KR20210008339A - 지방 유래 줄기 세포를 확장시키는 방법 - Google Patents

지방 유래 줄기 세포를 확장시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 및 적어도 하나의 아폽토시스 저해제와 함께 신체 조직으로부터 분리된 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포(MSC), 특히 지방 유래 줄기 세포를 전파시키는 방법에 관한 것이다. 상기 세포는 필요로 하는 대상체 내로의 이식에 사용될 수 있거나, 또는 이식에 사용될 수 있는 다양한 세포 유형으로 분화되도록 유도될 수 있다.

Description

지방 유래 줄기 세포를 확장시키는 방법
본 발명은 세포 이식 분야에 관한 것으로, 특히 본 발명은 시험관내에서 지방 유래 줄기 세포를 전파시키는 방법을 제공한다.
현재 개시된 주제에 대한 배경으로 관련이 있는 것으로 간주되는 참조문헌은 이하에 나열된다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본 명세서에서 상기 참조문헌에 대한 언급은 이 문헌들이 현재 개시된 주제의 특허가능성과 어떤 식으로든 관련이 있음을 의미하는 것으로 추론되어서는 안된다.
배경
종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 계열의 구성원인 Fas 리간드(Fas-L)는 림프구, 자연 살해(NK) 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포의 표면에서 발현되는 II형 막횡단 단백질(transmembrane protein)이다. 수용체(CD95 또는 Fas 수용체 (FasR))에 결합 시, Fas-L은 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. Fas-L은 수용체에 결합하고 카스파제(caspase)를 활성화시켜 아폽토시스를 촉진하는 사멸 리간드로 오랫동안 간주되어 왔다. 그러나, 축적된 데이터는 지금 Fas가 다양한 생리적 및 질병 상태에 광범위한 영향을 미칠 수 있는 다양한 비-아폽토시스 신호를 전달할 수 있음을 암시한다[1]. Fas-L은 면역계 항상성 유지에 관련이 있으며, 자가면역에 대한 보호자인 것으로 암시되었다. 그러나, 염증, 증식, 재생 및 암 진행과 같은 추가 세포 반응의 개시에 Fas-L 신호전달(signalling)의 관여를 입증하는 증거가 증가하고 있다. 다양한 세포 및 조직에서 CD95(FasR)의 비교적 편재적인 발현은 이러한 새로운 사고 방향을 확인시켜준다.
중간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cell: MSC)는 대부분의 성인 체조직에서 생성될 수 있는 다능성 세포이다. MSC는 플라스틱에 대한 접착성, 배양물에서 뼈, 지방 및 연골로의 분화 능력 및 일련의 뚜렷한 표면 마커의 발현을 특징으로 한다. 다양한 재생 및 면역억제 임상 적응증에 대한 MSC의 사용이 제안되었으며, 그 효능이 현재 수많은 임상 시험에서 평가되고 있다. 상당한 잠재력에도 불구하고, 일상적인 임상 진료에 MSC 사용의 전환은 부분적으로 투여 후 장기 생존율이 낮기 때문에 현재까지 달성되지 않았다.
낮은 Fas-리간드(FasL) 수준은 인간 골수에서 유래한 MSC의 증식을 촉진하고 높은 수준은 지방세포로의 분화를 저해한다[2]. MSC는 염증이 생기고 손상된 부위로 이동하는 것으로 알려져 있고 CD95를 발현하는 것으로 알려져 있기 때문에 Fas-L-유도 아폽토시스는 생체내 급속한 사멸에서 주요 역할을 할 수 있다는 것은 이미 제안되었다[3]. 이 개념은 배양된 골수(BM)[4-6] 및 태아 혈액[7] MSC에서 관찰되는 높은 Fas-L-의존적 아폽토시스율에 의해 더욱 뒷받침된다.
지방 유래 줄기 세포(adipose-derived stem cell: ASC)는 피하 지방의 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction, SVF)에서 유래된 MSC이다. 상기 세포는 골수(BM) MSC에 대해 기술된 모든 특성과 대부분의 재생 및 면역억제 성질을 공유하는 것으로 밝혀져 있지만[8], 조직 특이적 특성도 나타낸다[9 내지 11]. 새로 분리된 SVF는 수확 직후 재생 및 면역억제 목적을 위해, 수술장 내에서 사용되는 배양된 ASC의 대안으로서 최근 제안되었다. 중요하게도, 세포 요법을 위한 새로 분리된 자가 SVF의 사용은 배양된 ASC에 비해 치료 비용 및 시간과 규제 부담을 크게 줄일 것이다[12, 13]. SVF 이식의 치료 효능은 다양한 임상전 질병 모델에서 확립되었으며 다양한 임상 적응증에 대한 사용이 현재 임상 시험에서 평가되고 있다[13].
