose por uma quantidade estatisticamente significativa neste sistema, p.ex., por 25%, 30%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais. Estas observações in vitro podem ser complementadas usando ensaios in vivo num modelo animal de insuficiência hepática aguda.

Nalguns exemplos, uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição CM-MSC é administrada a um sujeito usando injeção sistémica intravenosa de bólus. A administração do bólus (também referida como infusão do bólus) inclui administração de uma dose de fármaco ao longo de um curto periodo de tempo, p.ex., por injeção num vaso sanguíneo.

Nalguns exemplos, uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição CM-MSC é administrada a um sujeito usando um sistema de gotejamento intravenoso. Outros modos de administração podem incluir qualquer número de vias de administração diferentes incluindo, mas não estando limitados a injeção intravenosa, intradérmica, subcutânea, e percutânea. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição CM-MSC pode ser dada ao sujeito em uma ou mais administrações, aplicações, ou dosagens. As composições podem ser administradas por uma ou mais vezes por dia ou uma ou mais vezes por semana; incluindo uma vez em alguns dias. Uma pessoa habilitada no estado da técnica entenderá que certos fatores podem influenciar a dosagem e tempo requeridos para efetivamente tratar um sujeito, incluindo, mas não estando limitado à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos prévios, o estado geral de saúde e/ou idade do sujeito, e outras doenças presentes. Adicionalmente, o tratamento de um sujeito com uma quantidade terapeuticamente eficaz de composições aqui descritas pode incluir um tratamento único ou uma série de tratamentos.

Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC é administrada a um sujeito como uma dose diária única ou como múltiplas doses diárias, por exemplo, 1, 2, ou 3 doses diárias. As doses podem ser administradas tendo ou não atenção à ingestão de alimentos.

Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC é administrada a um sujeito por um periodo de 1 a 7 dias. Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC é administrada ao sujeito por um periodo de pelo menos 1 semana a 1 mês, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, ou 4 semanas. Num exemplo alternativo adicional, uma composição MS-CMC é administrada a um sujeito por um período de pelo menos 1 mês a 1 ano ou superior. Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC é administrada até que o efeito terapêutico desejado (p.ex., recuperação funcional do fígado, p.ex., até níveis normais ou próximos dos normais, ou níveis gerenciáveis por outros meios terapêuticos) tenha sido atingida, como decidido pelo sujeito ou pelo profissional de saúde responsável pelo sujeito. Nalguns exemplos, a função hepática pode ser avaliada usando testes conhecidos de função hepática, por exemplo a lactato desidrogenase (LDH) sérica, fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina, níveis proteicos, tempo de protrombina, tempo de coagulação ativado (ACT), tempo de tromboplastina parcial (PTT) , e tempo de consumo de protrombina (PCT) (adicionalmente discutido abaixo).

Dosagem, toxicidade, e eficácia terapêutica da composição podem ser determinadas, p.ex., por procedimentos farmacêuticos estandardizados em culturas de células ou animais experimentais, p.ex., através da determinação de LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz para 50% da população). O rácio de dosagem entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêuticos e pode ser expresso como o rácio LD50/ED50. Compostos que exibem elevados índices terapêuticos são geralmente preferidos. Enquanto que compostos que exibem efeitos secundários tóxicos podem ser usados, cuidado deve ser tudo para desenvolver um sistema de entrega que direcione estes compostos para o local do tecido afetado de forma a minimizar o potencial dano em células não-infetadas e, assim, reduzir os efeitos secundários.

Nalguns exemplos, uma composição CM-MSC pode ser validada e/ou a eficácia terapêutica de uma composição CM-MSC, p.ex., ou um dado lote de uma composição CM-MSC, pode ser determinada usando um modelo experimental (p.ex., um modelo animal ou um modelo in vitro), p.ex., como aqui descrito.

Terapia e Dispositivos EB-MSC

Os métodos aqui descritos podem incluir o uso de dispositivos de auxilio hepático extracorporais com MSCs para tratar sujeitos com doença hepática. Tais dispositivos encontram-me no âmbito da presente invenção.

Dispositivos de auxilio hepático extracorporais são análogos aos dispositivos usados para realizar diálise hepática. Os dispositivos aqui descritos são dispositivos hepáticos bioartificiais (BAL) que incluem biorreatores extracorporais (EB), que são cartuchos ou vasos possuindo pelo menos uma entrada de perfusão e uma saida de perfusão, e u um compartimento celular, p.ex., uma matriz, dentro do vaso que fornece um ambiente adequado para as células vivas enquanto permitindo a perfusão do compartimento celular com meio adequado para a manutenção das células. Tais compartimentos celulares podem ser, p.ex., fibras ocas, com circulação de sangue ou plasma no exterior das fibras, ou pratos planos, ver, p.ex., Pat. U.S. No. 6,759,245.

Genericamente, sistemas compreendendo EBs também separam continuamente plasma de componentes celulares do sangue usando um gerador de ultrafiltração. 0 ultrafiltrado (p.ex., plasma) é circulado através do cartucho contendo as células cultivadas, i.e., um EB. Alternativamente, o sangue total pode ser tratado no EB.

Como acima notado, os cartuchos EB contêm uma barreira semipermeável composta de material que permite a passagem de macromoléculas e outros produtores celular de e para o plasma do sujeito. Contudo, as células por si só não deixam o EB. Após circulação e ou ou múltiplos passos através do biorreator, o ultrafiltrado tratado (p.ex., plasma) é recombinado com os componentes celulares do sangue do sujeito e devolvido ao sujeito via acesso venoso. Genericamente, o sangue ou plasma do sujeito é suplementado com heparina para prevenir a coagulação. Esta circulação é mantida continuamente durante, p.ex., um período de terapia auxiliar de 10 anos. Em sistemas BAL atuais, o sangue ou plasma contém toxinas do paciente para o biorreator contendo hepatócitos. Ver, p.ex., Yarmush et al., Cell Transplant, 1:323 (1992), and Arkadopoulos et al., Int'l J. Artif. Organs, 21:781 (1998).

Os presentes dispositivos incluem a) um biorrecator compreendendo um compartimento de tratamento de fluído, e opcionalmente uma barreira seletivamente permeável separando o compartimento de tratamento de fluído e o compartimento celular; e b) um reservatório celular em comunicação de fluído com o compartimento celular do biorreator, onde o reservatório celular compreende uma população de células estaminais mesenguimatosas indiferenciadas (MSCs). O sangue ou ultrafiltrado do sujeito é passado no compartimento de tratamento de fluídos onde agentes secretados por MSCs passam no sangue ou ultrafiltrado, ou por passagem dos agentes através da membrana seletivamente permeável, quando esta está presente. Nos presentes dispositivos, MSCs num EB são usadas num estado indiferenciado, como avaliado usando técnicas aqui descritas.

Dispositivos de auxílio hepático extracorporais incluindo biorreatores são também comummente referidos como dispositivos hepáticos bioartificiais (BAL) ou dispositivos de auxílio hepático bioartificiais (BLADs). Um número de tais dispositivos são conhecidos do estado da técnica e podem ser adaptados para uso com MSCs. Dispositivos de auxílio hepático extracorporais exemplificativos e comercialmente disponíveis que podem ser usados como aqui descritos, incluem, mas não estão limitados a, sistema ELAD® atualmente comercializado pela empresa Vital Therapies, Incorporated (representado na Fig. 1 da Pat. U.S. App. Pub. No. 2005/0182349), Circe's HEPATASSIST®, Gerlach's BELS, and Excorp Medical's BLSS. Outros dispositivos exemplificativos adicionais são descritos em Pat. U.S. Nos. 6,472,200, 5,605,835; 7,160,719; 7,273,465; 6,858,146; 6,582,955; 5,270,192; 6,759,245; e Pat. U.S. App. Pub. Nos. 2003-0017142. FIG. 25 mostra um diagrama esquemático de um sistema de auxílio hepático extracorporal em que EBs contendo MSCs como aqui descritos podem ser usados. O sistema incluir um biorreator exemplificativo 1 com múltiplos cartuchos 2. O biorreator 1 inclui uma entrada de fluído oxigenado 3 para a introdução de um fluído oxigenado de um sistema de fluído oxigenado 4, uma saída de fluído oxigenado 3', uma entrada de líquido 5 para a introdução de um líquido biológico, suplementado pela bomba 6 a partir da unidade de imunoisolamento 7, no biorreator, e uma saída de líquido 5' para a remoção do líquido biológico do biorreator para ser devolvido à unidade de imunoisolamento 7. O sangue de um paciente 9 flui através da bomba 6' para uma unidade de plasmaférese 8, a partir da qual uma porção do plasma flui então para a unidade de imunoisolamento 7, através da bomba 6''. O plasma tratado flui da unidade de imunoisolamento 7 e é misturado com sangue da unidade de plasmaférese 8 antes de regressar ao paciente 9. Para detalhes adicionais, ver Pat. U.S. No. 6,759,245.

No que refere à FIG. 26, outro Exemplo de um sistema hepático bioartificial é representado em forma esquemática (ver Pat. U.S. No. 7,160,719). O sistema 10 inclui um EB 42 que inclui MSCs, e opcionalmente hepatócitos. O fluído biológico a ser tratado (p.ex., sangue ou plasma) pode ser introduzido em EB 43 através de uma entrada de fluído biológico 32 e pode sair através de uma saída de fluído biológico 33. Por exemplos, um cateter venovenoso pode ser usado para colocar a corrente sanguínea de um mamífero em comunicação de fluído com EB 43 via uma entrada de fluído 32. Num Exemplo alternativo, um fluído biológico pode ser tratado in vitro usando um reservatório de fluído biológico (não representado) no luz do mamífero 51. Nalguns exemplos, o dispositivo inclui um gerador de ultrafiltração (UF) 41. Nestes casos, o sangue proveniente do mamífero 51 flui ao longo do circuito 31 para o gerador de UF 41, onde os componentes celulares são separados do plasma. O plasma ultrafiltrado flui então ao longo do circuito 32 para o EB 42, enquanto os componentes celulares são devolvidos ao UF tratador através do circuito 34. O fluído biológico é então devolvido ao mamífero 51 ou ao reservatório de fluido biológico através do circuito 35.

Embora as FIGs. 25 e 26 representem os vários componentes numa orientação específica e possuindo dimensões similares, os componentes podem ser de qualquer orientação, tamanho, ou forma.

Nalgumas situações, para minimizar a diferenciação de MSC, dispositivos EB individuais contendo MSCs podem ser operados até um máximo de 24 horas. Nalgumas formas de realização, células MSC podem ser combinadas com hepatócitos primários num EB convencional.

Assim, um sujeito com sua necessidade de terapia relacionada pode ser ligado a um dispositivo BAL possuindo um EB contendo MSCs (EB-MSC) , ou contendo uma mistura de hepatócitos e MSCs. Estes métodos podem ser usados para tratar sangue ou plasma do sujeito. 0 método inclui o fornecimento de um sistema, como aqui descrito, que contém um EM que inclui um compartimento celular contendo uma população de MSCs para o tratamento de sangue ou plasma; remover o sangue ou plasma do sujeito; introduzir o sangue ou plasma no compartimento de tratamento de fluído do EB; e permitir que o sangue ou plasma flua através e saia do compartimento de tratamento de fluído, assim tratando o sangue ou plasma. A velocidade de fluxo do plasma do sujeito através de um EB pode ser ajustada quando necessário, p.ex., até uma velocidade de cerca de 50-500 ml/minuto, p.ex., 50, 100, 200, 300, 400, e 500 ml/minuto. Nalguns exemplos, a velocidade do fluxo será ajustada para otimizar a passagem de agentes secretados de MSCs indiferenciadas para o ultrafiltrado. Nalguns exemplos, a velocidade de fluxo desejada será de 175 ml/minuto. Tratamento do sujeito (p.ex., circulação do plasma do sujeito através de um dispositivo) pode continuar por um período que seja terapeuticamente eficaz, p.ex., entre 1 hora e 24 horas, p.ex, cerca de 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, ou 23 horas. Os sujeitos podem ser submetidos a múltiplos ciclos de terapia EB-MSC com cada ciclo a durar, por exemplo, entre 1 hora e 24 horas. A terapia EB-MSC pode ser continuada, p.ex, até um desejado efeito terapêutico ser obtido (p.ex., recuperação de uma função hepática suficiente até um nível aceitável ou próximo da normalidade) ter sido atingido, como decidido pelo sujeoto pelo prestador de cuidados de saúde do sujeito, ou até que um fígado de um dador esteja disponível para transplante. Nalguns exemplos, a função hepática pode ser avaliada usando testes estandardizados de função hepática, por exemplo LDH sérica, ALP, AST, ALT, bilirrubina, níveis proteicos, tempo de protrombina, ACT, PTT, e PCT. Nalguns exemplos, testes de função hepática são realizados antes e/ou após a terapia EB-MSC, para avaliar a eficácia da terapia EB-MSC. Tais avaliações podem também ser feitas antes e/ou após cada ciclo de EB-MSC, assim como antes da terapia se iniciar e após a terapia ter sido completada devido ao efeito terapêutico desejado a ser atingido ou à obtenção de um órgão proveniente de um dador.

Dispositivos de auxílio hepático extracorporais incluindo biorreatores são comummente referidos como dispositivos hepáticos bioartificiais (BALs) ou dispositivos de auxílio hepático bioartificiais (BLADs). Um número de tais dispositivos são conhecidos do estado da técnica e podem ser adaptados para uso com MSCs. Dispositivos de auxílio hepático extracorporais exemplificativos e comercialmente disponíveis que podem ser usados como aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, ao sistema ELAD® atualmente comercializado pela empresa Vital Therapies, Incorporated (representado na Fig. 1 da Pat. U.S. App. Pub. No. 2005/0182349), Circe's HEPATASSIST®, Gerlach's BELS, and Excorp Medical's BLSS. Outros dispositivos exemplificativos adequados são descritos nas Pat. U.S. Nos. 6,472,200, 5,605,835; 7,160,719; 7,273,465; 6,858,146; 6,582,955; 5,270,192; 6,759,245; e Pat. U.S. App. Pub. Nos. 2003-0017142.

