JP3117994B2 - 永久的ヒト肝細胞の細胞系および肝臓補助装置（ｌａｄ）におけるその使用 - Google Patents

永久的ヒト肝細胞の細胞系および肝臓補助装置（ｌａｄ）におけるその使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は米国政府の支持でなされた。米国政府は本発
明においてある種の権利を有する。
緒言 発明の分野 細胞生物学的および医学の分野における本発明は、正
常の機能をもつ肝細胞の永久的細胞系およびそれらの使
用方法、とくに肝臓補助装置および肝細胞の代謝および
調節の研究における細胞系の使用方法に関する。
発明の背景 激症の肝不全（FHF）は、脳障害が症状の発生の８週
以内に起こる、きびしい肝細胞の機能障害として定義さ
れ［ベルナウ（Berunau）、J.ら、Sem.Liv.Dis.、６:97
−106（1986）；ヤンダ（Yanda）、R.J.、West.J.Me
d.、149:586−591（1988）；カテラリス（Katelari
s）、P.H,ら、Med.Clinics N.Ameri.、73:955−970（1
989）］は、一般に、ウイルス性肝炎、薬物反応または
中毒により引き起こされる。肝移植の不存在下に、生存
率は約20％であるが、患者の年令および病気の病因論に
依存して劇的に変化する（６〜79％）［ベルナウ（Beru
nau）ら、supra;ヤンダ（Yanda）、supra;カテラリス
（Kaelaris）ら、supra］。
FHFの臨床的過程は多器官の不全の発生により影響を
受け、そして死亡率はきびしい凝固の異常の発生、腎不
全、排水腫または心臓血管の崩壊とともに増加する［ビ
ハリ（Bihari）、D.J.ら、Sem.Liv.Dis.、６:119−128
（1986）］。多器官の不全の発生は、循環するトキシ
ン、例えば、メルカプタン類、フェノール類、脂肪酸
類、アンモニアおよび脈管の透過性を増加する分子の結
果である［ベルナウ（Berunau）ら、supra;ヤンダ（Yan
da）ら、supra;カテラリス（Karelaris）ら、supra］。
この透過性の増加の最もきびしい結果は脳において見ら
れる。トキシンは血管−脳障壁を横切り、そしてNa+−K
+ATPアーゼの阻害に似た作用およびGABA−ベンゾジアゼ
ピンレセプタの占有による意識のレベルの低下を生成す
る［バセット（Basett）D.J.ら、Gastroenterology、9
3:1069−1077（1987）］。この漸進的中枢神経系の障害
における最後の段階は大脳の水腫、FHFにおける死亡の
最も普通の原因［エデ（Ede）、R.J.ら、Sem.Liv.Di
s.、６:107−118（1986）］。
正常位の肝臓移植は、遺伝学的欠陥から腫瘍までの範
囲の肝機能を破壊する広範な種類の状態に対する有効な
処置である［スタルズル（Starzl）、T.E.ら、N.Engl.
J.Med.、321:1014−1022（1989）］。これは米国におけ
る増加している普通の処理であり、ほぼ2000の移植／年
であり、そして米国において次の数年以内に4000/年の
上昇、およびヨーロッパにおいて同様な数が期待され
る。財政および医学的源が入手可能であったが、実際の
必要性は米国単独で50,000件の肝臓移植／年程度の高さ
に到達しうることが推定された。
移植の主要な問題の１つは、肝機能の十分な量と不十
分な量との間のかなりの微細な区別である。例えば、ラ
ットは典型的には70％の肝切除に生き残るが、肝臓の80
％の除去は一般に致死的である。この事実は患者が頻繁
にFHFに急になることである。人工的肝臓の支持の満足
すべき方法は現在入手可能でないので、治療的決定は局
所的に入手可能な医学的源に基づいて、患者の同意を得
ないで、しばしばなされる。
正常位の肝臓移植による多器官の不全の逆転は、それ
を多の治療的物理療法が測定しなくてはならない治療の
標準とした。肝移植の必要性が明らかとなるまで、それ
を遅延したとき、患者の60％が死亡したとという観察に
基づいて、FHFで存在するすべての患者において支持さ
れている。
この可能な過度の熱心な観察は、FHFが均一な致死的
でないという事実を無視する。比較的すぐれた予後をも
つグレープ、例えば、アセトアミノフェンの中毒の患者
は同定された。FHFからの回復は正常の肝機能の回復に
通常関連し、そして移植は患者を一生の医学的監督およ
び免疫抑制にさらすので、致死的結果を病気の過程にお
いて早い時期に予測することができないかぎり、所期の
移植は最良のオプションと考えることができない。
他方において、緊急の移植はまた不満足である。昏睡
の段階IIIに入る患者は死の直ちの危険の増加であり、
それらの状態はしばしば急速に悪化する。これは不適合
性のドナーからの肝臓の移植を必要とことがある。事
実、欠損した器官の獲得によるいくつかの死亡が報告さ
れた［ビッカース（Vickers）、C.ら、J.Hepatol.、７:
1583−1588（1989）］。
緊急の正常位の肝臓移植は、現在、この分野において
知られている急性の肝臓の支持の唯一の方法である。そ
れな高い死亡率、禁止的コスト、および生命の患者の性
質への有意のマイナスの衝撃を有する。肝機能を支持す
る別法は、それが肝臓の再生が起こるために十分な時間
を提供できることにおいて、高度に望ましいであろう。
固体に対する利益は任意の合理的な計算を超えるが、財
政上の節約は100,000ドルになる；移植単独の実際のコ
ストは患者の状態に依存して70,000〜240,000である
［ディンドザンス（Dindzans）、V.J.ら、Dig.Dis.and
Sci.、34:161−166（1989）］。
肝臓の二次的損傷は循環するトキシンにより引き起こ
されうるので、早期の肝臓の支持は、また、内部の環境
を改良し、これにより肝臓の再生を促進する。再生が起
こらない場合、肝臓の支持は多器官の不全を妨害または
防止するであろう。こうして、患者を過度に長く「見る
こと」およびドナーを待つ患者の死亡という恐れは肝臓
補助装置の入手可能性により最小となるであろう。さら
に、再生できない肝臓をもつ患者のみに移植され、そし
て肝臓移植の外科の前に一般の健康の改良は外科の改良
と相関関係をもつ。
肝臓の移植の10〜20％において、移植され再灌流のと
き欠損する。次いで、これらの患者は緊急の題２の移植
片を必要とする。体外の肝臓補助装置の入手可能性は、
主要な外科の第２ラウンドの前に、移植片の回復を可能
とする。したがって、肝機能を支持する手段は緊急に必
要とされる。
人工的支持装置の使用は、肝臓、心臓および肺の移植
への劇的な作用を有したが、このような装置は肝臓の支
持に利用可能である。したがって、肝機能の長期間の保
持のための支持系が必要とされている。このような肝臓
補助装置はある数の移植の場合において用途を有するで
あろう。第１に、それは激症の肝不全の患者は第２に、
それは移植後の患者を安定化および補助するとき、とく
に再灌流のときグラフが応答することができない場合に
おいて使用される。第３に、ある場合においては、それ
は移植の代替手段として働く。この装置は患者の自然の
肝臓が再生する時間を緩し、手術の費用、免疫抑制への
一緒の依存および早期の死亡の可能性をなくすであろ
う。
関係する文献 ヒト肝腫瘍細胞系HepG2は米国特許第4,393,133号に開
示されている。HepG2細胞系を利用する他の実験は、ケ
リイ（Kelly）ら、In Vitro Cell.and Dev.Biol.、2
5:217−222（1989）、およびダーリントン（Darlingto
n）ら、In Vitro Cell.and Dev.Biol.、23:349:354
（1987）に報告されている。ヒト肝腫瘍細胞系は、ナカ
バヤシら、Cancer Research、42:3858−3863（1982）
に論じられている。
人工肝臓についての概観の論文は、ジャウレグイ（Ja
uregui）ら、Biocompatible Polymers,Metals,and Co
mposites,M.スジチェル（Szycher）編、Technical Pu
b、ペンシルベニア州ランカスター、pp.907−928（198
3）に記載されている。
先行技術に開示されている肝臓補助装置は、次のもの
を包含する：米国特許第4,853,324号；米国特許第4,67
5,002号；英国特許出願第GB2,211,857,A号；欧州特許出
願公開第0,079,781号；エールリッヒ（Ehrlich）ら、In
Vitro、14:443−450（1978）；ウォルフ（Wolf）ら、
Trans.Amer.Soc.Artif.Int.Organs、Vol.XXI:16−27（1
975）；ウォルス（Wolf）ら、International Journal
of Articicial Organs、１:45−５（1978）；およ
びウォルフ（Wolf）ら、International Journal of
Articicial Organs、２:97−103（1979）。
組織細胞または肝細胞のエンカプスレーションは、米
国特許第4,391,909号；米国特許第4,353,888号；サン
（Sun）ら、Trans.Am.Soc.Artf.Intern.Organs、Vol.XX
XI:39−41（1986）；およびカイ（Cai）ら、Artifical
Organs、12:388−393（1988）に記載されている。
人工膵臓として使用するための細胞培養装置は、米国
特許第4,242,460号に開示されている。
発明の要約 本発明は、肝欠損または不全に悩む被献体を指示する
ために有効なレベルで肝特異的生物学的活性を構成的に
提供する、永久的細胞系に関する。細胞は肝芽細胞腫か
らクローナル的に誘導され、そして正常のヒト肝細胞の
特性を多く示す。細胞の種々の肝疾患の処置似有用であ
る。とくに、細胞は激症の肝不全の被検体の処置するた
めの肝臓補助装置（LAD）において有用である。より典
型的には、本発明の装置および方法は肝移植をまつ患者
における待期的手段として有用である。
図面の簡単な説明 第１図。HepG2中の血清タンパク質の合成。HepG2細胞を
ほぼ10,000細胞/cm2でプレイティングし、そして毎日培
地を交換して示した密度に成長させた。培地を二重反復
実験の培養物から除去し、そしてアルブミン、AFPおよ
びトランスフェリンについてアッセイした。特異的産生
はμｇのタンパク質/mgの合計の細胞タンパク質/24時間
として示す。密度はmgの合計の細胞タンパク質/cm2とし
て表す。すべての値は二重反復実験の試料について二重
反復実験の決定の平均である。標準偏差はすべての場合