WO 2007/138597[14]은 세포 집단을 프로아폽토시스제(proapoptotic agent)와 접촉시켜 골수에서 분리된 세포의 불균질 집단으로부터 줄기 세포를 선택하는 방법에 관한 것이다.
WO 2017/051421[15]은 아폽토시스 유도제를 포함하는 성장 배지에서 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함하는 조직 또는 기관으로부터 얻은 분리된 세포를 인큐베이션하는(incubating) 것을 포함하는, 상기 MSC, 특히 지방 유래 줄기 세포를 전파시키는 방법을 개시한다.
제1 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 중간엽 줄기 세포(MSC)를 전파시키는 방법으로서,
(a) 신체 조직 또는 기관으로부터 세포를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 분리된 세포를
(i) 적어도 하나의 TNF 상과 리간드(superfamily ligand), 및
(ii) 적어도 하나의 아폽토시스 저해제(apoptosis inhibitory agent)
를 포함하는 성장 배지에서 인큐베이션함으로써, MSC가 농축된 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 지방 유래 줄기 세포 (ASC)를 확장(expanding)시키는 방법으로서,
(a) 지방흡입 흡인물(liposuction aspirate)로부터 기질 혈관 분획(SVF) 세포를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 분리된 세포를
(i) 적어도 하나의 TNF 상과 리간드, 및
(ii) 적어도 하나의 아폽토시스 저해제
를 포함하는 성장 배지에서 인큐베이션함으로써, ASC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 단계 (b) 전에 상기 SVF 세포는 적어도 2회의 계대배양 동안 배양물에서 유지된다.
일부 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드는 Fas-리간드(FasL), 종양 괴사 인자(TNF) α, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand: TRAIL), 종양 괴사 인자-유사 아폽토시스의 약한 유도제(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis: TWEAK), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 특정 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드는 FasL이다.
일부 실시형태에서, 상기 성장 배지는 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 활성제를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 적어도 1시간 동안이다.
일부 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 약 1시간, 2시간, 3시간 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 20 또는 23일 동안이다.
일 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 2시간 동안이다.
일 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 4일 동안이다.
일 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 14일 동안이다.
일 실시형태에서, 상기 배지는 3일마다 또는 4일마다 새로 공급된다.
일 실시형태에서, 상기 아폽토시스 저해제는 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 전에, 함께 또는 후에 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 아폽토시스 저해제는 카스파제 저해제, 세린 프로테아제 저해제(예컨대, HTRA2), 아폽토시스 단백질 저해제(IAP)(예컨대, XAF1), NF-카파 B 저해제, Smac 저해제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 특정 실시형태에서, 상기 카스파제 저해제는 Z-VAD-fmk이다.
일부 실시형태에서, 상기 아폽토시스 저해제의 양은 약 1μM 내지 약 50μM의 범위, 또는 약 5μM 내지 약 25μM의 범위이다.
일부 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드의 농도는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖ 범위이다.
일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제와 함께 인큐베이션된 후, 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제는 제거되고 상기 세포는 분화되도록 한다.
일 실시형태에서, 상기 세포는 지방세포, 연골세포 또는 골세포로 분화되도록 한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 상기 분화된 또는 미분화된 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 이식하는 것을 더 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 세포는 지방 조직, 뼈 조직, 근육, 결합 조직 또는 연골로 분화한다.
일 실시형태에서, 상기 세포는 지방 조직으로 분화되고 상기 환자는 유방 복원을 필요로 한다.
일 실시형태에서, 상기 세포는 뼈 조직으로 분화되고 상기 환자는 정형외과 적 손상, 뼈 재건 또는 뼈 복구의 치료를 필요로 한다.
일 실시형태에서, 상기 세포는 연골 조직으로 분화되고 상기 환자는 연골세포 이식, 반월상연골, 회전근개 또는 관절 연골 복구의 치료를 필요로 한다.
일 실시형태에서, 상기 환자는 미용 시술을 필요로 한다.
