KR20150100722A - 알코올성 간경변 치료용 자가 골수유래 중간엽 줄기세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간 질환을 위한 줄기세포 치료가 필요한 경우에 간 질환을 위한 줄기세포 치료를 제공한다. 본 발명의 일 양태의 경우, 본 발명은 알코올성 간경변증 환자를 치료하기 위하여 중간엽 줄기세포를 환자 내로 도입하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태의 경우, 본 발명은 자가 골수유래 중간엽 줄기세포가 인간의 알코올성 간경변증에 미치는 항-섬유화 효과와 관련된다. 본 발명의 또 다른 양태의 경우, 본 발명은 간경변증에 대한 줄기세포의 효과를 예측하기 위한 수단으로써 혈액학적 또는 조직학적 검사를 적용하는 방법과 관련된다. 한편, 본 발명의 또 다른 양태의 경우, 본 발명은 고순도의 줄기세포(98-99%) 및 다른 줄기세포에 비해 훨씬 더 우수하고 나은 성과를 가지는 줄기세포의 치료효과를 내기 위하여 고순도 줄기세포를 제작하는 방법과 관련된다.

Description

알코올성 간경변 치료용 자가 골수유래 중간엽 줄기세포{Autologous Bone-Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells For Alcoholic Cirrhosis}

본 발명은 알코올성 간경변 치료용 자가 골수유래 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.

하기의 논의는 다수의 출판물을 저자 및 출판년도에 따라 참조하였으며, 일부 출판물의 경우는 출판일이 최근이므로 본 발명의 선행기술로 고려될 수 없을 것이다. 본 명세서에서 이러한 출판물들의 논의는 보다 가능한 최대의 배경기술을 위하여 제공되는 것이며, 그와 같은 출판물들이 특허성 판단에서의 선행기술로 허용되는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.

진행성 간섬유증의 말기인 간경변증은 간 구조 왜곡과 재생 결절, 신생혈관 형성 및 션트(shunt) 형성의 특징을 보이며, 간 기능 상실과 간세포암으로 이어진다(1-5). 간경변증의 주요 원인은 만성 알코올 남용 및 B형 과 C형 간염 바이러스이다. 알코올성 간경변증(alcoholic liver cirrhosis, ALC)은 알코올 남용의 주요 의학적 합병증 중 하나로, 세계적으로 만성 간 질환의 주요 원인이다(6-8). 간경변증은 비가역적인 간 손상을 일으킬 수 있다. 치료를 받지 않으면, 간과 신장 기능 장애 및 위장관 출현이 일어날 수 있고, 때때로 사망에 이르게 된다. 미국의 경우, 간경변증으로 연간 약 25,000명의 사망자가 발생하고 있다. 그러므로 간경변증 및 다른 형태의 간 질환을 치료할 수 있는 효과적인 방법에 대한 요구가 있다.

진행된 간경변증에 대한 현재의 가장 효과적인 치료방법은 간 이식이다. 그러나 이 방법은 기증자의 부족, 수술 합병증, 면역 거부 반응 및 고액의 진료비 등의 몇 가지 한계점을 가지고 있다(9). 전체 장기 사용을 피하는 대체적인 방법, 예컨대 다양한 기원의 세포를 이식하는 것과 같은 방법이 최근 받아들여지고 있다(10, 11). 예를 들어, 줄기세포 이식이 간 질환의 효과적인 대체 치료요법으로 제시되었다(12, 13).

간 질환 동물 모델을 이용한 몇몇의 이전 연구는 골수 세포 이식이 간 재생 과정을 촉진하고 간섬유증을 감소시키며 간 기능과 생존율을 향상시킬 수 있다는 것을 입증하였다(14-17). 골수유래 줄기세포의 직접적인 간 투여를 시험한 초기의 병진식 파일럿 연구(translational pilot study)에 의해 밝혀진 바와 같이, 간 질환 치료제로서 줄기세포 이식은 그 전망이 고무적이며, 후기의 만성 간 질환에서 간 기능을 개선을 보임으로써 부분적인 간 절제술에 비해 향상된 간 재생을 제시하였다(18-24). 줄기세포 중에서, 특히 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 높은 자기복제 능력 및 분화 능력을 가지고 있으며 윤리적인 문제와 발암성 문제가 없기 때문에, 재생의학 분야에서 실용적인 장점을 가지고 있다.

본 발명은 간 질환을 위해 줄기세포 치료가 필요한 대상에 줄기세포 치료를 제공한다. 본 발명의 일 양태의 경우, 본 발명은 알코올성 간경변증 환자를 치료하기 위하여 중간엽 줄기세포(MSC)를 환자 내로 도입하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태의 경우, 본 발명은 자가 골수유래 중간엽 줄기세포가 인간의 알코올성 간경변증에 미치는 항-섬유화 효과와 관련된다. 본 발명의 또 다른 양태의 경우, 본 발명은 간경변증에 대한 줄기세포의 효과를 예측하기 위한 수단으로써 혈액학적 또는 조직학적 검사를 적용하는 방법과 관련된다. 한편 본 발명의 또 다른 양태의 경우, 본 발명은 고순도의 줄기세포(98-99%) 및 다른 줄기세포에 비해 훨씬 더 우수하고 나은 성과를 가지는 치료효과를 내기 위하여 고순도 줄기세포를 제작하는 방법과 관련된다.

본 발명이 공개 및 기재되기 전에, 본 발명은 명세서에 개시된 특정 구성, 공정 단계 및 물질에 한정되지 않으며 그러한 구성, 공정 단계 및 물질은 일정 정도 다양화될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항 및 이의 균등물에 의해서만 제한되므로, 명세서에서 사용된 용어는 특정한 구현예를 기술하기 위한 목적으로 사용된 것일 뿐이며, 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.

본 발명의 배경기술에 기재되고, 본 발명의 실행을 위한 추가적인 세부 사항의 제공을 위하여 명세서에서 언급된 출판물과 다른 참고 자료는 참고문헌에 통합되어 있다. 명세서에서 논의된 참고 자료는 본 발명의 출원일에 선행하여 공개된 것에 대해서만 제공된 것이다. 명세서의 어떤 내용도 선행발명 때문에 발명자가 이와 같은 개시를 선행할 권리가 없다는 것을 허용하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 “하나의" 및 ”그"는 그 내용이 명확하게 별도로 지시하지 않는 한, 복수의 참고자료를 포함하고 있다는 것을 주의해야 한다.

별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가지는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서, 다음의 용어들은 하기에 정의된 바에 따라 사용된 것이다.

본 명세서에서 사용된 “포함되는”, “의 특징을 가지는”, 및 이의 문법적으로 동등한 용어들은 추가적인, 인용되지 않은 구성요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는, 포괄적인 오픈엔드의 용어들이다. “포함하는”은 더 제한적인 용어인 “구성되는” 및 “필수적으로 구성되는”을 포함하는 의미로 해석되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 “구성되는” 및 이의 문법적으로 동등한 용어들은 청구범위에 특정되지 않은 구성요소, 단계, 또는 성분은 모두 배제한다는 의미이다.

본 명세서에서 사용된 “필수적으로 구성되는” 및 이의 문법적으로 동등한 용어들은 청구범위의 범위를, 특정한 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기초와 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 한정한다는 의미이다.