Seleção de Sujeitos

Os métodos aqui descritos são de uso particular para o tratamento de doenças hepáticas (p.ex., insuficiência hepática aguda) num sujeito com sua necessidade relacionada. Os métodos incluem: identificação de um sujeito com doença hepática (p.ex., insuficiência hepática aguda), e tratamento do sujeito com composições aqui descritas usando os métodos aqui descritos.

Nalguns exemplos, os métodos de tratamento aqui descritos incluem um passo de seleção de um sujeito com base na presença de uma doença hepática, p.ex., FHF ou fibrose hepática. Nalguns exemplos, um teste de função hepática, p.ex., como conhecido no estado da técnica ou aqui descrito, é administrado, e o sujeito é selecionado para tratamento usando um método aqui descrito com base no resultado desse teste, p.ex., um resultado de um teste que indique que o sujeito possui uma doença hepática (p.ex., uma doença hepática associada com a perda de função hepática e/ou perda ou dano de hepatócitos, p.ex., de células hepáticas parênquimatosas.

Assim, nalguns exemplos, um sujeito com sua necessidade de tratamento com as composições e método aqui descritos pode ser selecionado com base em, por exemplo, marcadores séricos de função hepática. Um sujeito com sua necessidade de tratamento com os métodos aqui descritos pode também ser selecionado com base no diagnóstico feito por um clinico especialista em doenças hepáticas (p.ex., doença hepática aguda) num sujeito.

Doenças Hepáticas 0 termo "doença hepática" aplica-se a muitas doenças e distúrbios que causam o funcionamento impróprio ou a falha de funcionamento do figado, e esta perda de função hepática é indicativa de uma doença hepática. Assim, testes de função hepática são frequentemente usados para diagnosticar doença hepática. Exemplos de tais testes incluem, mas não estão limitados a, ao seguinte; (1) Ensaios para determinar os niveis de enzimas séricas tais como lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST), e alanina aminotransferase (ALT), onde um aumento nos niveis enzimáticos indica doença hepática. Uma pessoa habilitada no estado da técnica irá razoavelmente entender que estes ensaios enzimáticos indicam apenas que o figado foi lesado. Eles não avaliam a capacidade do figado para funcionar. Outros testes podem ser usados para avaliar a capacidade do figado para funcionar. (2) Ensaios para determinar os niveis de bilirrubina sérica. Os niveis de bilirrubina sérica são reportados como bilirrubina total e bilirrubina direta. Os valores normais de bilirrubina sérica total são de 0,1 - 1,0 mg.dl (p.ex., cerca de 2 - 18 mmol/L). Valores normais de bilirrubina direta são de 0,0 - 0,2 mg/dl (0-4 mmol/L). Aumentos nos niveis de bilirrubina sérica são indicativos de doença hepática. (3) Ensaios para determinar os niveis de proteina sérica, por exemplo, albumina e globulinas (p.ex., alfa, beta, gama) . Valores normais para proteínas séricas totais são de 6,0-8,0 g/dl (60-80 g/L) . Um decréscimo na albumina sérica é indicativo de doença hepática. Um aumento na globulina é indicativo de doença hepática.

Outros testes incluem tempo de protrombina, rácio normalizado internacional, tempo de coagulação ativado (ACT), tempo de tromboplastina parcial (PTT), tempo de consumo de protrombina (PCT) , fibrinogénio, fatores de coagulação; alfa-fetoproteina, e alfa-fetoproteina-L3 (percentagem).

Um tipo clinicamente importante de doença hepática é a hepatite. A hepatite é uma inflamação do figado que pode ser causada por virus (p.ex, virus da Hepatite A, B, e C (HAV, HBV e HCV, respetivamente), quimicos, fármacos, álcool, doenças hereditárias, ou o próprio sistema imune do paciente (hepatite autoimune). Esta inflamação pode ser aguda e ser tratada nalgumas semanas a meses, ou ser crónica, e persistir ao longo de mutos anos. As hepatites crónicas podem persistir décadas antes de causarem sintomas significantes, tais como cirroses (cicatrização e perda de função), cancro hepático ou morte.

Outros exemplos importantes de diferenças doenças e distúrbios englobados pelo termo "doença hepática" incluem, sem estarem limitados a abcesso hepático amebiano, atresia biliar, carcinoma hepatocelular (HCC), doença hepática alcoólica, cirrose biliar primária, abcesso hepático piogénico, sindrome de Reye, colangite esclerosante, e doença de Wilson. Nalguns exemplos, as composições e métodos aqui descritos são adequados para o tratamento de doença hepática caracterizada pela perda ou dado de células hepáticas parenquimatosas. Nalguns aspetos, a etiologia destas pode resultar de uma resposta inflamatória local ou sistémica.

Insuficiência hepática

Insuficiência hepática ocorre quando grandes partes do figado ficam danificados e o figado não é mais capaz de realizar a sua normal função fisiológica. Nalguns aspetos, insuficiência hepática pode ser diagnosticada usando os ensaios acima descritos de dunção hepática. Nalguns exemplos, a insuficiência hepática pode ser diagnosticada (p.ex., inicialmente diagnosticada) com base nos sintomas do sujeito. Os sintomas que são associados com insuficiência hepática incluem, por exemplo, um ou mais dos seguintes, náusea, perda de apetite, fadiga, diarreia, icterícia, sangramento anormal/excessivo (p.ex., coagulopatia), abdómen inchado, desorientação mental ou confusão (p.ex., encefalopatia hepática), sonolência, e coma.

Insuficiência hepática crónica ocorre após esses a anos e é mais comummente causada por virus (p.ex., HBS e HCV) consumo a longo-termo/excessivo de álcool, cirrose, hemocromatose, e malnutrição.

Insuficiência hepática aguda é o aparecimento de complicações graves após os primeiros sinais de doença hepática (p.ex., icterícia). Insuficiência hepática aguda inclui um número de condições, todas elas envolvendo graves danos ou necrose de hepatócitos. Na maior parte dos casos de insuficiência hepática aguda, necrose massiva de hepatócitos ocorre, contudo, insuficiência hepatocelular sem necrose é caracteristica de figado gordo caracteristico da gravidez e da sindrome de Reye. Estado mental alterado (encefalopatia hepática) e coagulopatia na definição de uma doença hepática geralmente define a insuficiência hepática aguda. Consequentemente, insuficiência hepática aguda é geralmente clinicamente definida como o desenvolvimento de coagulopatia, usualmente num rácio normalizado internacional (uma medida de tempo que leva o sangue a coagular comparativamente com um valor INR médio) maior do que 1,5, e qualquer grau de alteração mental (encefalopatia) num paciente sem cirrose pré-existente e com uma doença com duração igual ou inferior a 26 semanas. A insuficiência hepática aguda indica que o figado foi sujeito a um dano grave resultando na disfunção de 80-90% de células hepáticas.

Insuficiência hepática aguda ocorre quando o figado falha rapidamente. Insuficiência hepática hiperaguda é caracterizada como a insuficiência do figado que se desenvolve no espaço de 1 semana. A insuficiência hepática aguda é caracterizada como a insuficiência do figado que se desenvolve entre 8-28 dias. A insuficiência hepática subaguda é caracterizada como a insuficiência do figado que se desenvolve entre 4-12 semanas.

Nalguns exemplos, as composições e métodos aqui descritos são particularmente adequados para o tratamento de insuficiência hepática subaguda, aguda e hiperaguda, sendo todas elas aqui coletivamente referidas como "insuficiência hepática aguda". Causas comuns de insuficiência hepática aguda incluem, por exemplo, hepatite virica, exposição a certos fármacos e toxinas (p.ex., hidrocarbonetos fluorados (p.ex., tricloroetano e tetracloroetano), amanita faloide (p.ex., comummente encontrada em "cicuta verde"), acetaminofeno (paracetamol), halotanos, sulfonamidas, henitoinas), isquémia hepática relacionada com problemas cardíacos (p.ex., enfarte agudo do miocárdio, paragem cardiorrespiratória, cardiomiopatia, e embolismo pulmonar), insuficiência renal, oclusão do fluxo venoso hepático (p.ex., sindrome Budd-Chiari), doença de Wilson, figado gordo agudo associado a gravidez, abcessos amebianos, e tuberculose disseminada.

Insuficiência hepática aguda engloba tanto insuficiência hepática fulminante (FHF) como insuficiência hepática subfulminante (ou insuficiência hepática de surgimento retardado). FHF é geralmente usado para descrever o desenvolvimento de encefalopatia 8 semanas após o surgimento de sintomas num paciente com um figado previamente saudável. Insuficiência hepática subfulminante é reservada para pacientes com doença hepática até 26 semanas antes do desenvolvimento de encefalopatia hepática. FHF é usualmente definida como a grave limitação das funções hepáticas na ausência de doença hepática pré-existente. FHF pode resultar da exposição a um indivíduo suscetível de um agente capaz de produzir grave dano hepático. Exemplos de tais agentes incluem agentes infeciosos, álcool excessivo, metabolitos hepatotóxicos, e compostos hepatotóxicos (p.ex., fármacos). Outras causas incluem anormalidades congénitas, doenças autoimunes e doença metabólica. Em muitos casos, a etiologia precisa da condição é desconhecida (p.ex., idiopática). FHF pode ser diagnosticada, por exemplo, usando os ensaios de função hepática acima descritos.

Fibrose hepática

Fibrose hepática corresponde à excessiva acumulação de proteínas da matriz extracelular incluindo colagénio que ocorre na maioria dos tipos de doenças hepáticas crónicas. Resultados de fibrose hepática avançados resulta em cirrose, insuficiência hepática, e hipertensão portal, e muitas vezes requerem transplante de figado. Um evento-chave na etiologia de fibrose hepática é a ativação inapropriada ou excessiva de células de Ito (Abdel-Aziz et al. , Am. J. Pathol., 137:1333-1342, 1990; Iredale et al. , J. Clin. Invest., 102:538-549, 1998).

Disfunção múltipla de órgãos A insuficiência de órgãos é geralmente definida como a perda de células parenquimatosas associada a uma resposta inflamatória local e sistémica. Mars especificamente, a insuficiência de órgãos é a insuficiência de um sistema essencial no corpo requerendo intervenção médica. A sindrome de disfunção múltipla de órgãos (MODS) é uma alteração na função dos órgãos num paciente gravemente doente requerendo intervenção médica para realizar a sua homeostasia. MODS usualmente envolve dois ou mais órgãos. MODS tipicamente resulta de infeção, lesão (acidente, cirurgia), hipoperfusão e hipermetabolismo. Após um evento iniciador, uma resposta inflamatória descontrolada é despoletada, que causa dano tecidular e despoleta por sua vez respostas locais e sistémicas. Insuficiência respiratória é comum nas primeiras 72 horas após o acontecimento inicial, insuficiência hepática é comum nos primeiros 5-7 dias, sangramento grastrointestinal pode ocorrer nos 10-15 dias, e insuficiência renal é comum nos 11-17 dias. As taxas de mortalidade para MODS variam de 30% a 100%. Não existe atualmente qualquer regime terapêutico eficaz disponível para reverter MODS estabelecida.

Nalguns exemplos, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para o tratamento de insuficiência de órgãos, p.ex., disfunção múltipla de órgãos.

Formulações farmacêuticas

As composições aqui escritas, p.ex., uma composição CM-MSC e agentes ativos desta isolados, podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um sujeito, p.ex., um mamifero, p.ex., um humano. Como aqui usado, o termo "veiculos farmaceuticamente aceitável" pretende incluir todo e qualquer solvente, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e agentes de retardadores de absorção, e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. 0 uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido. Exceto quando qualquer meio ou agente convencional é incompatível como o composto ativo, tal meio pode ser usado nas composições da invenção. Compostos ativos adicionais podem também ser incorporados nas composições.

Uma composição farmacêutica irá geralmente ser formulada para ser compatível com a sua via de administração desejada. Soluções ou suspensões usadas para administração parentérica, podem incluir os seguintes componentes: um diluente esterilizado tal como água para injeção, uma solução salina, óleos naturais não-voláteis, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicoll ou outros solventes sintéticos, agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metilparabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelante tais como ácido etilenodiaminotetraacético; agentes tamponizantes tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste de tonicidade tais como cloreto de sódio e dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser na forma de ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.

Composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas esterilizadas (onde solúveis em água) ou dispersões e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem soluções fisiológicas salinas, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução-tampão fosfato salina (PBS). Em todos os casos, a composição deverá ser esterilizada e deverá ser fluída até à extensão em que uma fácil incorporação/manuseamento em seringas seja permitida. A composição deverá ser estável nas condições de produção e armazenamento e deverá ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. 0 veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhante) e misturas adequadas relacionadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, mantendo o tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e por isso de surfatantes. Prevenção da ação de micro-organismos pode ser obtida através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferível a inclusão de agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida através da inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoesterarato de aluminio e gelatina.

Soluções injetáveis esterilizadas podem ser preparados por incorporação do composto ativo (p.ex., um agente aqui descrito) na quantidade requerida num solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredientes acima enumerados, como requerido, seguindo-se uma esterilização via filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo num veiculo esterilizado que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos provenientes daqueles acima enumerados. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos preferidos de preparação são secagem sob vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada relacionada.