일 실시형태에서, 상기 분화된 세포의 이식은 피부학적 병태의 치료를 위한 것이다.
일 실시형태에서, 상기 분화된 세포의 이식은 환자의 면역 관련 질환을 완화 또는 치료하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 상기 환자는 기관 또는 조직 이식을 받는다.
일 실시형태에서, 상기 기관 이식은 골수, 간, 신장, 혈관 또는 심장 이식으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 분화된 세포의 이식은 환자의 심장 장애를 치료하기위한 것이다.
일 실시형태에서, 상기 심장 장애는 뇌졸중, 협심증 및 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 분화된 세포의 이식은 크론병 환자의 항문 또는 항문 주위 누공을 치료하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 상기 분화된 세포의 이식은 혈관 복구를 위한 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 동종 또는 자가이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지, TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제를 포함하는 지방 줄기 세포(ASC) 성장 배지 또는 중간엽 줄기 세포(MSC) 성장 배지를 제공한다.
일 실시형태에서, 상기 ASC 또는 MSC 성장 배지는 혈청 또는 혈청 치환물을 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 제조 물품을 제공한다:
a. 지방 줄기 세포 성장 배지 또는 중간엽 줄기 세포 성장 배지를 포함하되, 상기 성장 배지가 세포 배양 배지, TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제를 포함하는 용기; 및
b. 시험관내에서 지방 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 확장시키기 위한 성장 배지의 사용 지침서(instruction).
일 실시형태에서, 상기 성장 배지는 혈청 또는 혈청 치환물을 더 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻은 농축된 세포 집단을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 농축된 세포 집단은 이를 필요로 하는 환자로의 이식 절차에 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 개시된 주제를 더 잘 이해하고 실제로 수행할 수 있는 방식을 예시하기 위해, 이제 실시형태들이 첨부된 도면을 참조하여 비제한적인 예로서만 설명될 것이다:
도 1A는 표준 세포 계수치에 의해 계산된 SVF 세포수 변화 배수를 Fas-L 농도(ng/㎖)의 함수로서 나타낸 그래프이다. 도 1B는 표준 세포 계수치에 의해 계산된 서브-G1 변화 배율을 Fas-L 농도(ng/㎖)의 함수로서 나타낸 그래프이다. 도 1C 및 도 1D는 요오드화 프로피듐(PI) 세포 주기 유세포 분석에 의해 계산된, 대조용 SVF 세포(Fas-L 처리 없음)(1C) 및 50 ng/㎖ Fas-L로 처리된 세포(1D)에서의 서브-G1 비율을 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 제시된다. 도 1E 및 1F는 50 ng/㎖ Fas-L와 함께(1F) 또는 Fas-L 없이(대조군)(1E) 배양된 SVF 세포의 이미지를 나타낸다. 도 1G는 처리된 세포의 부유 세포(도 1F에서 화살표로 표시됨)를 아넥신/PI 유세포 분석한 그래픽 표현이다. 도 1H 및 도 1I는 항-CD95에 의해 염색된 대조군 세포(1H) 및 Fas-L 처리된 세포(도 1I)를 그래픽으로 표현한 것이다.
도 2는 정상적인 배양 조건(대조군) 하에(도 2A 내지 도 2C, 도 2G, 도 2I 및 도 2J) 또는 50 ng/㎖ Fas-L 사용 하에(도 2D 내지 도 2F, 도 2H, 도 2K 및 도 2L) 배양된 계대배양 (P)0(도 2A 내지 도 2H) 및 P1(도 2I 내지 도 2L)에서의 인간 SVF 세포 중의 다양한 표면 마커 발현을 그래픽으로 표현한 것이다. 상기 세포들은 유세포 분석에 의해 CD45, CD31, CD34, CD29, CD105 및 CD73의 표면 마커 발현에 대해 조사하였다. CD45 및 CD31에 대한 염색은 입도(측면 산란 SSC-A)와 상관지어 제시된다.
도 3A 및 도 3B는 지방으로 분화된 염색된 세포(A - FasL을 첨가하지 않은 대조군; B - FasL과 함께 배양된 세포)의 사진이다. 도 3C는 광학 밀도(OD)로 나타낸 염색 양을 나타낸 그래프이다. 도 3D 및 3E는 뼈로 분화된 염색된 세포(D - FasL을 첨가하지 않은 대조군; E - FasL과 함께 배양된 세포)의 사진이다. 도 3F는 광학 밀도(OD)로 나타낸 염색 양을 나타낸 그래프이다.