본 발명은 알코올성 간경변증(ALC)을 가진 환자에서 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 항섬유증 효과에 관한 것이다. 명세서에 기재된 방법의 특정한 구현예에서, 인간 중간엽 줄기세포는 자가, 타가, 또는 대상과 HLA-양립가능한 것이다. 알코올성 간경병증을 가진 개별적 대상에 투여하는 중간엽 줄기세포의 수는 간경변증의 심각성, 간경변증 상태의 지속기간, 간경변증 조직의 크기 및 투여방법에 따라 다양해질 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 일 구현예의 경우, 농축된 인간 중간엽 줄기세포의 치료 유효용량은 안전하며 효과적인 양이다. 또 다른 특정한 구현예의 경우, 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)의 양은 최소한 1× 10⁴개 세포이다. 또 다른 구현예의 경우, 본 명세서에서 기재된 방법에서 대상에 투여된 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)의 양은 약 1× 10⁴ 내지 5× 10⁸개 세포이다. 어떤 구현예의 경우, 세포의 수는 1× 10⁴ 내지 5× 10⁷개, 1× 10⁴ 내지 5× 10⁶, 1× 10⁵ 내지 5× 10⁷, 1× 10⁶ 내지 5× 10⁷, 및 1× 10⁷ 내지 5× 10⁸개이다.

세포의 다른 타입들을 조합하여 투여하는 경우, 세포들의 타입은 자가, 타가, 또는 대상과 HLA-양립가능한 것일 수 있으며, 한편 다른 구현예의 경우, 하나의 세포 타입은 자가이고 다른 타입은 타가 또는 대상과 HLA 양립가능한 것일 수 있다.

대상에 투여한 세포의 양은 투여방법 및 투여부위에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 에드몬톤 프로토콜(Edmonton protocol)을 사용하는 치료 유효세포용량은 동맥주사의 경우보다 더 낮을 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법의 구현예들의 경우, 대상에 세포를 주사하여 투여하는 것이 효과적이다. 주사는 대상에 세포를 전신투여하는 것을 포함할 수 있으며, 또는 세포의 섬유화 조직으로의 이동을 촉진하기 위하여 세포를 섬유화 조직에 근접하여 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 또는 상기 두 가지를 모두 포함할 수 있다. 주사는 섬유조직에 혈액을 공급하는 혈관, 예컨대 간문맥 또는 간동맥에 이루어질 수 있으며, 또는 섬유화 조직으로부터 혈액을 제거하는 혈관, 예컨대 간정맥에 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 특정한 구현예들의 경우, 대상으로의 세포주사는 골수로의 주사, 동맥 내 주사, 근육 내 주사, 정맥 내 주사 또는 피내 주사를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법의 일 구현예의 경우, 세포를 최소한 하나의 동맥으로 주사함으로써 대상에 투여한다.

본 발명은 알코올성 간경변증을 가진 대상에서 간 기능을 개선하는 방법을 제공하며, 상기 대상에 자가 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)를 포함하는 조성물을 상기 BM-MSC의 항섬유증 효과를 명확하게 하는 방법으로 투여하는 것을 포함한다.

그 대상은 기준시점에 생체검사로 입증된 알코올성 간경변증을 가지고 있다.

그 대상은 BM-MSC를 투여하기 최소한 6개월 전부터 알코올을 섭취하지 않았다.

BM-MSC는 상기 대상의 골수에서 분리되고 1개월 동안 배양된 것이다.

BM-MSC를 투여하는 방법은 5× 10⁷개 BM-MSC를 간 동맥을 통해서, 4주 및 8주차에 두 번 대상에 주사하는 것이다.

12주차에 간 섬유증의 조직학적 및 정량적 개선을 평가하기 위하여, 대상으로부터 생검을 하고 실험실 테스트를 한다.

본 명세서의 방법의 어떤 구현예의 경우, 동맥 내 카테터(예컨대 벌룬 카테터(balloon catheter)에 한정되지 않는 것)를 이용하거나 또는 스텐트를 이용하여 세포를 대상에 투여하는 것을 수행하였다. 본 명세서의 방법에서 대상에 세포를 투여하기 위한 방법으로서, 세포를 대상에 전달하기 위해 현재 이용 가능한 어떤 방법도 사용될 수 있다.

본 명세서의 방법의 어떤 구현예의 경우, 최소한 하나 이상의 치료를 대상에 추가할 수 있다. 일 구현예의 경우, 추가되는 치료에는 야채 단백질이 풍부한 규정식, 알코올섭취 절제, 수면 휴식, 비타민 B, 비타민 E 또는 비타민 C, 또는 이들의 조합이 포함된다. 바람직한 구현예의 경우, 추가된 치료는 간이식 또는 간절제의 필요성을 더욱 감소시키거나, 생존율을 더 증가시킨다.

본 명세서의 방법의 어떤 바람직한 구현예의 경우, 투여 전에 중간엽 줄기세포를 농축한다. 농축에 의해 세포의 농도가 다른 세포들에 비해 증가하게 된다. 농축은 다른 타입의 세포를 조성물에서 제거하는 방법, 또는 다른 타입의 세포에 대해 한 종류의 세포를 농축하는 방법으로서 해당 분야에 알려져 있는 어떤 다른 방법에 의해서도 이루어질 수 있다. 어떤 구현예의 경우, 본 명세서의 방법에서 사용된 세포를 최소한 2배, 5배, 20배, 50배, 100배, 500배, 1,000배, 5,000배, 10,000배, 50,000배 농축하였다.

본 명세서의 방법의 어떤 구현예의 경우, 대상에 투여할 세포를 버퍼, 예컨대 식염수 버퍼에서 배양하였다. 어떤 바람직한 구현예의 경우, 버퍼는 치료를 받을 대상으로부터 분리한 인간 혈청을 포함한다. 인간 혈청은 표준적인 방법에 의해 분리될 수 있다. 인간 혈청을 포함하고 있는 용액을 냉동보존된 세포 샘플을 해동하기 위한 목적으로 사용할 수도 있다. 어떤 구현예의 경우, 인간 혈청을 포함하고 있는 용액은 1-20%의 인간 혈청, 보다 바람직하게는 5-15%의 인간 혈청을 포함하고 있다.

본 발명의 일 양태는 간 질환을 가지고 있는 대상에 인간 중간엽 줄기세포의 치료적 유효용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 간 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 중간엽 줄기세포는 다양한 환경의 영향에 따라 결합조직의 어떠한 특정 유형(예컨대, 지방, 유륜, 뼈, 연골, 탄성 조직 및 섬유성 결합조직)으로도 분화할 수 있는, 골수 및 말초혈액에서 발견되는 (조직)형성을 도와줄 수 있는 전능의 아세포이다. 중간엽 줄기세포는 보통 “골수 기질세포(marrow stromal cell)" 또는 ”기질세포(stromal cell)"라고 언급되기도 한다. 중간엽 전구세포(mesenchymal progenitor cell)는 중간엽 줄기세포로부터 유래하며 더 제한적인 분화능력을 가지고 있으나, 최소한 2 종류 조직으로 분화할 수 있다(예를 들어, Minguell et al. 2001 Exp Biol Med(Maywood); 226(6):507-20의 도 1을 참고). 본 명세서의 용어, “중간엽 줄기세포”는 중간엽 줄기세포, 중간엽 전구세포 및 골수 기질세포를 포함한다.

비록 hMSC가 희귀하며, 골수의 전체 유핵세포가운데 0.01-0.001%를 구성하고 있지만, 출원인들은 줄기세포능력의 상실없이 골수에서 hMSC를 분리하기 위한 세포 배양방법, 골수의 다른 세포들로부터 균질성을 가지기 위한 정제방법 및 배양에서의 세포분열을 통한 세포 수 증가방법을 완성하였었다(Haynesworth S E et al. Bone 13, 81-88(1992)).

