KR20170014270A - 층분리배양법을 이용한 지방-유래 줄기세포의 분리 및 이의 이용 - Google Patents

층분리배양법을 이용한 지방-유래 줄기세포의 분리 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 층분리 배양법을 이용한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 층분리 배양법은 지방조직으로부터 균질한 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있으며, 이러한 클로날 줄기세포는 세포 생장, 이동, 분비 능이 유의적으로 높은 특징을 나타낸다. 따라서, 이러한 클로날 줄기세포는 세포 치료제로서 효과적으로 이용될 수 있으며, 특히 탈모치료에 있어서 높은 효과를 나타낼 수 있다.

Description

층분리배양법을 이용한 지방-유래 줄기세포의 분리 및 이의 이용 {Isolation of adipose-derived stem cells by using a subfractionation culturing method}
본 발명은 층분리 배양법을 이용한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 기질유래이며 다양한 세포 종류로 분화할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 골수, 탯줄, 모낭 및 지방조직 등 다양한 조직에서 분리 되었다. MSCs는 다양한 세포 유형으로 분화하며, 성장인자를 제공하고 면역반응을 조절하는 능력에 의하여 줄기세포 치료에 있어서 매우 주목받고 있다. 지방 유래 줄기세포 (Adipose-derived stem cells, ASCs)은 다분화능 줄기세포로서, 이는 지방 조직으로부터 수득하며, 인간의 지방조직은 아주 흔하여, 용이하게 다량으로 수득가능한 바, 가장 각광받는 MSC 소재이다. 따라서, ASCs는 연구 및 세포 치료 모두에 이용될 수 있다.
종래 ASCs의 분리 방법은 콜라게나아제에 의한 분해 및 뒤이은 원심분리에 의하여 SVF (stromal vascular fraction)을 분리하고, 이를 단일 층 배양으로 확장한다. 분리된 세포는 섬유아세포 유사 형태를 나타낸다. 그러나, ASCs의 종래 분리법에 더불어 새로운 분리방법이 요구된다. 예를 들어, ASCs의 이식에 있어서, 안정성과 질을 높이기 위한 ASCs의 xeno-free 배양시스템이 개발된 바 있다.
본 발명자는 종래, 신규한 층분리배양법 (subfractionation culturing method, SCM)을 이용하여 골수-유래 MSCs를 분리하였으며, 이는 단일-세포 유래 MSCs(clonal (c)MSCs)를 마우스 및 인간세포로부터 수득하였다. 이러한 방법은 원심분리 또는 효소분해가 불필요하다. SCM의 원리는 세포 밀도 및 배양 플레이트에의 부착을 기반으로 MSCs를 분리하는 것에 있다. 낮은 밀도의 줄기세포는 높은 생장률 및 분화능을 나타낸다. cMSCs는 MSC-유사 섬유아세포 형태를 나타내며, 기타 방법에 의하여 분리된 MSCs와 유사한 표면 마커 프로파일은 나타낸다. 그러나, cMSC 세포주는 다양한 분화 능력, 세포주특이적 (lineagespecific) 유전자 발현 및 T-세포 억제 효과를 나타낸다. 이러한 SCM로부터 수득한 각 cMSC 세포주의 분화 및 조절 능력은 각자 상이하다. 이에 따라서, 임상 적용을 위하여 가장 효과적인 cMSC 세포주를 선발하는데 있어서 결정적이다.
ASCs는 GCM (gradient centrifugation method)에 의하여 지방조직으로부터 최초로 분리되었다. 그러나, 효소 분해 및 원심분리에 의하여 분리된 ASCs는 재생능 및 임상 결과에서 이질적인 차이를 나타내었다. 따라서, 세포 표면 마커 기반의 유동세포계측법을 사용하여 최초 집단에서부터 균질한 MSC 집단을 분리하였다. 그러나, 임상적으로 효과적인 ASC 집단은 낮은 존재비에 의하여 수득할 수 없었다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 효소 분해 또는 유동세포계측법의 이용 없이, 균질한 ASCs를 수득하기 위한 신규한 분리 방법을 개발하였다.
또한, 본 발명자들은 GCM 유래 ASCs 및 SCM으로부터 분리한 cASCs를 대상으로, 유사분열, 분비, 및 모발 성장-촉진 효과를 비교하였다. 이러한 클로날 ASCs (clonal ASCs, cASCs)은 매우 높은 유사분열 및 향상된 모발 성장-촉진 효과를 나타내었다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법을 이용한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 치료 또는 예방용 조성물 을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 하기의 단계를 포함하는 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법을 제공한다:
(a) 지방조직을 제 1용기에 배양하여 상층액을 수득하는 단계;
(b) 제1용기의 상층액을 제 2용기에 옮기는 단계;
(c) 상기 제2용기에 존재하는 세포를 배양하여 상층액을 수득하는 단계;
(d) (b) 및 (c) 단계를 1회 이상 반복하는 단계;
(e) 단일 세포 유래 콜로니를 분리하는 단계; 및
(f) 상기 콜로니로부터 성장 배지로 세포를 옮기고, 세포를 배양하는 단계.