도 4A는 인간 SVF가 50 ng/㎖ Fas-L의 존재 또는 부재(대조군) 하에 배양된 배양 평판의 사진이다. 콜로니는 Giemsa에 의해 염색하였다. 도 4B는 예시적인 큰 콜로니 사진이다. 도 4C는 예시적인 작은 콜로니 사진이다. 도 4D는 총 콜로니 수를 나타낸 그래프이다. 도 4E는 Fas-L 처리된 세포와 미처리(대조군) 세포 간에 비교된 큰 콜로니 수(> 100개 세포)를 나타낸 그래프이다.
도 5A는 정상적인 배양 조건 하에 또는 증가하는 Fas-L 농도 하에 6일 동안 배양된 ASC(P3)의 세포수 변화 배수를 나타내는 그래프이다. 도 5B 내지 도 5D는 상기 세포들의 서브-G1 비율을 나타낸 그래프이다. 세포수는 표준 세포 계수치(5A) 및 요오드화 프로피듐(PI) 세포 주기 유세포 분석(5B 내지 5D)에 의해 조사하였다. 데이터(5B)는 평균 ± 표준 편차로 제시된다. 도 5E 내지 도 5J는 정상 배양 조건에서 또는 50 ng/㎖ 및 100 ng/㎖ Fas-L와 함께 배양된 P3 ASC에서 유세포 분석에 의해 조사된 CD29, CD105 및 CD73의 표면 마커 발현을 나타낸 그래프이다.
도 6A는 Fas-L, 카스파제 저해제 Z-VAD-fmk 또는 둘 모두에 의해 4일 동안 처리된 ASC에서의 서브-G1 비율(서브-G1 변화 배율)을 나타낸 그래프이다. 도 6B는 세포수 변화 배수를 나타낸 그래프이다. 도 6C 내지 도 6D는 또한 대조군(6C), Fas-L 처리된 세포(6D) 및 Fas-L + 저해제 처리된 세포(6E)에서 서브-G1 비율을 보여준다. 서브-G1 비율은 PI 세포 주기 유세포 분석에 의해 결정하였고 세포수는 표준 세포 계수치에 의해 결정하였다. 데이터(6A 내지 6B)는 평균 ± 표준 편차로 제시된다. 도 6F 내지 도 6I는 다른 조건 하의 ASC의 대표적인 이미지이다.
도 7A 내지 도 7C는 표시된 Fas-L, Z-VAD-fmk, LY294002(PI3K 저해제)(7A), AZD6244(ERK-1/2 저해제)(7B) 및 SP600125(JNK 저해제)(7C)의 조합에 의해 처리된 배양된 ASC의 세포수 변화 배수를 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 제시된다.
본 발명은 Fas-L 처리가 지방 유래 줄기 세포(ASC)의 동시적인 아폽토시스 및 증식을 촉진시켜 증가된 세포수율 및 표현형 변위(phenotypic shift)를 초래한다는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 상기 세포에 대한 Fas-L의 복합적인 효과에 대한 이해는 본 발명자들로 하여금 지방 유래 줄기 세포를 Fas-L 및 아폽토시스 저해 제제를 포함하는 제제의 조합에 노출시키는 것을 포함하는 지방 유래 줄기 세포를 확장시키는 새로운 방법을 조성하게끔 하였다.
이하 실시예에서 상세히 설명되는 바와 같이, 인간 ASC는 통상적인 지방흡입절차로부터 분리하였고 Fas-L 처리에 대한 반응성에 대해 조사하였다. ASC는 동시 아폽토시스 및 증식에 의해 Fas-L에 반응하였고, 이는 증가된 골 분화 잠재력과 관련된 CD105의 감소된 발현 및 CD73의 증가된 발현을 포함하는 표현형 변위 및 세포 양의 순 이배화를 초래하였다. 또한, 새로 분리된 ASC의 처리는 또한 초기 줄기 세포 전구 세포에 의해 생성된 것으로 보이는 큰 콜로니 형성 단위 섬유아세포(CFU-F)의 증가를 초래하였다.
흥미롭게도, Z-VAD-fmk에 의한 카스파제 저해는 증식에 영향을 미침이 없이 Fas-L 유도 아폽토시스를 약화시켰고, JNK가 아닌 PI3K 및 MEK의 저해는 Fas-L 의존적 증식을 약화시켰지만 아폽토시스는 약화시키지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 ASC에서 Fas-L 신호전달이, 유도된 아폽토시스와 증식 사이에 섬세한 균형을 통해서 ASC의 확장 및 표현형 변위를 초래한다는 것을 보여준다.
