KR101756429B1

KR101756429B1 - 클로날 중간엽 줄기세포를 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101756429B1
Application number: KR1020150163406A
Authority: KR
Inventors: 송순욱; 서준규; 류지간
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2017-07-19
Also published as: KR20160060593A

Abstract

층분리 배양법 (subfractionation culturing method)을 통하여 수득한 줄기세포를 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 형성된 SCM를 이용한 클로날 BMSCs은 음경의 내피세포 및 해면 평활근의 함량을 증가시키고, 음경의 nNOS 및 신경미세섬유의 함량을 증가시킴으로써, 발기능력을 유의적으로 회복시키는 바, 매우 효과적인 발기부전 치료제로 활용될 수 있다.

Description

클로날 중간엽 줄기세포를 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR Erectile Dysfunction COMPRISING Clonal Mesenchymal Stem Cells}

층분리 배양법 (subfractionation culturing method)을 통하여 수득한 줄기세포를 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

신경-보존 (nerve-sparing) 기술 및 로봇식 시술 (robotic procedures) 등의 외과적 수술 기술의 발달에도 불구하고, 전립선암을 치료하기 위한 근치적 전립선 절제술 (radical prostatectomy, RP))의 흔한 합병증으로 발기부전이 발생한다. 양측 신경보존 RP 에도 불구하고 부분적 음경해면체 신경 손상 (cavernous nerve injury, CNI) 또는 신경차단 (neurapraxia)이 불가피하며, 이는 해면신경이 전립선 캡슐에 가까이 위치하며, 매우 미세하기 때문이다. 신경의 재생은 매우 느린 과정이므로, 음경의 장기간 신경제거 (denervation)는 발기조직의 구조적 변화를 야기하며, 이는 내피 및 평활근의 손실 및 세포외기질의 퇴적 및 해면체섬유증을 포함하며, 이는 결국 발기조직의 돌이킬 수 없는 손상을 야기시킨다. ED의 치료를 위하여 경구 PDE5 (phosphodiesterase-5) 억제제가 일반적으로 효과적임에도 불구하고, RP로부터 야기된 ED 남성 환자는 일반적인 ED 환자보다 이러한 치료에 덜 효과적이다. 따라서, 효과적인 ED의 치료를 위하여 음경해면체 조직에서의 병리학적 과정을 근본적으로 치료할 수 있는 새로운 치료법이 필요하다.

최근, 전임상 수준에서, ED를 치료하기 위하여 줄기세포 치료가 주목받고 있다. 골수, 지방 조직, 골격근 및 제대혈로부터 분리된 성체 줄기세포뿐만 아니라, 배아 줄기 세포를 포함하는 다양한 종류의 줄기세포가 ED 동물 모델에서 신경, 혈관 내피 세포 또는 평활근 재생에 사용되고 있다. 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cells, MSCs)는 성체 줄기 세포이며, ED연구의 전입상 연구에서 가장 광범위하에 조사된 것이 골수유래줄기세포 (bone marrow-derived stem cells, BMSCs)이다. 당뇨, 노화, 또는 CNI로부터 기인한 ED의 동물모델에 대한 종래 연구에서, BMSCs 단독 또는 유전자 변형 BMSCs의 IC 주입은 음경의 신경, 혈관 내피 세포, 또는 평활근 세포의 재생을 촉진하여 발기기능을 향상시킬 수 있음이 확인되었다.

중간엽 줄기세포를 분리하는 가장 잘 알려진 방법은 부착세포를 이용하고 비-부착 유동세포를 제거하여, 원심분리를 통하여 공여자 조직으로부터 단핵세포를 분획하는 것을 포함한다. ED 의 분야에서 대부분의 임상시험은 중간엽줄기세포를 분리하기 위하여 원심분리한 후, 부착세포 배양 기술을 이용하였다. 그러나, 최근의 증거는 종래의 구배 원심 분리 방법을 사용하여 분리된 중간엽 줄기 세포는 불균일(heterogeneous)하고 상이한 분화 잠재력을 포함하고 있는바, 예측할수 없는 결과에 이를 수 있으며, 이에 따라, 임상적 적용이 매우 제한적일 수 있음을 시사한다. 클로날 MSCs의 균일한 (homogeneous) 일부 집단을 수득하기 위하여, 본 발명자는 새로운 프로토콜을 확립하였으며, 이를 층분리 배양법 (subfractionation culturing method (SCM))으로 명명하였다. 이는 상대적으로 적은 양의 골수천자액 (bone marrow aspirate)으로부터 단일세포-유래 클로날 BMSCs를 제조하기 위한 것으로서, 2010년 8월 24일에 특허된 특허번호 제7,781,211호 미국 특허에 기술되어 있으며, 이는 그 전체로 본원에 참고로 인용된다.

본 발명자들은 SCM를 이용하여 마우스 클로날 BMSCs의 균일한 집단을 분리하였으며, 양측 해면체 신경 손상으로 유도한 발기부전 마우스 모델을 치료하는데 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 층분리 배양법 (subfractionation culturing method)을 통하여 수득한 줄기세포를 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 발기부전을 동맥성, 정맥성, 호르몬성, 신경인성일 수 있으며, 상기 발기부전은 해면 신경 손상에 의하여, 또는 당뇨에 의하여 야기된 것 일 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물을 해면정맥내 (intracavernous) 투여되거나, 복강내 (intraperitoneal) 투여되는 것 일 수 있다.

상기 줄기세포는 해면 콜라겐 함량에는 실질적인 영향을 주지 않을 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 음경의 해면 평활근의 함량을 증가시킬 수 있으며, 음경의 nNOS 및 신경미세섬유의 함량을 증가시킬 수 있다.

상기 층분리 배양법(subfractionation culturing method)은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

(i) 더 밀도가 높은 세포는 바닥에, 비교적 밀도가 낮은 세포는 상층액에 존재하도록, 세포 샘플을 원심분리 없이 제 1 용기에 위치시키는 단계;

(ii) 제 1 용기에서 밀도가 낮은 세포를 포함하는 상층액을 제 2용기에 옮기는 단계;

(iii) 더 밀도가 높은 세포는 바닥에, 비교적 밀도가 낮은 세포는 상층액에 존재하도록, 상층액에 존재하는 세포를 위치시키는 단계;

(iv) (ii) 및 (iii) 단계를 3회 이상 반복하는 단계;

(v) 상층액으로부터 다중계통 (multi-lineage) 줄기세포 또는 전구세포의 단일 콜로니를 분리하는 단계;

(vi) 콜로니로부터 성장 배지로 세포를 옮기고 세포를 배양하는 단계;

(vii) 세포를 4 내지 14 계대로 확장시키는 단계; 및

(viii) 다중계통 줄기세포 또는 전구세포의 뱅크 (bank)를 수득하는 단계.

또한, 상기 (vii)단계의 세포는 4 내지 6 계대로 확장된 것 일 수 있으며, 이 세포는 4 내지 6 계대 후 동결한 세포를 포함할 수 있다. 상기 동결은 -110 ℃ 내지 -150 ℃ 또는 액화질소에서 동결된 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 신선한 세포를 수득하기 위하여 세포를 해동하고 확장시키는 것을 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 (vii)단계의 세포는 8 내지 10 계대로 확장된 것일 수 있으며, 이 세포는 8 내지 10 계대 후 세포를 동결시킨 것을 포함할 수 있다. 상기 동결은 -110 ℃ 내지 -150 ℃ 또는 액화질소에서 동결된 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 신선한 세포를 수득하기 위하여 세포를 해동하고 확장시키는 것을 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 (vii)단계의 세포는 11 내지 14 계대로 확장일 수 있으며, 이 세포는 11 내지 14 계대 후 세포를 동결시킨 것을 포함할 수 있다. 상기 동결은 -110 ℃ 내지 -150 ℃ 또는 액화질소에서 동결된 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 신선한 세포를 수득하기 위하여 세포를 해동하고 확장시키는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 배양 용기는 평평한 바닥을 갖을 수 있으며, 세포 접착제로 코팅될 수 있다. 또한, 세포 접착제는 세포 접착제는 임의의 하전된 아미노산의 중합체를 포함할 수 있으며, 상기 세포 접착제는 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에 따라 형성된 SCM를 이용한 클로날 BMSCs은 음경의 내피세포 및 해면 평활근의 함량을 증가시키고, 음경의 nNOS 및 신경미세섬유의 함량을 증가시킴으로써, 발기능력을 유의적으로 회복시키는 바, 매우 효과적인 발기부전 치료제로 활용될 수 있다.