본 발명에 따른 방법에서 사용한 중간엽 줄기세포는 말초혈액 또는 골수에서 분리될 수 있다. hMSC를 준비하는 방법은 미국특허 공개공보 5,486,359에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 바람직한 구현예의 경우, 치료를 받는 대상의 골수 또는 말초혈액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리한다. 중간엽 줄기세포의 빠른 분리를 위해 몇 가지 기술들이 알려져 있으며, 여기에는 류코페레시스(leucopheresis), 밀도 구배 분획, 면역학적 선택, 차등 접착력 분리(differential adhesion seperation)과 같은 기술들이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 방법에서의 사용을 위한 hMSC는 화학적으로 규정된 혈청이 없는 배지 또는 “완전 배지”, 예컨대 10% 혈청을 보충한 DMEM(Dulbecco's Modified Egles Medium)에서 유지될 수 있다. 적합한 화학적으로 규정된 혈청이 없는 배지는 미국특허 공개공보 5,908,782 및 PCT 공개공보 WO96/39487에 기재되어 있으며, 완전 배지는 미국특허 공개공보 5,486,359에 기재되어 있다. 화학적으로 규정된 배지는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)과 같은 최소 필수 배지를 포함하는데, 여기에 인간 혈청 알부민, 인간 Ex Cyte 지방단백질, 트랜스패린, 인슐린, 비타민, 필수 및 비필수 아미노산, 피루빈산 나트륨, 글루타민 및 마이토겐(mitogen)이 보충될 수 있다. 이와 같은 배지는 분화없이 중간엽 줄기세포의 성장을 자극한다. 2주 동안 배양을 하면 접착된 세포집단이 10 내지 14배가 된다. 세포를 분주한 다음, 3-4일 마다 배지를 교체하여 비-접착 세포들을 제거하면, 줄기세포의 특징들을 보유하고 있으면서, 모노클로날 항체에 의해 확인되는 세포 표면 항원의 발현에 의해 식별되고 정량화될 수 있는, 고순도의 접착세포 배양의 결과를 얻게 된다.

본 명세서에 기재된 방법의 경우, hMSC의 치료 유효용량은 대상에 안전하게 받아들여질 수 있는 최대한의 세포 수부터 항섬유 효과의 유도를 위해 필요한 최소한의 세포 수의 범위일 수 있다. 일반적으로, 각 내피생성세포 및 hMSC의 치료 유효용량은 대상의 체중량(kg) 당 최소한 1x10⁴개 세 포이며, 가장 일반적으로, kg 당 각 타입의 세포 수가 5x10⁶개 세포 이상일 필요는 없다. 비록 hMSC가 자가이거나 대상과 HLA-양립가능한 것이 바람직하지만, hMSC는 다른 개인 또는 종, 유전 조작된 inbred donor strain, 또는 in virto 세포 배양에서 분리된 것일 수 있다.

MSC의 치료 유효용량을 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제에 현탁할 수 있다. 그러한 담체에는 기본 배지에 1% 혈청 알부민, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물 및 이들의 조합을 혼합한 것들이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 제형은 투여방법에 적합해야한다.

바람직한 구현예의 경우, 인간의 정맥투여를 위해 적합한 약제학적 조성물에서와 같은 일반적인 절차에 따라 hMSC 준비물 또는 조성물을 제형화할 수 있다. 전형적으로, 정맥, 동맥 또는 심장 내의 투여를 위한 조성물은 멸균한 등장성의 수용성 버퍼상태의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 주사 부위에서의 통증완화를 위한 국소 마취제를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 구성요소들은 분리되어 제공되거나 또는 유닛 제형 내에 복합제, 예컨대, 유효성분의 양을 표시하는 앰플과 같은 밀봉된 용기 내에 냉동된 농축물과 같은 제형으로 제공될 수 있다. 조성물을 주사로 투여하는 경우, 멸균한 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 포함하는 주사용 용기에 나누어 조제될 수 있다. 조성물을 주사로 투여하는 경우, 주사용 멸균수의 앰플 또는 식용수를 투여 전 구성요소를 혼합하기 위한 목적으로 제공할 수 있다.

본 명세서를 고려하였을 때, 대상에 세포를 투여하기 위한 수단이 다양할 수 있다는 것은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 그러한 방법에는 세포를 대상 내 목표위치에 주사하는 것도 포함된다. 세포를 주사, 이식, 또는 대상과의 접촉에 의한 도입을 촉진시킬 수 있는 전달용 장치에 주입할 수도 있다. 그러한 장치에는 세포를 투여 대상의 신체 내로 세포 및 액체를 주사하기 위한 튜브, 예컨대 카테터와 같은 것들이 포함된다. 바람직한 구현예의 경우, 튜브는 추가적으로 바늘, 예컨대 주사기를 포함할 수 있으며, 이를 통해 투여대상의 원하는 위치 내로 본 발명의 세포를 도입할 수 있다. 바람직한 구현예의 경우, 카테터(용어 “카테터”는 물질을 혈관으로 전단하기 위한 모든 종류의 다양한 튜브-유사 시스템을 포함하는 의미로 사용됨)를 통해 혈관 내로 투여하기 위하여 세포를 제형화할 수 있다. 다양한 형태의 전달을 위해 세포를 준비할 수 있다. 예를 들어, 세포를 용액 또는 젤에 현탁할 수 있다. 세포의 생존상태를 유지하면서 세포를 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제와 혼합할 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 담체 및 희석제에는 식염수, 수용성 버퍼 용액, 용매 및/또는 분산매(dispersion media)가 포함된다. 그와 같은 담체 및 희석제의 용도는 해당 분야에서 잘 알려져 있다. 바람직하게 용액은 멸균되고 유체이며, 등장성일 수도 있다. 바람직하게, 용액은 제조 및 보관 조건하에서 안정적이며, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로솔 및 이와 유사한 것들을 사용함에 있어 박테리아 및 균주와 같은 미생물의 오염으로부터 보호된다.

hMSC를 투여하는 방법에는 정맥 또는 동맥 주사 및 작용을 원하는 위치의 조직에 직접적인 주사방법이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 준비된 것을 어떤 일반적인 방법, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사(bolus injection)에 의해서 투여할 수 있으며, 다른 생물학적 유효성분과 함께 투여할 수 있다. 바람직하게 투여는 전신에 대한 투여(systemic administration)일 수 있다.

본 발명의 실행을 위해 적합하고 명세서에서 표시되지 않은 해당 분야의 기술범위 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물하그 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 및 면역학의 일반적인 기술을 사용할 수 있을 것이다. 그러한 기술들은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 다음과 같은 문헌을 참고할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook and Russell(Cold Spring Harbor Laboratory Press:2001); the treaties, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Using Antibodies, Second Edition by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor, New York, 1999; Current Ptocols in Cell Biology, ed. by Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, and Yamada, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999.