놀랍게도, 본 발명자들은 Fas-L 신호 전달이 새로 유도된 ASC 및 배양된 ASC 모두의 아폽토시스 및 증식을 동시에 활성화시키는 것을 발견하였다. 아폽토시스 유도에도 불구하고, Fas-L 신호전달은 ASC의 증가된 세포 확장(대략 이배화된 세포 양)을 초래하였고 MSC-특이적 마커 발현의 변화, 더 많은 양의 초기 CFU-F를 생산하는 능력 및 증가된 골 분화 잠재력에 입증되는 표현형 변위를 초래하였다. 추가 평가들은 아폽토시스성 및 증식성 Fas-L 신호가 상호연관되어 있지 않으며 아폽토시스 신호의 차단이 증식 신호에 전혀 영향을 미치지 않으며 그 반대도 마찬가지라는 것을 입증하였다. 증식 활성화는 PI3K 및 MEK 저해제 모두에 의해 약화되었으며, 이는 Fas-L 신호의 전달에 있어서 상기 경로들이 관여함을 시사한다. 재생 목적에 증가하는 SVF 세포 및 ASC 모두의 적용을 고려할 때, 아폽토시스 저해와 조합된 Fas-L 활성화의 사용은 세포수율을 높이고, 아마도 골 재생과 같은 특정 임상 적응증에 대한 세포 표현형도 증대시키기에 효율적인 도구로 작용할 수 있다. 종래 BM MSC의 Fas-L 처리 후에 보고된 격렬한 아폽토시스 반응 및 세포수율 저하를 감안할 때[2, 4-6], 증식 폭발에 의한 Fas-L 신호전달에 반응하는 ASC의 능력은 이 세포들의 전달 시, 특히 염증 부위에 일반적으로 농축된 Fas-L 제시 면역 세포에 노출되었을 때 임상적 이점으로 작용할 수 있다.
본 발명은 동시 아폽토시스 및 증식 활성으로 인한, Fas-L 신호전달 시의 SVF 유도 및 분리된 ASC 계수치의 전반적인 증가를 입증한다.
ASC에서 Fas 신호전달은 또한 CD105의 낮은 표면 발현(CD105-저) 및 CD73의 높은 표면 발현(CD73-고)을 갖는 세포의 퍼센트 증가에 의해 입증되는 표현형 변화를 초래하였다. CD105와 CD73은 모두 잘 확립된 MSC 마커이며, ASC 마커로도 특정되어 있다. Fas-L 처리는 미처리 대조군에 비해 CD105가 낮은 ASC의 증가 및 뼈 분화 잠재력의 개선을 모두 초래하였다.
Fas-L-유도된 아폽토시스 및/또는 증식을 촉진하는 신호전달 경로를 밝히기 위해, Fas-제어된 아폽토시스 및 비-아폽토시스 신호전달을 촉진하는 것으로 종래 입증된 다양한 경로의 저해제를 사용하였다. 중요하게도, 본 발명자들은 범-카스파제(pan-caspase) 저해제 Z-VAD-fmk에 의한 카스파제의 저해가 Fas-L-처리된 ASC에서 거의 완전한 아폽토시스 저해를 초래하였지만 증식에는 미미하거나 무시할 수 있는 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 이것은 ASC에서 Fas-L에 의해 야기된 비-아폽토시스 신호전달이 카스파제-독립적임을 강력하게 시사한다. 본 발명자들은 또한 ASC의 Fas-L-의존적 증식이 JNK 저해제가 아닌, ERK 및 PI3K 저해제에 의해 저해될 수 있다는 것도 발견하였다. 중요한 것은, 어떤 저해제도 ASC에서 Fas-L-의존적 아폽토시스를 유의적으로 제거하지 못했다. 따라서, Fas-L은 ASC의 아폽토시스 및 증식을 동시에 유도하지만, 각각의 기능적 결과를 촉진하는 신호전달은 Fas 수용체의 하류로 우회시키는 것처럼 보인다.