Num exemplo, uma composição CM-MSC é preparada com veiculos que protegerão as composições contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos para a preparação de tais formulações serão aparentes para aqueles habilitados no estado da técnica. Os materiais podem também ser obtidos comercialmente a partir da empresa Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossomais (incluindo lipossomas direcionados a células infetadas via anticorpos monoclonais específicos para antigénios víricos) podem também ser usadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles habilitados no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No. 4,522,811.

As composições farmacêuticas podem ser incluídas numa embalagem, invólucro ou dispensador conjuntamente com instruções para a sua administração. Num aspeto, as composições farmacêuticas podem ser incluídas como parte de um kit. Tais kits encontram-se também no âmbito da presente invenção. Métodos de Rastreio

Aqui descritos estão métodos para a identificação de compostos ativos contidos numa composição CM-MSC, p.ex., na fração de ligação a heparina de uma composição CM-MSC.

Nalguns exemplos, os compostos ativos contidos numa composição CM-MSC, p.ex., na fração de ligação a heparina de uma composição CM-MSC, podem ser obtidos através da análise sistemática de cada um dos componentes contidos numa composição CM-MSC. Alternativamente, uma composição CM-MSC pode ser fracionada, p.ex., através de tamanho e/ou carga, e as frações ativas podem ser identificadas. Depois, cada uma das frações ativas podem ser adicionalmente fracionadas, e as frações ativas relacionadas identificadas. Isto pode ser repetido um número desejado de vezes, e então os componentes da fração ativa podem ser identificados, p.ex., usando métodos conhecidos do estado da técnica (p.ex, HPLC, espectroscopia de massa), e alguns ou todos os componentes podem então ser testados quanto à sua atividade num ensaio do sistema. Se dois ou mais compostos ativos são identificados, eles podem ser combinados para formar uma composição combinada de forma a obter parte ou a totalidade da eficácia do CM-MSC completo, p.ex., uma composição combinada com pelo menos 40%, p.ex., 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais da eficácia de CM-MSC. Nalguns exemplos, a atividade terapêutica de componentes individuais de uma composição CM-MSC, ou frações com diferentes tamanhos de uma composição CM-MSC são testadas usando ensaios in vitro ou in vivo, p.ex., através do crescimento de hepatócitos, proliferação, sobrevivência, morfologia, e função; um número de tais ensaios são conhecidos do estado da técnica. Por exemplo, ensaios in vitro adequados são conhecidos do estado da técnica. Por exemplo, ensaios in vitro adequados podem incluir ensaios para analisar a proliferação de hepatócitos, p.ex., via incorporação de BrdU; apoptose de hepatócitos, por exemplo, através da análise de mudanças morfológicas associadas com apoptose/necrose, ou através do uso, p.ex., do ensaio TUNEL; RT-PCR para detetar alterações nos níveis de expressão de mRNA de IL-10, IL-6, HGF, EGF, e TNF-I; proliferação de células de Ito; apoptose de células de Ito; ELISA para detetar expressão alterada de IL-10, TNF-I, IL-ld, IL-6, IL-2, IL-lra, quimiotaxia de células do sistema imunitário. Tais ensaios in vivo incluem, análise de histologias hepáticas, p.ex., após biópsia hepática ou após sacrifício de um modelo animal ou estudos de sobrevivência de um modelo animal. 0 objetivos de tais experiências de rastreio é a identificação do componente biologicamente ativo de uma composição CM-MSC. 0 termo "componente biologicamente ativo de uma composição CM-MSC", como aqui usado, refere-se a um componente de uma composição CM-MSC que produz um ou mais dos efeitos benéficos aqui descritos, por exemplo, a modelação da sinalização de células de Ito, a promoção da proliferação de hepatócitos, a inibição da morte celular de hepatócitos, ou a indução de qualquer mudança nos níveis de expressão de mRNA ou proteínas em hepatócitos, como aqui descrito. Ensaios in vitro ou in vivo para detetar tais efeitos são conhecidos do estado da técnica e encontram-se aqui descritos.

Kits

Adicionalmente descritos estão kits. Nalguns exemplos, os kits compreendem uma ou mais doses de uma composição CM-MSC. A composição, forma, e tipo da forma de dosagem para o regime de indução e para o regime de manutenção podem variar dependendo dos requerimentos do sujeito. Por exemplo, a forma de dosagem pode ser uma forma de dosagem parentérica (p.ex., administração intravenosa de um bólus), uma forma de dosagem oral, uma forma de dosagem com libertação controlada ou retardada, uma forma de dosagem de entrega tópica, e uma forma de dosagem de entrega mucosa, incluindo qualquer combinação relacionada.

Num exemplo particular, um kit pode conter um ou mais dos seguintes elementos numa embalagem ou recipiente: (1) uma ou mais doses de uma composição CM-MSC, p.ex., na forma líquida ou na forma de uma solução congelada ou na forma liofilizada; (2) um ou mais agentes tamponizantes farmaceuticamente aceitáveis, (3) um ou mais veículos para a administração da dose, tal como uma ou mais seringas, um cateter, uma bomba, um hidrogel, e uma formulação de armazenamento para administração; (4) um ou mais agentes bioativos adicionais para administração concorrente ou sequencial com uma composição CM-MSC, tal como ingredientes ativos suplementares (SAI); e (5) instruções para administração. Kits em que dois ou mais, incluindo todos, os componentes (1)-(5), são encontrados no mesmo recipiente podem ser usados.

Quando um kit é suplementado, os diferentes componentes das composições incluídas podem ser empacotados em diferentes recipientes e misturados imediatamente antes de uso. Tal empacotamento separados dos componentes pode permitir um armazenamento a longo termo sem perda das funções dos componentes ativos. Quando mais do que um agente bioativo é incluído num kit particular, os agentes bioativos podem ser (a) empacotados separadamente e misturados separadamente com adjuvantes ou excipientes apropriados (similares ou diferentes, mas compatíveis), imediatamente antes de uso, (2) empacotados conjuntamente e misturados conjuntamente imediatamente antes de uso. Se os compostos escolhidos permanecem estáveis após a mistura, os compostos podem ser misturados algum tempo antes de uso em vez de imediatamente antes de uso, incluindo, por exemplo, minutos, horas, dias, meses, anos, e qualquer periodo até ao momento de produção.

As composições incluídas em kits particulares podem ser suplementadas em recipientes de qualquer tipo de forma a que a vida dos diferentes componentes seja optimamente preservada e estes não sejam absorvidos ou alterados pelos materiais do recipiente. Materiais adequados para estes recipientes podem incluir, por exemplo, vidro, polímeros orgânicos (p.ex., policarbonato e polistireno), material cerâmico, metal (p.ex., aluminio), uma liga ou qualquer outro material tipicamente empregado para conter reagentes similares. Recipientes exemplificativos podem incluir, sem limitação, tubos de ensaio, frascos, garrafas, seringas, e semelhantes.

Como acima referido, os kits podem também ser fornecidos com instruções. Estas instruções podem ser imprimidas e/ou podem ser fornecidas, sem limitação, como um meio eletrónico de leitura, tal como uma disquete, um CD-ROM, um DVD, um disco Zip, uma cassete de video, uma cassete de áudio, um dispositivo de memória flash. Alternativamente, as instruções podem ser publicadas num website da internet ou podem ser distribuídas ao usuário através de um email eletrónico.

Cartuchos de Biorreator Extracorporal para MSCs

Também incluídos na presente invenção estão EBs, e cartuchos para uso relacionado incluindo MSCs (cartuchos de EB-MSC). Cada cartucho pode ser fornecido como um cartucho único para uso num dispositivo de auxilio hepático extracorporal, como acima descrito. Cartuchos de EB-MSC podem ser fornecidos para uso único com um paciente por um período de tempo de até 24 horas. Múltiplos cartuchos podem ser fornecidos para uso num único sujeito, como ditado pelo regime de tratamento do sujeito. Um número de configurações adequadas de cartuchos é conhecido do estado da técnica, ver, p.ex., Pat. U.S. Nos. 5,270,192; 7,160,719; 6,858,146; 6,582,955; 6,759,245; Dixit and Gitnick, Eur. J. Surg. Suppl. (582):71-6 (1998); and Legallais et al., J. Memb. Sei. 181:81-95 (2001). Tais cartuchos podem incluir, p.ex., fibras ocas ou pratos planos. Geralmente, uma membrana semipermeável separará o fluído biológico a ser tratado a partir das células, e tal membrana pode fazer parte dos cartuchos, p.ex., uma parede exterior do cartucho. Os cartuchos são configurados para serem inseridos no dispositivo BAL, p.ex., como parte de um biorreator ou como um biorreator completo. FIG. 27 é uma ilustração esquemática de um biorreator de fibras ocas com cartuchos 100, contendo um número de fibras ocas 140, e uma entrada de fluído 110 e uma saída de fluído 120. As fibras ocas serão semipermeáveis, permitindo a passagem de fatores ativos secretados por MSCs no sangue ou plasma. A Fig. 28 é uma imagem da secção transversal do biorreacto 100 na linha A-A, ilustrando as fibras ocas 140, que possuem um interior de lúmen capilar 130 e são rodeadas pelo espaço extraepilar 150. Em biorreatores de fibras ocas, as MSCs pode encontrar-se tanto no lúmen 130, enquanto o sangue ou plasma flui através do espaço extracapilar 150, ou vice-versa. Neste caso, o compartimento incluindo as MSCs é considerado o compartimento celular, enquanto o compartimento através do qual o sangue ou plasma flui é o compartimento de tratamento de fluído. FIG. 29 é uma ilustração esquemática de um biorreator de pratos planos ou de duplo compartimento 200, incluindo um compartimento de tratamento de fluido 210 e um compartimento celular 220, separados por uma membrana semipermável 230. O sangue ou plasma flui através do compartimento de tratamento de fluido 210 ao longo do circuito 250. O compartimento celular 220 inclui MSCs 240 (e opcionalmente, hepatócitos) . Este tipo de biorreator é adicionalmente descrito em maior detalhe na Pat. U.S. No. 6, 759, 254 .

Também fornecidos estão kits que contêm um ou mais dos seguintes elementos numa embalagem ou recipiente: (1) um cartucho EB-MSC; (2) dois ou mais agentes tamponizantes farmaceuticamente aceitáveis; e (3) instruções para a instalação do EB-MSC num BAL especifico. Formas de realização em que dois ou mais, incluindo todos, os componentes (1)-(3), são encontrados no mesmo recipiente podem também ser usados.

EXEMPLOS A invenção é adicionalmente descrita nos seguintes Exemplos, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.

Exemplo 1 - Isolamento de MSC, Cultura e Expansão Ex Vivo MSCs humanas foram isoladas de aspirados de medula óssea disponíveis comercialmente (MSCs derivadas da medula óssea) obtidas de um único dador do sexo masculina de 25 anos de idade (Clonetics-Poietics, Walkersville, MD), como previamente descrito (Mauney et ai., Biomaterials, 26:6167- 6175, 2005) . Sucintamente, todos os aspirados de medula óssea foram plaqueados a uma densidade de 8-10 μΐ aspirado/cm2 em frascos de cultura de 175 cm2 e crescidos até confluência num meio de expansão a 37 °C e 5% CO2. O meio de expansão consistiu de Meio de Dulbecco Modificado por Eagle suplementado com 10 % soro fetal de bezerro, 100 U/ml penicilina, 100 yg/ml estreptomicina, 0,1 mM aminoácidos não-essenciais e 1 ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos alcalino (Life Technologies, Rockville, MD) . Após 4 dias de cultura, células hematopoiéticas não-aderentes foram removidas por lavagem com PBS, e monocamadas de células aderentes foram cultivadas com mudanças de meio 2-3 vezes por semana. As células foram passadas usando 0,25 % tripsina/0,1 % EDTA, subcultivadas a uma densidade de 5xl03 células/cm2 e usadas para as experiências durante as passagens 4-7. MSCs isoladas foram mantidas como previamente descrito (Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).

Exemplo 2 - Caracterização das MSCs derivadas da medula óssea Células estaminais mesenquimatosas (MSCs) possuem várias caracteristicas únicas e bem estabelecidas que permite que estas células possam ser distinguidas de outras células. Tais caracteristicas incluem a capacidade das células para reprodutivamente originarem (i.e., se diferenciarem em) adipócitos, osteoblastos, e condrócitos, em condições in vitro (Pittenger et al. , Science, 284:143-147, 1999); e a capacidades das células para reverterem distúrbios de tecido mesenquimatoso em humanos (Horwitz et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99:8932-8937, 2002). Adicionalmente, MSCs humanos podem adicionalmente ser identificados por avaliação da expressão na superfície celular de CD29, CD44, CD7 3, CD90, CD105, CD106, CDllb, CD14, CD18, CD34, CD36, e CD45 (Pittenger et al., Circ. Res., 95:9-20, 2004). MSCs isolados durante os métodos acima descritos foram caracterizados usando duas técnicas distintas.