において10％より小さい。
第２図。ミリセル（MillcellR）を含有する培養ウェル
の断面。細胞は上のチャンバー内で培養プレートのイン
サートの支持膜上で成長させた。
第３図。上から下のチャンバー内のHepG2/C3細胞により
メチオニンの吸収。メチオニン不含培地中で１時間イン
キュベーションした後、100μCi/mlのトラン（Tran）35
S−ラベル（labelR）を上または下のバーに添加し、そ
して細胞を37℃においてインキュベーションした。イン
サートを示した時間に取り出し、氷冷リン酸塩緩衝液中
でよくすすぎ、そしてカウンティング溶液の中に入れ
た。各時点は平均±３つのインサートのSEMを表す。
第４図。HepG2/C3A細胞中のグルコースの利用へのニド
ロプロピオン酸の作用。175cm2のフラスコ中の全面成長
の細胞の単一層を、１ミリモルのニトロプロピオン酸
（NOP）の不存在（正方形）または存在（円形）下に24
時間インキュベーションした。培地を交換し、そしてイ
ンキュベーションを正規の培地（閉じた記号）または使
用前に95％の酵素、５％の二酸化炭素で20分間気体処理
した培地（開いた記号）中で続けた。
■−正規の培地、− −酸素化培地、・−正規の培地
＋NOP、○−酸素化培地＋NOP。
第５図。乳酸塩＋または−オレイン酸からのHepG2/C3A
細胞によるグルコースの合成。細胞をアール（Earle）
のバランス塩溶液（EBSS）（グルコース不含）中で５ミ
リモルの乳酸（正方形）または５ミリモルの乳酸、１ミ
リモルのオレイン酸（円形）の存在下に使用前に95％の
酸素、５％の二酸化炭素で20分間気体処理した培地中で
インキュベーションした。
第６図。HepG2/C3A細胞中のグリコーゲンの合成。全面
成長のHepG2/C3A細胞を５ミリモルの乳酸および１ミリ
モルのオレイン酸を含有する、酸素化EBSS（グルコース
不含）中の一夜インキュベーションした。時間０におい
て、細胞に正規のMEM/MAB培地、1.3ミリモルのグルコー
ス濃度を有する10％の血清を供給した。再供給後示した
時間に、50μCiの3H−水および10μCiの１−14C−グル
コースを添加した。細胞を15分間インキュベーション
し、そしてグリコーゲンをチャン（Chan）およびエクス
トン（Exton）の方法により抽出した（参照、実施例
Ｖ、下）。次いで、3H−または14C標識したグリコーゲ
ンを液体シンチレーション分光光度計中でカウントし
た。結果をcpm（グリコーゲン）／分/gの細胞の湿式重
量として表す。各時点は単一の実験からの３回反復決定
の平均である。各点はほぼ2gの細胞を含有する１つの85
0cm2のローラーびんに基づく。インセットはグリコーゲ
ン中の3H/14Cの比を示す。
第７図。HepG2/C3A細胞の尿素合成。細胞は添加前に95
％の酸素、５％の二酸化炭素で20分間気体処理した、５
ミリモルの乳酸塩および10ミリモルの塩化アンモニウム
を含有するEBSS（グルコース不含）中で一夜インキュベ
ーションした。時間０において、細胞に同一培地を再供
給した。アリコートを示した時間に取り出し、そして下
の実施例VIに記載するように尿素の産生についてアッセ
イした。各点は２回の実験からの３回反復の決定の平均
である。各実験はほぼ2gの細胞を包含する単一の850cm2
のローラーびんに基づく。
第８図。フロパス（FloPath）1400カートリッジ中のHep
G2/C3A細胞によるアルブミンの産生。カートリッジをほ
ぼ0.5gの細胞とインキュベーションした。20mlの培地を
第５日後毛管外の空間から毎日取り出し、そして固相の
ラジオイムノアッセイを使用してヒト血清アルブミンに
ついてアッセイした（参照、実施例VII、下）。結果を
産生した合計のアルブミン/24時間として表す。
好ましい実施態様の説明 新規な細胞系、それらの調製、およびそれらの使用方
法が提供される。細胞系は、ヒト肝細胞の特性のほとん
どを支持する肝芽細胞腫から誘導された肝細胞系であ
る。細胞系は定性的および定量的の両者で肝臓をまねる
ことができる。それらはほぼ正常のレベルの、グリコー
リシス、グリコネオゲネシス、グリコネシスおよびウレ
オゲネシスを包含する、いくつかの中央の代謝経路を発
現する。さらに、これらの細胞はほぼ正常のレベルのア
ルブミンおよび他の血清タンパク質を合成し、高いレベ
ルの肝特異的転写因子を含有し、そしてヒト肝細胞の構
造および極性の特性を示す。
本発明の細胞系は既知の肝芽細胞腫の細胞系、HepG2
から誘導される。「誘導」とは、細胞系がHepG2から、
下に提供する、定められた選抜法により得られるか、あ
るいはクローニングされることを意図する。HepG2系
は、正常のヒト肝細胞のある種の特性を示す、ヒト肝芽
細胞腫細胞系である。この細胞系は米国特許第4,393,13
3号に開示されており、そしてアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（the American Type Cultu
re Collection）（ATCC）米国マリイランド州ロックビ
レ）から、ATCC No.HB8065として入手可能である。こ
の細胞系の特性は、次のものを包含する刊行物に開示さ
れている：ダーリントン（Darlngton）ら、試験管内細
胞および発育の生物学（In Vitro Cellular and De
velpmental Biology）、23:349−354;ケリイ（Kely）
ら、試験管内細胞および生物学（In Vitro Cellular
and Develpmental Biology）、25:217−222;ダーリ
ントン（Darlngton）、G.J.メソッズ・イン・エンジモ
ロジー（Meth.Enzymol.）、151:19−38（1987）；トリ
フト（Thrift）、R.N.ら、J.Lip.Res.、27:236−250（1
986）。ほとんどの他のヒト肝系と異なり、HepG2はヒト
Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）遺伝学的配列をもたない。こ
うして、本発明の細胞系は、HepG2からクローン的に誘
導され、HBVの遺伝学的配列をもたない。さらに、細胞
系は腫瘍形成性である。それらはヌードマウスにおいて
腫瘍を形成するHepG2から誘導される。
本発明の細胞系は、次の性質を示す細胞について選抜
することによって、HepG2系から得ることができる：
（１）強い接触阻害；（２）アルブミンの高い発現；
（一般に、少なくとも約20μｇのタンパク質/mgの合計
の細胞タンパク質/24時間、より一般に少なくとも約25
μｇのタンパク質/mgの合計の細胞タンパク質/24時
間）；および（３）全面成長において高いアルブミン／
アルファフェトプロテインの比（一般に、少なくとも約
15、より一般に少なくとも約25の比）。選抜法について
の細胞は実験の節に見いだすことができる。好ましい細
胞系、HepG2/C3A、これはアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（the American Type Culture
Collection）にATCC No.CRL−19741で受託された、
を、より詳しく下に記載する。
選抜された細胞系は、正常のヒト肝細胞により産生さ
れるレベルに類似するレベルのヒトアルブミンおよび他
の血清タンパク質を合成し、そして発育するか、あるい
は再生する正常の肝細胞について予測されるように、遺
伝子の発現の調節を実証する。示すように、このような
細胞系は高いアルブミンの産生および、全面成長に到達
したとき、高いアルブミン／アルファフェトプロテイン
（AFP）の比について選抜することによってクローニン
グされる。用語全面成長は、細胞が互いに接触しそして
有効成長表面の大部分またはすべてを覆い始めるとき、
培養中の細胞密度を呼ぶ。
成長の全面成長前において、選抜した細胞は再生する
肝臓に似た挙動をする。それらは急速な倍加時間（約24
時間）を有し、そしてAFP、アルドラーゼA/Cおよびピル
ベートキナーゼＫを包含する、ある数の胎児タンパク質
を発現する。全面成長に到達すると、細胞は大人の表現
型を取り、ここで細胞分割は劇的に遅くなり（倍加時間
＞200時間）そして胎児タンパク質の発現は停止する。
大人の表現型を発現する細胞は優勢となり、これはアル
ブミン、アルドラーゼ、ピルベートキナーゼＬの産生、
および正常の肝臓の組織学的特徴の発生により証明され
る。
本発明の細胞系は、本発明の目的に対してこの分野に
おいて知られている肝腫瘍細胞系を越えたいくつかの明
確な利点を有する。それらは極めてよく分化する。結
局、それらは肝欠損または不全の被検体を短いか、ある
いは長い期間の間時期するために有効なレベルで肝特異
的生物学的活性を構成的に発現する。
用語「構成的に」は、これらの細胞が、特定の形態の
誘発を必要としないで、肝特異的生物学的活性を通常発
現するという事実を意味する。いったんこれらの細胞が
全面成長に到達すると、それらは正常の肝特異的生物学
的活性を維持する。
用語「肝特異的生物学的活性」は、ここで使用すると
き、特異的に肝細胞の中で、ならびに本発明の細胞の中
で起こる、ある数の生理学的／生化学的反応を意味す
る。また、この用語は、これらの細胞が合成および分泌
するタンパク質および低分子量の産生物を意図する。
肝細胞は、ホメオスタシスに対して重要である。多数
の巧妙に調節された機能を実行する。哺乳動物の体にお
ける種々の細胞の型のうちで、肝細胞のみは炭水化物、
脂質、アミノ酸、タンパク質、核酸および補酵素を同時
に合成および破壊して独特の生物学的仕事を達成する経
路を兼備する。主要な「肝特異的」生物学的機能は次の
ものを包含する：（１）糖生成；（２）グリコーゲンの
合成、貯蔵および破壊；（３）アルブミン、ヘモペクシ
ン、セルロプラスミン、血液凝固因子（因子Ｖ、VII、
Ｘ、プロトロンビンおよびフィブリノゲンを包含す
る）、α１−抗トリプシン、抗トロンビンIII、およびA
FPを包含する血清タンパク質の合成；（４）胆汁酸類の
接合；（５）ヘムの胆汁顔料への転化；（６）リポタン
パク質の合成；（８）コレステロールの合成；（９）尿
素の合成およびグルタミンの合成を包含する、アンモニ
アの代謝；（10）芳香族アミノ酸の代謝的転化および再
利用を包含する、アミノ酸の代謝；および（11）無毒化
および薬物の代謝。
本発明の細胞は多分「肝特異的」生物学的機能のすべ
てのクラスを実行することができる。すべての機能はク
ラス４および５を除外して試験した。機能の例は、アン
モニアの代謝、アミノ酸の代謝、解毒、およびタンパク
質、ことに凝固因子、の産生を実施する能力を包含す