본 발명의 일 구체예에서 상기 (a) 단계는
(a-1) 지방조직 및 분리배지를 혼합하는 단계;
(a-2) 상기 혼합물을 교반하는 단계; 및
(a-3) 상기 혼합물로부터 지방층을 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 (a-1) 단계의 분리배지는 10 내지 30 % 우태아혈청, 1 내지 5%의 항생제 및 항진균제가 보충된 동물세포배양배지일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 (c) 단계의 배양은 5%의 CO2 농도 조건 하에서의 배양일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에서 상기 제조 방법은 (g) 세포를 3 내지 25 계대로 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 용기는 코팅제가 처리된 배양용기 또는 코팅제가 처리되지 않은 배양 용기일 수 있으며, 또한, 상기 용기는 평평한 바닥을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 상기 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-I 및 PODXL에 대하여 양성일 수 있으며, 또한, CD49f에 음성일 수 있으며, 또한, CD146에 양성일 수 있다.
또한, 상기 줄기세포는 다른 배양법에 의하여 분리된 중간엽 줄기세포에 비하여 Akt 또는 ERK1/2의 인산화가 증가된 것일 수 있으며, Klf4 또는 Nanog의 발현이 증가된 것 일 수 있으며, Diras3, Myb, Cdca7, Mki67, Rrm2, Cdk1 및 Ccna2으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 발현인 증가된 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 또한, 이종, 동종이계, 또는 자가 줄기세포인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 상기 조성물을 약학적, 의약외품 또는 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 층분리 배양법은 지방조직으로부터 균질한 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있으며, 이러한 클로날 줄기세포는 세포 생장, 이동, 분비 능이 유의적으로 높은 특징을 나타낸다. 따라서, 이러한 클로날 줄기세포는 세포 치료제로서 효과적으로 이용될 수 있으며, 특히 탈모치료에 있어서 높은 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 층분리배양법을 이용한 ASC (Adipose-derived stem cell)분리 방법을 단계별로 나타낸 모식도이다.
도 2는 GCM 및 SCM 분리된 ASCs의 세포형태 및 분화능을 확인한 결과이다.
도 2a: GCM 및 SCM 분리된 ASCs의 섬유아세포 형태.
도 2b: GCM 및 SCM 분리된 ASCsfmf 지방세포, 골세포, 및 연골세포 분화 배지에서 배양하고, 분화 특성을 비교한 결과.
도 3은 클로날 ASCs(cASCs)가 증가된 생장능, 이동능, 및 전분화능 마커 발현을 나타낸다는 것을 확인한 결과이다.
도3a는 MTT 어세이를 이용하여 GCM에 의해 분리된 ASCs 및 SCM 분리된 세 cASCs 세포주(패시지 8)의 생장을 비교한 결과이다.
도3b는 스크래치 이동 어세이를 이용하여 GCM에 의해 분리된 ASCs 및 SCM 분리된 세 cASCs 세포주(패시지 8)의 증가된 이동을 비교한 결과이다.
도 3c는 GCM에 의해 분리된 ASCs와 비교하여, SCM 분리된 세 cASCs 세포주에서 Akt 및 ERK1/2와 같은 유사분열 신호 분자 (mitogenic signaling molecule)의 인산화가 증가하였음을 나타낸 결과이다.
도3d 및 3 e는 qPCR을 통하여 cASCs에서 Klf4 (3d) 및 Nanog (3e)가 상향조절되었음을 확인 한 결과이다.
도 4는 클로날 ASCs (cASCs)가 증가된 모발-재생 활성을 나타냄을 확인한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 cASC-조정 배지가 처리된 모낭 세포에서 48시간 (도 4a) 및 72시간 (도 4b)에서 증가된 생장률을 나타내는 것을 확인한 결과이다.
도 4c 및 도 4d는 bFGF (도 4c) 및 VEGF (도 4d)와 같은 모발 재생과 관련된 분비인자들의 발현이 cASCs에서 상향조절되었음을 qPCR에 의하여 확인한 결과이다.
도 4e는 휴지기에서-성장기로의 변화를 ASC (1X104 세포) 피하주입 후 C3H/NeH 마우스에서 측정한 결과이다. 휴지기에서-성장기로의 변화는 cASCs의 처리군에서 유의적으로 유도되었다.
도 4f는 ASC 주입 후, 12일 뒤 새로운 모발의 무게를 측정한 것으로, cASCs-처리군이 GCM-분리된 ASCs-처리군에 비하여 유의적으로 컸다.
본 발명의 일 양상은 층분리 배양법 (subfractionation culturing method)을 이용하여 지방조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리, 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “줄기세포”는, 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)”는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)이다.
본 발명은 지방으로부터 유래하는 중간엽 줄기세포를 분리 및 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
본 발명에서는 층분리 배양법 (subfractionation culturing method)라고 명명되는 방법으로서 신체 샘플 또는 지질 흡입물과 같은 공급원에서 다중계통 줄기세포(MLSC)의 매우 균일한 집단을 분리하는 방법을 이용한다.