Primeiro, a pluripotência de MSCs da medula óssea foi avaliada in vitro através da cultura das células em meio de indução de (1) osteogénese, (2) adipogénese ou (3) condrogénese durante 2-3 semanas, com mudanças de meio a cada 3 dias, como se segue. (1) . Meio osteogénico consistiu de meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado com 0,1 μΜ dexametasona, 10 mM β-glicerol fosfato, 0,2 mM ácido ascórbico (AsA), 100 U/ml penicilina e 100 yg/ml estreptomicina. (2) . Meio adipogénico consistiu de IMDM suplementado com 0,5 μΜ 3-isobutill-metilxantina, 1 μΜ hidrocortisona, 0,1 mM indometacina, 10 % soro de coelho, 100 U/ml penicilina e 100 yg/ml estreptomicina. (3) . Para estudos de condrogénese, as células foram transferidas para um tubo de propileno de 15 mL e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos para formar micromassa em pellet que foi tratada com meio condrogénico. O meio de condrogénese consistiu de DMEM com elevado teor de glucose (Chemicon International, Temecula, CA) suplementado com 0,1 μΜ dexametasona, 50 yg/mL AsA, 100 yg/mL piruvato de sódio, 40 yg/mL pralina, 10 ng/mL TGF-βι, 50 mg/mL ITS + pré-mistura (Becton Dickinson; 6,25 yg/mL insulina, 6,25 yg/mL transferindo, 6,25 ng/mL ácido selénico, 1,25 mg/mL albumina do soro bovino, e 5,35 mg/mL ácido linoleico), 100 U/ml penicilina e 100 yg/ml estreptomicina. 0 fenótipo de células indiferenciadas foi avaliado após 2-3 semanas de indução, como se segue. (1) . 0 conteúdo mineral sob condições osteogénicas pfoi determinado usando coloração Von Kossa, como se segue. Sucintamente, as células foram fixadas com 4% para formaldeído durante 15 minutos, lavadas duas vezes com PBS, coradas com 1% de nitrato de prata sob uma luz 100 W durante 60 minutos e lavadas com água desionizada (Dl). (2) . A acumulação de lípidos após condições adipogénicas foi determinada com marcação via vermelho do Sudão, como se segue. Sucintamente, as células foram ficadas com 4% de paraformaldeído, lavadas duas vezes com PBS, marcadas com vermelho do Sudão durante 15 minutos e lavadas com água Dl. (3) . O conteúdo de proteoglicanos após condições condrogénicas foi avaliado por coloração via safranina-O, como se segue. Sucintamente, o micropellet foi fixado em 4% de paraformaldeído, diluído serialmente em etanol e embebido em blocos de parafina. Os blocos forma seccionados e marcados com safranina-O.

Todas as imagens foram registadas num microscópio Nikon Eclipse E800 Upright.

Os resultados mostraram que a osteogénese, adipogénese, e condrogénese foram induzidas nos seus respetivos meios de indução. A marcação para osteogénese, adipogénese, e condrogénese é visualizada por deposição mineral, gotas lipídicas e sulfato de condroitina, respetivamente.

Segundo, MSCs foram submetidas a imunofenotipagem por citometria de fluxo (FACS Calibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . O painel de antigénios à superfície incluía CD14, CD34, CD44, CD45, e CD106 (BD Pharmingen,

Franklin Lakes, NJ).

Como esperado, o perfil de antigénios à superfície de MSCs isolados foi CD14-, CD105+, CD34-, CD45-, CD106+ w CD44+.

Estas observações são consistentes com relatórios prévios de expressão de marcadores de superfície associados a MSCs indiferenciadas (Pittenger et ai., Circ. Res., 95:9-20, 2004) .

Assim, os métodos usados foram adequados para o isolamento de MSCs.

Exemplo 3 - Imunomodelação de Células de Ito por MSCs

Este Exemplo demonstra que MSCs são capazes de modelar células de Ito hepáticas ativadas (SCs), presumivelmente através de mecanismos parácrinos.

Pensa-se que fibrose hepática, a precursora de cirrose, seja geralmente o resultado de um desequilíbrio na síntese de matriz extracelular (ECM) e sua degradação mediada primariamente por SCs. SCs são pericitos frequentemente encontrados no espaço perisinusoidal localizado entre as sinusoides e hepatócitos no fígado. Num fígado normal e saudável, SCs são quiescenres e primariamente envolvidas no armazenamento de Vitamina A. Após dado hepático, SCs são submetidas a uma mudança fenotípica em células semelhantes a miofibroblastos, proliferativas, positivas para α-actina do músculo liso capazes de uma síntese aumentada de colagénio. SCs podem ser facilmente distinguidas por grandes gotas lipidicas observadas no citoplasma dessas células.

Ativação in vivo de SCs é dividida numa resposta fibrinogénica e hiperplásica que é mediada por muitos sinais autócrinos e parácrinos. Resolução espontânea de fibrose hepática tem sido reportada em diferentes modelos de ratos com lesões hepáticas crónicas (Abdel-Aziz, et ai., Am. J. Pathol., 137:1333-1342, 1990; Iredale et al., J. Clin. Invest. 102:538-549, 1998). Esta resolução tem sido correlacionada com a sintese diminuída de colagénio Tipo I e com a inibição tecidular de transcritos 1 e 2 de metaloproteinases da matriz (TIMP), com um decréscimo concomitante no número de SCs α-SMA-positivos (Iredale et al., J. Clin. Invest. 102:538-549, 1998). Não é claro se o decréscimo no número de SCs ativadas se deve a apoptose ou a reversão seletiva a um estado quiescente por sugestão ambiental.

Estes dados demonstram que terapia de MSCs é útil no tratamento de distúrbios causados por SCs ativadas num sujeito como, por exemplo, fibrose hepática.

Isolamento 3A-SC SCs de rato primários foram isolados de ratos Lewis fêmeas adultas com 2-3 meses de idade (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) pesando 180-200 g, como previamente reportado em detalhe para o isolamento de hepatócitos (Dunn et al., FASEB J., 3:174-177, 1989). Sucintamente, o sobrenadante dos passos de purificação de hepatócitos, contendo as células hepáticas não-parênquimatosas foi obtido e tratado com DNAse I durante 15 minutos a 37 °C, centrifugado a 300 g durante 20 minutos, e depois ressuspenso em PBS. Esta suspensão celular foi sujeita a separação por gradiente de densidade através da deposição gentil da suspensão no tipo de um gradiente isotónico descontínuo 40%-60% Percoll. As camadas foram então centrifugadas a 900 g durante 25 minutos. A densidade mais baixa da cama, enriquecida em SCs, foi então removida, diluída com PBS e centrifugada a 900 g durante 25 minutos. As células foram ressuspensas em meio SC (Meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% FBS, 100 U/ml penicilina e 100 yg/ml estreptomicina) e cultivados em frascos de cultura de 175 cm2. SCs foram cultivadas durante 10-14 dias em plástico de tecido de cultura, que levou à sua ativação, antes do seu uso nas experiências. A pureza e diferenciação de culturas de SCs foi avaliada através da realização de imunofluorescência para desmina, um marcador de miofibroblastos, e α-SMA, um marcador para miofibroblastos num estado mais avançado de diferenciação. A deteção de imunofluorescência foi realizada após uma fixação de 15 minutos em solução 4% de paraformaldeído preparada em solução-tampão fosfato salina (PBS), seguida por uma lavagem única com PBS. Todos os passos foram realizados à temperatura ambiente. As células foram permeabilizadas através da incubação com solução-tampão bloqueadora (10% soro de cavalo normal, 0,025% Triton X-100 e 0,5% dimetilsulfóxido em PBS) durante 45 minutos. Subsequentemente, as células foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-a-SMA (GeneTex Inc, San Antonio, TX; diluição 1:100) ou anticorpo policlonal de cabra antidesmina (Santa Cruz Biotechnology-clone C18; diluição 1:100 dilution) em solução-tampão de bloqueio durante 60 minutos. Após lavagem três vezes com solução-tampão bloqueadora, incubação com anticorpo secundário antimurino de cabra conjugado com rodamina vermelho-X conjugada ou anticorpo secundário anticabra de primata conjugado com FITC (diluoção 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) foi realizado durante 60 minutos, respetivamente. Três lavagens foram realizadas com solução-tampão bloqueadora, incubando com 5 yg/mL de 4' , 6 — diamidino2-fenilindolo (DAPI; Molecular Probes, Leiden, Netherlands) durante 5 minutos durante a primeira lavagem. As amostras sem anticorpo primário foram usadas como controlos negativos. Microscopia de contraste de fase e microscopia de fluorescência foram realizadas num microscópio invertido Zeiss AXIOVERT 200 M.

Todas as células estavam marcadas positivamente para desmina e α-SMA após dias dias de cultura, demonstrando um isolamento e purificação bem sucedidos de células SC.

3B - Sistemas de cultura para MSC e SC SCs isoladas foram cocultivadas com MSCs, isoladas e caracterizadas como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2, usando sistemas diretos ou indiretos, como se segue.

Sistema de cocultura direto: SCs e MSCs foram plaqueadas conjuntamente a um rácio de 1:1 em cada poço de uma microplaca de cultura de 6-poços (Corning Costar, Acton, MA)

Sistema de cocultura indireto: SCs e MSCs foram cocultivados usando uma configuração Transwell. Aproximadamente 1,0 x 105 SCs foram plaqueadas na câmara inferior com 0-1,0 x 105 MSCs plaqueadas nas inserções de membrana. MSCs foram substituídas com células endoteliais do cordão umbilical humano para controlos. As coculturas foram mantidas em meio SC durante 4 dias. 3C - MSCs Inibem a Síntese de Colagénio em Células de I to Ativadas A secreção por parte de SCs do péptido-C Tipo-I de procolagénio (PIP), um fragmento peptídico clivado a partir de um percursor de colagénio aquando da sua secreção extracelular, foi medido após quatro das de cocultura indireta como uma função do rácio MSC:SC, como o número de SCs a permanecer constante. A síntese de colagénio foi quantificada usando um ELISA para o péptido-C Tipo-I de procolagénio (Takara-Bio Inc. , Shiga, Japan). Após o período de cocultura, a inserção Transwell contendo MSCs foi removida e o meio nas SCs foi substituído por meio fresco. Vinte e quatro horas mais tarde, o meio foi recolhido e a concentração de péptido-C Tipo-I de procolagénio foi medida por ELISA.

Os níveis de PIP secretados por SCs ativadas (101 ± 11 pg/106 células/dia) foram significativamente reduzidos a um rácio de cocultura MSC:SC de 1:10 (41 ± 18 pg/106 células/dia; p = 0,0491), com uma redução de 66% a um rácio de cocultura de 1:1 (34 ± 5 pg/106 células/dia; p = 0, 004) . A secreção de PIP reduzida não foi observada em coculturas de SCs com células endoteliais do cordão umbilical (MVEC), sugerindo um efeito específico para MSCs. Estes resultados sugerem que fatores solúveis secretados por MSCs inibem a síntese de procolagénio em SCs ativadas. 3D - MSCs Induzem Apoptose em SCs Ativadas O decréscimo na fibrose hepática observadas após transplante de MSCs é acompanhado por uma redução no número de células a-SMA+ (células de Ito ativadas) observadas por coloração imunohistológica (Sakaida et al., Hepatology, 40:1304-1311, 2004; Fang et al., Transplantation, 78:83-88, 2004; Zhao et al. , World J. Gastroenterol., 26:6167-6175, 2005) . O mecanismo através do qual a redução no número de células de Ito actvadas ocorre é ainda pouco claro; existe evidência para uma capacidade proliferativa diminuída uma reversão para um fenótipo quiescente e para morte celular apoptótica. Assim, examinamos o destino de SCs ativadas co cultivadas indiretamente com MSCs através da medição da extensão da desdiferenciação de SCs, sua proliferação e morte. A diferenciação de SCs ou sua reversão até um estado quiescente foi determinada por análise da expressão de a-SMA, como acima descrito. A expressão de α-SMA não foi diminuída após cocultura. Esta observação sugere que SCs não revertem até um fenótipo quiescente na presença da MSCs . A proliferação de SCs foi avaliada usando citometria de fluxo para quantificar a população se SCs entrando na fase-S do ciclo celular, como medido através da incorporação de BrdU, após cocultura com MSCs.

Sucintamente, vinte e quatro horas antes da análise, as inserções Transwell contendo MSCs foram removidas e as culturas SCs foram tratadas com 10 μΜ BrdU. Células foram então lavadas com PBS três vezes, tripsinizadas e centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos. Para a fixação, o pellet foi ressuspenso em 70% etanol durante 45 minutos à temperatura ambiente, centrifugado e lavado duas vezes com PBS. As células foram incubadas com HC1 4 M durante 15 minutos *a temperatura ambiente, centrifugadas, lavadas duas vezes com PBS e incubadas com uma solução-tampão de bloqueio composta por PBS e 10% FBS durante 10 minutos. As células foram então incubadas com anticorpo anti-BrdU conjugado à sonda Alexa-Fluor 488 durante 60 minutos a 37 °C, centrifugadas e lavadas com PBS. Os controlos negativos consistiram de células incubadas sem o anticorpo. Células marcadas fluorescentemente foram analisadas por citometria de fluxo.

Como representado na FIG. 1, um declínio, de 30 ± 9% para 15 ± 4%, em SCs BrdU+ foi observado a um rácio de cocultura de 1:1 (p = 0, 043) .

Observação microscópica de coculturas indiretas indicou um decréscimo no número de SCs aderentes à microplaca de cultura de polistireno. Para determinar se a apoptose contabilizou para as mudanças no número de SCs após cocultura, marcação com Anexina-V-FITC e citometria de fluxo foram usadas.

Sucintamente, quantificação da apoptose/necrose celular foi determinada usando o kit Anexina-V FLUOS (Roche, Indianapolis, IN) seguindo as instruções do fabricante. Após cocultura, SCs foram recuperadas e marcadas com Anexina V durante 20 minutos e analisadas com recurso a citometria de fluxo. SCs desprovidas de soro serviram como o controlo positivo para apoptose. Os resultados foram normalizados relativamente aos sinais de fluorescência superiores à autofluorescência de SCs.