본 발명은 처음으로 Fas-L 신호전달이 새로 분리한 인간 ASC 및 배양된 인간 ASC의 아폽토시스 및 증식을 동시에 촉진하여 세포 확장의 총체적 증가 및 표현형 변화를 초래한다는 것을 입증한다. 재생 의학의 정황에서, Fas-L-농축 조건에서 생존하고 증식하는 능력은 생체내 임상 투여 후 SVF 세포 및 ASC의 생존에 도움을 줄 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 측면에서 하기 단계들을 포함하는 중간엽 줄기 세포(MSC)를 전파시키는 방법을 제공한다:
(a) 신체 조직 또는 기관으로부터 세포를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 분리된 세포를
(i) 적어도 하나의 TNF 상과 리간드, 및
(ii) 적어도 하나의 아폽토시스 저해제
를 포함하는 성장 배지에서 인큐베이션하여, MSC가 농축된 세포 집단을 수득하는 단계.
본 기술분야에 공지된 용어 "중간엽 줄기 세포"(MSC)는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 기질 세포에 관한 것이다. MSC는 최근 국제 세포 치료 학회(International Society of Cellular Therapy)에 의해 다음과 같은 특성을 가진 것으로 정의되었다: (1) 표준 배양 조건에서 유지될 때 플라스틱-접착성; (2) CD105, CD73 및 CD90의 발현, 및 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79α 또는 CD19 및 HLA-DR 표면 분자의 발현 부족(3). MSC는 시험관내에서 골아세포, 지방세포 및 연골아세포로 분화한다. 배양물에서 인간 중간엽 줄기 세포를 분리, 정제 및 확장시키는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 주로 골수로부터 중간엽 줄기 세포의 분리에 관한 미국 특허 제5,486,359호를 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신체 조직 또는 기관"은 지방 조직, 말초혈액, 골수, 치수, 양수, 양막, 융모막, 융모막 융모, 탈락막, 태반, 탯줄, 제대혈, 와튼 젤리(Wharton's jelly)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 중간엽 줄기 세포를 함유하는 대상체의 체내 임의의 조직 또는 기관에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 중간엽 줄기 세포는 지방 유래 줄기 세포이다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 지방 유래 줄기 세포(ASC)를 전파시키는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 얻은 지방흡입 흡인물로부터 기질 혈관 분획(SVF) 세포를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 분리된 세포를
(i) 적어도 하나의 TNF 상과 리간드, 및
(ii) 적어도 하나의 아폽토시스 저해제
를 포함하는 성장 배지에서 인큐베이션하여, ASC가 농축된 세포 집단을 수득하는 단계.
용어 "지방 유래 줄기 세포(ASC)" 및 "지방 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 지방 조직으로부터 분리된 MSC를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 "지방 조직"은 대부분 지방세포로 구성된 결합 조직을 의미한다. 지방세포 외에도 지방 조직은 지방전구세포, 섬유아세포, 혈관 내피 세포, 다양한 면역 세포, 예컨대, 지방 조직 대식세포, 줄기 세포 및 내피 전구 세포를 포함하는 세포의 기질 혈관 분획(SVF)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "기질 혈관 분획(SVF)"은 지방 조직 대식세포뿐만 아니라 지방전구세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 내피 전구 세포, T 세포, B 세포, 비만 세포의 풍부한 공급원인 지방 조직의 제조물에 관한 것이다.
지방흡입 흡인물로부터 지방-유래 줄기 세포 또는 SVF 세포를 분리하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Bunnell, B. A. et al.(2008) Methods 45(2): 115-120, Schreml et al. (2009) Cytotherapy 11 (7): 947-57, Yoshimura et al. (2006) J. of Cellular Physiology 208: 64-76). 예를 들어, 지방 조직은 흡입-보조 지방성형술, 초음파-보조 지방성형술 및 절제 지방절제술 또는 이들의 조합에 의해 환자로부터 제거될 수 있다. 조직 추출은 멸균 또는 무균 방식으로 수행되어야 한다.
흡입-보조 지방성형 절차를 위해, 지방 조직은 환자에 존재하는 지방 조직 저장소 내로 또는 그 부근으로 캐뉼라를 삽입한 다음, 지방 조직을 흡입 장치 내로 흡인시켜 수집한다. 주사기에 연결된 작은 캐뉼라는 비교적 적당한 양의 지방 조직(예컨대, 0.1㎖ 내지 수 백 밀리리터)을 수집하는데 적합할 수 있다. 더 많은 양의 조직이 필요한 경우에는 상기 절차에 더 큰 캐뉼라 및 자동 흡입 장치를 사용할 수 있다.