도 1은 마우스 클로날 골수-유래 줄기세포 (bone marrow-derived stem cells, BMSCs)를 분리하는 과정을 나타낸 도이다. 층분리 배양법 (Subfractionation culturing method)은 골수 천자액으로부터 매우 균일한 마우스 클로날 BMSCs를 분리하기 위한 방법이다. BMSCs는 골수-유래 줄기세포를 의미한다.
도 2은 클로날 BMSCs의 분리 및 특징을 나타낸 도이다.
(A) ex vivo 배양 과정 중에서의 클로날 BMSCs의 형태 (morphology)를 나타낸 도이다.
(B) 클로날 BMSCs의 다능 변형성 (multipotent plasticity)을 in vitro 분화를 이용하여 나타낸 도이다. 적적한 유도 후, 세포가 다계통 분화 (multilineage differentiation)능이 있음을 확인하기 위하여, 세포를 oil red O (지방세포분화), alizarin red S (골형성 분화), 또는 safranin O (연골 분화)으로 염색하였다.
(C) 세포는 양성 마우스 MSC 마커에는 양성인 반면, 조혈/내피 (hematopoietic/endothelial) 마커에 대해서는 음성을 나타내었다.
(D) 혼합된 림프구 반응에서, 클로날 BMSCs의 공동 배양은 T 세포의 증식을 억제 하였다. BMSCs는 골수 유래 줄기 세포, MSCs는 중간엽 줄기세포를 나타낸다.
도 3은 클로날 BMSCs 이식이 해면 신경의 전기 자극에 의하여 유발된 ICP (intracavernous pressure)를 회복시킴을 나타낸 도이다.
(A) PBS (20 μL) 또는 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IC (intracavernous) 주입, 및 clonal BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IP (intraperitoneal) 주입 2주 후 유발한 위수술 그룹 (sham operation group) 또는 CNI 마우스에서의 ICP 반응을 나타낸 도이다. 자극의 간격은 막대로 표시하였다.
(B, C) 평균 최대혈압 (mean systolic blood pressure, MSBP)에 대한, 평균 최대 ICP및 총 ICP (곡선 아래 면적)의 비율을 각 그룹별로 계산하였다. 각 막대는 각 그룹의 N = 6 동물의 평균값 (± SE)을 의미한다. *P < 0.01 vs. 위수술 및 BMSC (IC) 그룹. #P < 0.01 vs. PBS 그룹 †P < 0.05 vs. PBS 그룹. BMSCs는 골수-유래 줄기세포를 의미하며, CNI는 해면 신경 손상을 의미한다.
도 4는 클로날 BMSCs의 이식이 내피세포함량을 높여 해면 내피 함량을 증가시킴을 나타낸 도이다.
(A) PBS (20 μL) 또는 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IC (intracavernous) 주입, 및 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IP (intraperitoneal) 주입 2주 후, 위수술 그룹 또는 CNI 마우스로부터 분리한 해면체 조직의 항- PECAM-1 염색 결과를 나타낸 도이다. Scale bar = 100 μm.
(B) 각 그룹에서, PECAM-1 (red) 및 phosphohistone H3 (PH3; green)에 대한 항체로 해면체를 면역형광 이중 염색한 결과이다.
(C) 해면체 조직 내 내피 세포 함량의 정량적 분석은 영상 분석기를 사용하여 수행하였다. 각 막대는 각 그룹 당 N = 6 동물의 평균값 (± SE)을 나타낸다. *P < 0.01 vs. 위수술 및 BMSC (IC) 그룹. #P < 0.01 vs. PBS 그룹. †P < 0.05 vs. PBS 그룹.
(D) 고전력장 (high-power field) (화면 배율 x400) PH3-면역양성 내피세포의 수를 나타낸 도이다. 각 막대는 각 그룹 당 N = 6 동물의 평균값 (± SE)을 나타낸다. *P < 0.01 vs. 위수술, BMSC (IC), 및 BMSC (IP) 그룹. #P < 0.01 vs. PBS 그룹. BMSCs (bone marrow-derived stem cells)은 골수-유래 줄기세포, CNI(cavernous nerve injury)는 해면 신경 손상, HPF(high-power field)는 고전력장을 나타낸다.
도 5는 클로날 BMSCs의 이식이 해면 평활근 함량을 증가시키는 것을 나타낸 도이다.
(A) PBS (20 μL) 또는 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IC (intracavernous) 주입 및 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IP (intraperitoneal) 주입 2주 후 위수술 그룹 또는 CNI 마우스로부터 분리한 해면체 조직을 항- PECAM-1 및 평활근 α-액틴으로 염색한 결과이다. Scale bar = 100 μm.
(B) 해면체 조직 내 평활근 함량의 정량적 분석은 영상 분석기를 사용하여 수행하였다. 각 막대는 각 그룹 당 N = 6 동물의 평균값 (± SE)을 나타낸다. *P < 0.05 vs. 위수술그룹. #P < 0.01 vs. PBS 그룹. †P < 0.05 vs. PBS 그룹. BMSCs (bone marrow-derived stem cells)은 골수-유래 줄기세포, CNI(cavernous nerve injury)는 해면 신경 손상을 나타낸다.
도 6은 클로날 BMSCs의 이식이 해면 콜라겐 함량에는 영향을 미치지 않음을 개시한 도이다.
(A) PBS (20 μL) 또는 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IC (intracavernous) 주입 및 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IP (intraperitoneal) 주입 2주 후 위수술 그룹 또는 CNI 마우스로부터 분리한 해면체 조직을 MT (Masson trichrome) 염색한 결과이다. Scale bar = 200 μm.
(B) 해면체 조직 내 콜라겐 함량의 정량적 분석은 영상 분석기를 사용하여 수행하였다. BMSCs (bone marrow-derived stem cells)은 골수-유래 줄기세포, CNI(cavernous nerve injury)는 해면 신경 손상을 나타낸다.
도 7은 클로날 BMSCs 이식이 음경의 nNOS 및 신경미세섬유 (neurofilament) 함량에 미치는 영향을 개시한 도이다.
(A) PBS (20 μL) 또는 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IC (intracavernous) 주입 및 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)의 단일 IP (intraperitoneal) 주입 2주 후 위수술 그룹 또는 CNI 마우스로부터 분리한 음경 조직을 항- nNOS 염색한 결과이다. Scale bar = 25 μm.
(B) 각 그룹에서의 음경 조직을 항-신경미세섬유 염색한 결과이다.
BMSCs (bone marrow-derived stem cells)은 골수-유래 줄기세포, CC (corpus cavernosum)는 음경해면체, CNI(cavernous nerve injury)는 해면 신경 손상, DNB (dorsal nerve bundle)는 배측신경다발을 나타낸다.
도 8은 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식의 발기 기능 복원 확인한 도이다.
(A) 치료 2주 후, 정상대조군 또는 당뇨 마우스에서, 1분간 해면 신경을 자극 (5 V, 12 Hz, 1 ms)한 후, 해면정맥내 음경압력 (intracavernous pressure)을 측정한 결과이다.
(B) MSBP (mean systolic blood pressure)에 대한 최대 ICP (intracavernous pressure)를 나타낸 그래프이다.
(C) MSBP (mean systolic blood pressure)에 대한 총 ICP의 비를 나타낸 그래프이다.
도 9는 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 해면 내피 세포 및 평활근 세포 함량의 증가를 확인한 도이다.
PECAM-1에 대한 항체를 이용한 해면 조직의 면역 조직 화학 염색을 치료 2주 후의 정상대조군 및 당뇨 마우스에 대하여 수행하였다. 정상 대조군 마우스보다 당뇨군, PBS-처리된 당뇨 마우스에서 유의적으로 낮은 해면 내피 세포 함량이 관찰되었다. 클로날 BMSCs의 IC 주사는 해면 내피 세포 함량을 유의적으로 복원하였다 (도 9A 및 9B).
치료 2 주 후 정상대조군 및 당뇨 마우스에서, 평활근 α-액틴에 대한 항체를 이용하여 해면체 조직의 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 정상대조군 마우스에 비하여 당뇨군, PBS-처리 당뇨 마우스에서 유의적으로 낮은 해면 평활근 세포 함량을 관찰 하였다. 당뇨 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 주입은 해면 평활근 함량을 회복시켰다 (도 9A 및 9C).
도 10은 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 내피세포유래 산화질소 합성효소의 인산화 유도 결과를 나타낸 도이다. BMSCs의 IC 주사는 내피세포유래 산화 질소 합성효소의 인산화가 정상대조군 수준으로 회복시켰다.
도 11은 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 해면 섬유화의 억제 효과를 나타낸 도이다. 당뇨 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 주입은 해면 섬유화를 억제하였으며, 해면 콜라겐 함량의 차이는 없었다.
도 12는 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 음경 nNOS 및 신경미세섬유 함량의 증가를 나타낸 도이다. 당뇨 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 주입은 신경미세섬유 및 nNOS함량을 유의적으로 회복시켰다.