도 1은 환자 선정과 연구 설계 흐름도이다.
도 2는 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 면역 표현형과 분화 잠재능력을 보여주는 것이다. (A) 세포 표면 항원(CD14, CD34, CD45, CD73 및 CD105)의 발현을 유동세포계수법을 이용하여 평가하였다. (B) 양성 개체군의 대표 히스토그램으로 11명의 환자에 대한 평균과 표준편차를 나타내고 있다. (C) 내생의 알칼리 포스파타아제(endogenous alkaline phosphatase)의 활성에 대해 양성으로 염색된 골수유래 중간엽 줄기세포로서, 이는 골 형성 배지(OM;Ⅰ) 내에서 골 세포로의 분화를 나타내는 것이며, 대조군 배지(CM;Ⅱ)에서는 음성으로 염색되었다. 지방 방울(lipid droplet)에 대해 양성으로 염색된 골수유래 중간엽 줄기세포로서, 이는 지방 형성 배지(AM;Ⅲ) 내에서 지방 세포로의 분화를 나타내는 것이며, 대조군 배지(CM; Ⅳ)에서는 음성으로 염색되었다(× 200).
도 3은 조직학적 및 면역 조직화학적 분석을 보여주는 것이다.
조직학적 분석을 H&E(A, B) 및 MTC(C, D) 염색에 의해 평가하였다(× 100). 골수유래 중간엽 줄기세포 치료법은 Laennec fibrosis scoring system에 따르는 F4C 치료 전(A, C)에서 F4B 치료 후(B, D)로의 경변증 개선을 유도하였다.
간 생검 표본으로부터의 조직 절편을 Picrosirius Red 염색한 결과, 적색으로 염색된 콜라겐 비율이 치료 전(E)에서 치료 후(F)로의 변화를 나타내었다(× 40). Picrosirius Red로 염색된 콜라겐의 상대적인 면적을 이미지 분석 프로그램을 이용하여 분석하였다. 콜라겐의 비례 면적 비율이 치료 전 22.61± 8.39%에서 골수유래 중간엽 줄기세포 치료법 실시 후 17.70 ± 6.93%로 감소하였다. 데이터는 평균 및 표준편차이다. *p<0.001
도 4는 섬유증과 관련된 유전자 발현 분석을 보여주는 것이다.
골수유래 중간엽 줄기세포 치료방법 실시 후, 실시간 PCR로 분석한 결과, (A)TGF-β1, (B)collagen-1, (C)α-SMA의 상대적인 발현(2-ΔΔCt 값)은 각각 3.81± 1.39에서 2.65± 1.21(*p=0.013)로, 4.51± 2.62에서 3.15 ± 2.82(*p=0.021)로, 4.27± 1.89에서 2.34± 1.60(*p=0.007)로 유의하게 감소하였다. 데이터는 평균 및 표준편차이다.

실시예에서는 본 발명을 일반적으로 기술하였으며, 하기의 실시예에 따르는 참고자료에 의해 본 발명을 더 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자라면, 상기 언급된 교시 및 하기의 예들로부터, 다른 줄기세포 공급원 및 선별 방법, 다른 배양배지 및 배양 방법, 다른 투여량 및 처리 일정, 다른 동물 및/또는 사람을, 본 발명의 청구 범위를 벗어나지 않는 한, 제한 없이 모두 사용할 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이므로, 하기의 실시예는 단지 본 발명의 특정 양태 및 구현예의 예시 목적으로 포함된 것이며, 본 발명을 한정하려는 것이 아니다.

실시예 1 알코올성 간경변증 환자에 대한 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 치료의 항섬유화 효과

생검에 의해 알코올성 간경변증으로 판명되고, 본 발명 참여 이전에 6개월 이상 알코올을 섭취하지 않은(최근 알코올 섭취로 인한 염증의 영향을 배제하기 위함) 37세부터 60세 사이의 환자를 본 발명에 적합하다고 간주하였다(25, 26). 6개월의 알코올 절제가 대부분의 참가자에서 활성이 있는 염증을 추가적으로 감소시키고 간 조직을 안정화시키며, 최근의 알코올 소비로 인한 심한 염증으로 발생될 수 있는 편견을 제거하는데 필요할 것이라고 가정하였다.

또한, 20세 이하 또는 65세 이상의 환자, B형 또는 C형 간염 바이러스와 관련된 간경변증, 심한 간부전(혈청 빌리루빈>85 μmol/L), 간성혼수, 간신증후군, 반복적인 위장관 출혈, 특발성세균성복막염, 간 종양 또는 다른 종류의 암 병력을 가지는 환자 및 임신 또는 수유 중인 환자의 경우, 본 발명에서 제외하였다(도 1).

각 환자의 Child-Pugh score 및 MELD(Model for end-stage liver disease) score를 결정하기 위하여, 초음파 검사 및 CT 스캔을 포함하는 방사선 이미징 연구, 및 실험실 연구를 수행하였다. B형 또는 C형 간염 감염 및 자가 항체에 대한 혈청학적 검사를 실시하여 간 질환의 다른 원인을 배제하였다.

이와 같은 기준에 따라, 본 발명을 위해 일차적으로 12명의 환자를 선택하였으나, 알코올 섭취(60 g/1주 이상의 지속적인 알코올 섭취)를 계속한 환자 한명을 제외하였다. 따라서, 최종적으로 11명의 환자를 등록하였으며, 환자들의 일반적 특징을 표 1에 정리하였다.

	줄기세포 치료 전 (총 n = 11)	줄기세포 치료 후 (총 n = 11)	P
Age(years) /sex(males:females)	49.55± 7.9(3760) /10:1	49.55± 7.9(3760) /10:1	-
Etiology(alcohol)	11(100%)	11(100%)	-
Albumin(g/dL)	3.5± 0.6(2.64.5)	3.9± 0.5(2.94.5)	0.016
AST (IU/L)	49.1± 19.7(2282)	43.1± 18.8(2379)	0.103
ALT (IU/L)	15.6± 6.5(628)	15.3± 7.1(932)	0.843
r-GT	54.2± 11.6	52.7± 10.9	0.471
Total bilirubin (mg/dL)	1.3± 0.9(0.23.6)	1.1± 0.7(0.42.9)	0.163
Prothrombin time (INR)	1.2± 0.1(1.01.4)	1.1± 0.1(1.01.3)	0.050
Platelet count (/mm3)	119,545.5± 66,872.0 (51,000246,000)	112,363.6± 34,989.3 (73,000179,000)	0.642
Creatinine(mg/dL)	0.7± 0.2(0.51.0)	0.6± 0.2(0.40.9)	0.311
Child-Pugh score	7.1± 0.9(69)	5.4± 0.7(57)	0.000
MELD score	9.2± 2.8(615)	8.3± 2.4(613)	0.005
Histology			0.020
F4A	1(9.1%)	4(36.4%)
F4B	3(27.3%)	4(36.4%)
F4C	7(63.6%)	3(27.3%)

AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; rGT, gamma glutamyl transferase; MELD, Model for End-Stage Liver Disease.

골수 천자, 중간엽 줄기세포의 분리 및 세포 배양

임상 등급의 자가 중간엽 줄기세포의 생산을 위한 모든 제조 및 제품 시험 절차는 우수의약품제조관리기준(GMP) 조건(FCB-Pharmicell Co., Ltd., Sungnam, Korea) 하에서 실시하였다. 국소 마취 후 10-20㎖ 정도의 골수를 환자의 뒤엉덩뼈 능선에서 채취하였다. 골수 단핵세포를 밀도-구배 원심분리(Histopaque-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 분리하였다. 단핵세포(2-3 × 10⁵ cells/㎠)를 75-㎠ 플라스크(Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)에 분주하고 10% 소 태아혈청(FBS, Gibco)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 첨가한 low-glucose DMEM(Dulbecco‘s modified Eagle’s medium; Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지에서 37℃, 5% CO² 조건으로 배양하였다. 5일 후, 배지를 교체하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 세포 배양이 80%의 밀집도를 보일 때 세포에 트립신/EDTA 용액(Gibco)을 처리하여 수확하고 175-㎠ 플라스크에 4-5× 10³ cells/㎠ 밀도로 다시 분주하였다. 주사를 위한 세포의 경우, 4-5회까지 연속적으로 계대배양을 하였다. 2차 주사를 위하여, 배양 중 일부의 passage-2 세포를 수확하고 10% 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich) 및 90% FBS에서 냉동보존하였다.