る。これらの機能は、細胞を肝臓補助装置において使用
すべきとき、とくに重要である。
比較的短い時間のLADの形態の被検体、例えば、肝移
植を待つか、あるいは肝拒絶反応後のかつ再移植を待つ
FHF患者を支持するために、前述の肝特異的機能の４つ
のグループはとくに重要である。他の機能不全は他の手
段（例えば、グルコースの供給およびグルコースレベル
のモニター）により提供することができるか、あるいは
特別な注目を必要としない（例えば、胆汁酸類の接合ま
たは胆汁顔料の産生、または薬物代謝活性）。
肝欠損または不全に悩む被検体を「支持するために有
効な」レベルは、正常なまたは正常に近いレベルの血清
タンパク質、凝固因子、アミノ酸、および肝臓の中で産
生末端か、あるいは肝臓により代謝される他の代謝物を
生ずるレベルである。これらの種々の分子および代謝産
制物およびそれらの濃度またはレベルの生理学的ならび
に病理学的範囲はこの分野においてよく知られており、
そして次の文献に記載されている：例えば、ブラウンワ
ルド（Braunwald）、E.ら編、内部医学のハリンソンの
原理（Harrison's Principles of Internal Medica
ne）、第11版、マクグロー・ヒル（McGraw Hill）発行
社、ニューヨーク州ニューヨーク（1987）、これをここ
に引用によって加える。
いったん特定の細胞系が強い接触阻害、アルブミンの
高い発現、および全面成長における高いアルブミン／ア
ルファフェトプロテインの比の初期の基準に基づいて選
抜されると、細胞系は肝特異的生物学的機能の実行につ
いて試験することができる。
こうして、実験を実施して、とくに細胞を肝臓補助装
置として使用できる環境において、細胞の代謝機能を検
査することができる。試験した代謝機能は、酸素の依存
性、グルコースおよび尿素の合成、ビリルビンの吸収お
よび接合、および凝固因子の生合成を包含する。
肝臓は極端に好気的器官であり、そして体の酸素消費
の20％を占める。生体内の肝臓に似て、本発明の培養物
は高いレベルの肝特異的機能のために酸素を必要とする
ことが認められる（参照、実験の節）。適切な酸素化の
準備は、選抜した細胞における成長および分化の両者を
刺激することができる。選抜した細胞系への酸素の作用
は、次のもを包含する、いくつかの方法で試験すること
ができる： （１）連続的に灌流する細胞培養における細胞の成長速
度を、溶解した酸素（４〜20％）の増加する濃度で検査
することができる。成長速度は、高い濃度のグルコース
を含有する標準の培地の中で、その乳酸塩およびアミノ
酸を唯一の炭素源として含有するグルコース不含培地の
中で検査することができる。糖生成は過度に酸素感受性
であるので、細胞の成長は、グルコースの存在下の細胞
に比較して、グルコース不含培地において劇的に影響を
受けることが期待されるであろう。
（２）代謝活性のインジケーターは、また、細胞中で酸
素の異なる濃度において測定することができる。このよ
うな代謝活性は、合計の酸素消費、エネルギーの供給、
レドックス状態、およびグルコース消費／酸素消費の比
を包含する。
グルコースおよび尿素の合成は、血液から過剰のアミ
ノ酸およびアンモニアを除去する主要な手段である。ア
ミノ酸の異化は炭素の遊離を生じ、炭素はクエン酸のサ
イクルおよびそこからグルコースに転換する。このプロ
セスの間に解放された窒素は尿素の合成において使用さ
れる。したがって、選抜された細胞系はグルコースおよ
び尿素の両者を合成しなくてはならない。グルコースお
よび尿素を測定する方法はこの分野において知られてお
り、例えば、参照、ケルシャー（Kershcer）ら、酵素的
分析法（Methods of Enzymatic Analysis）、H.U.バ
ーグマイアー（Bergmyer）編、第３版、Verlag Chemi
e、ワインハイム、Vol.VII、pp.59−67（1983）。
血清ビリルビンの増加は肝臓の病気の高度に可視のイ
ンジケーターである。高い循環レベルの非接合ビリルビ
ンは、大人において一般に毒性ではないが、脳の損傷お
よび新生児において死を生成ことがある。この状態は、
死後の脳幹核の典型的な黄色の外観のために、核黄疸と
して知られている。選抜された細胞系がビリルビンを代
謝する能力は、例えば、酸素化した単一層の培養物を使
用して検査することができる。この試験のために、血液
ビリルビン過剰の患者からの血清を酸素化した細胞とイ
ンキュベーションして、細胞がビリルビンを接合するこ
とができるかどうかを倍加時間する。直接の結合の研究
は、標識しない競争相手の存在および不存在下に、
［3H］−ビリルビンを使用して実施して、VmaxおよびKm
を決定することができる。
細胞系は、また、凝固因子の生合成について試験す
る。凝固因子の多数は肝臓により合成され、そしてひど
い凝固障害の発生は激症のFHFの全長で徴候である。ビ
タミンＫ依存性グループのすべては影響を受けないが、
抗トロンビンIII（AT III）は最も有意な欠乏として同
定された。細胞系をフィブリノゲン、プロトロンビン、
因子VII、およびＸ、およびAT IIIを合成する能力につ
いて試験する。これらの因子の産生レベルは、商業的に
入手可能な抗体を使用して定量することができる。
細胞系の性質は肝臓補助装置（LAD）において細胞系
をとくに有用とする。大部分について、細胞は細胞を循
環する手段ならびにこの装置を通過する血液から細胞を
分離する手段を提供する任意の装置において使用するこ
とができる。膜または毛管は文献において利用可能であ
り、これらは欠陥から細胞への毒性の溶質のクロスオー
バーならびに膜を横切って血液の中に入る細胞により提
供される必要かくべからざる代謝物の拡散を可能とす
る。透過選択膜および半透膜は、さらに、免疫系に対す
る機械的バリヤーを提供する。大部分について、約20,0
00ダルトンから約80,000ダルトンまで、一般に約30,000
ダルトンから約50,000ダルトンまでの分子量のカットオ
フの特徴を有する、膜または毛管を使用する。しかしな
がら、約0.1μ〜約0.3μ、通常約0.2μの孔大きさをも
つ膜を使用することは好ましい。この範囲の孔大きさは
細胞の要素排除するが、なおタンパク質およびタンパク
質複合体を通過させる。こうして、FHFの血清タンパク
質の欠乏を軽減することができる。
一般に、細胞は肝臓補助装置の中で成長する。細胞の
成長後、被検体の血液をこの装置に通過させ、そして溶
解した分子種（例えば、ビリルビン）は膜を通して拡散
し、そして細胞により吸収および代謝される。大部分に
ついては、装置は主として体外の血液の処理に基づく。
一般に、装置は血液の流れに取り付けられ血液灌流装置
の中に細胞を収容するように設計されている。典型的に
は、装置は動脈と静脈の間の血流に取り付けられる。
肝臓補助装置のいくつかの設計は文献において既知で
ある。例えば、装置は次の文献に記載されている：バイ
ルス（Viles）ら、米国特許第4,675,002号および米国特
許第4,853,324号；ジャウレギン（Jaurgin）、英国特許
第2,221,857A号；ウォルフ（Wolf）ら、インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・アーティフィシャル・オーガ
ン（International J.of Artificial Organs）、２:
97−103（1979）；ウォルフ（Wolf）ら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・アーティフィシャル・オー
ガン（International J.of Artificial Organs）、
１:45−51（1978）；およびエールリッヒ（Ehrlich）
ら、試験管内（In Vitro）、14:443−450（1978）、こ
れらの開示をここに引用によって加える。好ましい装置
は、中空繊維のカートリッジおよび同様な灌流装置を包
含する。
バイオリアクター、例えば、中空繊維のバイオリアク
ターを肝臓補助装置として利用することができる。この
ようなバイオリアクター、例えば、アンコーネット（An
chornet）系列は文献において知られており、そして商
業的に入手可能である。参照、例えば、ハイフェッツ
（Hifetz）ら、バイオテクニークス（BioTecniques）、
７:192−199（1989）；およびドリフリオ（Donofri
o）、D.M.Amer.Biotech.Lab.、Sept.1989、発行＃940、
これらの開示をここに引用によって加える。
本発明の細胞は、大きい数の細胞のための容量をも
つ、中空繊維のカートリッジまたは同様な灌流装置の中
で成長させるとき、灌流した肝臓として機能することが
でき、ヒトの肝臓の代謝の補助および肝特異的生物学的
活性の置換を可能とする。したがって、開示した細胞の
培養物を含有する灌流装置は肝臓補助装置として機能す
ることができる。本発明の１つの実施態様において、LA
Dは体外であり、体の外側の動脈および静脈の循環への
その節族を呼ぶ。体外のLAD（またはELAD）は、FHFに悩
む被検体のための一時的肝臓の支持を提供するためにと
くに有用である。他の実施態様において、LADは体の中
に移植する、すなわち、「体内」である。この実施態様
は、長期間のLADとして、有用であり、そして有用であ
ることがある。
肝臓補助装置における使用するために、細胞は一般に
膜または多孔質の支持体上で成長させる。大部分につい
て、細胞は成長のとき支持体に付着する。しかしなが
ら、結合材料を準備して細胞を支持体に取り付けること
ができる。適当な結合材料はこの分野において知られて
いる。参照、例えば、英国特許第2,221,857A号。
中空繊維のカートリッジは正常の器官の３次元の特性
生成する２つのチャンバーのユニットである［クナゼク
（Knazek）R.H.、Fedr.Proc.、33:1978−1981（197
4）；ク（Ku）K.ら、Biotechnol.Bioeng.、23:79−95
（1983）］、これらの開示をここに引用によって加え
る。培地または成長培地を毛管の空間を通して循環さ
せ、そして細胞を体外空間の中で成長させる［タラカン
（Tnarakan）、J.P.ら、Biotechnol.Bioeng.、28:1605
−1611（1986）］。このような中空繊維の培養系は、モ
ノクローナル抗体の産生のためのハイブリドーマ細胞系
の培養のために有用であるとした開示された［アルトシ
ュルター（Altshlter）G.L.ら、Biotechnol.Bioeng.、2
8:646−658（1986）；ハイフェッツ（Heifetz）H.H.