본 발명의 일 양상은 층분리 배양법 (subfractionation culturing method)을 통하여 수득한 줄기세포를 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "신체 샘플"은 단일 유형의 세포를 격리하고자 하는 포유류로부터 수득된 임의의 샘플을 의미한다. 이러한 신체 샘플로는 뼈 골수 샘플, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 및 사이토카인-활성화된 말초 혈액을들 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 세포의 소스 및 치료를 논의하기 위한 "포유류" 또는 "대상"은 인간, 국내 및 농장동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 랫, 마우스, 토끼 등을 포함하는 포유류 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "세포 샘플"는 뼈 골수 샘플, 말초 혈액, 제대혈, 지방조직 샘플 및 사이토카인-활성화된 말초 혈액을 포함하는 여러 유형의 세포 혼합물을 포함하는 임의의 샘플을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "균일한" 집단은 일반적으로 동일한 유형의 세포가 집단 내에 존재하는 것을 제시한다. "실질적으로 균일한"이라는 것은 약 80 %의 균질성 또는 약 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.1 %, 99.2 %, 99.3 %, 99.4 %, 99.5 %, 99.6 %, 99.7 %, 99.8 % 또는 99.9 %의 균일성을 의미할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "저밀도 세포"는 샘플에서 다른 것들보다 밀도가 낮은 세포 및 격리의 대상이 되는 세포를 의미한다. 저밀도 세포는 비제한적으로 다중계통 줄기세포, 전구세포 및 다른 골수 간질세포를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MLSC"는 다중계통 줄기세포를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MLSC/PC"는 다중계통 줄기세포 또는 전구세포를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "MSC"는 골수 간질세포 또는 중간엽 줄기세포를 의미한다.

상기 발기부전을 동맥성, 정맥성, 호르몬성, 신경인성 유형일 수 있으며, 상기 발기부전은 해면 신경 손상에 의하여 야기된 것 일 수 있다. 또한 상기 발기부전은 당뇨성 발기부전일 수 있다.

(iv) (ii) 및 (iii) 단계를 3회 이상 반복하는 단계;

(vii) 세포를 4 내지 14 계대로 확장시키는 단계; 및

상기 배양 용기는 평평한 바닥을 가질 수 있으며, 세포 접착제로 코팅될 수 있다. 또한, 세포 접착제는 세포 접착제는 임의의 하전된 아미노산의 중합체를 포함할 수 있으며, 상기 세포 접착제는 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물는, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당 조합해, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화하는 것을 생각된다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다. 또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다.

주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다.

유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로 카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.

환자의 체내에의 투여는 바람직하게는 비경구투여이며, 구체적으로는 정맥에의 1회 내지 3회의 투여가 기본이지만 그 이상의 투여라도 좋다. 또, 투여 시간은 단시간이라도 장시간 지속 투여라도 좋다. 더욱 구체적으로는, 주사제형, 경피투여형등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사, 해면정맥내 주사등에 의해 투여할수가 있지만, 바람직하게는 해면정맥내 주사 또는 복강내 주사이다. 정맥내 주사의 경우, 통상의 수혈의 요령에서의 이식이 가능해져 환자를 수술할 필요가 없고, 나아가 국소 마취도 필요없기 때문에, 환자 및 의사 쌍방의 부담이 가볍다. 또 병동에서의 이식 조작이 가능한 점으로써 매우 적합하다. 장래의 구급의료의 발전을 고려하면, 구급 반송중, 혹은 발증 현장의 투여도 생각할 수 있다.

발기부전 환자를 치료하기 위하여 본 발명의 클로날 BMSCs는 치료적 유효량을 환자에게 투여할 수 있으며, 상기 치료적 유효량은 특별히 제한되는 것은 아니나, 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg인 것이 바람직하고, 1×10⁵cell/kg 내지 1×10⁷cell/kg인 것이 더욱 바람직하고, 5×10⁵ cell/kg 내지 5×10⁶ cell/kg인 것이 가장 바람직하다. 상기 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여방법이라면 어느 것이나 사용가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥내 투여가 가장 바람직하다.

층분리 배양기술

본 발명에서 층분리 배양법 (subfractionation culturing method)라고 명명되는 방법으로서 신체 샘플 또는 인간 골수와 같은 공급원에서 다중계통 줄기세포(MLSC)의 매우 균일한 집단을 분리하는 방법을 이용한다. 1ml 뼈 골수 천자액(aspirate)에서 총 16 개의 골수 세포주를 확립하였다. 16개 중에서, FACS 분석에 의해 별도의 표현형을 나타내는 4개의 세포주에 대해 특성화하였다. 이들 세포주 모두는 자기-재생 기능 및 중배엽, 외배엽, 내배엽 계통 세포로의 분화능과 같은 다중계통 줄기세포의 특징을 나타내었다.

골수 MSC는 조혈 세포에 의한 오염 없이 분리하기 어려운 것으로 알려져 있다. 임상 설정에 적용하기 위해서는, 면역근원의 문제를 해결하고 임상적 효과를 정확하게 평가하기 위해 MSC의 균일한 집단을 갖는 것이 중요하다. 전통적으로, MSC의 균일한 집단의 분리는 MSC-특이적 항체 칼럼 정제에 의해 실행되었다. 그러나, 이러한 완전한 MSC-특이적 항체가 아직도 가능하지 않기 때문에 이 방법은 충분하지 않다.

뼈 골수 샘플과 같은 생체 샘플로부터 MLSC를 분리하기 위한 본 발명의 원리는, 다중계통 줄기세포 또는 전구세포가 낮은 세포 밀도를 갖고, 따라서 이들이 이에 따라 샘플에서 다른 세포과 분리될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 성숙한 MSC는 신속 자기-재생(RS) 세포보다 크다. RS 세포는 다중계통의 분화를 위하여 더 큰능력을 갖는 것으로 알려져 있다.

다른 양태에서, 더 접착력이 높은 줄기세포를 얻기 위해 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 배양 접시가 사용되었다. 본 출원인은, 양(+) 또는 음(-)으로 임의 하전된 배양 표면은 코팅하지 않은 접시 표면에 비해 줄기세포의 표면에 접착을 촉진하는 것을 밝혀냈다. 코팅하지 않은 접시보다 각각 약 2 내지 3배 많은 세포가 콜라겐 또는 폴리리신-코팅된 배양 접시에 부착되었다(데이터가 미기재). 단일 세포-유도된 뼈 골수 세포 콜로니의 수득과 관련하여, 다른 인간 골수 천자액 및 3개의 상이한 혈통의 마우스 골수 샘플에서 유사한 결과가 수득되었으며(데이터 미기재), 이는 이 프로토콜이 다른 뼈 골수 천자액과 일관적이며 또한 다른 종에서의 MLSC의 분리에 적용될 수 있음을 보여주고 있다.

따라서, 하나의 실시양태에서, 배양 접시의 바닥은 양(+)으로 하전된 아미노산, 예컨대 폴리리신, 폴리아르기닌, 또는 음(-)으로 하전된 아미노산, 예컨대 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트, 또는 이들의 조합에 의해 코팅되어서, 줄기세포 또는 전구세포가 접시의 바닥에 접착하는 것을 도와줄 수 있다.

더 무겁거나 더 밀집된 세포의 대부분이 최초 2개의 2시간의 배양 단계에서 제거될 수 있기 때문에, 본 발명의 층분리 배양 방법을 실시하기 위해서는, 적혈구 또는 백혈구와 같은 임의의 유형의 세포를 샘플로부터 미리 제거하도록 임의의 유형의 원심분리도 사용할 필요가 없다. 이 점에서, 이는 세포들 사이의 임의의 물질을 소화시키는 임의의 효소로 세포를 미리 처리할 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 시스템의 장점들 중 하나는, 세포 배양액 중에 피콜(Picoll), 휘콜(Ficoll) 또는 휘콜-히파크(Ficoll-hypaque)와 같은 오염을 도입할 수 있는 통상적으로 사용되는 밀도-구배 원심분리 및 단핵세포 분획 단계들을 회피할 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명의 층분리 배양 방법은, 신체 샘플, 바람직하게는 골수 샘플로부터 매우 균일한 MLSC를 분리하기 위한 단순하고 효과적이고 경제적인 프로토콜이다.

대안적으로, MSC 분리의 종래 밀도-구배 원심분리에 의한 분리/분획된 단핵세포는, 단일 세포-유도된 콜로니를 수득하고 줄기세포 또는 전구세포의 균일한 집단을 분리하기 위해서 접시 D1 내에 가할 수 있다. 따라서, 분획 배양 방법에서는 종래 밀도-구배 원심분리법에 의해 분획된 단핵세포가 이용될 수 있다.