골수유래 중간엽 줄기세포의 면역표현형 및 분화 분석

주사 당일, 골수유래 중간엽 줄기세포의 면역표현형(CD14, CD34, CD45, CD73, CD105)을 분석하고, 분화 가능성(골세포 분화 및 지방세포 분화; 도 2)을 확인하였다. 면역표현형 분석을 위하여, 골수유래 중간엽 줄기세포를 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 PE(phycoerythrin)가 결합된 항체(CD14-FITC, CD34-FITC, CD45-FITC, CD73-PE, CD105-PE; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 염색하였다. 즉, 5× 10⁵개의 세포를 0.2 ㎖의 인산완충식염수(PBS)에 현탁한 다음, FITC- 또는 PE-결합된 항체와 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 대조군 isotype으로 FITC- 또는 PE-결합된 마우스 IgG를 단백질 특이적 일차 항체와 동일한 농도로 사용하였다. 세포의 형광 강도를 유동세포계수법(Epics XL; Beckman Coulter, Miami, FL, USA)으로 평가하였다.

골세포 분화 분석을 위해, 우선 세포를 2× 10⁴ cells/㎠ 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하고 다음과 같은 골혈성 배지에서 2-3주 동안 배양하였다: 10% FBS, 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 10^-7 M 덱사메타손(dexamethasone), 0.2 mM 아스코르브산(ascorbic acid, Sigma-Aldrich)을 보충한 low-glucose DMEM 배지(27). 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)에 의해 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)로부터 p-니트로페놀(p-nitrophenol)이 방출되는 것으로부터 골세포 분화를 정량화하였다(28).

지방세포 분화를 위하여, 골수유래 중간엽 줄기세포를 2× 10⁴ cells/㎠의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하고, 1주 동안 배양한 다음, 지방 형성 배지(10% FBS, 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 10 ㎍/㎖ 인슐린, 100 μM 인도메타신(indomethacin)을 첨가한 high-glucose DMEM)로 3주 더 배양하여 분화를 유도하였다. 분화된 세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 처리하여 고정화시키고 지방 방울을 보여주기 위해 신선한 Oil Red-O 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다(도 2C).

자가 골수유래 중간엽 줄기세포 주사

주사 당일, 중간엽 줄기세포를 trypsin/EDTA를 이용하여 수확한 후 PBS로 두 번, 생리식염수로 한 번 세척하고, 10 ㎖의 생리식염수에 최종 농도 5× 10⁶ cells/㎖로 현탁하였다. 중간엽 줄기세포의 임상적 사용을 위한 기준으로서 투여 3-4일 전 시험에서 80% 이상의 생존률, 미생물 오염(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 마이코플라즈마)의 부재를 보이며, 유동세포계수법에 의한 평가로 90% 초과의 세포가 CD73 및 CD105를 발현하고 3% 미만의 세포에서 CD14, CD34 및 CD45가 결여되어 있는 것을 포함하였다. 4주차와 8주차에 각각 10 ㎖의 식염수에 들어있는 5× 10⁷개의 세포를 동축 혈관조영 카테터(coaxial angiographic catheter, Boston Scientific, Natick, MA, USA)를 이용하여 우측 간동맥을 통해 주사하였다. 골수유래 중간엽 줄기세포의 주사를 간동맥에 위치한 동축 혈관조영 카테터(Boston Scientific)를 이용하여 실시하였다. 주사 과정뿐만 아니라 백혈구 성분채집을 통하여 지속적인 모니터링을 수행하였으며, 혈류동태의 변화를 기록하였다.

추적 조사

등록 후 연구 설계에 따라 환자들을 추적 조사하였다. 이 연구에 참여하는 동안 환자들은 어떤 다른 약물 치료도 받지 않았다. 알코올 부작용을 매주 환자 및 환자 가족과의 전화통화, 및 매달의 병원 방문을 통해 모니터링하였다. 매번 병원 방문 시, 존재하는 부작용을 평가하기 위한 임상적, 생화학적 시험을 실시하였다. 알코올 섭취의 증거의 증거가 있는 경우 본 연구에서 해당 환자를 제외하였다. 2차 치료용 골수유래 중간엽 줄기세포 2차 주사 후, 12주차에 추적 조사용 간 생체검사를 실시하였다(도 1).

일차 및 이차 결과

일차 결과는 조직학적 발견의 개선이었으며, 이는 Laennec fibrosis scoring system에서 최소한 1점 이상의 향상을 필요로 하는 것이었다. 이차 결과에는 간섬유화에 관련된 직접적인 마커인 Child-Pugh score의 변화 및 부작용 발생의 변화가 포함되었다.

섬유화 평가

조직 형태학적 및 면역 조직화학적 분석

기준시점 및 2차 치료용 골수유래 중간엽 줄기세포 주사 후 12주차에, 쌍을 이루는 간 생체검사(paired liver biopsy)를 실시하였다. 파라핀에 박힌 간 생검 표본을 5 ㎛ 두께의 절편으로 준비한 다음, 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, H&E), MTC(Masson‘s trichromeMTC), α-SMA(α-smooth muscle actin), 및 Picrosirius Red를 이용하여 염색하였다.

환자의 임상 데이터를 모르는 한 명의 간 병리학자(M.Y.C)가 Laennec fibrosis scoring system(표 2 및 도 3) 및 METAVIR fibrosis scoring system을 이용하여 섬유화를 평가하였다(29, 30). 이 연구를 위하여 길이 15 mm 이상, 너비 1.2 mm 이상의 간 생검 표본이 필요하였다. 단편화된 생검에서, 각 개별적인 단편의 최대 크기를 더하여 전체 길이를 추정하였다. Laennec system을 이용하는 경우, 각 표본에서 우세한 유형의 격막 두께를 선택하였고 스코어링을 위하여 가장 작은 결절을 선별하였다. Laennec fibrosis scoring system은 간경변증을 세 가지 하위분류로 나누고, 처치 후 섬유화 정도를 좀 더 상세하게 평가할 수 있게 해주기 때문에 이 시스템을 이용하였다(29). 또한, 간섬유증에서 치료로 유도된 변화를 평가하기 위하여, 컴퓨터화된 이미지 분석 시스템(analySIS 3.0, Soft Imaging System, MuGermany)을 이용하여 디지털 현미경 사진에서의 MTC 염색에 대해 양성인 전체 면적의 비율로서 섬유화 면적을 정량화 하였다. 섬유화 면적을 정량화하기 위하여, × 100의 원래 배율에서 현미경상의 구역을 임의로 선택하였다. 면역조직화학적 분석을 위하여, 조직 절편을 완충용액으로 세척한 후, α-SMA에 대한 일차 항체(1:800 희석, Neomarkers, Fremont, CA, USA)와 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 조직 절편을 크로모젠 3-아미노-9-에틸카르바졸(chromogen 3-amino-9-ethylcarbazole, BioGenex, San Ramon, CA, USA)로 5-7분 동안 반응시켰다. 마운팅 전에, 조직 절편을 헤마톡실린으로 대비염색한 다음, 탈수시켰다. 탐지 시스템으로서 UltraVision LP Large Volume Detection System(Lab Vision, Runcorn, UK)을 사용하였다. 컴퓨터화된 이미지 분석 시스템을 이용하여 면역 양성 세포의 형태학적 분석도 실시하였다.