Em SCs cultivadas isoladamente, existiu um nível basal de apoptose (25%). Usando o sistema de cocultura indireta com um rácio de 1:1, existou um aumento aproximado de 2,5-vezes na apoptose (55%) . Cocultura com fibroblastos resultou num nível de apoptose que foi similar ao de SCs sozinhas (32%), demonstrando que o efeitos próapoptótico era específico para MSCs. TABELA 1: Apoptose de SCs Ativadas como uma Função do Número de MSCs.

Como representado na Tabela 1, uma morte significativa de SC também ocorreu para rácios de cocultura MSC:SC de 1:100 ou mais elevados, sugerindo que pequenos números de MSCs podem libertar potentes moléculas pró-apoptóticas que induzem a morte de SCs.

Quando tidos conjuntamente, estes resultados in vitro implicam que o transplante de MSCs in vivo pode melhorar ou resolver a fibrose hepática através de um mecanismo envolvendo um efeito pró-apoptótico seletivo em SCs ativadas. 3E - MSCs Secretam IL-10 e TNF-ot MSCs foram expostas a IL-1, IL-6, ou fator de necrose tumoral-α (TNF-a), todos estes sendo citocinas conhecidas por estarem envolvidas na fibrose hepática, durante 24 horas. Os niveis de secreção de proteína IL-10 e de mRNA foram determinados pelo ensaio de imunoadsorção enzimática competitiva (ELISA) e RT-PCR, respetivamente.

Sucintamente, MSCs humanas foram tratadas com 2,5 ng/ml IL-6 (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN), 5 ng/ml IL-1 (R&amp;D

Systems, Minneapolis, MN), ou 25 ng/ml TNF-α (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN) suplementadas em meio de expansão para MSCs durante 24 horas. As MSCs cultivadas em meio de expansão serviram como controlo negativo. Após tratamento, as células foram recolhidas e analisadas para mudanças na expressão genética. A quantificação de IL-10 humana foi determinada usando as instruções fornecidas pelo fabricante (Endogen, Rockford, IL) . Os sobrenadantes foram analisados após 48 horas de cocultura e armazenados a -20 °C até análise.

RNA foi extraído de 0,1-1,0 x 106 MSCs usando o kit de purificação NUCLEOSPIN RNA (BD Biosciences, Paio Alto, CA) seguindo as instruções do fabricante. Aproximadamente 1 yg do mRNA total foi transcrito reversamente para Cdna usando o kit ONESTEP RT-PCR (Qiagen, Valencia, CA) seguindo as instruções do fabricante e amplificados num termociclador Perkin Elmer-Cetus Thermal Cycler 480. As condições de ciclização foram: 1) 50 °C durante 30 minutos; 2) 95 °C durante 15 minutos; 3) 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 1 minuto; e 4) um passo de extensão final a 72 °C durante 10 minutos. IL-10 foi amplificada usando uma combinação de oligonucleótidos sense e antisense SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:2, respetivamente, para produzir um produto de PCR de 364 pares de bases (bp). Glyceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi amplificada usando uma combinação de oligonucleótidos sense e antisense SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, rrespectivamente, para produzir um produto de PCR de 238 bp. 5'-AAGCCTGACCACGCTTTCTA3' SEQ ID NO: 1 5'-GTAGAGCGGGGTTTCACCA3' SEQ ID NO:2 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT3' SEQ ID NO:3 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG3' SEQ ID NO:4

Como representado nas FIGs. 2-3, aquando da exposição a IL-6 (2,5 ng/ml) ou TNF-α (25 ng/ml) , as citocinas que são significativamente aumentadas em modelos de lesão hepática, levam à sobrerregulação tanto do mRNA de IL-10 (FIG. 2) como à secreção de proteina no meio de cultura (FIG. 3).

Como representado na FIG. 4, IL-6 e TNF-α foram ambos encontrados presentes no sistema de cocultura direta SC/MSC, como determinado por ELISA, como acima descrito. IL-6 foi secretada por SCs ativadas (65 ± 1 pg/106 células/dia), enquanto TNF-α foi secretado por MSCs (23 ± 1 pg/106 células/dia).

Como representado na FIG. 5, SCs ativadas são capazes de induzir MSCs a secretaram IL-10 quanto as células são cocultivadas diretamente a um rácio de 1:1 (54 pg/106 células/dia). Estes niveis revelaram-se similares aos niveis observados na FIG. 6.

Como representado na FIG. 6, a um rácio MSC:SC de pelo menos 1:10, SCs foram capazes de induzir uma experessão aumentada de mRNA de IL-10 em MSCs quando cultivadas indiretamente usando a configuração Transwell acima descrita. Usando o mesmo sistema. A secreção de proteina IL-10 aumentou para 32 ± 7 pg/106 células/dia (p < 0,01).

Uma vez que tanto IL-6 como TNF-α foram detetadas em coculturas de MSC-SC, neutralização por anticorpos monoclonais foi realizada para determinar o papel de IL-6 e TNF-α na libertação de IL-10 por MSCs.

Neutralização de citocinas especificas foi realizada durante coculturas indiretas. Para todas as experiências de neutralização, o rácio de MSCs:SCs foi de 1:1. IL-10 anti-humana (BioLegend, San Diego, CA) , TNF-α, (BioLegend, San Diego, CA), ou HGF e IL-6 antimurina (Cell Sciences, Canton, MA) foram diluidas em meio SC com base nas concentrações de 50% inibição do valor máximo dadas pelo fabricante. Meio fresco com anticorpos neutralizantes foi adicionado após 48 horas de cocultura.

Como representado na FIG. 7, um decréscimo significativo na libertação de IL-10 (48 ± 4 para 18 ± 1 pg/106 células/dia; p < 0,01) foi observado quando as coculturas foram tratadas com 1250 ng/ml de anticorpo neutralizante anti-IL6. Nenhuma diferença significativa foi observada após tratamento com anticorpo neutralizante anti-TNFa. Quando tidos conjuntamente, estes dados implicam que SCs actovadas secretam IL-6, que induz MSCs a secretarem IL-10. 3F - MSCs Inibem a Síntese de Colagénio e a Proliferação Via Sinalização Parácrina de IL-10 e TNF-ot

Para determinar se a supressão previamente observada da sintese de colagénio e proliferação em SCs ativadas, após cocultura indireta com MSCs, foi mediada por IL-10 e TNF-a derivados de MSCs, niveis de secreção de PIP por SCs ativadas foram medidas após quatro dias de cocultura indireta com MSCs na presença de anticorpos neutralizantes para IL-10, TNF-α, ou ambos.

Normalização parcial da secreção de PIP foi observada após neutralização de IL-10 ou TNF-α a concentrações de anticorpo de 1000 ng/ml e 500 ug/ml ou mais elevadas, respetivamente. Neutralização de IL-10 eTNF-α em cocultura levou a um aumento sinergético nos niveis de PIP de 79 í 9 pg/106 células/dia para 215 ± 20 pg/106 células/dia (p = 0,002) a concentrações máximas de anticorpo.

Os efeitos de TNF-α e IL-10 derivados de MSCs na proliferação de SCs ativadas foi analisada. Neutralização dos efeitos de IL-10 numa cocultura 1:1 levou a um aumento marginal no número de células BrdU-positivas, de 12% para 15% para a concentração máxima de anticorpo. Neutralização de TNF-α resultou num efeito mais significativo na proliferação com um aumento no número de células BrdU positivas de 13% para 33% (p = 0,0197) . Neutralização de ambas as citocinas levou ao aumento mais significativo na proliferação da população (13% para 44%).

Estes dados sugerem um efeito sinergético entre as vias de sinalização TNF-α e IL-10 (p = 0,009). 3G - Fatores de crescimento de hepatócitos (HGF) derivados de MSCs induzem Apoptose em SCs ativados

Dada a observação que um número relativamente pequeno de MSCs poderia causar apoptose de SCs, cocultura indireta de sobrenadantes foi analisada para a presença de potentes sinais próapotóticos.

Como representado na FIG. 8, uma quantidade considerável de fatores de crescimento de hepatócitos (HGF) em mono- e coculturas foi detetada e foi produzida a niveis aproximadamente equivalentes de SCs e MSCs.

TABELA 2: Apoptose de SCs Ativadas como uma função da Neutralização de HGF

Como representado na Tabela 2, um decréscimo na apoptose foi observado como uma função do anticorpo neutralizante para HGF. Este decréscimo na apoptose não correu quando as culturas foram incubadas com um anticorpo de controlo sem especificidade para HGF. Estes dados apoiam im papel para HGF derivado de MSCs na aceleração da taxa de apoptose de SCs.

Em sumários, os dados apresentados no Exemplo 3 demonstram que MSCs são capazes de inibir a função proliferativa e fibrinogénica de SCs ativadas através de sinalização parácrina e como uma função do número de MSCs. Esta inibição é causada por IL-10 e TNF-α derivados de MSCs, que atuam sinergicamente. A secreção de IL-10 por MSCs é uma resposta dinâmica à secreção de IL-6 por SCs actovadas. A secreção de IL-10 por MSCs em resposta a TNF-α foi observada após estimulação exógena, mas não durante mono-ou coculturas. Este resultado presumivelmente reflete os elevados níveis de estimulação usados in vitro (p.ex., aproximadamente 25 ng ml-1) comparativamente com os baixos níveis medidos em cocultura (p.ex., aproximadamente 2,5 ng ml-1). Esta observação fortemente sugere que uma concentração limiar de TNF-α é necessária para induzir a expressão de IL-10 em MSCs. IL-6 e TNF-α também aumentam a sinalização fator nuclear (NF)-kappa B em vários tipos de células. Assim, NF-kappaB pode também desempenhar um papel na expressão de citocinas por parte de MSCs durante a inflamação. MSCs também induziram apoptose em SCs ativadas, que é mediada por HGF. 0 efeito de HFG derivadas de MSCs e IL-10 é provavelmente suplementar à sinalização autócrina destas proteínas em SCs. Os dados acima descritos encontrma sumarizados na FIG. 9.

Estes estudos demonstram pela primeira vez que MSCs atuam através de múltiplos mecanismos para coordenar uma resposta integrada, dinâmica à inflamação, particularmente fibrose. Mecanismos imunoprotetores similares podem também influenciar o fenótipo de hepatócitos, células de Kupffer, células endoteliais sinusoidais, e células imunitárias que infiltram o figado durante a inflamação.

Exemplo 4 - Terapia Acelular Baseada em MSCs - Produção de um Meio Condicionado Acelular para MSCs (CM-MSC)

Este exemplo demonstra a produção de uma composição CM-MSC. MSCs foram isoladas e caracterizadas como descrito no

Exemplo 1 e Exemplo 2. Nalgumas formas de realização, MSCs foram caracterizadas com base na deteção de marcadores expressos na superfície celular (p.ex., CD14-, CD105+, CD34-, CD45-, CD106+ e CD44+). As células que não satisfizeram os critérios de caracterização descritos no Exemplo 2 foram descartadas. Nalgumas formas de realização, MSCs humanas foram fornecidas pelo Centro Tulane para Terapia Genética.

Uma composição CM-MSC foi produzida através da cultura de MSCs até uma densidade celular máxima de 70-80% confluência. As células não foram permitidas entrarem em fase de diferenciação. Por outras palavras, MSCs foram mantidas num estado indiferenciado. Nalgumas formas de realização, a diferenciação de MSCs foi monitorizada usando os critérios de caracterização descritos no Exemplo 2. Nalgumas formas de realização, uma confluência de 70-80% corresponde a lxlO6 MSCs por frasco de cultura de 175 cm2. Nalgumas formas de realização, uma composição CM-MSC foi produzida usando 2xl06 MSCs, que foram obtidas usando dois frascos de cultura de 175 cm2 com cada frasco a conter lxlO6 células. CM-MSC foi preparado como se segue; 1. (1) MSCs 70-80% confluentes foram lavadas exaustivamente com uma solução-tampão fosfato salina (PBS); 2. (2) MSCs de (1) foram cultivadas em 15 ml de meio DMEM desprovido de soro suplementado com 0,05% albumina de soro bovino para prevenir a agregação de proteínas; 3. (3) MSCs foram cultivadas durante 24 horas; 4. (4) meio de cultura foi recolhido de (3); e 5. (5) meio de cultura recolhido foi concentrado 25-vezes (p.ex., 25 vezes) usando ultrafiltração com um cutoff de 3 kD. A composição CM-MSC foi concentrada usando unidades de ultrafiltração (Amicon Ultra-PL 3, Millipore, Bedford, MA, USA) . A composição CM-MSC foi fracionada em frações de ligadas a heparina e frações não-ligadas a heparina. Para as experiências de fracionamento, uma composição CM-MSC concentrada foi passada através de uma coluna de heparina-agarose de acordo com as instruções do fabricante. Sucintamente, as colunas foram iniciadas com 10 equivalentes de solução-tampão de ligação (10 mM fosfato de sódio, pH 7,0) . A amostra foi aplicada, seguida por 10 volumes equivalentes de solução-tampão de ligação, que foi considerada como a fração não-ligada a heparina. A fração ligada foi eluida como 10 volumes de solução-tampão de ligação suplementada com 1 M NaCl. As frações lavadas e eluidas foram recolhidas separadamente. As frações lavadas e eluidas foram recolhidas e reconcentradas, como acima descrito.