본원은, 생체 샘플, 특히 예시되어 있는 골수 샘플에 존재하는 줄기세포 또는 전구세포에는 여러 유형이 존재한다는 것을 나타내는, 단일 세포 유도된 줄기세포주의 세포 표면 단백질 발현에서의 특징의 다양성에 대해 설명한다. 분리된 MLSC는 일반적으로 CD34, HLA-DR, CD73, CD31, CD166, HLA 클래스 I에 대해서는 네거티브이거나, 또는 약간 포지티브이며, CD44, CD29, CD105에 대해서는 매우 포지티브있었다. 그러나, D4 및 D5의 접시로부터의 일부 세포주는 분명한 수준의 표면 단백질을 보여 주지만, 이는 뼈 골수에서 일부 다른 다중계통 줄기세포 또는 전구세포가 존재할 수 있는 것을 보여주고 있다. 훙(Hung) 등은, 뼈 골수가 표면 마커 분석에서 다른 많은 군의 MSC를 포함할 수 있다고 가정하였다[24]. 다양한 표면 마커를 갖는 이러한 MSC는 세포의 여러 분화 능력을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 층분리 배양 방법에 의해 단일 세포 유도된 균일한 줄기세포의 분리로 인해, 이러한 군의 세포가 뼈 골수 또는 다른 특이적으로 분리된 신체 샘플 중에 존재하고 배양 조건이 세포 확장 동안 그의 능력이 변화시키지 않는 한, 조직 특이적 줄기세포 또는 관계된 전구세포의 분리가 가능하게 된다. MSC 치료 및 세포 이식 처리의 안전성과 유효성은, 본원에 제시된 바와 같이, 특정 성질을 갖는 세포 하위-집단을 특징지을 수 있음으로써 향상된다.

본원은, 재생 기능 및 외배엽, 중배엽 및 내배엽 계통 세포로의 다중계통 분화능을 갖는, 단일 세포로부터 유래하는 MLSC 라인의 매우 균일한 집단을 임의의 다른 신체 샘플, 특히 골수로부터 분리하는 새로운 방법을 제시한다. 줄기세포를 분리하기 위해 항체를 이용할 필요 없이 밀도-구배 원심분리 및 단핵세포 분획 단계를 제거함으로써, 본 발명의 하위-분획 배양 방법은 단순하고 효율적이고 경제적 절차로 및 치료 상황에 대해 더욱 안전하게 더 균일한 MLSC의 집단을 생성시킨다.

내배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/ 형질전환제

내배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제는, 간, 폐, 췌장, 갑상선 및 장 세포와 같은 유형의 세포를 위해, 간세포 성장 인자, 온코스타틴-M(oncostatin-M), 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자-4, 베이직 섬유아세포 성장 인자, 인슐린, 트랜스페린(transferrin), 셀렌산(selenius acid), BSA, 리놀렌산, 아스코베이트 2- 포스페이트, VEGF 및 덱사메타손과 같은 제제를 포함한다.

중배엽 세포계통을 위한 유도, 분화/ 형질전환제

중배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제는, 연골세포, 뼈세포, 지방세포, 근육 세포 및 혈액 세포와 같은 유형의 세포를 위해, 인슐린, 트랜스페린, 셀렌산, BSA, 리놀렌산, TGF-β1, TGF-β3, 아스코베이트 2-포스페이트, 덱사메타손, β-글리세로포스페이트, 아스코베이트 2-포스페이트, BMP 및 인도메타신과 같은 제제를 포함한다.

외배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/ 형질전환제

외배엽 세포 계통을 위한 유도, 분화/형질전환제는, 신경세포, 피부 세포, 뇌 세포 및 눈 세포와 같은 유형의 세포를 위해, 디부티릴 사이클린 AMP, 이소부틸 메틸잔틴, 인간 상피 성장 인자, 베이직 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자-8, 뇌-유도된 신경영양(neurotrophic) 인자 및/또는 다른 신경영양 인자와 같은 제제를 포함한다.

층분리 배양방법으로 수득한 세포를 이용한 발기부전의 치료

최근 줄기세포 치료가 주목받고 있으며, BMSCs (bone marrow-derived stem cells)은 발기부전에서 사용되는 줄기세포중 가낭 연구가 많이 이루어진 중간엽 줄기세포 중 하나이다. 그러나, 줄기세포 치료의 임상 적용에 있어서 가장 큰 장애는 분리된 세포의 비균일한 성질이며, 이는 상이한 치료 결과를 초래한다.

이에 따라 본 발명자들은 층분리 배양방법 (subfractionation culturing method, SCM)을 이용한 단일 콜로니로부터 수득한 마우스 크로날 BMSCs의 발기부전에의 효과를 해면 신경 장애 (cavernous nerve injury, CNI) 마우스 모델에서 확인하였다.

20주령 C57BL/6J 마우스를 4 그룹으로 분류하였다: 위수술 그룹, PBS (20 μL) 또는 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)를 단일 IC (intracavernous) 주입 처리한 양측 CNI 그룹, 및 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL)를 단일 IP (intraperitoneal) 주입처리한 양측 CNI 그룹.

클로날 BMSC 계통은 형광-활성 세포 분류를 이용한 세포-표면 에피토프 및 분화 잠재력을 분석하였다. 양측 해면 신경 손상 및 치료 뒤 2 주 후, 해면 신경의 전기적 자극을 통하여 발기기능을 측정하였다. 음경을 조직학적 분석을 위하여 회수하였다.

클로날 BMSCs은 중간엽 줄기세포의 세포 표면 마커를 발현하였으며, 지방세포, 골원성 세포, 및 연골원 세포를 포함하는 다양한 계통으로 분화할수 있는 능력이 있었다. 클로날 BMSCs의 IC 및 IP 주입 모두 CNI 마우스에서, 해면 내피 및 평활근 함량, 및 음경 nNOS 및 신경미세섬유의 함량을 유의저으로 회복시켰다. 클로날 BMSCs의 IC 주입는 발기 능력을 유의적으로 회복시켜 위대조군 값의 90 내지 100%에 도달한 반면, 클로날 BMSCs의 IP 주입은 발기능력을 부분적으로 회복시켰다. 주입은 해면정맥내 일 수 있다.

본 발명자들은 SCM를 이용하여 마우스 클로날 BMSCs의 균일한 집단을 확립하였다; 클로날 BMSCs는 CNI 마우스의 발기능력을 성공적으로 회복시켰다. 클로날 중간엽 줄기세포의 균일한 특성이 이러한 임상적 적용을 가능하게 한다.

본 발명자는 클로날 BMSCs의 IC 또는 IP 주입이 CNI 마우스에서 해면 내피 및 평활근 세포 함량, 및 음경 nNOS 및 신경미세섬유 함량을 유의적이게 회복시킴을 제시한다. 클로날 BMSCs의 IC 주입은 발기 능력을 유의적으로 회복시켜 위대조군 값의 90 내지 100%에 도달한 반면, 클로날 BMSCs의 IP 주입은 발기능력을 부분적으로 회복시켰다.

본 발명에서, 본 발명자들은 상대적으로 소량의 골수 첨자액 (aspirate)으로부터 층분리 배양방법 (subfractionation culturing method, SCM)을 이용하여 분리된 마우스 클로날 BMSCs 계통을 사용하였다; 클로날 BMSCs는 세포의 표현형 및 분화 잠재력으로 특정된다. 클로날 BMSCs는 MSCs의 세포 표면 마커를 발현하여, 지방원 세포, 골원세포 및 연골원세포를 포함하는 다양한 세포 계통으로 분화되었다. 종래, 본 발명자들은 SCM를 이용한 6개의 인간 클로날 BMSC 계통을 확립하였으며, 확립된 클로날 BMSC 계통이 세포 표면 에피토프, 분화 잠재력 및 사이토카인 분비에 있어서 매우 다양함을 확인하였으며, 이는 골수에 다양한 종류의 줄기세포가 존재함을 나타낸다. 이러한 종래 연구를 통하여, 본 발명자들은 클로날 BMSCs의 균일한 부분집단 (subpopulation)에서 상이한 세포 유형이 존재하며, 이는 다양한 임상 상황에서 치료적인 이점을 가질 수 있음을 제시하였다. 클로날 줄기세포 계통을 확립하기 위한 본 발명의 프로토콜의 장점은 하기와 같다. 먼저, 골수 흡인물이 소량만 필요하다. 둘째, 본 발명의 프로토콜은 구배-원심 분리 단계를 필요로 하지 않으며, 따라서 줄기 세포에 유해 할 수 있음 피콜(Picoll), 휘콜-히파크(Ficoll-hypaque)와 같은 오염 가능성을 배제한다. 셋째, 줄기 세포를 분리하기 위한 어떤 효소 처리 또는 필터링 절차가 필요하지 않다. 마지막으로, 본 발명자는 중간엽 줄기 세포의 매우 균일한 집단을 수득하였다. 줄기세포 치료의 임상 적용에 대한 주요 제한은 통상적인 방법을 사용하여 분리된 줄기세포의 비균일성 (heterogeneity)이다. 단일 세포 유래 콜로니로부터 얻어진 클로날 MSCs의 균일한 집단은 이와 같은 문제를 회피하고 줄기 세포 치료의 임상 적용을 용이하게 할 수 있다.