지방흡입 흡인물로부터 지방 유래 줄기 세포 또는 SVF 세포를 분리하기 위한 예시적인 프로토콜은 이하 실시예 섹션에 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "전파시키는"은 신체 조직 또는 기관, 예를 들어, 지방흡입 흡인물로부터 분리된 중간엽 줄기 세포의 수를 시험관내에서 확장(확장시키는), 증대(multiplication), 증식(proliferation) 또는 증가시키는 것에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "대상체"는 포유류 대상체, 특히 인간 대상체에 관한 것이다.
선택적으로, 상기 분리 단계 (a)는 조직을 분해시키는 단백질분해 효소(예컨대, 콜라게나제, 예를 들어 콜라게나제 I 형) 또는 단백질분해 효소의 혼합물에 대한 노출을 포함한다(콜라게나제 분해라고도 함). 세포의 콜라게나제 분해를 수행하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 콜라게나제 분해를 수행하기 위한 여러 화합물은 시판되고 있다(예컨대, Cytori Therapeutics의 Celase® GMP). 콜라게나제 I 형은 0.1% 내지 0.3% 사이의 범위로 첨가될 수 있다. 중성 프로테아제, 예컨대, Dispase II는 상기 분해 반응에 선택적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 이하 실시예에 제시된 바와 같이, 콜라게나제는 37℃에서 교반 하에 0.375 ㎎/㎖의 농도로 60분 동안 첨가될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "종양 괴사 인자(TNF) 상과 리간드"는 현재 TNF 상과에 속하는 것으로 인식되는 40개 초과의 상이한 리간드-수용체 시스템 계열을 의미한다. TNF 상과에 속하고 본 발명에 따라 사용될 수 있는 예시적인 리간드는 Fas-리간드(FasL), TNFα, Trail(Apo2 리간드) 및 Tweak(Apo3 리간드)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 TNF 상과 리간드는 세포 추출물로부터 생화학적으로 합성되거나 정제된 재조합 폴리펩타이드일 수 있다. 이들은 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 투여될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서 상기 TNF 상과 리간드는 FasL, TNFα, TRAIL, TWEAK 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서 상기 TNF 상과 리간드는 FasL이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 FasL의 비제한적인 예는 모두 FasL의 다량체인 superFasL, APO010 또는 MegaFasL(R&D)을 포함한다. Fc-FasL 또는 FasL 단량체와 같은 다른 형태의 FasL도 본 발명에 포함된다.
배지내 TNF 상과 리간드의 농도는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖ w/v 범위, 예를 들어 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 20 ng/㎖, 30 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖ w/v의 TNF 상과 리간드이다. 상기 TNF 상과 리간드가 FasL인 특정 실시형태에서, 상기 배지는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖ w/v FasL, 예를 들어 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 20 ng/㎖, 30 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖ w/v FasL을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 배지는 25 ng/㎖, 50 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖ FasL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 아폽토시스 저해제는 카스파제 저해제, 세린 프로테아제 저해제(예컨대, HTRA2), 아폽토시스 단백질 저해제(IAP)(예컨대, XAF1), NF-카파 B 저해제, Smac 저해제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 특정 실시형태에서, 상기 카스파제 저해제는 Z-VAD-fmk이다.
일부 실시형태에서, 상기 아폽토시스 저해제의 양은 약 1μM 내지 약 50μM의 범위, 또는 약 5μM 내지 약 25μM의 범위이다.
상기 제시된 바와 같이, 중간엽 줄기 세포(MSC) 또는 지방 유래 줄기 세포(ASC)를 전파시키는 방법은 분리된 세포를 TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제를 포함하는 성장 배지에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 본 기술분야에 공지된 바와 같이, 용어 "인큐베이션하는"은 세포 인큐베이터에서 적절한 온도 및 기체 혼합물(전형적으로, 포유류 세포의 경우 37℃, 5% CO2)에서 세포를 성장시키고 유지시키는 것을 의미한다. 본 발명의 정황에서 사용된 바와 같이, "TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제를 포함하는 성장 배지에서 상기 분리된 세포를 인큐베이션하는"은 상기 분리된 세포를 TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제와 접촉시키는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법은 TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제와의 인큐베이션이 적어도 1시간 동안인 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 약 1시간, 2시간, 3시간 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 20 또는 23일 동안이다.