ら、バイオテクニークス（BioTecniques）、７:192−19
9（1989）；ドノフリオ（Donofrio）D.M.Amer.Biotech.
Lab.、Sept.1989、発行＃940）］。さらに、細胞系PLC/
PRF5およびレウバー（Reuber）肝腫瘍［マクアレエル
（McAleer）W.J.ら、J.Virl.Meth.、７:263−271（198
3）；ウォルフ（Wolf）C.F.W.（1982）］および膵臓小
島細胞［アラキ（Araki）Y.ら、糖尿病（Diabetes）、3
4:850−854（1985）］を包含する、ある数の他の細胞の
型はこの方法において培養されてきている。
いったんある装置が肝臓補助装置としての使用のため
に選択されると、それに適当な培地および細胞の接種が
準備される。一般に、細胞を複合培地、例えば、アール
（Earle）塩類を含むイーグルMEM（Gibco）と10％の規
定した／補充した子ウシ血清（Hyclone）を含有するワ
イマウス（Waymouth）MAB87/3（Gibco）との3/1混合物
の中で成長させる。次いで、装置を37℃の室温において
培地の一定した循環および新鮮な培地の一定した流入に
維持する。中空繊維のカートリッジとともに使用するた
めに、カートリッジに150ml/分の再循環した培地を約0.
5ml/分の一定の流入で供給する。1400cm2のカートリッ
ジに一般に約１×109細胞を接種する。
装置の中の細胞の機能をここで肝臓補助装置として機
能する装置の能力について試験することができる。これ
は、前述したように、必須の肝臓の生物学的機能の測定
を包含する。
大部分について、追記の酸素をこの系に添加すること
は必要がない。しかしながら、培養物の中の酸素の張力
を決定しそして必要に応じて、追加の酸素を添加するこ
とができる。
選抜された細胞系の培養物の中の酸素の張力を変化さ
せて最適な酸素のレベルを決定するために、細胞を連続
的灌流装置中で成長させることができる。この装置は再
循環ポンプ、培地びん、および標準の６ウェルの培養皿
上に適合するふたから成るであろう。培地は細胞の表面
の上に連続的に再循環させ、そして培地の容器の中に戻
し、ここで気体処置することができる。培地は４％〜20
％の酸素、５％のCO2および残部の窒素を含有する調製
物で気体処置する。このようにして、細胞は適当な雰囲
気の中で維持して、気体混合物の作用を決定することが
できるにする。成長速度は合計のタンパク質含量／ウェ
ルをモニターすることによって決定できる。
ATP、ADPおよびAMPは、ホタルのルシフェラーゼを使
用して、ルンジン（Lundin）ら、メソッズ・イン・エン
ジモロジー（Meth.Enzymol.）、133:27−41（1986）に
記載されているように測定する。NAD/NADHの比は、乳酸
デヒドロゲナーゼを横切る乳酸塩／ピルベートの比か
ら、およびマレートデヒドロゲナーゼを横切るマレイン
酸／オキサロアセテートの比から計算することができ
る。これらの代謝物の濃度は、酵素的分析の方法（Meth
ods of Enzymatic Analysis）、H.U.バーグマイアー
（Bergmyer）編、第３版、Verlag Chemie、ワインハイ
ム、Vol.VI、pp.570−588に記載されている方法により
教示されるように決定することができる。NADP/NADPHの
比は、イソクエン酸塩デヒドロゲナーゼを横切るイオク
エン酸塩／アルファ−ケトグルタレートの比から、およ
びリンゴ酸酵素を横切るリンゴ酸塩／ピルベートの比か
ら計算することができる。これらの代謝物の決定は、ま
た、酵素的分析の方法（Methods of Enzymatic Anal
ysis）に記載されている。エネルギー変化は方程式（AT
P＋0.5ADP）／（ATP＋ADP＋AMP）から計算することがで
きる。
肝臓補助装置の酸素依存性を見るほかに、装置は、ま
た、分離した、灌流したヒトの肝臓を刺激するそれらの
能力に関して特性決定されるであろう。これは装置を、
前述したように、グルコースおよび尿素の合成、ビリル
ビンの吸収および接合、および凝固因子の生合成につい
て試験する。尿素はカップリングしたグルタメートデヒ
ドロゲナーゼ／ウレアーゼのアッセイを使用して定量す
ることができる。グルコースは色素がカップリングした
グルコースオキシダーゼアッセイを使用して決定でき
る。尿素およびグルコースの決定のためのアッセイは、
酵素的分析の方法（Methods of Enzymatic Analysi
s）に記載されている。
前に論じたように、種々のビタミンＫ依存性因子凝固
因子、プロトロンビン、因子VIII、IXおよびＸ、ならび
に抗トロンビンIIIは、ケリイ（Kely）ら、In Vitro
Cell Dev.Biol.、25:217−222（1987）に記載されてい
るように、固相ラジオイムノアッセイを使用して決定す
ることができる。イムノアッセイのための抗体はデイコ
ー・インコポレーテッド（DANKO,Inc.）を得ることがで
きる。
好ましいLADの実施態様において、細胞系HepG2/C3Aを
肝臓補助装置として使用するための中空繊維のカートリ
ッジの中に供給する。この装置は毛管外の空間内に含有
された中空繊維の毛管からなる。培地を毛管の空間を通
して循環させる、そして細胞を毛管外の空間の中で成長
させる。
細胞の成長のために、細胞を毛管外の空間の中に接種
し、そして新鮮な培地を一定の流入で供給する。1400cm
2のカートリッジに有効数、通常約１×109の細胞を接種
し、そして全面成長に、通常約14〜約21日間成長させ
る。
供給した培地は一般に複合培地、通常イーグルMEDと1
0％の規定した／補充した子ウシ血清を含有するアール
塩類との3/1混合物である。これは細胞の成長のための
栄養を提供する。こうして、細胞は毛管の外側表面上で
成長する。全面成長の細胞を含有する中空繊維のカート
リッジは、肝欠損または不全に悩む被検体を支持する肝
臓補助装置として機能することができる。
細胞系は、また、生物人工的肝臓または肝臓支持体と
して使用することができる。このようにして、細胞を生
物人工的器官として使用するのための中空繊維の毛管膜
の中にエンカプスレーションするか、あるいはその中で
成長させる。細胞を生物材料、例えば、アルギン酸塩−
ポリリジン膜の中に、次の文献により教示されるよう
に、エンカプスレーションする：カイ（Cai）ら、人工
的器官（Artificial Oegans）、12:388−393;サン（Su
n）ら、Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs）、XXXIII:
39−41（1986）；オ・シェア（O'Shea）ら、バイオヒミ
カ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.