종래 연구에서는 당뇨 랫트에 BMSCs의 IC 주입은 해면 내피 및 평활근 함량을 유의적으로 증가시킨다는 것을 개시하고 있다. 이러한 결과와 동일하게, CNI 마우스에서, 마우스 클로날 BMSCs의 IC 주입은 해면 내피 및 평활근 함량의 완전한 회복을 유도하였다. 동물 모델에서, CNI는 섬유형성 (profibrotic) 인자의 발현 증가를 유발하며, 해면체 섬유증 (cavernous fibrosis)을 유도함이 증명되었다. 콜라겐 I과 III의 증가된 단백질발현 및 해면 콜라겐함량이 증가가 CNI 마우스 및 RP를 남성의 해면체 조직에서 관찰되었다. 그러나, 본 발명에서는 Masson's trichrome 염색을 이용하여 결정된 해면 콜라겐 함량이 CNI 후 증가하지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상대적으로 단기간의 CNI에 기인할 수 있다. 해면 평활근과 결합조직 (connective tissue)간의 균형은 정맥 폐색 (veno-occlusive) 매커니즘의 유지에 매우 중요하다. 해면 평활근 함유량이 임계량보다 적으면, 정맥-폐색 매커니즘은 필연적으로 작동하지 않는다. 본 발명에서, CNI 마우스에서 평활근에 대한 콜라겐의 비율에 근거하여, 마우스 클로날 BMSCs의 IC 및 IP 주입은 해면 섬유증을 유의적으로 감소시키고, 이는 평활근 함량의 복원에 주로 기인하여, 치료 후 콜라겐 함량의 감소에 의한 것이 아니다.

BMSCs가 해면 내피 세포 및 평활근 세포로 분화할 수 있음이 보고되었으나, 축적된 증거는 MSCs의 근거리 분비 (paracrine) 활성이 줄기세포 치료이점을 제공하는 중요한 역할을 수앵함을 제시한다. 이러한 개념은 MSCs의 조정 배지 (conditioned medium) 또는 용해물을 투여하는 실험에 의하여 더 뒷받침되었다. 당뇨 랫트에서의 종래 연구는 BMSC-조정 배지의 IC 주입은 발기 기능을 유의적으로 회복시킨 반면, BMSC-처리 구룹에서 관찰되는 수준에는 이르지 못함을 입증하였다. ex vivo 조건 하에서의 BMSC-조정 배지의 결과는 줄기세포의 근거리 분비 (paracrine)활성에 대한 간접적인 증거를 제공하며, 체내 투여 후 BMSCs의 영양이나 분비 활동에 영향을 미칠 수 있는, 혈청 단백질과 면역 시스템과 같은 수많은 요인에 의하여 in vivo 상황을 완전히 반영할 수 없었다.

본 발명에서는, 이러한 근거지분비 활성에 대한 직접적인 증거를 얻기 위하여 BMSCs IP 투여하였다. IC 주입 그룹에서 관찰한 것과 같은 명백한 발기 기능의 회복이 확인되지는 않았지만, BMSCs의 IP 주입 역시 해면 내피 및 평활근 합량을 회복시킴으로써 CNI 마우스에서의 발기 기능을 유의적으로 회복시켰으며, 이는 BMSCs의 근거리분비 (paracrine) 효과를 뒷받침한다.

발기 기능의 유지에 있어서 온전한 nNOS-양성 뉴론의 수가 중요하다. 본 발명에서, CNI 마우스에서, 클로날 BMSCs의 IC 및 IP 주입은 음경의 nNOS 함량을 유의적으로 회복시켰다.

본 발명의 새로운 프로토콜은 다양한 분화 잠재력 및 사이토카인 분비 프로필을 갖는 인간 클로날 MSC 라이브러리를 확립하는데 사용하였다. 이러한 인간 클로날 MSC 라이브러리는 다양한 원인으로부터 기인한 발기부전 치료를 위하여 원인-특이적 또는 개별화된 줄기세포 치료를 가능하게 할 것이다. 예를 들어, 전립선 암의 치료를 위한 RP 또는 장기간 당뇨로부터 발생한 결합된 신경성 및 혈관인성 (vasculogenic) 발기부전을 위하여, 신경 및 혈관 재생에 높은 가능성을 나타내는, 신경영양 및 혈관 신생인자의 높은 분피 프로파일을 나타내는 클로날 MSC 계통를 선택할 수 있다.

이 발명은 단일 세포 유래 콜로니로부터 얻어지는 클로날 BMSCs가 ED 치료에 유용한 것을 나타내는 첫 번째 연구이다. 본 발명에서, 발명자들은 SCM을 이용하여 마우스 클로날 BMSCs의 균일한 집단을 분리하여 특정하였다. In vitro에서, 클로날 BMSCs는 지방원 세포, 골원세포, 연골원세포를 포함하는 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있다. 클로날 BMSCs의 IC 및 IP 주입 모두는 성공적으로 내피 세포, 평활근, 신경 세포의 합량을 복원하여 CNI 쥐에서 발기 기능을 회복시켰다. 줄기 세포를 임상 시험에 적용할 때의 주요한 제한은 분리된 세포의 비균일한 (heterogeneous) 이질적인 성질이다. 단일 세포 유래 콜로니로부터의 균일한 클로날 MSCs의 수득은 임상 응용을 가속화 할 수 있다.

본 발명은 본원에서 설명된 특정 실시양태들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 사실상, 이러한 본원의 설명에 덧붙여, 당업자에게는 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 발명의 다양한 변형이 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위에 속하는 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이를 제한하고자 하여 제공되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1- 신경인성 발기부전 치료효과 확인 방법

실시예1 .1 - 클로날 BMSC 계통의 분리 및 구축

DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium)-저 글루코스(GIBCO-BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), 10% FBS(fetal bovine serum), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 5-ml 배양 배지를 이용하여 골수강 (bone marrow cavity)을 세척함으로써, 5 주령의 C3H 마우스의 경골과 대퇴골로부터 마우스 골수 샘플을 회수하였다. 다음에, 완전 성장 배지 15 ml을 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 100-mm 배양 접시에서 배양 하였다. 50 ml/L CO₂와 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 한 후, 상층액을 깨끗한 중간 100-mm 접시로 옮겼다 (도 1). 제 2의 1 시간 배양 후, 상층액을 중간 접시로부터 새로운 접시 (D1)로 옮기고 추가로 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음 상층액을 D1으로부터 새로운 접시 (D2)로 옮긴 뒤 1일 동안 배양한 후, 새로운 접시 (D3)로 다시 옮긴 뒤 1일 동안 배양하였다. 이 과정을 1일 및 2일의 배양 (각각 D4와 D5)함으로써 2차례 반복하였다. 7~14일 동안 배양 한 후, 클로닝 실린더 (GIBCO-BRL) 내에서 트립신/ EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid)의 2-3분 처리 후, 배양 접시 상의 잘 분리된, 단일-세포-유래 콜로니를 박리 및 분리하였다. 배양물을 6-웰 플레이트로 옮기 뒤, 세포가 계속 증식 (expand)할 수 있는 큰 배양 플라스크로 옮겼다. 세포가 일단 70-80%의 집합체(confluence)에 도달하면, 트립신/EDTA을 이용하여 회복한 뒤, 50-100 cells/cm² 까지 계대배양하였다. 5 마우스의 골수샘플을 이용하여 D1 내지 D2 접시 상에서 10 및 20 콜로날을 수득하였으며, 다수의 콜로날 BMSC 계통을 확립할 수 있었으며, 본 발명에 사용하기 위하여 하나(D101)를 선택하였다.