생체 샘플로부터 클로날 줄기세포를 분리하기 위한 본 발명의 원리는, 다중계통 줄기세포 또는 전구세포가 낮은 세포 밀도를 갖고, 따라서 이들이 이에 따라 샘플에서 다른 세포들과 분리될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 성숙한 MSC는 신속 자기-재생(RS) 세포보다 크다. RS 세포는 다중계통의 분화를 위하여 더 큰 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.
다른 양태에서, 더 접착력이 높은 줄기세포를 얻기 위해 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 배양 접시가 사용될 수 있다. 본 발명자는, 양(+) 또는 음(-)으로 임의 하전된 배양 표면은 코팅하지 않은 접시 표면에 비해 줄기세포의 표면에 접착을 촉진하는 것을 밝혀냈다. 코팅하지 않은 접시보다 각각 약 2 내지 3배 많은 세포가 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 배양 접시에 부착되었다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 배양 접시의 바닥은 양(+)으로 하전된 아미노산, 예컨대 폴리리신, 폴리아르기닌, 또는 음(-)으로 하전된 아미노산, 예컨대 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트, 또는 이들의 조합에 의해 코팅되어서, 줄기세포 또는 전구세포가 접시의 바닥에 접착하는 것을 도와줄 수 있다.
더 무겁거나 더 밀집된 세포의 대부분이 최초 2개의 배양 단계에서 제거될 수 있기 때문에, 본 발명의 층분리 배양 방법을 실시하기 위해서는, 적혈구 또는 백혈구와 같은 임의의 유형의 세포를 샘플로부터 미리 제거하도록 임의의 유형의 원심분리도 사용할 필요가 없다. 이 점에서, 이는 세포들 사이의 임의의 물질을 소화시키는 임의의 효소로 세포를 미리 처리할 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 시스템의 장점들 중 하나는, 세포 배양액 중에 피콜(Picoll), 휘콜(Ficoll) 또는 휘콜-하이팩(Ficoll-hypaque)와 같은 밀도구배용액을 도입할 수 있거나 줄기세포에 손상을 줄 수 있는 통상적으로 사용되는 밀도-구배 원심분리 및 단핵세포 분획 단계들을 회피할 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명의 층분리 배양 방법은, 신체 샘플, 바람직하게는 지방 흡인물로부터 매우 균일한 클로날 줄기세포를 분리하기 위한 단순하고 효과적이고 경제적인 프로토콜이다.
대안적으로, MSC 분리의 종래 밀도-구배 원심분리에 의한 분리/분획된 단핵세포는, 단일 세포-유도된 콜로니를 수득하고 줄기세포 또는 전구세포의 균일한 집단을 분리하기 위해서 배양 용기 D1 내에 가할 수 있다. 따라서, 분획 배양 방법에서는 종래 밀도-구배 원심분리법에 의해 분획된 단핵세포가 이용될 수 있다.
본원은, 생체 샘플, 특히 예시되어 있는 지방-흡인물에 존재하는 줄기세포 또는 전구세포에는 여러 유형이 존재한다는 것을 나타내는, 단일 세포 유도된 줄기세포주의 세포 표면 단백질 발현에서의 특징의 다양성에 대해 설명한다. 분리된 클로날 줄기세포는 CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-I 및 PODXL에 대하여 양성이며, CD49f에 대해서는 음성이었다. 또한 일부 세포주는 CD146에 양성을 나타내었다.
다양한 표면 마커를 갖는 이러한 MSC는 세포의 여러 분화 능력을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 층분리 배양 방법에 의해 단일 세포 유도된 균일한 줄기세포의 분리로 인해, 이러한 군의 세포가 다른 특이적으로 분리된 신체 샘플 중에 존재하고 배양 조건이 세포 확장 동안 그의 능력이 변화시키지 않는 한, 조직 특이적 줄기세포 또는 관계된 전구세포의 분리가 가능하게 된다. MSC 치료 및 세포 이식 처리의 안전성과 유효성은, 본원에 제시된 바와 같이, 특정 성질을 갖는 세포 하위-집단을 특징지을 수 있음으로써 향상된다.
본원은, 재생, 다분화능, 이동능 등을 가지는 단일 세포로부터 유래하는 클로날 줄기세포 라인의 매우 균일한 집단을 지방조직으로부터 분리하는 새로운 방법을 제시한다. 줄기세포를 분리하기 위해 항체를 이용할 필요 없이 밀도-구배 원심분리 및 단핵세포 분획 단계를 제거함으로써, 본 발명의 하위-분획 배양 방법은 단순하고 효율적이고 경제적 절차로 및 치료 상황에 대해 더욱 안전하게 더 균일한 클로날 줄기세포의 집단을 생성시킨다.
상기 지방으로부터 유래하는 중간엽 줄기세포의 제조방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 지방조직을 제 1용기에 배양하여 상층액을 수득하는 단계;
(b) 제1용기의 상층액을 제 2용기에 옮기는 단계;
(c) 상기 제2용기에 존재하는 세포를 배양하여 상층액을 수득하는 단계;
(d) (b) 및 (c) 단계를 1회 이상 반복하는 단계;
(e) 단일 세포 유래 콜로니를 분리하는 단계; 및
(f) 상기 콜로니로부터 성장 배지로 세포를 옮기고, 세포를 배양하는 단계.