Acta）、804:133−136（1984）；サン（Sun）ら、J.Con
trolled Release）、２:137−141（1985）；および米
国特許第4,391,909号。次いで、エンカプスレーション
された細胞およびベヒクルのカプセルを被検体の腹腔内
に注射する。
新規な細胞はヒトの肝臓の代謝の研究ならびに肝特異
的遺伝子の調節に有用である。細胞系は、ヒト肝細胞系
を使用する通常の場合のように、本来ヒト肝芽細胞腫か
ら誘導され、ヒト肝腫瘍から誘導されない。したがっ
て、それらは、代謝機能および肝特異的遺伝子の発現を
包含する、すべての肝機能の研究に有用である。それら
は、また、有用な試験管内肝モデルを提供する。細胞お
よび細胞系は、また、薬物または他の製剤学的組成物の
代謝および／または毒物学の研究に使用することができ
る。膜または肝臓補助装置上で成長した細胞は、プロト
タイプの人工肝臓として働く。こうして、種々の糖剤ま
たは化合の臨床的指示は試験管内モデルにおいて評価す
ることができる。
肝臓補助装置の中で成長した細胞は、また、血清タン
パク質の産生について有用である。示すように、細胞は
肝特異的生物学的活性を示し、そして血清タンパク質、
イソ酵素、凝固因子などを合成する。したがって、細胞
はこれらのタンパク質のための試験管内の工場として利
用することができる。この方法において、上澄み液を細
胞培養物から回収し、そして血漿タンパク質を分離し、
そして精製する。便宜上、細胞を半透膜上で成長させる
ことができ、この半透膜は血清タンパク質が膜を横切っ
て拡散するようにさせ、ここでそれらはそれ以上の使用
のために分離および精製される。
細胞は肝臓のモデルとして機能することができるの
で、それらは、また、ウイルス性肝炎の研究に有用であ
る。それはとくに真実である。なぜなら、細胞系はＢ型
肝炎により形質転換されず、そしてHBV配列をもたない
からである。
本発明において開示する肝細胞は、この分野において
知られている他の系、例えば、分離され灌流したラット
細胞（IPRL）を越えた利点を有する。培養物は永久的で
ある。すなわち、それらは無限の寿命を有し、これによ
り実験的に厳格な場合において長期間の暴露の作用の研
究を可能とする。永久的細胞系の単一層の培養物は典型
的には数カ月間維持され、そして本発明の方法に従い調
製された肝臓補助装置は、通常、アルブミンの産生およ
びグルコースの利用により決定して、無限の期間にわた
って、一般に８週にわたって機能する。本発明の培養法
の使用は、現在の米国政府の目標（認可および契約のた
めのNIHガイド、supra）に適合する、肝の灌流のために
要求される動物の規則的な犠牲の必要性を減少する。最
後に、本発明の培養した細胞を含有するカートリッジは
他の種から分離精製した肝臓よりいっそう密接にヒトの
代謝を反映する。
本発明の方法、とくに中空繊維に基づく合成の使用
は、肝臓補助装置としていくつかの利点を提供する。カ
ートリッジは非常に高い密度の培養物を支持する。毛管
外の体積に基づいて、15〜20gの細胞を1400cm2単位で成
長させることができ、そして100gの細胞を7000cm2の単
位で成長させることができる。これは一部分1400cm2の
単位で１日当たりに生産された細胞の量に基づく（参
照、実施例II、下）。この単位は肝不全に悩む被検体に
脾臓の支持を提供するするために十分な細胞塊を達成す
ることができる。
カートリッジで成長した細胞は極性化し、そしてそれ
らの成長は正常の肝臓の構造に近似する。細胞は毛管の
空間から栄養を受け取り、そして廃棄産生物を毛管外の
空間（ECS）の中に分泌する。ECSを灌流して、還流産生
物の蓄積を防止することができる。
培地の連続的流れおよびインラインの酸素化装置は、
より一定した酸素およびエネルギーの供給を提供する。
肝臓の代謝の中の酸素の重要な役割は、IPRLの文献によ
く記載されており、前のページで定義したが、細胞培養
の文献において大きく無視されてきている。例えば、He
pG2/C3または3Aの普通の培養は酸素（したがって、エネ
ルギー）が制限される。酸素化した培地の一定の循環
は、細胞の代謝の必要性を満足する［ウォルフ（Wolf）
D.ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（Eur.J.Biochem.）、151:299−303（1985）］。
追加の酸素を運ぶ能力を必要とする場合、灌流された器
官について記載されているように、赤血球または溶解し
たヘモグロビンの使用が提供される［ゴアズ（Gores）
G.J.ら、ヘパトロジー（Hepatology）、６:511−517（1
986）］。
ここで本発明を全体的に記載したが、例示のために提
供された次の実施例を参照すると、本発明はいっそう容
易に理解されるであろう。これらの実施例は、特記しな
い限り、本発明を限定しない。
実験 実施例Ｉ HepG2/C3Aについての選抜の概要 HepG2細胞を５つの150mmの細胞培養皿の中で0.5細胞/
cm2の密度でプレイティングした。100の個々のコロニー
をこれらのプレートからクローニングリングで取り出し
た。コロニーを最初に平坦の上皮様細胞から丸いゆるく
接続する細胞までの範囲の、広い範囲の形態について選
抜した。これらを24ウェルの皿の中で全面成長に成長さ
せ、そして上澄み液を固相ラジオイムノアッセイを使用
してアルブミンの産生について試験した。100ng/mgの合
計の細胞のタンパク質/24時間から25μg/mg/24時間の範
囲の非常に広い範囲の産生レベルが見いだされた。10ク
ローン（Ｃ〜Ｌ）を１μg/mg/24時間以上のアルブミン
の産生で選択し、そして再び制限希釈のクローニングに
かけてクローン性を保証した。次いで、これらの10クロ
ーンをアルブミンの酸性、全面成長におけるアルブミン
/AFP比および接触阻害について分析した。これらのパラ
メーターについての値を表１に示す。クローンC3をそれ
以上の分析のために選択する。G2/C3細胞を、エネルギ
ー源として、ピルベートおよびアミノ酸を含有するが、
グルコースを含有しない培地の中でプレイティングし
た。この培地の完全な処方を下に示す。血清を透析して
グルコースを除去し、そして他の複合炭化水素を添加し
た。細胞は新しいヌクレオチドなどの産生のためにグル
コースを必要とするので、ピルベートおよびアミノ酸か
らグルコースを合成することができる細胞のみはこの培
地の中で増殖することが期待されるであろう。30×106
の初期のプレィティングから、２つのコロニー3Aおよび
3Bをこの培地の中で６週後に分離した。これらの細胞は
平坦化し、小さい核および隆起した核小体をもつ上皮で
ある。細胞のほぼ10％は２核である。
グルコース不含培地の処方 リットル当たり 塩化カルシウム 0.12g 塩化コバルト ２μg 硫酸銅 0.6mg 硝酸第１鉄 0.5mg 塩化カリウム 0.25g 硫酸マグネシウム 0.35g 塩化ナトリウム 6.8g 重炭酸ナトリウム 2.2g リン酸ナトリウム、２塩基性 0.3g 硫酸亜鉛 1mg モリブデン酸 15μg 塩化マグネシウム 15μg アルギン 126mg システイン 24mg グルタミン 292mg ヒスチジン 42mg イソロイシン 52.5mg ロイシン 52.4mg リジン 72.5mg メチオニン 15.1mg フェニルアラニン 33mg スレオニン 10.2mg トリプトファン 10.2mg チロシン 46.8mg バリン 46.8mg アラニン 8.9mg アスパラギン 15mg アスパルテート 13.3mg グルタメート 14.7mg グリシン 7.5mg プロリン 11.5mg セリン 10.5mg すべてのアミノ酸はＬ対掌体である。
ビオチン 1mg Ｄ−Caパントテン酸塩 1mg 塩化コリン 1mg 葉酸 1mg イノシトール 2mg ニコチンアミド 1mg ピリドキサルHCl 1mg リボフラビン 0.1mg チアミHCl 1mg アスコルビン酸 125μg エルゴカルシフェロール 10μg メナジオン 100ng トコフェロール 20μl レチン酸 10μg グルタチオン 50μg ハイポキサンチン 200μg リノレイン酸 ５μg リポ酸 10μg チミジン 25μg ピリビン酸ナトリウム 1.1g 表１ HepG2の種々のクローンの特性 クローン 最終密度 アルブミン AFP 比 C3 0.30 29.5 1.1 25.7 D5 0.62 20.5 3.9 5.3 E2 0.81 3.1 4.1 0.8 F1 0.44 9.3 6.5 1.4 G6 0.78 3.5 4.6 0.8 H1 0.47 9.7 5.7 1.7 I1 0.38 22.5 6.1 3.7 J5 0.35 32.7 3.1 10.5 K1 0.31 23.7 0.8 29.6 L3 0.34 12.8 0.9 14.2 密度はmgの合計の細胞のタンパク質/cm2として報告す
る。アルブミンおよびAFPはμｇタンパク質/mgの合計の
細胞タンパク質/24時間として報告する。
したがって、示すように、クローン的に誘導された細
胞系、とくにHepG2/C3Aは、高いアルブミンの産生およ
び全面成長における高いアルブミン／アルファフェトプ
ロテインの比を実証する。細胞系は正常の肝細胞の多数
の追加の特徴を表す。細胞により産生されたヒトアルブ
ミンおよび他の血清タンパク質のほぼ正常のレベルは、
肝機能をまねるそれらの可能性を強調する。さらに実証
するように、G2/C3A細胞は、糖生成および尿素合成を包
含する、正常のレベルの中枢の代謝プロセスを実行す
る。これらの理由のために、本発明の細胞系、とくにG2
/C3Aは、ヒト肝臓のシミュレーションのための、実際の
肝臓学における使用のための、およびわれわれの体外肝
臓補助装置として、HepG2を包含する、この分野におい
て知られている他の細胞を越えた明確な利点を提供す
る。
実施例II HepG2/C3は肝細胞の表現型の変調のための試験管内のモ
デルを提供する HepG2/Cの培養物を低い密度でプレイティングすると
き、それらは24時間の倍加時間により、およびアルファ
フェトプロテイン、アルドラーゼＡおよびＣおよびピル
ベートキナーゼＫを包含する胎児肝細胞のいくつかのマ
ーカーの発現により、特性決定される急激な分割の期間
に入る。培養物が全面成長となるとき、成長は遅くな
り、そして新しい定常状態が200時間を越えた倍加時間
で確立される。同時に、遺伝子の調節の同調スイッチが
起こり、胎児タンパク質の急な減少およびそれらの大人
の相手の増加を生ずる。例として、培養物が成熟すると
きのアルブミン合成の増加は第１図に示されている。
実施例III HepG2/C3A細胞は肝特異的構造および培養における輸送