Exemplo 5 - Indução FHF Experimental e Regimes de

Tratamento

Este Exemplo demonstra a indução de FHF num modelo animal experimental. A indução de insuficiência hepática fulminante (FHF) foi previamente reportada (Shinoda et ai., J. Surg. Res., 137:130-140, 2007). Sucintamente, ratos Sprague-Dawley machos pesando 250-300g forma usados para experiências FHF. Hepatócitos foram isolados de ratos Lewis fêmeas com 150-200g. Todos os animais (Charles River Laboratories, Boston, MA) foram manuseados de acordo com as normas delineadas pelo Comité de Recursos Laboratoriais, National Institutes of Health. FHF foi induzido usando duas injeções de Gal-N (Sigma Aldrich, St Louis, MO), dissolvido fresco em solução 0,9% NaCl e administrado i.p. com um intervalo de 12-horas. Diferentes dosagens de Gal-N foram escolhidas para análise tecidular (0,6 g/kg) e estudos de sobrevivência (1,2 g/kg), baseados em estudos prévios. Quando apropriado, vinte e quatro horas antes da indução FHF, 0,9 ml de CM-MSC ou de solução 0,9% NaCl (controlo veiculo) foi injetada através da veia peniana sob anestesia cetamina/xilazina (110 mg/kg e 0,4 mg/kg i.p. respetivamente). Animais recebendo 0,6 g/kg foram sacrificados 36 horas mais tarde para recolhimento de tecidos. A sobrevivência foi monitorizada a cada 12 horas durante 28 dias.

Exemplo 6 - Terapia CM-MSC Inibe Mudanças Hepáticas

Grosseiras

Este Exemplo demonstrou um efeito hepatoprotetor de CM-MSC. FHF induzida por Gal-N é tipicamente acompanhada por mudanças caracteristicas na aparência grosseira do figado consistindo de palidez aumentada e uma consistência macia e atrofiada. FHF foi induzida em ratos Sprague-Dawley usando Gal-N, como descrito no Exemplo 5. Animais foram tratados com infusões sistémicas de CM-MSC concentrado com com veiculo (controlo). Uma dose subletal de Gal-N (0,6 g/kg) foi usada para análise de tecidos 36 horas após tratamento e 1,2 g/kg Gal-N foram administrados para estudos de sobrevivência. As histologias do figado foram analisadas como se segue.

Espécimes de fígado, fixados em formalina, embebidos em parafina foram seccionados a 4 ym e corados com hematoxilina &amp; eosina (H&amp;E). A avaliação histológica foi realizada por um observador imparcial, que avaliação as secções de fígado usando os seguintes critérios: "0" para histologia normal, "1" para morte hepatocelular menor e inflamação, "2" necrose amplamente dispersa com inflamação, "3" para disrupção lobular completa e necrose difusa de hepatócitos com inflamação panlobular, e "4" para mortalidade.

Neste ensaio, um de quatro animais de controlo morreu antes dos animais serem sacrificados, confirmando que a extensão das lesões no modelo usado se tornava rapidamente fatal. A necropsia não foi realizada neste animal, mas com base na nossa experiência prévia com este modelo, esperamos que este aparecimento grosseiro seja anormal.

Dois dos três fígados de controlo remanescentes, que se revelavam macios e atrofiados com uma anormal palidez e com uma superfície com textura rugosa. O fígado de um rato tratado com veículo aparentou estar normal. Em contraste, nenhum dos 4 fígados tratados com CM-MSC demonstrou mudanças patológicas grosseiras. Em contraste com os fígados de controlo afetados, os fígados de animais tratados com CM-MSC apresentavam maiores dimensões com uma coloração escura e uma superfície brilhante típica de um fígado saudável.

Como representado na FIG. 10, dois dos 16 animais de controlo (12,5%) sobreviveram ao período completo de observação. Todos os outros ratos tratados com veículo (87,5%) morreram no espaço de 60 horas. No grupo CM-MSC, 2 dos 8 animais (25%) morreram nas primeiras 60 horas. Quatro (50%) sobreviveram ao período de estudo de 28 dias. No geral, o tratamento com CM-MSC significativamente melhorou a sobrevivência de FHF induzida por Gal-N (p = 0,017) .

Exemplo 7 - Tratamento com CM Subregla a Inflamação

Sistémica

Lesão Hepático grave (p.ex., após tratamento com Gal-N) pode resultar numa resposta inflamatória local e sistémica que pode ultimamente levar a insuficiência multiórgãos e morte. Para investigar a resposta inflamatória sistémica em animais expostos a Gal-N, amostras de soro foram recolhidas de animais Gal-N 36 horas após tratamento com uma injeção sistémica de CM-MSC (n = 4) ou veículo (n = 3) e analisados por ELISA, como se segue.

Amostras de sangue foram centrifugadas a 12,000 rpm durante 15 minutos numa microcentrífuga e soro foi recolhido para análise. A quantificação de IL-Ιβ murina, TNF-α, IL-6, IL-2, antagonista do recetor de interleucina-1 (IL-lra) e IL-10 foi determinado usando ELISA seguindo as instruções do fabricante (R&amp;D Systems, Minneapolis, MN).

Como representado nas FIGs. 11A-F, análise dos níveis sistémicos de citocinas revelou um decréscimo não-significativo para IL-Ιβ (p = 0,054), mas níveis significativamente diminuídos de TNF-a (64%) (p = 0,0002) e IL-6 (54%) (p = 0,0002), todas as quais são citocinas pró-inflamatórias conhecidas por serem sobrerreguladas após lesão hepática. Níveis de IL-2 não variaram (p = 0,43) . Em contraste, a concentração de IL-lra foi 87% mais baixa em animais tratados com CM-MSC (p = 0,0002) . Os níveis da citocina anti-inflamatória IL-10 foram aumentados 4-vezes em animais tratados com CM-MSC (p = 0,032) .

Estes estudos mostram que a infusão de sobrenadantes de MSC subregula a inflamação sistémica tipicamente associada com FHF.

Exemplo 8 - CM-MSC Melhora a Patologia Hepática

Trinta e seis horas após o tratamento sistémico com CM-MSC ou veiculo, as amostras de figados de ratos Gal-N foram analisadas por coloração hematoxilina &amp; eosina (H&amp;R) secções embebidas em parafina.

Avaliação microscópica de secções de figado marcadas com coloração H&amp;E revelou profunda morte hepatocelular com vacuolização citoplasmática, infiltração de leucócitos mononucleadas panlobular e grave distorção da arquitetura tecidular em animais tratados com veiculo. Em contraste, figados de animais tratados com CM-MSC demonstraram apenas infiltração periportal menor de células imunitárias com edema e deposição de fibrina, caracteristico de reparação tecidular. FIG. 12A mostra uma examinação histológica semiquantitativa confirmando diferenças significativas entre os grupos. A avaliação média no grupo CM-MSC foi de 1,5 ± 0,6 e 3,0 ± 0,8 para animais tratados com veiculo (p = 0,024) .

Quantificação de células imunitárias infiltrantes foi realizada usando o software de imagem com licença freeware ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Como representado na FIG. 12B, um decréscimo de 58% no número de células imunitárias infiltrantes foi observado após infusão CM-MSC (33 ± 9,3 comparativamente com 84 ± 37 nos controlos) (p = 0, 004) .

Estes resultados demonstram que a terapia com CM-MSC inibe o dano hepático e a infiltração de células imunitárias em FHF induzida por Gal-N.

Exemplo 9 - CM-MSC Inibe a Apoptose Hepatocelular In vivo

Apoptose hepatocelular foi analisada de acordo com os seguintes procedimentos.

Secções com quatro microns de espessura de tecido hepático fixado com formalina foram desparinizadas e rehidratadas após cozimento a 60 °C durante 1 hora. A atividade da Peroxidase foi bloqueada usando 3% peróxido de hidrogénio em etanol durante 15 minutos. O método "marcação de nicks por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase" (TUNEL) foi realizado usando o kit de deteção de apoptose in situ APOPTAG Peroxidase (Chemicon International, Temecula, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As secções foram desenvolvidas usando 3,3'-diaminobenzidina e com marcação de contraste com Hematoxilina de Gill. A quantificação da reatividade-TUNEL e células imunitárias infiltrantes foi realizada usando o software de imagem com licença freeware ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Dez imagens com ampliação de 40x tiradas aleatoriamente foram analisadas por animal. As partículas foram quantificadas usando critérios apropriados para tamanhos correspondentes dos núcleos. Partículas com área maior do que 700 ym2 foram analisadas para especificamente identificar hepatócitos de células inflamatórias e não-parênquimatosas.

Para determinar de a infusão CM-MSC decresce a morte celular apoptótica, o número de núcleos TUNEL-reativos nas secções de fígado foi determinada. Em secções de ratos tratados com veículos, muitos núcleos apoptóticos foram observados. Em contraste, poucos núcleos TUNEL-positivos estiveram presentes após tratamento com CM-MSC. A quantificação revelou uma redução de 90% nos núcleos TUNEL-positivos (8,3 ± 12 / campo de visão) comparativamente com os animais de controlo (81 ± 52) (p = 0, 009) . Estas observações confirmam que a terapia com CM-MSC efetivamente reduz a morte hepatocelular neste modelo de lesão hepática aguda.

Exemplo 10 - CM-MSC Inibe Apoptose de Hepatócitos in vitro A inibição de morte hepatocelular por terapia CM-MSC in vivo pode tanto ser um efeito direto de moléculas tróficas preservando células hepáticas, ou um efeito indireto, por exemplo através da inibição da resposta imunitária. Assim, a capacidade de CMMSC para inibir diretamente a apoptose foi avaliada em hepatócitos cultivados, como se segue.

Hepatócitos primários de rato foram isolados usando um procedimento de perfusão da colagenase de dois-passos como previamente descrito (Dunn et al., FASEB J., 3:174-177, 1989) . O rendimento foi rotineiramente 200-300 milhões de hepatócitos com viabilidade superior a 90% como determinado por exclusão com azul de tripano. O meio de cultura para os hepatócitos consistiu de meio DMEM suplementado com 10% FBS, 14 ng/ml glucagon, 0,5 U/ml insulina, 20 ng/ml fator de crescimento epidérmico (EGF), 7,5 yg/ml hidrocortisona, 200 yg/ml estreptomicina e 200 U/ml penicilina. As condições de cultura foram meio de cultura de hepatócitos para experiências de controlo; meio de cultura de hepatócitos misturado a um rácio 50:1 com CM-MSC concentrado 25 vezes (2% CM-MSC); e meio de cultura de hepatócitos misturado a um rácio 12,5:1 para 8% CM-MSC.

Hepatócitos primários isolados de ratos foram cultivados como acima descrito para um total de 7 duas em microplacas de 12-poços a uma densidade de lxlO5 células/cm2 numa configuração de colagénio em gel-sanduiche. A apoptose foi induzida usando Actinomicina D (1 hora) e TNF-a (8 horas) . Durante a exposição de TNF-α, hepatócitos foram cultivados em meio de cultura de hepatócitos apenas ou meio de cultura de hepatócitos suplementado com 2% ou 8% de CM-MSC concentrado 25-vezes. Os hepatócitos foram marcados usando um ensaio de fluorescência Live Dead (Molecular Probes). A morte celular foi quantificada usando análise digital de imagem relativamente a 4 imagens por poço. As experiências foram realizadas em triplicado.

Como representado na FIG. 14, um aumento de 22% na fração de células viáveis foi observado quando o meio de cultura de hepatócitos foi suplementado com 2% CM-MSC (46% células viáveis comparativamente com 38% células viáveis no grupo de controlo) (p = 0,005). Nenhum aumento significativo na viabilidade de hepatócitos foi observado com 8% CM-MSC (43%) (p = 0,15). Estas experiências demonstram que baixo nivel de CM-MSC tem um efeito antiapoptótico direto em hepatócitos. Por outras palavras, CM-MSC possui um efeito preservante direto em hepatócitos.

Salvamento/proteção da apoptose hepatocelular foi mais proeminente in vivo do que in vitro. Esta observação deve-se presumivelmente à inibição local e sistémica da resposta apoptótica.

Exemplo 11 - CM-MSC Aumenta a Regeneração Hepática A estimulação de programas de reparação endógenos é também um mecanismo potencial do efeito terapêutico promovido por CM-MSC acima descrito.

Amostras de figado de ratos Gal-N foram analisadas 36 horas antes da indução FHF com CM-MSC ou veiculo. Marcação de antigénio nuclear de células proliferativas (PCNA) foi realizada através do tratamento de secções com Tampão Citrato lOmM a pH 6,0 usando uma panela de pressão digital. Subsequentemente, as secções foram bloqueadas com soro de cavalo 1,5% durante 15 minutos e incubadas com anticorpo monoclonal murino anti-PCNA (Clone 24, BD Transduction Laboratories, San Jose, CA) a uma diluição 1:500 durante 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo primário foi detetado usando o kit Vectastain Elite ABC (Vetor laboratories, Burlington, CA) . As secções foram desenvolvidas usando 3,3'-diaminobenzidina e marcação de contraste com Hematoxilina de Gill. Células PCNA-reativas foram quantificadas e comparadas a animais tratados com veiculo. Como representado na FIG. 15, 3-vezes mais células PCNA-reativas foram observadas em figados tratados com CM-MSC comparativamente com os figados de controlo.

Os perfis de expressão de mRNA de 10 genes conhecidos por serem sobrerregulados durante a regeneração hepática foram obtidos através de RT-PCR, como descrito no Exemplo 3E. Combinações de oligonucleótidos no sentido direto e no sentido reverso estão representados na Tabela 3.

TABELA 3: Oligonucleótidos para RT-PCR

Bandas visivelmente mais notórias foram observadas para cada um dos genes analisados. Como representado na FIG. 16, esta observação foi confirmada usando análise quantitativa. Os aumentos variaram desde 4-vezes a 27-vezes.

Estes resultados demonstram que a administração de fatores solúveis derivados de MSC aumentam os programas de regeneração hepática durante FHF.