실시예 1.2 - 면역 세포 화학 및 유동 세포 계측법

세포 표면 항원 표현형을 위하여, 트립신/EDTA를 처리하여, 175 cm² 플라스크에서 확립된 5-7 패시지의 클로날 BMSCs를 회수하고 PBS를 이용하여 2회 세척하였다. 세포를 FITC-결합 항체와 함께 30분동안 4℃에서 배양한 후, 0.1%의 BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. 하기의 항체를 유세포계측법에 사용하였다: CD34 (Serotec, Oxford, UK), CD44 (Serotec), CD45 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA), CD103 (BD Biosciences Pharmingen), CD105 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), CD117 (BD Biosciences Pharmingen), MHC Class II (BD Biosciences Pharmingen), 및 Sca-1 (BD Biosciences Pharmingen). 세포를 0.1 % BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였으며, 녹색 FITC 형광에 대한 525 nm의 필터의 유동 세포 계측법을 이용하여 분석하였다.

실시예 1.3 - In vitro 분화

분화 잠재력을 비교하기 위해 다음의 방법을 이용하여 확립된 클로날 BMSCs가 지방원 세포, 골원 세포, 또는 연골원세포로 분화하도록 유도하였다.

연골 분화를 위하여, 펠렛 배양 시스템를 사용하였다. 약 2 × 10⁵ 클로날 BMSC를 15-mL 폴리프로필렌 튜브 (Falcon, Bedford, MA, USA)에 위치키고 및 원심 분리하였다. 세포 펠렛을 10 ng/mL TGF-β1 (R&D Systems), 10 ng/mL TGF-β3 (R&D Systems), 50 μg/mL 아스코르브산 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), 10-7 mol/L 덱사메타손 (Sigma), 40 μg/mL 프롤린 (Sigma), 및 1% ITS + Premix (6.25 μg/mL 인슐린, 6.25 μg/mL 트랜스페린, 6.25 ng/mL 셀렌 산, 1.25 mg/mL BSA, 및 5.25 mg/mL 리놀레산; Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)으로 보충된 α-MEM으로 이루어진 500 μL 연골분화 배지에서 37℃ 및 50 mL/L CO₂에서 배양하였다. 연골 분화 배지 3 주 동안 3 일마다 교환하였다. 현미경 관찰을 위하여, 펠릿을 OCT 화합물(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)을 이용하여 내장시키고, 8 μm의 섹션으로 동결시킨 후 톨루이딘 블루 또는 사프라닌 O로 염색하였다.

조골세포 및 지방세포 분화를 조사하기 위해, 단층 배양 시스템을 사용하였다. 조골 세포 분화를 위하여, 클로날 BMSCs를 12-웰 플레이트에서 50 cells/cm² 로 플레이팅하였으며, 집합체 (confluence)가 될 때까지 배양 하였다. 배양물은 10% FBS, 50 μg/mL 아스코르브 산 (Sigma), 10-8 mol/L 덱사메타손 (Sigma), 10 mmol/L β- β-글리세로포스페이트 (Sigma), 및 1 mmol/L dibutyryl-cyclic AMP (db-cAMP)으로 보충된 α-MEM으로 이루어진 조골 분화 배지에 배양하였다. db-cAMP는 최초 4일 동안에만 첨가되었다. 배지는 3주동안 3일마다 교환하였다. 세포를 10% 포르말린 (Sigma)를 이용하여 실온에서 10분동안 고정하고, 0.1% 알리자린 레드 S (Sigma)로 염색하였다.

지방세포 분화를 평가하기 위해, 클로날 BMSCs은 12 웰 플레이트에서 50 cells/cm² 로 플레이팅하고, 집합체를 형성할때 까지 α-MEM (20% FBS)에서 배양하였다. 그 다음 배양물을 10% 소 태아 혈청, 10-7 mol/L 덱사메타손 (Sigma), 10 μg/mL 인슐린 (Sigma), 0.5 μmol/L IBMX (1-methyl-3-isobutylxanthine) (Sigma), 및 50 μg/mL 인도메타신 (Sigma)로 보충된 DMEM-고 글루코스로 이루어진 지방세포분화 배지에서 배양하였다. 배양물은 4 일 동안 37°C 및 50 mL/L CO₂ 에서 배양 하였다. 세포를 실온에서 10 분 동안 10 % 포르말린 (시그마)를 이용하여 고정하고, 10 분 동안 오일-레드-O로 염색 하였다.

실시예 1.4 - 신경인성 발기부전 동물 유도 및 치료

12 주령 C57BL/6J 마우스를 본 발명에서 이용하였다. 실험은 본 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다. 마우스를 4 그룹으로 나누었다: 위수술 그룹, PBS (20 μL) 또는 cBMSCs (3 × 10⁵ cells in 20 μL of PBS)를 단일 IC (intracavernous) 주입 처리한 양측 CNI 그룹, 및 클로날 BMSCs (3 × 10⁵ cells/20 μL of PBS)를 단일 IP (intraperitoneal) 주입처리한 양측 CNI 그룹.

위수술 그룹은 직접적인 해면 신경의 조작없이 양측 해면 신경의 시각화가 가능하도록 전립선의 노출을 시술받았다. CNI 그룹에서는, 톱니가 아닌 지혈기(Karl Stortz Co., Tuttlingen, Germany)를 이용하여 해면 신경을 손상시켰다. 지혈기는 2 분 동안 신경절로부터 1mm 위치의 각 해면 신경에 완전 말단 클로져 (full tip closure)에 적용되었다. CNI 후, 음경을 멸균 기법을 사용하여 노출시켰다. 30-게이지 주사기를 이용하여 해면체의 중앙 부분에 클로날 BMSCs투여하였다 절개는 6-O Vicryl (polyglactin 910) 봉합사를 사용하여 폐쇄하였다. 모든 절차는 해부 현미경 (Zeiss, Gottingen, Germany)의 도움으로 수행 하였다. 본 발명자는 음경을 조직학적 검사를 위해 회수한 후 CNI 및 치료 2 주 후, 해면 신경의 전기 자극을 통하여 의해 발기 기능을 평가 하였다 (그룹 당 N = 6).

실시예 1.5 - 발기 기능 측정

전술 한 바와 같이 발기 기능을 해면 신경의 전기 자극을 통하여 측정하였다.

실시예 1.6 - 조직학적 검사

파라핀 내장 전, 각 음경 조각의 중간 부분은 회수한 즉시 PBS중 10 % 포르말린에 고정시켰다. 시편을 4-μm의 절편으로 잘라 Masson trichrome을 사용하여 염색하였다.

형광 현미경 관찰을 위하여, 음경 조직을 24시간 동안 4 ℃에서 4% 파라포름알데히드에 고정한 뒤, 동결된 조직 절편 (12 ㎛의 두께)를 PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule, 내피세포마커; Chemicon, Temecula, CA, USA; 1:50), 포스포히스톤 H3 (Upstate, Temecula, CA, USA; 1:50)에 대한 항체, 평활근 α-액틴에 대한 FITC-결합된 항체 (평활근 세포 마커, Sigma; 1:200), nNOS (neuronal nitric oxide synthase) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1:100), 또는 신경미세섬유 (축색돌기 마커; Sigma-Aldrich; 1:100)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 대조구 절편은 일차 항체 없이 배양하였다. PBS로 수회 세척 후, 절편을 실온에서 2 시간 동안 tetramethyl rhodamine isothiocyanate- 또는 FITC-결합된 이차 항체와 함께 배양하였다. 샘플을 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA, USA)를 포함하는 용액 내로 축적하여 핵염색을 하였다. 신호를 시각화하였으며, 디지털 영상을 공초점 현미경 (FV1000, Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 수득하였다.

해면의 내피 세포, 평활근 세포, 콜라겐 함유량을 정량적 화상 분석 시스템 ((National Institutes of Health [NIH] Image J 1.34, http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)을 이용하여 분석하였다. 또한, 해면체 조직에서 평활근 콜라겐의 비율에 의해 결정되는, 해면 섬유증의 정도를 평가 하였다. 포스포히스톤 H3-면역양성 내피 세포의 개수는 6 또는 8 개의 다른 위치에서 × 400의 화면 배율로 계수하였다. 값은 고전력 필드마다 표시하였다.

실시예 1.7 - 통계 분석

결과는 평균 ± 표준 오차로 나타내었다. 매개변수 (parametric) 데이터의 그룹 비교는 Newman-Keuls post hoc test에 따라서, 일원 변량 분석에 의해 이루어졌다. 본 발명자는 Kruskal-Wallis test를 사용하여 비모수 데이터를 수득하였다. SigmaStat 3.5 software (Systat Software Inc., Richmond, CA)를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. P가 5 % 미만인 경우, 유의적인 것으로 판단하였다.