プロセスを維持する 肝臓補助装置において使用するためのHepG2/C3A細胞
の可能性を検査する努力において、培養における正常の
ヒト肝細胞のモデルとしてこれらの細胞の活性を、とく
にいくつかの肝特異的構造および輸送現象に注意して、
研究した。
Ａ、材料および方法 ミリセル−CM（Millcell−CMR）およびミリセル−HA
（Millcell−HAR）培養プレートインサート（12mmの直
径）を、ミリポア・コーポレーション（Millipore Cor
p.、マサチューセッツ州ベッドフォード）から入手し
た。この−CMインサートはナイロン膜を含有し、そして
この膜は湿潤したとき透明となるが、それが細胞の付着
を支持する前に、生物学的材料（例えば、コラーゲンま
たは細胞外マトリックス）でコーティングしなくてはな
らない。−HA膜はニトロセルロースを含有し、これは不
透明に止まるが、コーティングの不存在下に細胞の付着
を指示する（第２図）。各チャンバーにおける培地の体
積は0.5mlであった。
トラン35S−ラベル（Tran35S−labelR）（＞1,000Ci/
ミリモルのメチオニンを含有する）ICN（Irvine、カリ
フォルニア州）から入手した。［2,4,3H］−コール酸
（10〜25Ci/ミリモル）はニュー・イングランド・ニュ
ークリアー（New England Nuclear）（マサチュセッ
ツ州ボストン）から入手した。組織培地はギブコ（GIBC
O）（ニューヨーク州グランドアイランド）から入手
し、そして補充物質はハイクロン（Hyclone）（ユタ州
ローガン）から入手した。マトリゲル（MatrigelR）、
すなわち、エンゲルベス−ホルム−スワーム（Engelbet
h−Holm−Swarm）（EHS）腫瘍により産生した細胞外マ
トリックスの抽出物は、コラボレイティブ・リサーチ
（Collaborative Research）（マサチュセッツ州ベッ
トフォード）から入手した。抗ヒトアルブミン抗体はア
トランチック・アンチボディイス（Atlantic Antibodi
es）（メイン州スカーボロー）から入手した。すてべの
他の化学物質は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigm
a Chemical Co.）（ミゾリー州セントルイス）から入
手した。
１、組織培養 HepG2/C3サブクローンは、その肝特異的遺伝子のよく
調節された発現のために、研究のために選択した。細胞
は10％の補充した子ウシ血清（Hyclone）を補充したMEM
/MABの中の12mmの培養プレートのインサートの中で成長
させた。−CMインサートをマトリゲルでコーティングし
て細胞の付着を可能とした。
２、細胞の極性の基準 細胞をを横切るpHの勾配を、上皮層を横切るイオン勾
配を維持する細胞の測度として使用した。上部および下
部のチャンバーからの培地を独立に集めた。各チャンバ
ーの中の体積はわずかに0.5mlであったので、３つのウ
ェルからの試料をpHの測定のためにプールした。全面成
長以下の単一層をもつか、あるいは細胞が付着していな
い膜を横切るpHの勾配を対照として測定した。
３、アルブミンの分泌 全面成長の培養は、細胞分割およびアルファフェトプ
ロテイン（AFP）合成の劇的な減少、およびアルブミン
合成の鋭い増加により特徴づけられる。循環するタンパ
ク質は細胞の洞様の面から分泌されると仮定されるの
で、ベクターのアルブミンの分泌を基底外側の機能のマ
ーカーとして使用した。タンパク質は、ウシ血清アルブ
ミンと交差反応しない、固相ラジオイムノアッセイによ
り測定した。
４、メチオニンの吸収 メチオニンの吸収を、また、基底外側の膜の活性のイ
ンジケーターとして使用した［バルカロバ−スタンダー
（Balcarova−Stander）、J.ら、EMBO J.、３:2687−2
694（1984）］。細胞をメチオニン不含培地の中で１時
間インキュベーションした。この期間の終わりにおい
て、100μCi/mlのトラン35S−ラベル（Tran35S−labe
lR）を含有する培地をチャンバーの１つに添加し、そし
て培養物を37℃においてインキュベーションした。イン
サートを３、５および10分に除去し、冷PBS中で２回す
すぎ、10mlのユニバーゾル（UniversolR）（Schwartz/M
ann Biotech、オハイオ州クレブランド）のに入れ、そ
してカウントした。
５、コール酸の吸収および分泌 これらの測定は懸濁培養について記載されているよう
に実施した［タラオ（Tarao）K.ら、Am.J.Physiol.、24
3:253−258（1982）］。253−258（1982）］。２μCi/m
lの［2,4,3H］−コール酸を含有する培地を上部または
下部のチャンバーに添加し、そして37℃において30分間
インキュベーションした。この負荷期間後、インサート
を氷冷生理食塩水の中で２回洗浄し、そしてアッセイが
準備されるまで氷上に保持した。分泌は加温培地を両者
のチャンバーに添加し、37℃において５分間インキュベ
ーションし、そして各チャンバーの中の培地をカウント
することによって測定した。パイロット実験は、標識の
５％より小が５分の終わりにおいて細胞に関連したまま
であることを示した。
６、電子顕微鏡検査をJEOL JEM100CXを使用して実施し
た。インサートの全体を２％のグルタルアルデヒドの中
に10分間入れて固定した。次いで、膜をインサートから
除去し、そしてアラルダイトの中に埋め込んだ。−CMイ
ンサートのプラスチック膜は満足すべき区画化すること
ができないので、これらの膜上で成長した細胞は埋め込
みの前に下に横たわるマトリゲル層とともに剥離され
た。−HAインサートの中で成長した細胞はそれらのニト
ロセルロース膜とともに埋め込まれた。
Ｂ、結果 １、全面成長の基準 −CM膜は湿潤しているとき透明であるので、細胞を倒
立顕微鏡下に見ることができた。すべての場合におい
て、全面成長はアルファフェトプロテイン（AFP）分泌
の減少およびアルブミン分泌の増加［ケリイ（Kelly）
J.H.ら、1989、supra］およびpH勾配の発生が伴った。
それゆえ、これらの基準を使用して、−HA（ニトロセル
ロース）膜上で成長した細胞の全面成長を評価した。細
胞を105/mlで密度でプレイティングし、通常３日以内に
全面成長に到達した。細胞の極性の基準は、細胞がマト
リゲルまたはニトロセルロース上で成長したかどうかに
かかわらず同様であった。したがって、特記しない限
り、データをプールする。
２、pH勾配の細胞を横切るpH pHの測定のための十分な培地を得るために、３つのイ
ンサートのグループをプールした。pHの勾配は細胞をも
たないインサートにおいて、あるいは細胞が全面成長に
到達する前に発生しなかった。いったん全面成長に達成
すると、上部のチャバーの中のpHは持続的により高かっ
た。表３は９つの観察の結果を示す（３つのウェルは各
測定のためにプールした）。上部のチャンバーは0.038
単位の層の平均であり、下部のチャンバーより約17％高
い水素イオン濃度を表した。
３、アルブミンの分泌 全面成長の細胞は、アルブミンを上および下の両者の
チャンバーの中に分泌した。しかしながら、上部のチャ
ンバーは下部のチャンバーより約30％高いヒトアルブミ
ンを絶えず含有した（表１）。
４、メチオニンの吸収 放射線標識したメチオニンの吸収、すなわち、基底外
側の因子の指示を第３図に示す。上部のチャンバーから
の吸収はすべての時点においてより高く、５分において
29％より高くそして10分において26％より高かった。標
識はマトリゲルまたは膜単独により取り上げられなかっ
た。
５、コール酸の吸収および分泌 30分の負荷期間後、標識したコール酸の分泌を上部お
よび下部のチャンバーにおいて測定した。予備的研究に
おいて、標識期間の間に取り上げられた標識の95％以上
は５分以内に分泌されたことが示された。したがって、
細胞により取り上げられた合計のカウントは上部および
下部のチャンバーの中の合計により推定された（表
４）。コール酸の最高の吸収は下部チャンバーからであ
った（ほぼ7200cpm対3200cpm）。しかしながら、標識の
88％は下部のチャバーの中に分泌して戻り、最小の上皮
を横切る輸送が起こっていることを示唆した。これは上
部に負荷した細胞と鋭い対照であり、ここで標識の62％
を細胞の層を横切って輸送され、そして下部のチャンバ
ーの中に分泌される。コール酸はマトリゲルまたはニト
ロセルロース膜単独により取り上げられなかった。分泌
された層は、薄層クロマトグラフィーにより評価して、
変更しなかったコール酸であった。
数は平均±SEM。ｐ値は対となったスチューデント式
テストを使用して計算した。細胞を全面成長まで12mmの
ミリセル（Millcell）インサートの中に成長させ、そし
て培地を上部および下部のチャンバーから独立に集め
た。pHの測定は３ウェルからプールした試料について実
施し、そしてアルブミン濃度は固相RIAにより測定し
た。
２μCi/mlの［2,4,3H］−コール酸を含有する培地を
上部または下部のチャンバーに添加し、そして細胞を37
℃において30分間インキュベーションした。この負荷期
間後、インサートを氷冷生理的塩類溶液中で２回洗浄
し、そしてアッセイを実施するまで氷上に保持した。分
泌は加温培地を両者のチャンバーに添加し、37℃で５分
間インキュベーションし、そして各チャンバーにおいて
培地の放射能を評価することによって測定した。カウン
トの５％より小が５分の終わりにおいて細胞の中に残留
した。
６、超構造の研究 接合部複合体により取り囲まれそして正常の微小絨毛
を示す毛細胆管が細胞の間で明らかであった。微小絨毛
の境界により特徴づけられる、不完全な小管がまた見ら
れ、そしてこれらの多数は下のチャンバーに向かって開
いているように見えた。微小絨毛膜は、また、多数のコ
ーティングされた小窩および小嚢をもつ最も活性なエン
ドサイトーシスの膜であった。細胞の間の胆管の発生
は、細胞がマトリゲルまたはニトロセルロース上のいず
れで成長したかにかかわらず同様であった。しかしなが
ら、不完全な毛細胆管の開口はニトロセルロース上で成
長した細胞において、細胞が膜の中に成長する傾向があ
ったので、容易には見られなかった。
論考 HepG2/C3細胞系を主要な肝細胞のための基質として検
査した。なぜなら、これらの細胞は、胎児タンパク質か
ら大人表現型への発現の切り替えを伴う、強い接触阻害
を実証からである。さらに、細胞は正常に近いレベルの
肝タンパク質を発現する。
細胞極性の非特異的マーカーは、上部および下部のチ
ャンバーの間のpHの差、およびメチオニンの吸収を包含
した。下部のチャンバーにおけるH+濃度は上部のチャン
バーにおけるより約17％高かった（表３）。