Exemplo 12 - CM-MSC Estimula a Proliferação de Hepatócitos in Vitro A duplicação de hepatócitos, um componente maior da regeneração hepática, é regulado por uma complexa interação de sinais parácrinos e endócrinos envolvendo tipos de células hepáticas não-parênquimatosas assim como órgãos extra-hepáticos. Para determinar se fatores derivados de MSC podem diretamente aumenta a replicação de hepatócitos, o efeito de CM-MSC na proliferação in vivo de hepatócitos primários isolados foi explorada.

Hepatócitos primários de ratos foram isolados como descrito no Exemplo 9. Os hepatócitos foram subsequentemente plaqueados a uma baixa densidade (1,25 x 103 células/cm2) numa camada alimentadora de fibroblastos 3T3 J2 (8 x 104 células/cm2) previamente expostos a 12 yg/ml mitomicina-C durante 2,5 horas para suspender o crescimento. Os hepatócitos foram permitidos proliferar com mudanças diárias de meio. 0 meio de cultura de hepatócitos é como descrito no Exemplo 9. Células foram cultivadas com 10 μΜ bromodesóxiuridina (BrdU; Sigma). Após 48 horas, as culturas foram fixadas em 70% etanol durante 45 minutos e tratadas com HC1 4N e 0,2% TRITONX-10. As células foram então incubadas em solução-tampão de bloquei durante 30 minutos e incubadas durante 60 minutos com anticorpo anti-BrdU-Alex594 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e anticorpo para albumina antirrato de coelho (ICN Pharmaceuticals, Aurora, OH) at 37°C, seguido por IgG anticoelho conjugado com FITC (ICN Pharmaceuticals) à temperatura ambiente. Células Brdu-positivas em cada colónia de hepatócitos foram contadas em imagens de microscopia de fluorescência. O conteúdo de albumina em amostras de sobrenadante foi determinado por ensaio de imunoadsorção enzimática competitiva (ELISA9 usando albumina murina purificada e um anticorpo antialbumina conjugado com peroxidase (MP Biomedicals, Aurora, OH) . 0 conteúdo de ureia foi determinado com um kit comercialmente disponível (StanBio Laboratory, Boerne, TX) de acordo com as instruções do fabricante. A proliferação de colónias de hepatócitos murinos numa camada alimentadora de fibroblastos 3T3 como crescimento suspendido pode ser visualizada por dupla marcação imunofluorescente com BrdU e albumina. Como representado na FIG. 17A, com suplementação de 2% CM-MSC (representada no gráfico como 2), um aumento de 79% em hepatócitos BrdU-positivos foi observado (93± 12 por campo de visão com CM-MSC vs. 52 ± 14 nas culturas dos controlos) (p = 0,001) . Quando o meio foi suplementado com 8% CM-MSC (representado no gráfico como "8")/ nenhum aumento significativo foi medido (59 ± 14 BrdU) (p = 0,37) .

Como representado na FIG. 17B, em paralelo com estas descobertas, a quantidade total de albumina secretada e ureia sintetizada por poço foi aumentada em culturas suplementadas com 2% CM-MSC. Os niveis de albumina foram 29 ± 2,4 pg/ml/day, comparativamente com 20 ± 1,2 pg/ml/d nas condições dos controlos (p = 0,006). Nenhuma diferença significativa comparativamente com o controlo foi observada em condições 8% CM-MSC (23 ±2,2 pg/ml/d) (p = 0,14).

Como representado na FIG. 17C, a sintese de ureia variou de 69 ± 8,1 yg/ml/d nas culturas dos controlos para 90 ± 10 yg/ml/d nas condições 2% CM-MSC (p = 0,019), mas não foi significativamente alterada na presença de 8% CM-MSC (53,1 yg/ml/d) (p = 0,063).

No geral, assim, marcadores da proliferação e função de hepatócitos foram significativamente mais elevados na presença de 2% CM-MSC in vitro. Embora 8% CM-MSC também tenha tido um efeito na proliferação e função de hepatócitos in vitro, não foi tão pronunciada como os níveis observados para 2% CM-MSC.

Os dados aqui apresentados claramente demonstram que CM-MSC é capaz de aumentar a proliferação de hepatócitos. CM-MSC aumentou o número de células proliferativas pelo menos 3 vezes na regeneração de um fígado lesado. As células MSC não são requeridas para as observações acima descritas. Fatores secretados contidos em CM-MSC são suficientes para protegerem hepatócitos de apoptose e promoverem a proliferação de hepatócitos. Assim, infusão sistémica de CM-MSC representa uma estratégia eficaz para a terapia MSC.

Exemplo 13 - Fatores derivados de MSCs revertem Insuficiência hepática fulminante

Este exemplo demonstra que moléculas derivadas de MSCs fornecem benefícios de sobrevivência contra a perda de células parenquimatosas, onde a perda de células é integrada com uma resposta imunitária local e sistémica, após a administração intravenosa de bólus de CM-MSC e/ou perfusão extracorporal com um biorreator contendo MSCs (p.ex., MSCs indiferenciadas).

Ratos Sprague-Dawley foram administrados intraperitonealmente com um total de duas injeções de 1,2 g/kg de uma hepatotoxina, D-galactosamina (Gal-N), separadas por 12 horas, como descrito no Exemplo 5.

Animais tratados 24 horas mais tarde com injeções intravenosas na veia peniana de (1) MSCs integrais ou (2) lisados de MSCs. As MSCs foram isoladas e caracterizadas como descrito nos Exemplos 1 e 2.

Um total de 2 x 106 células foram administradas a cada sujeito para terapia com células MSC integrais. 0 volume de MSCs integrais foi de 500 μΐ.

Lisados celulares foram preparados por sonicação. A dose de células sonicadas administradas foi de 2xl06 células por sujeito. O volume de lisado MSC foi de 500 μΐ. Contrariamente a CM-MSC, o lisado de MSC não foi concentrado.

Veiculo (PBS) e lisados celulares de fibroblastos NIH 3T3 foram administrados como controlos. O volume de cada controlo foi de 500 μΐ.

Como representado na FIG. 18, nenhum beneficio significativo foi visivel após a infusão intravenosa de 2 x 106 MSCs humanas. Esta observação deve-se presumivelmente ao pobre enxerto, aprisionamento na camada capilar alveolar, e/ou rejeição imunitárias das células. Em contraste, tratamento com lisados celulares, derivados da mesma massa celular usada para o transplante, mostrou uma tendência para sobrevivência aumentada comparativamente com o veiculo (P < 0,47) e controlos de lisado fibroblástico (P < 0,36) .

Exemplo 14 - Componentes derivados de MSCs revertem FHF

As experiências descritas neste Exemplo demonstram que componentes derivados de MSCs promovem sobrevivência em modelos-FHF e que este efeito não é específico para uma espécie, p.ex., o potencial terapêutico de CM-MSC não +e específico para uma espécie.

Como representado na FIG. 19A, um estudo longitudinal usando CM-MSC de 2 x 106 MSCs humanas revelou um benefício de sobrevivência distinto comparativamente com meio concentrado com o veículo (P < 0,032) e fibroblasto (P < 0,026) . A sobrevivência a 72 horas de ratos induzidos com FHF foi monitorizada como uma função da massa de MSCs a partir da qual o CM-MSC foi recolhido. Como representado na FIG. 19B, CM-MSC foi mars eficaz quando derivada de uma massa de MSC de 2 x 106 células. A observação que lisados e sobrenadantes de MSC xenogénicos decresceram a mortalidade animal sugerem que estes fatores podem atravessar barreiras específicas. Assim o potencial terapêutico de CM-MSC não é específico para uma espécie.

Exemplo 15 - Função Metabólica e Secretória em EB-MSC fornece Hepatoprotecção e Beneficio de Sobrevivência

Um biorreator extracorporal-MSC (EB-MSC) foi desenvolvido para combinar a eficácia de células integrais de MSC e CM-MSC num único dispositivo. A operação de um dispositivo extracorporal foi previamente reportada (Shinoda et ai., J. Surg. Res., 137:130-140, 2007). Sucintamente, ratos Sprague-Dawley machos pesando entre 280 e 370 gramas foram anestesiados usando injeções intraperitoneais de cetamina e xilazina a 110 e 0,4 mg/kg, respetivamente. A artéria carótida esqueda e a veia jugular direita foram canuladas e o animal foi colocado numa jaula metabólica. Vinte e quatro horas mais tarde, 1,2 g/kg Gal-N fresco dissolvido em solução fisiológica salina e ajustado a pH 7,3 com NaOH 1 N foi injetado i.p., seguido por uma segunda injeção igual 12 horas mais tarde, como descrito no Exemplo 5. Vinte e quatro horas após a primeira injeção de Gal-N, as linhas arterial e venosas foram ligadas a um circuito extracorporal. 0 plasma foi separado usando um separador de plasma (MicroKros, tamanho do poro 0,2 micron). O plasma foi perfusionado através de um biorreator com pratos planos, de policarbonato, e subsequentemente reunido com os componentes celulares do sangue e devolvido ao animal. O biorreator extracorporal foi operado durante 10 horas. Os animais que morreram durante a operação do reator e falharam em receber o tratamento adequado (EB-MSC, N = 3 e Fibroblasto-EB, N = 2) foram censurados para análise. A sobrevivência dos animais foi monitorizada a cada 12 horas. O plasma ou o sangue completos foram analisados quanto á presença de biomarcadores de lesão hepática (p.ex., alanina aminotransferase sérica (ALT), aspartato aminotransferase sérico (AST)) usando um ensaio metabólico microfluidico (Picollo, Abaxis, Union City, CA). Uma representação esquemática exemplificativa de um circuto extracorporal é representada na FIG. 20.

Os animais foram tratados 24 horas após a indução de FHF com um EB-MSC ligado à circulação sistémica do animal. Biorreatores plaqueados com fibroblastos (EB-fibroblastos) e biorreatores acelulares (EB-acelulares) serviram como controlos. Após 10 horas de perfusão extracorporal, os animais foram retirados do apoio auxiliar e foram monitorizados quanto à sua sobrevivência. O plasma foi obtido no inicio de, e 24 horas após, o tratamento de biorreacores e analisados para a libertação de enzimas de hepatócitos. Como representado nas FIGs. 21A-B, serologias hepáticas, incluindo aspartato aminotransferase (AST; P < 0,02) e alanina aminotransferase (ALT; P < 0,001) foram melhoradas em animais tratados com EB-MSC. Estes dados demonstram um efeito hepatoprotector da terapia com este tipo de dispositivos como demonstrado pela redução nos marcadores bioquímicos de morte de hepatócitos. Como representado na FIG. 21C, 71% dos animais tratados com EB- MSC sobreviveu, comparativamente com 14% no controlo acelular (P < 0,037) e no controlo de fibroblastos (P < 0,05) . A Tabela 5 mostra as serologias hepáticas após tratamento com EB-MSC. TABELA 5: Serologias hepáticas são melhoradas após

Tratamento com EB-MSC

Os dados são expressos como a média ± erro padrão da média (SEM) . A percentagem de mudança refere-se ao momento pós-EB-MSC (24 horas) relativamente ao momento pré-EB-MSC. (-) corresponde a EB sem MSCs. N = 5 para (-). N = 3 para (+). Nenhum dado considerado devido à existência de mortalidade (N/A).

Como representado na Tabela 5, serologias hepáticas foram melhoradas após tratamento com EB-MSC.

Exemplo 16 - Terapia CM-MSC Inibe a Invasão de Leucócitos Panlobular, Duplicação do dueto biliar e morte hepatocelular

Mudanças histopatológicas pós-CM-MSC foram avaliadas usando um regime de dosagem subletal de Gal-N (0,6 g/kg) para induzir lesão hepática aguda, enquanto assegurando a sobrevivência no nosso grupo tratado com controlo para efeitos de comparação. Deverá ser notado que mesmo até a esta dose de Gal-N, a mortalidade ocorreu num grupo tratado com veículo (N = 1) . Isto confirma que a extensão da lesão neste modelo pode ainda assim er fatal. Ratos lesados administrados como Gal-N foram tratados com veículo (N=4) ou CM-MSC (N=4) 24 horas após lesão e os seus fígados foram recolhidos 36 horas após para análise patológica. O tecido hepático foi recolhido de ratos induzidos com um regime subletal de Gal-N (0,6 g/kg), 36 horas após tratamento com CM-MSC. O tecido foi fixado em formalina tamponizada 10%, embebida em parafina, seccionada até uma espessura de 6-ym, e marcada com hematoxilina e eosina.

Avaliação microscópica de tecido hepático de ratos tratados com veículo revelou uma profunda apoptose hepatocelular, duplicação do dueto biliar e infiltração de leucócitos mononucleadas panlobular com vacuolização citoplasmática e grave distorção da arquitetura tecidular. Ratos tratados com CM-MSC não mostraram sinais de inflamação disseminada, embora uma infiltração periportal menor com edema e deposição de fibrina consistente com reparação tecidular tivesse sido observada.

Histopatologia foi avaliada usando os critérios descritos no Exemplo 6 ("0" para histologia normal, "1" para morte hepatocelular menor e inflamação, "2" necrose amplamente dispersa com inflamação, "3" para disrupção lobular completa e necrose difusa de hepatócitos com inflamação panlobular, e "4" para mortalidade). Claramente, figados tratados com CM-MSC apresentaram uma pontuação menor do que figados tratados com veiculo. Números mais baixos de leucócitos infiltrantes foram observados em figados tratados com CM-MSC.