실시예 2- 신경인성 발기부전 치료효과 확인 결과

실시예 2.1 - 클로날 BMSCs의 분리 및 특성

매우 균일한 중간엽 줄기 세포를 얻기 위하여, 종래 기술된 바와 같이 본 발명자는 C3H 마우스의 골수천자액으로부터 클로날 BMSCs을 분리하였다. 본 연구에 사용된 세포는 종래의 2 차원 세포 배양 (도 2A)에서 전형적인 섬유 모세포 형태를 보였다. 분리된 세포가 중간엽 줄기 세포인지 확인하기 위해, 분화 잠재력 및 세포 표면 마커의 발현을 조사 하였다. 세포는 뛰어난 다중계통(multilineage) 분화 잠재력을 보였다. 지방세포, 조골 세포, 또는 연골세포 배지를 사용하여 in vitro 세포를 유도도하였을 때, 세포들은 전형적인 지방세포 (오일 레드 O 염색), 조골세포 (알리자린 레드 S 염색) 및 조골 세포 (사프라닌 O 염색)의 표현형을 나타내었다 (도 2B). MSC 세포 표면 마커의 발현을 분석하기 위하여, 여러 항체를 이용한 유동 세포 계측법을 사용하였다. 세포는 알려진 MSC 마커 CD44 및 Sca-1을 발현하였으나, 조혈 및 내피 세포 마커 CD34, CD45, 및 MHC Class II는 발현하지 않았다 (도 2C). 클로날 BMSCs의 면역 억제 가능성을 시험하기 위해, 혼합 림프구 반응 분석을 실시 하였다. T 세포 증식의 억제는 클로날 BMSCs의 존재하에 항체-활성화된 비장세포 (splenocyte)를 이용하여 측정 하였다. 도 2D에 나타난 바와 같이, 클로날 BMSCs가 BMSCs대 비장세포 (splenocyte)가 1:100의 비율인 경우에도 T-세포 억제 잠재력을 나타내었다. 이러한 결과는 마우스 BM로부터 분리된 클로날 BMSCs가 MSC 특성을 가지고 있음을 보여 주었다.

실시예 2.2 - CNI 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식의 발기 기능 복원 확인

치료 2주 후, 위 대조군 또는 CNI 마우스에서, 1분간 해면 신경을 자극 (5 V, 12 Hz, 1 ms)한 후, 해면정맥내 (intracavernous) 추적을 수행하였으며, 그 결과를 도 3A에 나타내었다.

MSBP (mean systolic blood pressure)에 대한 최대 ICP (intracavernous pressure) 및 총 ICP는 위대조군에 비하여 PBS-처리 CNI 마우스에서 유의적으로 낮게 나타났다.

클로날 BMSCs의 단일 IC 주입은 PBS-처리 CNI 마우스에 비하여 발기능력의 회복을 유도하였으며, 이는 위대조군 값의 90 내지 100%에 이른 반면, 클로날 BMSCs의 단일 IP 주입은 발기능력은 부분적으로 회복시켰다 (도 3B및 3C). 4개의 실험군 간에 전신혈압의 검출 가능한 차이는 관찰되지 않았다.

실시예 2.3 - CNI 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식의 내피 세포 증식 유도를 통한 해면 내피 함량의 증가

PECAM-1에 대한 항체를 이용한 해면 조직의 면역 조직 화학 염색을 치료 2주 후의 위대조군 및 CNI 마우스에 대하여 수행하였다. 위 대조군 마우스보다 PBS-처리된 CNI 마우스에서 유의적으로 낮은 해면 내피 세포 함량이 관찰되었다. 클로날 BMSCs의 IC 및 IP 주사 모두는 해면 내피 함량을 유의적으로 복원하였다 (도 4A 및 4C). 클로날 BMSCs가 내피세포 증식을 통하여 해면 내피 함량 증가를 유도하는지 여부를 조사하기 위하여, 포스포히스톤 H3(세포 증식을 나타내는 핵단백질)에 양성인 내피세포 수를 결정하기 위하여 면역 염색을 이용하였다. 위대조군 또는 PBS 처리 CNI 마우스에 비하여, 클로날 BMSCs를 IC 또는 IP 주입한 CNI 마우스가 해면 동양혈관 (cavernous sinusoids)에서 유의적으로 많은 포스포히스톤 H3-양성 내피세포를 나타내었다. 대조적으로, 위대조군 또는 PBS-처리 CNI 마우스에서는 포스포히스톤 H3-양성 내피세포가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다 (도 4B 및 4D).

실시예 2.4- CNI 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 평활근 함량의 증가

치료 2 주 후 위대조군 및 CNI 마우스에서, 평활근 α-액틴에 대한 항체를 이용하여 해면체 조직의 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 위대조군 바우스에 비하여 PBS-처리 CNI 마우스에서 유의적으로 낮은 해면 평활근 세포 함량을 관찰 하였다. CNI 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 및 IP 주입은 모두 해면 평활근 함량을 회복시켰다 (도 5). 또한, Masson trichrome 염색을 이용하여 해면 콜라겐 함량을 결정하였다. 4개의 실험군간에 검출 가능한 해면 콜라겐 함량의 차이가 관찰되지 않았다 (도 6). 해면체에서, 평활근 함량에 대한 콜라겐의 비율을 기초로 결정되는 해면체 섬유증의 정도는 위 대조군에 비하여 PBS-처리 CNI 마우스에서 유의적으로 높았다. 클로날 BMSCs의 IC 및 IP 주입은 모두 CNI 마우스에서의 해면체 섬유증을 유의적으로 감소시켰다.

실시예 2.5 - CNI 쥐에서 클로날 BMSCs 이식을 통한 음경 nNO 및 신경미세섬유 함량의 증가

해면체 조직 또는 척수 신경 다발에 nNOS 및 신경미세섬유의 발현은, 위대조군에 비하여 PBS-처리 CNI 군에서 유의하게 낮았다. CNI 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 주입은 신경미세섬유 및 nNOS함량을 유의적으로 회복시켰다. nNO 및 신경미세섬유 함량의 발현은 클로날 BMSCs의 IP 주입 후에 증가하였으나, IC 주사군의 수준에는 도달하지 않았다 (도 7).

실시예 3- 혈관인성 발기부전 치료효과 확인 방법

실시예 3.1 - 동물모델 유도 및 치료

16 주령 C57BL/6J 마우스를 본 발명에서 이용하였다. 실험은 본 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다. 마우스를 4 그룹으로 나누었다: 정상대조군, 당뇨군, PBS (20 μL) 또는 cBMSCs (3 × 10⁵ cells in 20 μL of PBS)를 단일 IC (intracavernous) 주입 처리한 당뇨군. PBS 또는 클로날 BMSCs는 30-게이지 주사기를 이용하여 해면체의 중앙 부분에 투여하였다.

고혈당 당뇨군은 8 주령 C57BL/6J 마우스를 대상으로 스트렙토조토신(streptozotocin, Sigma, USA)을 PBS에 녹여 마우스 한 마리당 50 mg/Kg (body weight) 농도로 연속 5일 복강 내 주사하여 당뇨를 유도하였다. 스트렙토조토신 마지막 주사일로부터 8 주 후 혈당을 측정해 식전 혈당 250 mg/dL 이상, 식후혈당 500 mg/dL 이상의 마우스만을 선별하여 본 발명에 이용하였다.

실시예 3.2 - 발기 기능 측정

실시예 3.3 - 조직학적 검사

파라핀 내장 전, 각 음경 조각의 중간 부분은 회수한 즉시 10 % 포르말린에 고정시켰다. 시편을 4-μm의 절편으로 잘라 Masson trichrome을 사용하여 염색하였다.

형광 현미경 관찰을 위하여, 음경 조직을 24시간 동안 4 ℃에서 4% 파라포름알데히드에 고정한 뒤, 동결된 조직 절편 (12 ㎛의 두께)을 PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule, 내피세포마커; Chemicon, Temecula, CA, USA; 1:50), Phospho-eNOS (phosphorylated endothelial nitric oxide synthase, 인산화된 내피세포유래 산화질소 합성효소, Cell Signaling Beverly, MA, USA; 1:25), 평활근 α-액틴에 대한 FITC-결합된 항체 (평활근 세포 마커, Sigma; 1:200), nNOS (neuronal nitric oxide synthase, 신경세포유래 산화질소 합성효소, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1:100), 또는 신경미세섬유 (neurofilament, 축색돌기 마커; Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA; 1:100)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 대조군 절편은 일차 항체 없이 배양하였다. PBS로 수회 세척 후, 절편을 실온에서 2 시간 동안 tetramethyl rhodamine isothiocyanate- 또는 FITC-결합된 이차 항체와 함께 배양하였다. 샘플을 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA, USA)를 포함하는 용액 내로 축적하여 핵염색을 하였다. 신호를 시각화하였으며, 디지털 영상을 공초점 현미경 (FV1000, Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 수득하였다.