メチオニンの吸収は上部のチャンバーから25〜29％高
く（第３図）、基底外側膜が上方に向いていることを示
した［バルカロバ−スタンダー（Balcarova−Stande
r）、J.ら、EMBO J.、３:2687−2694（1984）］。肝極
性、アルブミン分泌およびコール酸輸送の特異的マーカ
ーは、また、この向きを示した（アルブミン濃度は上の
チャンバーにおいて30％高く、そしてコール酸輸送は上
部→下部の方向に５倍高いかった；参照、表３および
４）。
最も極性化した細胞はそれらの基底膜を細胞外マトリ
ックス（ECM）に付着して成長したが、HepG2/C3細胞が
反対の向きに成長する傾向はまったく驚くべきことでは
ない。肝細胞は管状器官において見いだされるような通
常密な基部膜上に位置せず、そしてそれらの基本的面は
半接着班の存在により特徴づけられない。ある期間、肝
ECMは他のマトリックスと定性的に異なると考えられた
［ロジキンド（Rojkind）、M.ら、ジャーナル・オブ・
セル・バクテリオロジー（J.Cell Biol.）、87:255−2
63）］。しかしながら、最近の報告が示唆するように、
差は定量的であり、そして肝ECMは他の組織において見
いだされる同一構成成分のゆるい配置である［メイハー
（Maher）、J.J.ら、ガストロエンテロジー（Gastroent
erolgy）、94:1053−1062（1988）；ビッセル（Bissel
l）、D.M.ら、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・
ガストロエンテロジー（Scand.J.Gastroenterol.）、23
（Suppl.151）:1−７（1988）］。
肝の表現型の維持はちょうどマトリックスの相互作用
より多くを必要とする；細胞−細胞の接触は主要な役割
を演ずる。HepG2/C3細胞はこれに関して興味あるもので
ある。それらは成長または機能について肝ECMに依存し
ないが、それらは細胞−細胞の接触に高度に依存する。
低い密度で接触した細胞は、プレートの上を広がらな
い、小さいコロニーを形成する。さらに、細胞を濃縮し
たマトリゲル上で成長させたとき、コードの形成が観察
された。こうして、ECMの単一層はこれらの細胞の固有
の極性を変更するために十分ではなく、そして基底外側
の面は上の緩衝液チャンバーの指示されない環境におい
て優先的に形成した。
下のチャンバーからのコール酸の高い吸収（先端の膜
を横切る）は予期せざることであった。３つの可能な説
明は次の通りである；（ａ）肝細胞は毛細胆管から胆汁
酸を吸収する能力を有する：（ｂ）これらの培養した細
胞における先端の膜は有意なレベルの基底膜タンパク質
を含有する（不完全な極性）；または（ｃ）下の膜の微
小絨毛は表面積を、コール酸の輸送が受動拡散単独でに
より増加する点まで、増加することがありうる。
要約すると、培養において極性化した細胞に日常的に
適用された極性の基準の多くはHepG2/C3細胞に等しい適
用可能であると思われる。
実施例IV HepG2/C3Aの通常培養における代謝は酸素制限的である 代理肝細胞としてHepG2/C3Aを使用する可能性を評価
するために、このような細胞が実施することを必要とす
る、いくつかの代謝プロセスを測定した。第４図は重要
な実験の結果を示し、この結果が示すように、標準の培
養の条件下に、細胞は主要な嫌気的代謝を実行する。こ
の驚くべき発見は、まず、簡単な単一層におけるグルコ
ースの利用の初期の測定により示唆された。培地の中の
グルコース濃度は24時間以内に非常に低いレベルに低下
し、これが示唆するように、グルコースの利用は非効率
的であり、そして糖生成は実行されなかった。論理的説
明は、細胞が低酸素であり、したがって、クエン酸サイ
クルを利用することができなかったことであった。この
仮説を２つの方法で試験した。
第１に、グルコースの利用は標準の条件下にかつイン
キュベーション前に酸素化した培地の両者において検査
した。第４図に示すように、酸素化した培地の中の細胞
は有意により少ないグルコースを使用した。
過剰のグルコースの利用は細胞がクエン酸サイクルを
通してピルベートを転換できないためであることを決定
するために、同様な実験をニトロプロピオン酸（NOP）
の存在下に実施した。NOPはスクシネートのトランジシ
ョン状態の類似体であり、スクシネートデヒドロゲナー
ゼを不可逆的に不活性化し、クエン酸サイクルの利用を
防止する［アルストン（Alston）、T.A.ら、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、74:3767−3771
（1977）］。この阻害因子の添加は低酸素条件下に作用
をもたず、クエン酸サイクルは活性とならないであろ
う。他方において、NOPは酸素化された培養物における
グルコース利用曲線をシフトするので、それは低酸素曲
線に似る。この曲線は第４図に示されている。
これらの細胞における代謝活性を評価するとき重要な
変数は、経路が酸素制限的（したがって、エネルギー）
制限的でないことを保証することである。培養している
細胞が酸素制限的であることができる程度は広く理解さ
れていない。乳酸塩からのグルコースおよび尿素の合成
は、添加した酸素の不存在下のＴ−フラスコにおいて無
視できた。下に示す実験の残部は、気密容器の中で95％
のO2＋５％のCO2中で、同一混合物で気体処理した培地
を使用して実施した。
実施例Ｖ HepG2/C3Aの糖生成活性 乳酸塩およびアミノ酸からのグルコースの合成は主要
な肝特異的代謝機能である。第５図は、補助エネルギー
源としてオレイン酸存在または不存在における乳酸塩か
らのグルコースの合成速度を示す。期待するように、オ
レイン酸はグルコースの産生を刺激する。なぜなら、こ
の脂肪酸を使用してこのプロセスにおけるエネルギーを
供給することができるが、乳酸塩は炭素を供給するから
である。これらの実験において測定したグルコースの合
成速度（乳酸塩から1.13モル／分/g、乳酸塩＋オレイン
酸塩から2.44モル／分/g）は、灌流したラットの肝臓ま
たは分離したラットの肝細胞を使用して見いだされた速
度とよく一致する［クレブス（Krebs）、H.A.ら、pp.26
9−291（1976）］。これは全体の肝特異的経路を通る束
の測定であり、単に単一の酵素のレベルでないことを指
摘すべきである。これがが示すように、重要な糖生成酵
素、ピルベートカルボキシラーゼ、ホスフェノールピル
ベートカルボキシラーゼおよびフルクトースジホスファ
ターゼのすべては、HepG2/C3A細胞において適当に発現
および調節される。
実施例VI HepG2/C3Aにおけるグルコースの合成 グルコースを断食したラットに投与するとき、それは
期待されるように直接グリコーゲンに再合成されず、ま
ずピルベートに分解され、次いでグルコースに再合成さ
れることが実証された［ニューガード（Newgard）、C.
B.ら、バイオロジカル・ケミストリー（Biol.Chem.）、
258:8046−8052（1983）］。これらの実験は、まずグル
コース分解経路通過した後、グリコーゲンとして堆積さ
れる、投与したグルコースの百分率を定量する、二重標
識技術を使用した。これらの実験は全ラットにおいて実
施したので、グルコース代謝の最初の部位に関して、連
続する問題が残った。グルコースはまず末梢組織、例え
ば、筋肉により利用され、次いで乳酸塩として肝臓に送
り戻されて、グルコース−６−ホスフェートおよびグリ
コーゲンに合成されることができるが、あるいはグルコ
ースは肝臓内の異なる代謝ゾーンにより異なるように利
用されることができるであろう。
HepG2/C3Aを使用して、同様な二重標識つけの研究を
実施した（参照、第６図）。これらの研究が実証するよ
うに、肝臓はこれらの代謝の相互転化のすべてを実施す
ることができる。14C−グルコースおよび3H−水を大量
の非標識糖と同時に投与したとき、グルコースの大部分
はまずグルコース分解を通して分解され、次いでグリコ
ーゲンに再系された。これはグリコーゲンの中に見いだ
される3Hの量により示される。グルコース分解通過し、
次いで再合成されるグルコースは、直接使用するグルコ
ースより非常に多くの組み込まれた3Hを有するであろ
う。標識されたグルコースおよび3H−水を投与し、グル
コースの初期のボーラス後の時間を変化させたとき、減
少する量の炭水化物はグルコース分解を通過した後、グ
リコーゲンを堆積し、これは14Cに関する3Hの量の減少
により示され、第６図に対するインセットに示されてい
る。これらの結果が示すように、グルコース分解および
糖生成は同時に活性であることができるが、グルコース
を添加すると、直接のグリコーゲン合成に徐々にスイッ
チされる。
実施例VII HepG2/C3Aにおける窒素の代謝 肝臓はアンモニアおよび他の窒素含有化合物のクリア
ランスのための主要な器官であり、そして窒素の不釣合
いは激症のFHFの患者が直面する、より重大な代謝の問
題の１つである。したがって、HepG2/C3Aがいくつかの
形態の窒素に代謝する能力を測定した。第７図は乳酸塩
および塩化アンモニウムからの尿素の合成を示す。この
実験から計算した速度、20μモル／分/gの細胞、は、ラ
ットの灌流した肝臓および分離した肝細胞において測定
された速度（２〜８μモル／分/gの肝臓［クレブス（Kr
ebs）、H.A.ら、pp.269−291（1976）］）によく匹敵す
る。
HepG2/C3A細胞が窒素を代謝する能力の他の試験にお
いて、細胞をFHFの患者からの血清の試料とインキュベ
ーションした。予備処理さた血清はアンモニアおよびい
くつかのアミノ酸、顕著にはフェニルアラニンおよびオ
ルチニンの増加を示した。この血清を0.5gのHepG2/C3A
細胞で３時間処理した後、尿素は増加し、そしてアミノ
酸は減少した。フェニルアラニンは、フェニルアラニン
ヒドロキシラーゼの作用下にチロシンの分解の１つのみ
のルートを有し、劇的に減少することに注意すべきであ
る。フェニルアラニンヒドロキシラーゼは、テトラヒド
ロビオプテリンリダクターゼに依存して、この反応のた
めの補酵素を供給する。再び、これは肝特異経路を通る
束の測度であり、そしてこれらの細胞が正常の肝細胞の
代謝を達成することを示す。このFHF血清を同一質量のH
eLa細胞またはHepaSK細胞（肝臓の内皮細胞系）とイン
キュベーションすると、測定したパラメーターのいずれ
の有意の変化も示されなかった。
実施例VIII 中空繊維のカートリッジの中で成長したHepG2/C3A 細胞培養のための中空繊維の装置は、主としてモノク
ローナル抗体の産生においてハイブリドーマの成長のめ
に使用されてきている［ハイフェッツ（Heifetz）、A.