상기 방법은 층분리 배양법으로, 이는 원심분리 또는 효소의 분해 처리 없이, 지질 조직로부터 균일한 MSC를 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 (a) 단계는
(a-1) 지방조직 및 분리배지를 혼합하는 단계;
(a-2) 상기 혼합물을 교반하는 단계; 및
(a-3) 상기 혼합물로부터 지방층을 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서는 상기 (a-1) 단계의 분리배지는 10 내지 30 % 우태아혈청, 1 내지 5%의 항생제 및 항진균제가 보충된 동물세포배양배지일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 동물세포배양배지로서 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)를 사용하였다.
또한, 상기 (c) 단계는 5%의 CO2 농도 조건 하에서 배양될 수 있다.
또한, (g) 세포를 3 내지 25 계대로 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 지방조직은 신체 샘플로부터 분리할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "신체 샘플"은 단일 유형의 세포를 격리하고자 하는 포유류로부터 수득된 임의의 샘플을 의미한다. 이러한 신체 샘플로는 뼈 골수 샘플, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 및 사이토카인-활성화된 말초 혈액일 수 있다. 특히, 본 발명의 일 구체예에서 상기 지방조직은 지질-흡입물일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포의 근원 및 치료를 논의하기 위한 "포유류" 또는 "대상"은 인간, 국내 및 농장동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 랫, 마우스, 토끼 등을 포함하는 포유류 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "균일한" 집단은 일반적으로 동일한 유형의 세포가 집단 내에 존재하는 것을 제시한다. "실질적으로 균일한"이라는 것은 약 80 %의 균질성 또는 약 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.1 %, 99.2 %, 99.3 %, 99.4 %, 99.5 %, 99.6 %, 99.7 %, 99.8 % 또는 99.9 %의 균일성을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 배양용기는 코팅제가 처리된 배양용기 또는 코팅제가 처리되지 않은 배양용기인 것일 수 있고, 용기는 평평한 바닥일 수 있다. 상기 용기는 세포 접착제로 코팅된 것일 수 있으며, 상기 세포 접착제는 하전된 아미노산 중합체일 수 있다. 상기 세포 접착제는 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 제공한다.
상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 전술한 방법에 의하여 분리 및 제조된 것일 수 있다.
또한, 중강엽 줄기세포는 CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-I 및 PODXL에 대하여 양성일 수 있으며, CD49f에 대해서는 음성일 수 있다. 또한 일부 클로날 중간엽 줄기세포는 CD146에 양성일 수 있다.
또한, 상기 줄기세포는 다른 배양법에 의하여 분리된 중간엽 줄기세포에 비하여 Akt 또는 ERK1/2의 인산화가 증가된 것일 수 있으며, Klf4 또는 Nanog의 발현이 증가된 것 일 수 있으며, Diras3, Myb, Cdca7, Mki67, Rrm2, Cdk1 및 Ccna2으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 발현인 증가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 층분리 배양법은 바람직하게는 전술한 방법에 의하여 분리 및 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물는, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당 조합해, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화하는 것을 생각된다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다. 또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다.
주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다.
유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로 카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.
환자의 체내에의 투여는 바람직하게는 비경구투여이며, 구체적으로는 정맥에의 1회 내지 3회의 투여가 기본이지만 그 이상의 투여라도 좋다. 또, 투여 시간은 단시간이라도 장시간 지속 투여라도 좋다. 더욱 구체적으로는, 주사제형, 경피투여형등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사, 정맥내 주사등에 의해 투여할 수가 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사 또는 복강내 주사이다. 정맥내 주사의 경우, 통상의 수혈의 요령에서의 이식이 가능해져 환자를 수술할 필요가 없고, 나아가 국소 마취도 필요없기 때문에, 환자 및 의사 쌍방의 부담이 가볍다. 또 병동에서의 이식 조작이 가능한 점으로써 매우 적합하다. 장래의 구급의료의 발전을 고려하면, 구급 반송중, 혹은 발증 현장의 투여도 생각할 수 있다.
탈모 환자를 치료하기 위하여 본 발명의 클로날 cASCs는 치료적 유효량을 환자에게 투여할 수 있으며, 상기 치료적 유효량은 특별히 제한되는 것은 아니나, 1×104 cell/kg 내지 1×108 cell/kg인 것이 바람직하고, 1×105cell/kg 내지 1×107cell/kg인 것이 더욱 바람직하고, 5×105 cell/kg 내지 5×106 cell/kg인 것이 가장 바람직하다. 상기 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구 투여 방법이라면 어느 것이나 사용가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥내 투여가 가장 바람직하다.