해면의 내피 세포, 평활근 세포, 콜라겐 함유량을 정량적 화상 분석 시스템 (National Institutes of Health [NIH] Image J 1.34, http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)을 이용하여 분석하였다. 또한, 해면체 조직에서 평활근 콜라겐의 비율에 의해 결정되는, 해면 섬유증의 정도를 평가 하였다.

실시예 3.4 - 단백질 항원-항체 면역 반응 (Western blotting method)

각 음경 조각의 중간 부분은 회수한 즉시 액체질소에 급속 동결한다. 급속 동결한 조직을 곱게 갈아 RIPA buffer와 phosphate inhibitor cocktail 혼합액을 이용해 단백질을 추출한다. SDS-PAGE 전기영동을 이용해 단백질을 크기 별로 분리한 후 나이트로셀룰로우즈에 이동시켜 항원-항체 면역반응을 시킨다. Phospho-eNOS (Cell Signaling; 1:300), eNOS (Transduction Laboratories Inc., Lexington, KY, USA; 1:300), β-actin (Abcam, Cambridge, U.K.; 1:6000) 1차 항체를 나이트로셀룰로우즈에 있는 항원에 반응시키기 위해 밤샘 배양을 하였다. PBS 완충액으로 3회 세척 후 2차 항체를 상온에서 2시간 배양하고 다시 PBS 완충액으로 3회 세척한다. 항원-항체 면역반응을 마친 나이트로셀룰로우즈를 ECL 용액과 반응시켜 결과를 수득하였다.

실시예 3.5 - 통계 분석

실시예 4 - 혈관인성 발기부전 치료효과 확인 결과

실시예 4.1 - 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식의 발기 기능 복원 확인

치료 2주 후, 정상대조군 또는 당뇨 마우스에서, 1분간 해면 신경을 자극 (5 V, 12 Hz, 1 ms)한 후, 해면정맥내 음경압력 (intracavernous pressure)을 측정하였으며, 그 결과를 도 8A에 나타내었다.

MSBP (mean systolic blood pressure)에 대한 최대 ICP (intracavernous pressure) 및 총 ICP의 비는 정상대조군에 비하여 당뇨군, PBS-처리 당뇨군에서 유의적으로 낮게 나타났다. 클로날 BMSCs의 단일 IC 주입은 당뇨군, PBS-처리 당뇨군에 비하여 발기능력의 회복을 유도하였으며, 이는 정상대조군 값의 80 내지 100%에 이르는 회복을 보였다. (도 8B및 8C). 4개의 실험군 간에 전신혈압의 검출 가능한 차이는 관찰되지 않았다.

실시예 4.2 - 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 해면 내피 세포 및 평활근 세포 함량의 증가

PECAM-1에 대한 항체를 이용한 해면 조직의 면역 조직 화학 염색을 치료 2주 후의 정상대조군 및 당뇨 마우스에 대하여 수행하였다. 정상 대조군 마우스보다 당뇨군, PBS-처리된 당뇨 마우스에서 유의적으로 낮은 해면 내피 세포 함량이 관찰되었다. 클로날 BMSCs의 IC 주사는 해면 내피 세포 함량을 유의적으로 복원하였다 (도 9A 및 9B).

치료 2 주 후 정상대조군 및 당뇨 마우스에서, 평활근 α-액틴에 대한 항체를 이용하여 해면체 조직의 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 정상대조군 마우스에 비하여 당뇨군, PBS-처리 당뇨 마우스에서 유의적으로 낮은 해면 평활근 세포 함량을 관찰 하였다. 당뇨 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 주입은 해면 평활근 함량을 회복시켰다 (도 9A 및 9C).

실시예 4.3 - 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 내피세포유래 산화질소 합성효소의 인산화 유도

Phosphorylated-eNOS에 대한 항체를 이용한 해면 조직의 면역 조직 화학 염색과 단백질 항원-항체 면역 반응(Western blotting method)을 치료 2 주 후의 정상 대조군 및 당뇨 마우스에 대하여 수행하였다. 정상 대조군 마우스보다 당뇨군, PBS-처리된 당뇨 마우스에서 유의적으로 낮은 내피세포유래 산화 질소 합성효소의 인산화가 나타났고, 클로날 BMSCs의 IC 주사는 내피세포유래 산화 질소 합성효소의 인산화가 정상대조군 수준으로 회복되었다 (도 10).

실시예 4.4 - 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 해면 섬유화의 억제

치료 2 주 후 정상대조군 및 당뇨 마우스에서, Masson trichrome 염색을 이용하여 해면평활근 및 콜라겐 함량을 측정하였다. 해면 섬유화 정도, 즉 해면 콜라겐/평활근 비는 정상대조군 마우스에 비하여 당뇨군, PBS-처리 당뇨 마우스에서 유의하게 높았다. 당뇨 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 주입은 해면 섬유화를 억제하였다 (도 11). 4개의 실험군간에 검출 가능한 해면 콜라겐 함량의 차이는 관찰되지 않았다 (도 11).

실시예 4.5 - 당뇨성 발기부전 마우스에서, 클로날 BMSCs 이식을 통한 음경 nNOS 및 신경미세섬유 함량의 증가

음경 신경 다발에 nNOS 및 신경미세섬유의 발현은, 정상대조군에 비하여 당뇨군, PBS-처리 당뇨 마우스에서 유의하게 낮았다. 당뇨 마우스에서 클로날 BMSCs의 IC 주입은 신경미세섬유 및 nNOS함량을 유의적으로 회복시켰다 (도 12).

당업계의 숙련자에게는, 통상의 실험을 사용하면 본원에 특별히 기재된 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 등가 형태를 인식할 것이며 또는 확인할 수 있다. 이러한 등가형태는 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 것이다.

Claims

(i) 더 밀도가 높은 세포는 바닥에, 비교적 밀도가 낮은 세포는 상층액에 존재하도록, 세포 샘플을 원심분리 없이 제 1 용기에 위치시키는 단계;
(ii) 제 1 용기에서 밀도가 낮은 세포를 포함하는 상층액을 제 2용기에 옮기는 단계;
(iii) 더 밀도가 높은 세포는 바닥에, 비교적 밀도가 낮은 세포는 상층액에 존재하도록, 상층액에 존재하는 세포를 위치시키는 단계;
(iv) (ii) 및 (iii) 단계를 3회 이상 반복하는 단계;
(v) 상층액으로부터 다중계통 (multi-lineage) 줄기세포 또는 전구세포의 단일 콜로니를 분리하는 단계;
(vi) 콜로니로부터 성장 배지로 세포를 옮기고 세포를 배양하는 단계;
(vii) 세포를 4 내지 14 계대로 확장시키는 단계; 및
(viii) 다중계통 줄기세포 또는 전구세포의 뱅크 (bank)를 수득하는 단계; 를 포함하는 층분리 배양법 (subfractionation culturing method)을 통하여 수득한 골수 유래 클로날 중간엽 줄기세포 계통을 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 발기부전은 동맥성, 정맥성, 호르몬성 또는 신경인성인 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 발기부전은 해면 신경 손상 또는 당뇨에 의하여 야기된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물을 해면정맥내 (intracavernous) 투여되는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 복강내 (intraperitoneal) 투여되는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 해면 콜라겐 함량에는 영향을 주지 않는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 음경의 해면 평활근의 함량을 증가시키는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 음경의 nNOS 및 신경미세섬유의 함량을 증가시키는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 (vii)단계의 세포는 4 내지 6 계대로 확장된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 세포는 4 내지 6 계대 후 동결한 세포인 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 동결은 -110 ℃ 내지 -150 ℃ 또는 액화질소에서 동결된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 세포는 신선한 세포를 수득하기 위하여 세포를 해동하고 확장시키는 것을 더 포함하는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 (vii)단계의 세포는 8 내지 10 계대로 확장된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 세포는 8 내지 10 계대 후 세포를 동결시킨 것을 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 15에 있어서, 상기 동결은 -110 ℃ 내지 -150 ℃ 또는 액화질소에서 동결된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 15에 있어서, 상기 세포는 신선한 세포를 수득하기 위하여 세포를 해동하고 확장시키는 것을 더 포함하는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 (vii)단계의 세포는 11 내지 14 계대로 확장된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 18에 있어서, 상기 세포는 11 내지 14 계대 후 세포를 동결시킨 것을 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 19에 있어서, 상기 동결은 -110 ℃ 내지 -150 ℃ 또는 액화질소에서 동결된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 18에 있어서, 상기 세포는 신선한 세포를 수득하기 위하여 세포를 해동하고 확장시키는 것을 더 포함하는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 용기는 평평한 바닥을 갖는 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서 상기 용기는 세포 접착제인 하전된 아미노산의 중합체로 코팅된 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 24에 있어서, 상기 세포 접착제는 콜라겐, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트, 폴리글루타메이트 또는 이들의 조합인 것인, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.