H.ら、バイオロジカル・テクニークス（Bio.Technique
s）、７:192−199（1989）］。これらの装置はインライ
ンの酸素化系を装備するので、HepG2/C3Aは、静止培養
におけるより中空繊維の装置で成長させたとき、よりよ
く実行することが予測された。これらの装置は、また、
正常の肝臓の３次元の構築のあるものを提供するという
利点を有する。第８図は、アミコン・フロパス（Amicon
FloPath）1400カートリッジの中で成長したHepG2/C3A
によるアルブミンの産生速度を示す。このカートリッジ
をほぼ１×109細胞とインキュベーションした。グルコ
ースの利用およびアルブミンの産生をその後毎日モニタ
ーした。培養物を破壊せずに５週後、アルブミンの産生
が安定するとき、どれだけ多くの細胞がカートリッジの
中に存在するかを正確に評価する方法はない。しかしな
がら、細胞が成長した毛管外の空間は、この装置におい
て20mlである。この全体の空間が細胞で充填されている
と仮定すると、最大数は約20×109または20gの細胞であ
る。Ｔ−フラスコまたはマルチウェルの皿における通常
の培養条件（これは前述したように酸素制限的であるこ
とができる）下に、HepG2/C3Aは全面成長の培養におい
て約６μｇのアルブミン/mgの湿潤重量/24時間を産生す
る。中空繊維のカートリッジの中で成長したHepG2/C3A
細胞は、この量を２ファクターだけ越えた。アルブミン
／細胞の収量のこの増加は、多分、中空繊維の装置によ
り提供された、より生理学的培養条件のためである。
実施例IX LADにおいてHepG2/C3A細胞を使用する肝疾患の動物の処
置 HepG2/C3A細胞を、実施例VIIに記載するように、中空
繊維のカートリッジの中で高い密度に成長させた。この
立体配置は、細胞を、体外肝臓補助装置（ELAD）とし
て、灌流したヒトの肝臓と同様に機能させることができ
る。
前述の方法を使用して、このようにして調製したELAD
は、肝不全の動物を救う。致死以下の投与量のアセトア
ミノフェンを注射したイヌを使用するモデルを後述する
ように利用し、そして肝臓の壊死および機能のパラメー
ターを処置を通してモニターする。
Ａ、外科的手順： 無菌の条件および全体的麻酔下に、イヌにおいて頸動
脈と内部の頸静脈との間にシャントとつくる。胸鎖乳突
の前の境界に沿って切開をつくり、そして頸動脈および
内部の頸静脈を露出させる。両者の血管を下顎の角度の
レベルで結合し、そしてシャントを２つの血管の間で仕
上げる。シラスチック透析カテーテルを所定位置に縫合
し、切開を通して外に出し、そして創傷を4/0のシルク
で閉じた。動物が麻酔から回復するまで動物を観察し、
そして再び６時間に検査する。窮迫をモニターし、そし
てアセトアミノフェン（100mg/kg）をｑを６時間prmで
投与する。縫合糸を１週に除去し、そしてシャントが成
熟してしまうまで透析を開始しない。ELADの取り付け
は、シャントの球心性および遠心性の四肢に透析カテー
テルを経てカートリッジを取り付けることによって実施
する。創傷は外科用テープで常時カバーして、シャント
位置への損傷を回避する。
Ｂ、アセトアミノフェンの中毒 アセトアミノフェンの注射（第１投与について750mg/
k、第２の２回の投与について200mg/k）と同時に、１％
のキシロカイを皮下注射して痛みのある局所的反応を回
避する。致死以下の投与量を受けるグループにおける肝
臓の障害は、重大な症候を引き起こさない。致死投与量
を受け取るグループは、昏睡状態の前に、無食欲、嘔吐
および下痢を経験する。追加の薬物は、フランカビラ
（Francavilla）、A.らのモード（Gastroenterology、9
6:470−478（1989）］に従い、動物に投与しない。これ
は対照動物においてのみ重要である；肝臓透析を受ける
動物は無症候性である。
次いでLADを使用してトキシン、接合ビリルビンを除
去し、正常のアミノ酸のプロフィルを回復し、そして血
清タンパク質および凝固因子を置換する。
ELADをまた使用して、致死投与量のアセトアミノフェ
ンを与えた無肝臓のイヌの肝機能を支持する。イヌは間
欠的体外肝臓透析により生き続けている。本発明の細胞
系は、肝臓補助装置において使用する他の細胞の問題を
克服する。本発明の細胞は永久的であり、肝臓のきわめ
て重大な生物学的機能を複製することができ、そしてき
わめてよく分化する。肝臓補助装置において使用すると
き、細胞は肝欠損または不全の被検体を支持するために
有効なレベルで肝特異的生物学的活性を発現するするこ
とができる。こうして、本発明は肝機能を支持する方法
を提供する。これは肝臓の再生起こるために十分な時間
を提供し、ならびに循環するトキシンを除去することに
よって肝臓の再生のためのよりすぐれた環境を提供す
る。さらに、肝臓を再生することができない患者におい
て、患者は移植を待つ間生き続けることができる。
この方法は、また、第１の肝臓の移植前に、肝不全後
に患者が回復することができる手段を提供する。また、
緊急の第２の移植を必要とする患者において、肝臓補助
装置の入手可能性は、第２ラウンドの主要な外科を実施
する前に、患者を回収させることができるであろう。
この明細書の中に述べたすべての刊行物および特許出
願は、本発明が関係する当業者の技量のレベルを示す。
すべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物また
は特許出願が詳しくかつ個々に示す場合と同程度にここ
に引用によって加える。
本発明を理解を明瞭にするために例示および実施例に
より記載してきたが、ある種の変化および変更は添付す
る請求の範囲内で行うことができることは明らかであろ
う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 A61M 1/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】肝欠損または不全に悩む被検体を支持する
    ために有効なレベルで肝特異的生物学的活性を構成的に
    有する永久肝細胞の細胞系であって、該細胞系はグルコ
    ース不含培地中で成長することができ、そして全面成長
    において、該細胞系は約20〜41.2μg/mgの合計細胞タン
    パク質/24時間のアルブミンの発現速度を示し、そして
    該細胞系は、アルブミン／アルファフェトプロテインの
    比が約15〜51.5であるように、アルブミンおよびアルフ
    ァフェトプロテインを産生する永久肝細胞の細胞系。
  2. 【請求項２】肝欠損または不全に悩む被検体を支持する
    肝臓補助装置であって、該肝臓補助装置は肝欠損または
    不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特
    異的生物学的活性を構成的に有する永久肝細胞の細胞系
    の細胞からなり、該細胞系はグルコース不含培地中で成
    長することができ、そして全面成長において、該細胞系
    は約20〜41.2μg/mgの合計細胞タンパク質/24時間のア
    ルブミンの発現速度を示し、そして該細胞系は、アルブ
    ミン／アルファフェトプロテインの比が約15〜51.5であ
    るように、アルブミンおよびアルファフェトプロテイン
    を産生する肝臓補助装置。
  3. 【請求項３】対向する第１および第２の表面を有する半
    透膜をさらに含み、該細胞系が該第１面と接触している
    請求の範囲第２項記載の肝臓補助装置。
  4. 【請求項４】工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために
    有効なレベルで肝特異的生物学的活性を構成的に有する
    永久肝細胞の細胞系であって、該細胞系はグルコース不
    含培地中で成長することができ、そして全面成長におい
    て、前記細胞系は約20〜41.2μg/mgの合計細胞タンパク
    質/24時間のアルブミンの発現速度を示し、そして該細
    胞系は、アルブミン／アルファフェトプロテインの比が
    約15〜51.5であるように、アルブミンおよびアルファフ
    ェトプロテインを産生する永久肝細胞の細胞系の細胞
    を、対向する第１および第２の表面を有する半透膜に付
    与し、そして （ｂ）該第１表面上の該細胞を、細胞が全面成長に到達
    するまで培養することからなり、該培養工程は、 （ｉ）該第１表面に該細胞を接種し、そして （ii）該細胞の成長を支持する培地を、細胞が全面成長
    に到達するまで連続的に循環させる、 ことからなる、肝欠損または不全に悩む被検体を支持す
    る肝臓補助装置の調製方法。
  5. 【請求項５】工程： （ａ）肝欠損または不全に悩むヒト以外の被検体の血液
    を請求の範囲第２項記載の肝臓補助装置と接触させ、該
    接触は血液中の分子を請求の範囲第２項記載の細胞と接
    触させて該血液に含まれる分子の吸収および代謝的プロ
    セスを達成し、そして該接触はさらに該細胞中で産生さ
    れるタンパク質および低分子量の分子を血液中に入れさ
    せるものであり、そして （ｂ）分泌された代謝廃棄物を肝臓補助装置から除去す
    る、 ことならなる、肝欠損または不全に悩むヒト以外の被検
    体を支持する方法。
  6. 【請求項６】該肝臓補助装置が対向する第１および第２
    の表面を有する半透膜をさらに含み、該細胞は該第１の
    表面と接触し、そして工程（ａ）において血液を該第２
    の表面と接触させる、請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために
    有効なレベルで肝特異的生物学的活性を構成的に有する
    永久肝細胞の細胞系であって、該細胞系はグルコース不
    含培地中で成長することができ、そして全面成長におい
    て、該細胞系は約20〜41.2μg/mgの合計細胞タンパク質
    /24時間のアルブミンの発現速度を示し、そして該細胞
    系は、アルブミン／アルファフェトプロテインの比が約
    15〜51.5であるように、アルブミンおよびアルファフェ
    トプロテインを産生する永久肝細胞の細胞系を培地中で
    維持し、 （ｂ）上澄み液を該培養物から回収し、 （ｃ）血漿タンパク質を該上澄み液から分離し、そして （ｄ）該血漿タンパク質を精製する、 ことからなる、血清タンパク質の製造方法。
  8. 【請求項８】工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために
    有効なレベルで肝特異的生物学的活性を構成的に有する
    永久肝細胞の細胞系であって、該細胞系はグルコース不
    含培地中で成長することができ、そして全面成長におい
    て、該細胞系は約20〜41.2μg/mgの合計細胞タンパク質
    /24時間のアルブミンの発現速度を示し、そして該細胞
    系は、アルブミン／アルファフェトプロテインの比が約
    15〜51.5であるように、アルブミンおよびアルファフェ
    トプロテインを産生する永久肝細胞の細胞系を培地中で
    維持し、 （ｂ）該細胞系を試験すべき薬物に暴露し、そして （ｃ）該培養物を該薬物の代謝物の存在下に分析する、 ことからなる、薬物および薬理学的化合物の代謝的活性
    を評価する方法。
  9. 【請求項９】工程： （ｄ）該代謝物を他の細胞培養物の中に導入して、それ
    らの突然変異誘発または有害作用を決定する、 ことをさらに含む、請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために
    有効なレベルで肝特異的生物学的活性を構成的に有する
    永久肝細胞の細胞系であって、該細胞系はグルコース不
    含培地中で成長することができ、そして全面成長におい
    て、該細胞系は約20〜41.2μg/mgの合計細胞タンパク質
    /24時間のアルブミンの発現速度を示し、そして該細胞
    系は、アルブミン／アルファフェトプロテインの比が約
    15〜51.5であるように、アルブミンおよびアルファフェ
    トプロテインを産生する永久肝細胞の細胞系を培地中で
    維持し、 （ｂ）該細胞系の肝炎を菌株で感染させ、そして （ｃ）該菌株により引き起こされる該細胞系への作用を
    観察する、 ことからなる、ウイルス肝炎の検査方法。
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