또한 본 발명의 일 양상은 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 본 발명의 상기 줄기세포 이외에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 줄기세포는 0.01 내지 15중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
탈모를 개선, 치료 또는 예방하기 위하여, 상기 줄기세포 또는 이의 배양액을 적당히 희석하여 피부에 직접 도포할 수도 있으며, 본 발명의 탈모 치료용 조성물이 환부에 효과적으로 적용될 수 있도록 연고제로 제조할 수 있다. 상기 연고제는 본 발명의 탈모 치료용 조성물을 무기물질과 배합한 다음, 이를 지용성 기제로 코팅하여 제조할 수 있다. 상기 무기물질은 항균성, 소염효과, 표피재생 효과 등이 우수한 소재를 사용하는 것이 바람직하고, 이들의 구체적인 예로는 산화아연, 탄산아연, 산화철 등이 있다. 또한, 수용성 물질인 본 발명의 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물을 안전하게 함침 할 수 있는 세라믹 담체를 추가로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세라믹 담체로는 제올라이트, 활석, 석고, 모려분 및 이들의 혼합물이 바람직하게 사용된다. 이러한 세라믹 담체는 수용성 성분의 함침성이 우수하여 피부에 수용성 성분의 공급을 원활히 할 수 있다.
본 발명은 본원에서 설명된 특정 실시양태들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 사실상, 이러한 본원의 설명에 덧붙여, 당업자에게는 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 발명의 다양한 변형이 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위에 속하는 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이를 제한하고자 하여 제공되는 것은 아니다.
실험예 1: 세포 배양 및 지질- 흡인물 ( lipo -aspirate) 로부터 분리된 cASC 의 제조
건강한 여성 수여자로부터 동의 하에 지방흡입술 흡인물을 얻었다 (분당 차병원으로부터 BD2011-152D로 승인됨). 기울기 원심법(gradient centrifugation method, 이하 'GCM')을 이용하여 지방-유래된 줄기세포(Adipose-derived stem cells, 이하 'ASC')의 분리를 수행하였으며, 변형된 SCM 방법에 의해 cASC(clonal ASC)의 분리를 수행하였다. 총 85ml 의 지방흡입술 흡인물을 cASC 분리에 사용하였다. 지질 흡인물을 멸균된 병에 위치시키고, 동일한 부피의 분리 배지를 지질 흡인물에 첨가하였으며 이를 교반하였다. 상기 분리배지로는 20% 열 불활성화된 우태아혈청 및 2% 항생제/항진균제가 보충된 DMEM 배지를 사용하였다. 교반을 통해 얻은 상기 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양하고 수용성 배지로부터 지방층을 분리하였다. 지방 조직을 함유하는 상부 지방층(fatty layer) 85ml를150mm 배양 접시(D1, Corning Life Science, Tewksbury, MA) 로 이동시키고 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 지방 상층액을 새로운 150mm 배양 접시 (D2) 로 이동시켰으며, D1 배양 플레이트를 신선한 분리 배지(85ml)로 보충하였다. 이와 같이 D3 내지 D5 배양 접시들을 24시간 간격으로 제조하고 부착 섬유아세포 유사 세포들이 광학현미경 하에서 검출될 때까지 배양하였다.
이와 같이 층분리배양법(subfractionation culturing Method, 이하 'SCM')을 이용하여 ASC를 분리하는 공정을 도 1에 간략하게 나타내었다.
세포 부착 후, 지방 상층액을 제거하고 세포들에서 지방 분해물을 제거하기 위해 세척을 수행하였다. 각각의 접시를 추가적으로 단일 세포 유래, 즉 클로날 콜로니를 형성할때까지 배양하였다. 각각의 콜로니들을 트립신화를 통해 3분 동안 콜로니 실린더에서 분리시켰으며 10mm 배양 접시에 재플레이팅하고 175mm 플라스트로 이동시켰다 (계대 1). 세포들이 ~60 내지 70% 컨플루언스에 도달하였을 때, 이들을 트립신화 하고 1000 내지 3000 세포/cm2 로 각각의 계대에 대하여 재플레이팅하였다. 2 계대 이후, 상기 세포들을 10% FBS 및 1% 항생제가 보충된 DMEM 또는 a-MEM 배지를 증식배지로 하여 배양하였다.
모낭-유래 모유두 세포 (Hair follicle-derived dermal papilla cell)를 PromoCell (Heidelberg, Germany)로부터 얻었으며 이를 SupplementMix 가 보충된 모낭 모유두 세포 성장 배지 (PromoCell) 에서 배양하였다.
실험예 2: cASC 특징 분석
5계대에서, 상기 세포들을 하기와 같이 MSC 마커 발현에 대하여 분석하였으며, 분화 능력을 분석하였다. 먼저 FACS Calibur 유세포 계수기 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)를 이용한 유세포 분석을 수행하여 다양한 세포 표면 항원의 존재를 확인하였다. 분석을 위해 항-CD14, 항-CD34, 항-CD45, 항-CD49f, 항-CD73, 항-CD90, 항-CD106, 항-CD119, 항-CD146, 항-HLA 클래스 I, 항-HLADR (BD Biosciences Pharmingen), 항-CD44, 항-CD105 (Serotec, Kidlington, UK) 및 항-PODXL (R&D Systems, Minneapolis, MN) 항체를 사용하였다. 아형-매칭 항체들을 대조군으로 사용하였다. 분화 능력을 시험하기 위하여, 지방세포성, 골세포성 및 연골세포성 분화를 유도하였다.