[표 2] 간 생검 표본의 섬유화 점수 산정를 위한 Laennec scoring system

Stage	Name	Septa (thickness and number)	Criteria	Score
0	No definite fibrosis			0
1	Minimal fibrosis	+/-	No septa or rare thin septum; may have portal expansion or mild sinusoidal fibrosis	1
2	Mild fibrosis	+	Occasional thin septa; may have portal expansion or mild sinusoidal fibrosis	2
3	Moderate cirrhosis	++	Moderate thin septa; up to incomplete cirrhosis	3
4A	Mild definite, or probable cirrhosis	+++	Marked septation with rounded contours or visible nodules. Most septa are thin(one broad septum allowed)	4
4B	Moderate cirrhosis	++++	At least two broad septa, but not very broad septa and less than half of biopsy length composed of minus nodules	5
4C	Severe cirrhsis	+++++	At least one very broad septum or more than half of biopsy length compsed of minute nodules(micronodular cirrhosis)	6

콜라겐의 총량을 정량화하기 위하여 Picrosirius Red 염색을 실시하였다. 파라핀에 박힌 간 생검 표본의 5 ㎛ 두께 절편에서 파라핀을 제거하고 증류수로 재수화(rehydration)한 후, 제조사의 설명서에 따라 Picrosirius Red 염색 키트(Polysciences, Warrington, PA, USA)으로 염색하였다.

또한, 컴퓨터화된 이미지 분석 시스템(IMT i solution, Vancouver, Canada)을 이용하여 현미경(Olympus BX51, Tokyo, Japan)상에서 Picrosirius Red 염색에 대해 양성인 전체 면적의 비율로 표현되는, 콜라겐 비례 면적으로부터 콜라겐(섬유 조직의 주요 성분)의 양을 추산하였다. 콜라겐 비례 면적을 측정하는 과정에서, 이미지의 인위적 결과 및 대간문맥관과 혈관벽에 존재하는 구조적인 콜라겐을 제거하였다(31).

Transforming growth factor β1, 타입 1 콜라겐 및 α-SMA 유전자 발현

제조자의 설명서에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 쌍을 이루는 간 생검(paired liver biopsy)으로부터 전체 RNA를 분리하였다. 분광광도계(Ultrospec 2100 pro UV/Visible, Amersham Bioscience, Freiburg, Germany)를 사용하여 RNA 순도와 농도를 확인하였다. GeneAmp RNA PCR Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 랜덤 헥사머(Random hexamer)로 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭을 위하여, GenBank 데이터베이스의 인간 특이적 유전자 서열에 기초하여 관심 유전자에 대해 서열 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. ABI PRISM 용 SYBR GreenER qPCR SuperMix(Invitrogen)을 이용하여, ABI PRISM 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)으로 제조사의 지시에 따라 정량 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 수행하였다. SDS2.2.2 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 타겟 유전자의 Ct(cycle threshold) 값을 내재적 컨트롤인 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 Ct 값으로 노말라이징하였다. 2-ΔΔCt의 방정식을 이용하여 상대적인 변화를 계산하였다.

통계 분석

PP 분석(per-protocol analysis)로 결과를 분석하였다. Fisher‘s exact test, MannWhitney U-test 및 Wilcoxon signed-rank test를 이용하여 비교를 하였다. 결과를 평균± 표준편차 값으로 표현하였다. 통계적 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다. 의료 통계학자(E.H.C.)가 연구 설계와 데이터 분석을 지원하였다.

실험결과

본 연구에 참여한 환자의 특징을 표 1에 정리하였다. 모든 환자들은 쌍을 이룬 생체검사에 의해 입증된 간경변증을 가지고 있었으며, 그룹의 평균연령은 50세(범위 37-60세)이었다. 남녀 비율은 10:1 이었다. CD14, CD34, CD45, CD73 및 CD105 세포의 면역표현형을 확인하였고, 자가 BM-MSC 주사 당일 골세포 또는 지방세포 분화를 유도하였다(도 2). 1차와 2차 주사된 세포군 모두에서, 98% 초과의 세포가 CD73 또는 CD105(BM-MSC의 양성 마커)를 발현하였으며, 1% 미만의 세포가 CD14, CD34 또는 CD45(BM-MSC의 음성 마커)를 발현하였다(도 2B). 모든 환자의 BM-MSC가 골세포와 지방세포로 분화할 수 있었다(도 2C).

일차 결과

조직학적 및 면역조직화학적 분석

Laennec fibrosis scoring system은 간경변 조직 내에서 상세한 개별적인 변화를 나타내었다(F4A-F4C; 표 2). 조직학적 분석을 H&E와 MTC 염색을 통하여 평가하였다. Laennec fibrosis system에 따르면, 6명의 환자(54.5%)에서 BM-MSC 치료에 따른 조직학적 개선이 관찰되었다(표 3).

[표 3] BM-MSC 치료법으로 인한 임상 조직학적 마커의 변화(Pre, BM-MSC 치료법 이전; Post, BM-MSC 치료법 이후)

Patient no.	Child-Pugh score		MELD score		Histology
	Pre	Post	Pre	Post	Pre	Post
1	7	7	8	7	F4C	F4B
2	6	5	8	6	F4C	F4A
3	7	5	11	10	F4B	F4A
4	6	5	8	8	F4A	F4A
5	8	6	13	11	F4C	F4C
6	7	5	8	8	F4B	F4A
7	9	7	15	13	F4C	F4C
8	8	6	10	10	F4C	F4B
9	7	5	7	6	F4B	F4B
10	6	5	7	6	F4C	F4B
11	7	5	6	6	F4C	F4C

BM-MSCs, bone marrow-derived mesenchymal stem cells;

MELD, model for end-stage liver disease

이와 같은 결과를 α-SMA 발현을 보여주는 면역 조직화학적 염색 및 Picrosirius Red 염색에 의해 추가적으로 확인하였다(도 3). 이미지 분석 프로그램을 이용하여 Picrosirius Red로 염색된 콜라겐 비례 면적의 상대적인 발현을 분석하였다. BM-MSC 치료법 이후, 콜라겐 비례면적 비율이 22.61± 8.39%에서 17.70± 6.93%로 유의하게 감소하였다(p<0.001)(도 3G) (표 4).

[표 4] Picrosirius Red 염색 이미지 분석

Patient no.	Laennec fibrosis histology		Pre* (n = 11)	Post* (n = 11)
	Pre	Post
1	F4C	F4B	24.12	12.75
2	F4C	F4A	33.72	21.59
3	F4B	F4A	26.69	21.83
4	F4A	F4A	4.89	4.76
5	F4C	F4C	30.05	26.77
6	F4B	F4A	16.46	11.80
7	F4C	F4C	32.60	28.40
8	F4C	F4B	19.62	16.49
9	F4B	F4B	16.08	14.31
10	F4C	F4B	21.18	15.62
11	F4C	F4C	23.35	20.34
Mean			2.61	17.70
SD			8.39	6.93

* Percentage of the collagen area

이차 결과

BM-MSC 치료 후 실험실 데이터의 변화

전반적인이 간기능을 평가하기 위하여 Child-Pugh score를 이용하였다; 11명의 환자 중 10명(90.9%)에서 점수가 7.1± 0.9(치료-전)에서 5.4± 0.7(치료-후; p<0.001; 표 1 및 3)로 향상되었다. BM-MSC 치료에 따른 다른 주요 실험실 파라미터[알부민, 알라닌아미노기전달효소(alanine aminotransferase,ALT), 아스파르트산아미노기전달효소(aspartate aminotransferase, AST), 빌리루빈(bilirubin), 크레아티닌(creatinine)]의 변화를 표 1에 정리하였다. MELD score는 BM-MSC 치료 이후, 9.2± 2.8에서 8.3± 2.4로 감소하였다(p<0.005; 표 1 및 3).