Exemplo 17 - CM-MSC Altera a Migração de Células Imunitárias para o Fígado

Para investigar se a ausência de infiltração de leucócitos panlobular observada em figados tratados com CM-MSC pode ser devida à diversão dependente de CM-MSC da migração de células imunitárias para longe de um órgão-alvo, inflamado, leucócitos marcados radioactivamente foram adotivamente transferidos diretamente após tratamento com CM-MSC ou veiculo em ratos com lesões hepáticas administrados com Gal-N (0,6 g/kg). Sucintamente, leucócitos foram isolados de sangue completo de rato por lise de eritrócitos promovida por NH4C1. As células foram centrifugadas, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em solução 0,9% salina contendo o isótopo oxina Inlll (GE Healthcare Biosciences Corp., Piscataway, NJ). As células foram marcadas a 92% de eficiência com elevada viabilidade. Aproximadamente 15xl06 células foram infundidas na veia peniana de ratinhos lesados administrados com Gal-N (0,6 g/kg) diretamente após tratamento com veiculo ou CM-MSC. O tráfico de leucócitos nestes animais usando tomografia computorizada de emissão de fotão único (SPECT) ao longo do tempo. Imagens SPECT foram capturadas usando uma configuração de câmara gama M.CAM (Siemens Medicai Systems, Malvern, PA) a 0, 3 e 24 horas após infusão de leucócitos. Uma ilustração deste protocolo é fornecida na FIG. 22.

Qualitativamente, mais leucócitos foram observados migrando para o figado ao longo do tempo em animais tratados com veiculo. Em contraste, houve um distinto decréscimo na intensidade do sinal no figado de animais tratados com CM-MSC ao longo do tempo. Estes resultados sugerem que existe uma pressão seletiva em leucócitos para emigrarem do figado devido a CM-MSC, contrariamente às condições do controlo onde leucócitos eventualmente migraram para o órgão lesado.

Como representado na FIG. 22B, em ratos administrados com uma dose subletal de Gal-N (0,6 mg/kg), mudanças dramáticas nas contagens de leucócitos e diferenças foram observadas nas populações de sangue periférico em animais tratados com CM-MSC. A distribuição de leucócitos foi também avaliada ao nivel dos órgãos. Os animais foram sacrificados nos pontos temporais de 0,5 horas, 8 horas, e 24 horas. S niveis de leucócitos foram determinados para órgãos indicados usando detetores de cintilação.

Como representado na FIG. 22C, órgãos linfoides e o figado são os locais primários de atividade de CM-MSC (50% dos órgãos sólidos totais às 24 horas). Uma considerável atividade CM-MSC foi contudo, observada em cada um dos órgãos analisados.

Estes dados apoiam a noção de que migração alterada de leucócitos pode ser um potencial alvo para a terapia CM- MSC. Estes dados também suportam o uso sistémica da terapia CM-MSC, p.ex, para o tratamento de insuficiência multiórgãos num sujeito. Assim, a terapia CM-MSC pode fornecer um efeito benéfico nos seguintes órgãos, o pulmão, o coração, o pâncreas, o GI, o timo, o nódulo linfático, a medula óssea, o baço, o figado, e o sangue.

Exemplo 18 - Caracterização de CM-MSC

Num esforço para entender os mediadores moleculares dos efeitos observados na terapia com MSC, examinamos CM-MSC usando um array de proteínas de elevada densidade.

Sucintamente, sobrenadantes MSC foram preparados através da recoleção de meio desprovido de soro após 24 horas de culturas de aproximadamente 2xl06 MSCs. Os sobrenadantes foram analisados por um painel de proteínas especificas usando um array com anticorpo (RAYBIO Human Cytokine Antibody Array C Series 2000, RayBiotech Inc., Norcross, GA) como especificado pelo fabricante.

Como representado na FIG. 23A, CM-MSC continha 69 das 174 proteínas analisadas, que incluíram um amplo espectro de moléculas envolvidas na imunomodelação e na regeneração hepática. Como representado na FIG. 23B, análise de clusters revelou que uma grande fração (30%) de CM-MSC era composta de quimiocinas, muitas das quais são expressas a elevados niveis. CM-MSC foi então fracionado com base na funcionalidade usando métodos baseados em afinidade em vez de outros critérios moleculares arbitrários tais como o tamanho ou a hidrofobicidade, como se segue. CM-MSC foi passado através de uma coluna de afinidade impregnada com sulfato de heparina, um conhecido ligando para todas as quimiocinas e separando assim as frações ligadas a heparina das frações não-ligadas a heparina. Cada fração foi infundida em ratos tratados com FHF com sobrevivência global até ao ponto final do estudo.

Como representado na FIG. 23C, a atividade terapêutica de CM-MSC foi restringida à fração ligada a heparina, fornecendo uma forte correlação entre quimiocinas e o beneficio de sobrevivência após infusão de CM-MSC em ratos induzidos com FHF. CM-MSC não aumentou os niveis de expressão de mRNA do fator de transcrição Foxp3 em células mononucleadas do sangue periférico. A expressão de Foxp3 é restrita a células T regulatórias, uma população de linfócitos supressores endógenos. CM-MSC é quimiotacticamente ativa, enquanto que CM-fibroblastos é inerte. Isto foi avaliado usando uma câmara de quimiotaxia microfluidica como previamente descrita (Jeon et ai., Nat. Biotech., 20:826-830, 2002). Os neutrófilos expostos a CM-fibroblastos não apresentaram mudanças morfológicas envolvidas com quimiotaxia, enquanto que neutrófilos expostos a CM-MSC apresentam proeminentes extensões filopodiais e são quimiotacticamente preparados.

Um componente de CM-MSC que pode ser responsável para uma replicação aumentada de hepatócitos é SDF-la. Hepatócitos foram proliferados usando as técnicas acima mencionadas em meio de cultura estandardizado sozinho ou suplementado com 5 ng/ml SDF-la (FIG 29B) ou o antagonista do recetor SDF-la, AMD3100 at 1 uM. Estimulação aumentada de SDF-la originou colónias de maiores dimensões, enquanto que o bloqueio da sinalização SDF-la originou colónias mais pequenas. FIG. 24 mostra a s+intese de ureia em células tratadas com SDF-la e AMD3100. A síntese de ureia é um biomarcador substituto para a massa de hepatócitos; os resultados mostram diferenças significativas entre as condições do controlo e a modelação da via de sinalização SDF-la.

Também aqui descrito está: (1) Um sistema para o tratamento sangue ou plasma proveniente de um mamifero, o sistema compreendendo um biorreator extracorporal (EB) compreendendo um compartimento de tratamento de fluido e um compartimento celular, e uma barreira seletivamente permeável separando o compartimento de tratamento de fluido e o compartimento celular, onde o compartimento celular compreende uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs). (2) 0 sistema de (1), onde o compartimento celular adicionalmente compreende uma população de hepatócitos primários. (3) 0 sistema de (1), onde a barreira seletivamente permeável compreende um conjunto de fibras ocas. (4) 0 sistema de (1), onde o EB adicionalmente compreende uma entrada de fluido biológico e uma sarda de fluido biológico, onde a entrada de fluido biológico e a sarda de fluido biológico permitem a comunicação de fluido entre o compartimento de tratamento de fluido e a corrente sanguinea de um mamifero. (5) 0 sistema de (1), adicionalmente compreendendo uma pluralidade de bombas para circular o sangue ou plasma através do compartimento de tratamento de fluido. (6) 0 sistema de (1), o sistema adicionalmente compreendendo um cartucho de ultrafiltração em comunicação de fluido com um compartimento de tratamento de fluido. (7) Um método de tratamento de doença hepática num sujeito, o método compreendendo: (a) identificação de um sujeito possuindo uma doença hepática; (b) fornecimento de um sistema para o tratamento de sangue ou plasma de um mamifero, o sistema compreendendo um biorreator extracorporal (EB) compreendendo um compartimento de tratamento de fluido e um compartimento celular, e uma barreira seletivamente permeável separando o compartimento de tratamento de fluido e o compartimento celular, onde o compartimento celular compreende uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs); e (c) exposição do plasma ou sangue dos sujeitos aos MSCs no EB. (8) 0 método de (7), onde o sujeito é identificado através da avaliação do nivel de um marcador sérico de função hepática. (9) 0 método de (8), onde o marcador sérico de função hepática é selecionado do grupo consistindo de lactato desidrogenase (LDH) , fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina sérica, albumina e globulinas. (10) O método de (7), onde o EB adicionalmente compreende uma população de hepatócitos primários. (11) Um método para o tratamento de sangue ou plasma de um sujeito possuindo uma doença hepática, o método compreendendo: (a) identificação de um sujeito possuindo uma doença hepática; (b) fornecimento de um sistema compreendendo um biorreator extracorporal (EB) compreendendo um compartimento de tratamento de fluido e um compartimento celular, e uma barreira seletivamente permeável separando o compartimento de tratamento de fluido e o compartimento celular, onde o compartimento celular compreende uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs); (c) remoção do sangue ou plasma do sujeito; (d) introdução do sangue ou plasma no compartimento de tratamento de fluido do EB; e (e) permitir que o sangue ou plasma flua através e saia do compartimento de tratamento de fluido, assim tratando o sangue ou plasma. (12) 0 método de (11), onde o sujeito é identificado através da avaliação do nivel de um marcador sérico de função hepática. (13) 0 método de (12), onde o marcador sérico de função hepática é selecionado do grupo consistindo de lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST) , alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina sérica, albumina e globulinas. (14) 0 método de (12), onde o EB adicionalmente compreende uma população de hepatócitos primários. (15) Um método de preparação de uma composição para o tratamento de doença hepática, o método compreendendo: (i) obtenção de uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs); (ii) cultura de MSCs num meio; (iii) obtenção do meio; (iv) fracionamento do meio; (v) seleção de uma fração do meio que é capaz de uma ou mais ações de promoção da proliferação de hepatócitos ou inibição da morte de hepatócitos; e (vi) opcionalmente, formulação da fração selecionada para administração a um mamífero. (16) 0 método de (15), onde a composição é concentrada 25-vezes. (17) 0 método de (16), onde o meio compreende um meio de cultura de tecidos desprovido de soro ou solução-tampão fosfato salina (PBS). (18) 0 método de (15), adicionalmente compreendendo a liofilização da composição. (19) Uma composição fornecida pelo método de (15). (20) Um método de tratamento de doença hepática num sujeito, o método compreendendo a identificação de um sujeito com sua necessidade relacionada, e administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo Meio Condicionado para MSCs (CM-MSC). (21) O método de (20), onde o sujeito é identificado através da avaliação de um nível de um marcador sérico de função hepática. (22) O método de (21), onde o marcador sérico de função hepática é selecionado do grupo consistindo de lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina sérica, albumina e globulinas. (23) O método de (21), onde o tratamento continua até que o nível no sujeito de um marcador sérico de função hepática se encontra na gama normal como determinado pelo médico responsável pelo sujeito. (24) 0 método de (21), onde a doença hepática a ser tratada é insuficiência hepática aguda, insuficiência hepática fulminante, ou fibrose hepática. (25) 0 método de (21), onde a composição é administrada usando uma técnica intravenosa com bólus. (26) 0 método de (21), onde o CM-MSC é obtido por um método compreendendo: (a) obtenção de uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs); (b) cultura de MSCs num meio; (c) obtenção do meio; (d) opcionalmente, formulação da fração selecionada para administração ao sujeito. (27) 0 método de (21), onde o CM-MSC é obtido por um método compreendendo: (a) obtenção de uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs); (b) cultura de MSCs num meio; (c) obtenção do meio; (d) fracionamento do meio; (e) seleção de uma fração do meio que é capaz de uma ou ambas as ações de promoção da proliferação de hepatócitos e inibição da morte de hepatócitos; e (f) opcionalmente, formulação da fração selecionada para administração ao sujeito. (28) Um método para a identificação de um composto biologicamente ativo para tratamento de uma doença hepática, o método compreendendo; (a) obtenção de uma ou mais frações de um meio contendo fatores secretados de uma população de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs); (b) análise da capacidade de uma ou mais das frações para promover uma ou ambas as funções de proliferação de hepatócitos ou inibição da morte de hepatócitos; (c) seleção de uma fração do meio que promove uma ou ambas as funções de proliferação de hepatócitos ou inibição da morte celular; e (d) identificação de uma ou mais moléculas presentes na fração selecionada. (29) 0 método de (28), onde as frações são obtidas de acordo com tamanho. (30) O método de (28), onde as frações são obtidas de acordo com carga. (31) O método de (28) onde a fração do meio é uma fração ligada a sulfato de heparina do meio.

OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

Deverá ser entendido que enquanto a invenção tenha sido descrita em conjugação com a descrição detalhada relacionada, a descrição anexa pretende ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, que é definida pelo âmbito das reivindicações anexas. Outros aspetos, vantagens e modificações encontram-se no âmbito das seguintes reivindicações.

Lisboa, 9 de junho de 2016

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um dispositivo de auxilio hepático extracorporal compreendendo uma população purificada de células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs).
2. 2. Um dispositivo de auxilio hepático extracorporal de acordo com a reivindicação 1, onde a população purificada de MSCs indiferenciadas a. é essencialmente livre de material celular não-MSC, ou b. é 100% MSCs, ou c. permanece indiferenciada, ou d. encontra-se em solução não compreendendo soro animal, ou e. é derivada da medula óssea.
3. 3. Um cartucho para biorreator extracorporal compreendendo células estaminais mesenquimatosas indiferenciadas (MSCs) e uma barreira semipermável que permite passagem de macromoléculas mas não de MSCs.
4. 4. Um cartucho para biorreator extracorporal de acordo com a reivindicação 3, onde o cartucho é fornecido para uma utilização única com um paciente.
5. 5. Um kit compreendendo o cartucho da reivindicação 3, um ou mais agentes tamponizantes farmaceuticamente aceitáveis, e instruções para instalação do cartucho num dispositivo de auxilio hepático extracorporal. Lisboa, 9 de junho de 2016