실험예 3: 조정 배지의 제조
GCM 에 의해 분리된 ASC로부터 얻은 조정 배지 (CM) (GCM-CM) 또는 SCM에 의해 분리된 ASC에서 얻은 조정 배지(cASC-CM)를 당분야에 알려진 방법을 이용하여 제조하였다 (Kim WS, Park BS, Kim HK 외, J Dermatol Sci 2008;49(2):133-42). 수집된 조정 배지를 10분 동안 1800rpm 으로 원심분리하고, 0.22 μm 시린지 필터를 통해 여과하였다. 여과물을 그 뒤 다시 3kDa 분자량 컷오프 Vivaspin™ 시료 농도계에서 원심분리하였으며, 농축계수 10으로 농축하였다.
실험예 4: MTT 증식 분석
세포를 ~x103 세포/cm2으로 6-웰 플레이트에 접종하였다. 48 또는 72 시간 배양 후 MTT 모액 95mg/ml 을 각각의 웰에 배지 부피의 1/40으로 추가하였다. 37℃ 에서 4시간 동안 배양한 후, MTT 함유 배지를 제거하고 환원된 포르마잔 염색 시약을 1ml 디메틸 설폭사이드 첨가에 의해 용해시켰다. Sunrise ™ 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 595nm 에서 흡광도를 측정하였다.
실험예 5: 스크래치 이동 어세이 (Scratch migration assay)
6웰 플레이트에 ~ 5 X 104 cells/cm2의 세포를 심었다. ASCs가 완전한 컨플루언스에 도달한 후, 멸균된 피펫 팁을 이용하여 단일층에 스크래치를 만들었다. 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 새 배지를 첨가하였다. 상처 부위의 이미지는 이동 어쎄이의 시작과 끝(24시간)에 현미경을 이용하여 수득하였다. 이동의 정량을 위해, 각 상처에 따라 10개의 무작위적으로 선택된 지점을 표시한 후, 상처 끝 시작부위로부터 이동된 세포의 수평 길이를 측정하였다. 결과값은 대조군에 상대적인 %로 나타냈다.
실험예 6: 마트리겔 기초의 관 형성 활성 어쎄이 ( Matrigel -based tube-forming activity assay)
관-형성 활성은 Jeong(Stem Cells Dev, 2013)이 개시한 방법에 따라 측정하였다. 보다 구체적으로, 24웰 플레이트의 각 웰을 basement membrane-like extracellular matrix extract (Matrigel; BD Biosciences, Bedford, MA)로 코팅하였다. 세포(1.5X103 cells/cm2)를 마트리겔이 코팅된 웰에 위치시킨 후, 37°C, 5% CO2의 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 관 형성의 이미지는 위상차 현미경을 이용하여 수득하였으며, tube-like networks의 코드 길이를 측정하였다.
실험예 7: 웨스턴 블랏 (Western blots)
웨스턴 블랏은 종래 공지된 방법에 따라 p-extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2)(1:2000 희석, Cell Signaling, Danvers, MA), ERK1/2 (1:4000 희석, Cell Signaling), p-Akt (1:1000 희석, Cell Signaling) 및 Akt (1:4000 희석, Cell Signaling)에 대한 1차 항체를 이용하여 수행하였다.
실험예 8: RT- PCR 및 quantitative real-time PCR
총 RNA는 TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 분리하였으며, cDNA synthesis kit (Promega, Madison, WI)를 이용하여 역전사를 통해 cDNA를 수득하였다.
실험예 9: 마이크로어레이( Microarray )
총 RNA의 준비 및 마이크로어레이 혼성화는 Kim 등 (Cell Death Dis, 2013)이 개시한 방법에 따라 수행하였다. 보다 구체적으로, 전체 RNA(200 ng)를 biotinylated cRNA를 수득하기 위하여 표지하였으며, 이를 4X44 K Whole Human Genome Microarray kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 혼성화하였다. 마이크로어레이는 Agilent microarray scanner (Agilent Technologies)를 이용하여 스캔하였고, 각 프로브의 로우 신호 값을 분석하기 위하여 이미지를 Agilent Feature Extraction software (Agilent Technologies)로 추출하였다.
실험예 10: 마우스에 ASCs 의 피하 주입
마우스를 USP(United States Pharmacopoeia) 및 CHA 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)로부터 검증된 프로토콜에 따라 마취시켰다. cASCs의 모발 성장에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 종래 개시된 7주령의 C3H/NeH 마우스를 이용하였다. 보다 구체적으로, 각 마우스의 등을 전자 면도기를 이용하여 면도하였다. 각 마우스의 면도된 부위에 cASC로부터 분리된 세포(1x104)를 피하 주입하였다. 모발 성장의 표지로 피부의 암화 정도를 모니터링하였다. 12일 후, 등 털을 면도한 후 무게를 측정하였다.