섬유증과 관련된 유전자 발현

줄기세포 투여이후, 실시간 PCR에서의 TGF-β1(transforming growth factor β1), collagen-1(type 1 collagen), α -SMA(α-smooth muscle actin)의 상대적인 발현(2-ΔΔCt 값)이 각각 3.8± 1.4에서 2.6± 1.2 (P=0.013), 4.5± 2.6에서 3.1± 2.8(P=0.021), 4.3± 1.9에서 2.3± 1.6 (P=0.007)로 유의하게 감소하였다(도 4).

안전성

모든 11명의 환자들은 치료를 견뎌 내었다. 발열, 과민 반응, 급성 거부반응 발열과 같은 줄기-세포 치료의 가능한 부작용의 징후를 정기적으로 모니터링하였다. 추적 조사 기간 동안 줄기세포 치료와 관련된 종양 발생의 증거는 없었다.

논의

명백한 간경변증 단계에서, 비가역적 간 질환은 간 이식을 필요로 하는 필수 과정이다(32). 그러나 간 이식은 장기 기증자의 부족, 고액의 의료비, 기증자-수여자 간의 갭의 확대, 면역 거부 반응에 대한 평생 의존과 같은 몇 가지 한계를 가지고 있다. 이런 이유로, 줄기세포 이식은 간질환의 효과적인 대체 치료요법으로 제시되어 왔다(10, 12, 13). 실험 및 임상 연구에서 줄기세포 치료법은 간섬유증에 대해 기대가 되는 장점들을 나타내었다(13, 14, 19, 22). 골수는 조혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포의 두 가지 주요 줄기세포군을 포함하고 있으며, 그 중 중간엽 줄기세포가 간 또는 간세포 이식을 위한 대안 세포 공급원으로 고려되어 왔다(24). 간 손상에서, 중간엽 줄기세포는 간세포로 분화할 수 있고, 내생 유조직세포(endogenous parenchtmal cell)의 재생을 촉진하며, 손상된 부위로 이동하여 섬유 매트릭스의 분해(항 섬유화 효과)를 증가시킨다. 뿐만 아니라, 몇몇 임상 연구에서 BM-MSC가 B형 또는 C형 간염 바이러스 관련 간경변증 환자에서 간 기능을 향상시키는 것과 같은 기대되는 효과를 보여주었다 (22, 33). 그러나, 알코올성 경변증을 가진 환자의 간 섬유증에서 자가 BM-MSC의 효과를 조사한 연구는 지금까지 없었다.

자가 BM-MSC 주사 후, 11명의 환자 중 6명(54.5%)에서 조직학적 개선이 관찰되었다. 10명의 환자(90.9%)에서 Child-Puch score가 향상되었고, TGF-β1, αSMA, collagen-1의 발현이 유의하게 감소하였다(p<0.05). 중요한건, 이 연구 동안 어떤 중요한 합병증이나 부작용도 관찰되지 않았다는 것이다. 이러한 결과는 BM-MSC 치료가 강경변증에서 항섬유화 치료로서의 가능성을 가지고 있으며, 간 부전이 있는 진행된 간경변증에서 간 이식을 위한 연결 치료요법으로의 가능성을 가지고 있다는 것을 나타내는 것이다. 현재의 항바이러스 치료법은 B형 또는 C형 간염 바이러스 관련 간경변증 환자에서의 간섬유증을 개선할 수 있지만, 알코올성 간경변증의 경우 유일한 치료는 알코올 절제이다. 따라서 본 발명은 알코올성 경변증 치료를 위한 새로운 전략을 제시하고 있다.

METAVIR 시스템에 의해 F4로 분류되는 간경변증 내에서 심각도의 조직학적 다양성이 명확하다. 현재 간경변증은 그 손상 원인이 제거되면 잠재적으로 가역적일 것으로 생각되고 있다. 간경변증 내 하위분류의 부족은 항바이러스 약물과 같은 치료제의 항섬유화 효과를 평가하는데 문제가 될 수 있다. 예를 들어, 항섬유화 치료법이 Laennec 시스템에서 F4C에서 F4A로의 간섬유증의 개선을 유도하였지만, 전통적인 METAVIR 시스템에서 변화가 부족한 경우, 치료가 효과가 없다는 잘못된 결론을 내릴 수 있게 된다. 이런 이유로, 간경변증의 추가적인 조직학적 하위분류가 필요하다 (4, 29). 본 연구에서, F4 간경변증의 더 상세한 분류를 제공하기 위하여 새로운 Laennec fibrosis scoring system을 적용하였다.

알코올성 간 질환 환자에 대한 개입 연구의 질은 알코올 섭취 모니터링에 결정적으로 의존한다(6 , 7). 본 연구에서, 혈청 AST/ALT 비율, γ-글루타밀펩티드전이효소(γ-glutamyl transpeptidase), 및 혈액검사에서의 평균 코퍼스 부피(mean corpus volume)를 포함하는 혈청학적 간기능 검사를 이용하여 대상자의 알코올 재섭취 및 알코올 절제를 모니터링하기 위하여 최선을 다하였다. 뿐만 아니라, 매주 전화 통화와 매달 환자 및 그 가족 구성원과의 일대일 인터뷰를 통하여 알코올 섭취를 모니터링하였다. 이는 좋은 교감을 형성하여 대부분 참가자의 알코올 재섭취를 금지하는데 있어 효과적이었다.

또한, 생검 간 조직의 형태 계측학적 분석 및 정량 실시간 PCR을 통한 TGF-β1, collagen-1, αSMA 측정의 타당성을 높이기 위하여, 간섬유증을 평가하는 다른 방법들도 본 연구에 포함시켰다(31). 본 연구의 최종 한계는 주사된 중간엽 줄기세포 및 환자의 신체 내에서 그 세포들의 위치를 추척하지 않았다는 것이었다. 비록 주사된 줄기세포의 신체 내 추적이 복잡한 과정이며 추적 연구의 해석이 최근 상당한 논란을 야기하였으나, 이는 줄기세포가 간 기능과 간 용적을 향상시키기 위하여 작용하는 방법을 이해하하기 위하여 매우 중요한 것이다.

본 발명은 BM-MSC가 알코올성 간경변증 환자에서 간섬유증에 미치는 영향을 확인한 최초의 연구이다. 본 발명의 결과들은 이 클래스의 물질이 간섬유증을 위한 치료법으로서 승인되는 것을 지지해준다. 결론적으로, BM-MSC 치료는 간섬유증의 조직학적 개선을 가져오며, 알코올성 간경변증의 항섬유화 치료을 위한 새로운 전략을 제공할 수 있을 것이다.