실험예 11: 통계 분석
통계 분석은 Student’s t-test를 이용하였으며, 모든 실험은 3회 수행하였고, p < 0.05일 때 통계적 유의성을 갖는다고 판단하였다.
실시예 1: cASCs 의 수율
약 85 ml의 지질-흡인물을 85 ml의 DMEM와 혼합하고, 뒤이어 상층액을 새로운 배양 디쉬에 매 24시간마다 이동시켰다. 결과, D1 (22), D2 (24), D3 (16) 및 D4 (10) 디쉬에서 잘 분리된 단일 콜로니를 수득할 수 있었다. 일 콜로니 당 400 ~500 세포가 형성되었으며, 세포는 빠르게 생장하였다. 이전 디쉬로부터 세포 배양 상층액을 이동시킨 후 10-21일 후 부착세포 (adherent cell)이 컨플루언스 (confluence)에 도달하였다. cASCs는 10 패시지 이상 섬유아세포 유사 형태 (도 2a)를 나타내었다. 72 콜로니를 분리해낸 후, 가장 높은 생장율을 나타내는 3개의 cASCs 주를 이후 실험을 위하여 선발하였다.
실시예 2: cASCs 의 특징
5 패시지에서 세개의 cASC 주의 세포 표면 에피토프를 FACS 분석을 이용하여 비교하였으며, 14개 세포 표면 단백질 마커 패널을 이용하여 수행하였다.
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
5 패시지에서의 세포 표면 마커의 발현 분석
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 세 cASC 주는 CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-I 및 PODXL에 대하여 양성 (GCM (gradient centrifugation method)에 의하여 분리된 ASCs의 세포 표면 마커와 유사)이었다. 그러나, cASCs는 조혈세포마커 예를 들어 CD34 및 CD45에 대하여 음성이었다.
GCM (gradient centrifugation method) 및 SCM (subfractionation culturing method)에 의하여 분리된 ASCs와 세포 표면 마커의 발현 양상이 일반적으로 유사하지만, D107-cASCs은 낮은 수준으로 CD146을 발현하며, 그에 반하여 다른 배양물은 그렇지 않았다. 또한, GCM에 의하여 분리된 ASCs에서는 낮은 수준으로 CD49f가 발현하였다.
세 cASC 주의 분화력을 확인하기 위하여, in vitro 연골세포, 골형성 및 지방세포 분화 분석을 수행하였다. 도 2B에 나타난 바와 같이, 다분화능을 확인하였으며, 세 세포주 모두 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포로 분화하였다.
실시예 3: cASCs 의 생장
8 패시지 및 10 패시지에서, 세 cASCs 주의 세포 생장을 GCM에 의하여 분리된 ASCs의 세포 생장과 비교하였다. 8 패시지에서의 결과를 도 3a 에 나타내었다. 세 ASCs의 생장률은 GCM에 의하여 분리된 ASCs에 비하여 유의적으로 높았다. 또한, cASCs는 10 이상 패시지에서도 확장이 가능하였으며, 다만 10 패시지 후 생장률은 감소하였다.
실시예 4: cASCs 의 이동
GCM에 의하여 분리된 ASCs 및 8 패시지에서의 세 cASC 주의 이동능을 상처 이동 어세이를 이용하여 비교하였다. 8 패시지의 이동능을 도 3B에 나타내었다.
세 cASCs 주에서의 이동률은 GCM에 의하여 분리된 ASCs에 비하여 유의적으로 컸다. cASCs가 높은 생장률 및 이동능을 나타냄을 바탕으로, 웨스턴 블롯을 이용하여, Akt 및 ERK1/2와 같은 유사분열 신호 분자 (mitogenic signaling molecule)의 인산화를 확인하였다. cASCs에서는 GCM에 의하여 분리된 ASC에 비하여 더 높은 Akt 및 ERK1/2의 인산화를 나타내었다. (도 3C).
실시예 5: cASCs 에서의 전분화능 ( Pluripotency ) 마커의 발현
RT-PCR에 의하여 전분화능 특이적 마커의 mRNA 수준을 확인하였으며, qPCR를 이용하여 발현에서의 차이점을 확인하였다 (도 3D 및 E).
Klf4 (도 3D) 및 Nanog (도 3E)의 발현은 qPCR에서 나타낸 바와 같이, GCM-분리된 ASCs에 비하여 cASCs에서 더 높았다. Klf4 및 Nanog의 상향조절은 ASC의 생장에 관여한다.
실시예 6: DEG (differentially expressed genes) 분석
뒤이어, 마이크로어레이 분석을 이용하여 GCM으로 분리된 ASCs 와 D107 cASC 주 간의 DEG (differentially expressed genes)를 비교하였다 (각각 n = 2). D107 cASCs에서는 55개의 유의적으로 상향조정된 유전자 (> 4.5-배) 및 23개의 하향 조정된 유전자 (< 4.5-배)을 나타냄을 확인하였다.
DEGs를 이용한 GO분석에서, cASCs에서 세포 생장 및 세포 분화에 관련된 유전자가 상향 조정됨을 확인하였다. 또한, 세포 생장과 관련된 10개의 상향조정된 유전자를 선택하고, 3개의 cASC에서의 이의 상향 조정을 qPCR를 통하여 확인하였다.
Figure pat00002
표 2에 나타난 바와 같이, Diras3, Myb, Cdca7, Mki67, Rrm2, Cdk1 및 Ccna2의 발현이 3개의 cASCs에서 모두 높았다.
실시예 7: cASCs 의 모발 조절
ASCs는 모발 주기를 휴지기에서 성장기로 촉진하며, 성장기 모발에서의 적소 (niche)로서 역할을 수행한다. 모발에서의 ASCs 및 cASCs의 능력을 3개의 실험적 시스템을 이용하여 비교하였다.
첫번째로, 조정 배지 (conditioned medium)를 수득하고, 분리된 DP 세포의 처리에 사용하였다. cASCs로부터 수득한 조정배지의 처리는 48시간 및 72시간에서, DP 세포의 생장율을 증가시켰으며, 이는 MTT 어세이를 통하여 확인하였다 (도 4A 및 B). 이에 따라, 모발 생장에 관여하는 생장인자의 발현을 RTPCR을 이용하여 측정하였으며, mRNA 수준의 변화를 qPCR를 이용하여 확인하였다. bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 VEGF의 mRNA 발현은 cASCs에서 상향조정되었다 (도 4C 및 D). 이러한 생장인자들의 상향 조절은 cASCs에 의한 모발 생장에 기여할 수 있다.
휴지기에서-성장기로의 변화를 ASC (1X104 세포) 피하주입 후 C3H/NeH 마우스에서 측정하였다. GCM-분리된 ASCs와 비교하여, cASCs는 휴지기에서-성장기로의 변화를 촉진한다 (도 4E). 또한, 신규한 모발 무게는 ASC 처리 12일 후 cASC-처리군에서 유의적으로 높았다 (도 4F).
이러한 결과는 선별된 cASCs의 모발 성장 촉진 효과가 GCM에 의하여 분리된 ASCs에 비하여 월등히 높다는 것을 나타낸다.
당업계의 숙련자에게는, 통상의 실험을 사용하면 본원에 특별히 기재된 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 등가 형태를 인식할 것이며 또는 확인할 수 있다. 이러한 등가형태는 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 것이다.

Claims (18)

  1. (a) 지방조직을 제 1용기에 배양하여 상층액을 수득하는 단계;
    (b) 제1용기의 상층액을 제 2용기에 옮기는 단계;
    (c) 상기 제2용기에 존재하는 세포를 배양하여 상층액을 수득하는 단계;
    (d) (b) 및 (c) 단계를 1회 이상 반복하는 단계;
    (e) 단일 세포 유래 콜로니를 분리하는 단계; 및
    (f) 상기 콜로니로부터 성장 배지로 세포를 옮기고, 세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 (a) 단계는
    (a-1) 지방조직을 및 분리배지를 혼합하는 단계;
    (a-2) 상기 혼합물을 교반하는 단계; 및
    (a-3) 상기 혼합물로부터 지방층을 분리하는 단계; 를 포함하는 것인,
    지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 (a-1) 단계의 분리배지는 10 내지 30 % 우태아혈청, 1 내지 5%의 항생제 및 항진균제가 보충된 동물세포배양배지인 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양은 5%의 CO2 농도 조건 하에서의 배양인 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은
    (g) 세포를 3 내지 25 계대로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 용기는 코팅제가 처리된 배양용기 또는 코팅제가 처리되지 않은 배양용기인 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 용기는 평평한 바닥을 갖는 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  8. 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-I 및 PODXL에 대하여 양성인 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 줄기세포는 CD49f에 음성인 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 줄기세포는 CD146에 양성인 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 줄기세포는 Akt 또는 ERK1/2의 인산화가 증가된 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 줄기세포는 Klf4 또는 Nanog의 발현이 증가된 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  15. 청구항 8에 있어서, Diras3, Myb, Cdca7, Mki67, Rrm2, Cdk1 및 Ccna2으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 발현인 증가된 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  16. 청구항 8에 있어서, 상기 줄기세포는 이종, 동종이계, 또는 자가 줄기세포인 것인, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포.
  17. 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  18. 층분리 배양법에 의하여 분리된, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109097430A (zh) * 2018-07-12 2018-12-28 江苏瑞思坦生物科技有限公司 临床用脂肪干细胞检测体系
EP3480301A1 (en) * 2017-11-06 2019-05-08 SCM Lifescience Co., Ltd. Method for isolation of stem cells from bone marrow using subfractionation culturing method and proliferation thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101198691B (zh) * 2005-06-17 2013-01-09 同种疗法有限公司 多种系干细胞的分离

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3480301A1 (en) * 2017-11-06 2019-05-08 SCM Lifescience Co., Ltd. Method for isolation of stem cells from bone marrow using subfractionation culturing method and proliferation thereof
CN109749991A (zh) * 2017-11-06 2019-05-14 Scm生命科学有限公司 干细胞的层分离培养及增殖方法
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