본 발명을 이와 같은 바람직한 구현예에 대한 특정 참고 자료와 함께 상세하게 기재하였으나, 다른 구현예를 통해서도 동일한 결과를 얻을 수 있을 것이다. 모든 참고 자료, 응용, 특허 및 상기 인용된 출판물의 공개, 및 이에 대응하는 적용의 공개는 명세서에서 참고문헌에 의해 통합되어 있다. 상기 기재한 구현예는 단지 본 발명의 원칙의 응용에 대한 예시라는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한, 다수의 변형 및 대체적인 구현예가 유도될 수 있으며, 첨부된 청구항들은 그러한 변형 및 방식을 포함하도록 작성된 것이다. 따라서, 본 발명을 도면에 도시하고, 발명의 가장 실용적이고 선호되는 구현예로 현재 간주되는 것과 관련하여 상기와 같이 기재하였지만, 청구범위에 기재된 본 발명의 원리와 개념을 벗어나지 않는 한 다수의 수정이 이루어 질 수 있다는 것은 해당 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

참고문헌

1. Bolondi L, Gramantieri L. From liver cirrhosis to HCC.

Intern Emerg Med 2011; 6(Suppl. 1): 938.

2. Iredale JP. Cirrhosis: new research provides a basis for rational and targeted treatments. BMJ 2003; 327: 143-7.

3. Kim MY, Baik SK, Yea CJ, et al. Hepatic venous pressure gradient can predict the development of hepatocellular carcinoma and hyponatremia in decompensated alcoholic cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 2009; 21:12416.

4. Kim MY, Suk KT, Baik SK, et al. Hepatic vein arrival time as assessed by contrast-enhanced ultrasonography is useful for the assessment of portal hypertension in compensated cirrhosis. Hepatology 2012; 56: 105362.

5. Lee SS, Shin HS, Kim HJ, et al. Analysis of prognostic factors and 5-year survival rate in patients with hepatocellular carcinoma: a single-center experience. Korean J Hepatol 2012; 18: 4855.

6. Gao B, Bataller R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology 2011; 141:157285.

7. Kim MY, Cho MY, Baik SK, et al. Beneficial effects of candesartan,

an angiotensin-blocking agent, on compensated alcoholic liver fibrosis - A randomized open-label controlled study. Liver Int 2012; 32: 97787.

8. Kwon OS, Jung YK, Kim YS, et al. Effect of alcohol on the development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis B virus-related cirrhosis: a cross-sectional casecontrol study. Korean J Hepatol 2010; 16: 30814.

9. Singal AK, Duchini A. Liver transplantation in acute alcoholic hepatitis: current status and future development. World J Hepatol 2011; 3: 2158.

10. Strom SC, Bruzzone P, Cai H, et al. Hepatocyte transplantation: clinical experience and potential for future use. Cell Transplant 2006; 15(Suppl. 1): S10510.

11. Strom S, Fisher R. Hepatocyte transplantation: new possibilities for therapy. Gastroenterology 2003; 124: 56871.

12. Kakinuma S, Nakauchi H, Watanabe M. Hepatic stem/progenitor cells and stem-cell transplantation for the treatment of liver disease. J Gastroenterol 2009; 44: 16772.

13. Kharaziha P, Hellstrom PM, Noorinayer B, et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. Eur J Gastroenterol Hepatol 2009; 21: 1199205.

14. Cho KA, Lim GW, Joo SY, et al. Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4 -induced liver fibrosis in mice. Liver Int 2011; 31: 9329.

15. Sakaida I, Terai S, Yamamoto N, et al. Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice. Hepatology 2004; 40: 130411.

16. Hardjo M, Miyazaki M, Sakaguchi M, et al. Suppression of carbon tetrachloride-induced liver fibrosis by transplantation of a clonal mesenchymal stem cell line derived from rat bone marrow. Cell Transplant 2009; 18: 8999.

17. Higashiyama R, Inagaki Y, Hong YY, et al. Bone marrowderived cells express matrix metalloproteinases and contribute to regression of liver fibrosis in mice. Hepatology 2007; 45: 21322.

18. Mormone E, George J, Nieto N. Molecular pathogenesis of hepatic fibrosis and current therapeutic approaches. Chem Biol Interact 2011; 193: 22531.

19. Pai M, Zacharoulis D, Milicevic MN, et al. Autologous infusion of expanded mobilized adult bone marrow-derived CD34+ cells into patients with alcoholic liver cirrhosis. Am J Gastroenterol 2008; 103: 19528.

20. Rockey DC. Current and future anti-fibrotic therapies for chronic liver disease. Clin Liver Dis 2008; 12: 93962. 21. Sakaida I, Terai S, Nishina H, Okita K. Development of cell therapy using autologous bone marrow cells for liver cirrhosis. Med Mol Morphol 2005; 38: 197

202.

22. Terai S, Ishikawa T, Omori K, et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy. Stem Cells 2006; 24: 22928.

23. Am Esch JS 2nd, Knoefel WT, Klein M, et al. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem Cells 2005; 23: 46370.

24. van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology 2008; 47: 163443.

25. D’'amico G, Garcia-Tsao G, Pagliaro L. Natural history and prognostic indicators of survival in cirrhosis: a systematic review of 118 studies. J Hepatol 2006; 44: 21731.

26. Veldt BJ, Laine F, Guillygomarc’'h A, et al. Indication of liver transplantation in severe alcoholic liver cirrhosis: quantitative evaluation and optimal timing. J Hepatol 2002; 36: 938.

27. Hu Y, Liao L, Wang Q, et al. Isolation and identification of mesenchymal stem cells from human fetal pancreas. J Lab Clin Med 2003; 141: 3429.

28. Martin JY, Dean DD, Cochran DL, et al. Proliferation, differentiation, and protein synthesis of human osteoblastlike cells (MG63) cultured on previously used titanium surfaces. Clin Oral Implant Res 1996; 7: 2737.

29. Kim MY, Cho MY, Baik SK, et al. Histological subclassification of cirrhosis using the Laennec fibrosis scoring system correlates with clinical stage and grade of portal hypertension. J Hepatol 2011; 55: 10049.

30. Wanless IR, Sweeney G, Dhillon AP, et al. Lack of progressive hepatic fibrosis during long-term therapy with deferiprone in subjects with transfusion-dependent betathalassemia. Blood 2002; 100: 15669.

31. Calvaruso V, Burroughs AK, Standish R, et al. Computerassisted image analysis of liver collagen: relationship to Ishak scoring and hepatic venous pressure gradient. Hepatology 2009; 49: 123644.

32. Suk KT, Baik SK, Yoon JH, et al. Revision and update on clinical practice guideline for liver cirrhosis. Korean J Hepatol 2012; 18: 121.

33. Peng L, Xie DY, Lin BL, et al. Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in liver failure patients caused by hepatitis B: short-term and long-term outcomes. Hepatology 2011; 54: 8208.

Claims (6)

1. 알코올성 간경변증을 가진 대상에서 자가 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 항섬유증 효과를 명확히 하여 간 기능을 개선하는 방법으로서, 상기 대상에 상기 자가 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포(BM-MSC)를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 대상은 기준시점에 생검에 의해 입증된 알코올성 간경변증을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 대상은 BM-MSC를 투여하기 최소 6개월 이전부터 알코올을 섭취하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 BM-MSC는 상기 대상의 골수에서 분리되고 1개월 동안 증폭된 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 4항에 있어서, BM-MSC를 투여하는 방법은 5 x 10⁷개 BM-MSC를 간 동맥을 통해 4주차와 8주차에 두 번 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 1항에 있어서, 간 섬유화의 조직학적 및 양적 개선을 평가하기 위하여 12주차에 대상으로부터 생체검사 및 실험실 시험을 하는 것을 특징으로 하는 방법.

Images