일 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 2시간 동안이다.
일 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 4일 동안이다.
일 실시형태에서, 상기 인큐베이션은 14일 동안이다.
하나의 특정 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드는 FasL이고, 상기 아폽토시스 저해제는 Z-VAD-fmk이고, 상기 인큐베이션은 4일 동안이다.
일부 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제를 포함하는 상기 배지는 3일마다 또는 4일마다 새로 교환되고, 즉, 동일한 함량을 갖는 새 배지로 대체된다.
일부 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제와의 인큐베이션은 세포가 분리되고 1 내지 7일 후에 개시한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법은 단계 (a) 후 분리된 세포를 정상 성장 배지에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 배양한 다음, 상기 TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제와 함께 인큐베이션하는 것이다.
하나의 특정 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제와의 인큐베이션은 성숙 ASC, 즉, SVF 분리 후 2회 계대 또는 3회 계대 세포를 이용하여 수행한다.
일 실시형태에서, FasL과 인큐베이션하기 전에, 상기 분리된 세포는 예를 들어 Fas의 발현을 증가시킴으로써, FasL에 대한 세포 반응에 영향을 미칠 수 있는 분자(즉, 세포를 그 효과에 감작시키기 위해)와 예비인큐베이션된다. TNFα는 상기 감작 분자의 일례이다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법은 FasL 및 아폽토시스 저해제와 인큐베이션하기 전에, 상기 분리된 세포를 TNFα와 예비인큐베이션하는 것이다. 추가 특정 실시형태에서, TNFα와의 예비인큐베이션은 1 내지 4일 동안 수행한다.
특정 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제 외에도, 상기 세포는 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 활성제와 함께 인큐베이션된다. 구체적이고 비제한적인 예에서, 상기 세포는 사멸 수용체 3(DR3, TNFRSF25로도 알려짐)의 하나 이상의 길항제와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이러한 길항제는 예를 들어 abcam, R&D Systems 및 기타 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능한 항 DR3 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 MSC 또는 ASC가 농축된 세포 집단을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "농축된"은 세포 집단에서 MSC 또는 ASC의 상대적인 수를 상기 세포 집단의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100%로 향상, 증대 또는 증가시키는 것을 의미한다.
상기 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제와의 인큐베이션 기간이 완료되면 상기 전파된 세포는 배양물로부터 제거되고, 재접종되어, 이제 배양 조건에 따라 지방세포, 연골세포, 골세포, 섬유아세포 또는 근세포 중 어느 하나로 분화될 수 있다. 각각 원하는 세포 유형으로 분화시키기 위한 조건은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 특정 시약을 포함하는 배지에서 상기 세포의 인큐베이션을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법은 상기 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제와 함께 인큐베이션한 후, 상기 TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제는 제거하고 상기 세포가 분화되도록 하는 것이다. 다른 특정 실시형태에서, 상기 세포는 지방세포, 연골세포 또는 골세포로 분화되도록 하고, 본 명세서에서 "분화된 세포"로 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "분화되도록 하고"는 임의의 원하는 세포 유형으로 분화시키기에 적합한 조건 하에서 상기 세포를 인큐베이션하는 것에 관한 것이다. 이러한 조건은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 특히 전형적인 시약 세트를 포함하는 배지에서의 인큐베이션을 포함한다.
예를 들어, 중간엽 줄기 세포 지방생성 배지는 중간엽 줄기 세포를 지방생성 계통으로 쉽게 분화시키는 시약(즉, 덱사메타손, IBMX, 인슐린 및 인도메타신)을 포함한다. 이러한 배지는 상업적으로 입수 가능하고, 예컨대, Lonza의 hMSC Adipogenic Differentiation BulletKit™ Medium 또는 Stemcell Technologies의 MesenCult™ Adipogenic Differentiation Medium가 있다. 지방세포로의 분화는 그 다음 지방생성 분화의 양과 관련된 정량적 값을 제공하는 다양한 방법에 의해 검증될 수 있다. 다른 배지를 사용하여 다른 세포 유형으로의 분화를 유도할 수 있다(예컨대, 중간엽 줄기 세포 연골생성 분화 배지, 중간엽 줄기 세포 골형성 분화 배지 또는 중간엽 줄기 세포 신경생성 분화 배지(Promocell)). 전파된 ASC는 조혈을 지지하면서, 또한 자신 외에 다른 생식세포-기원의 세포, 예컨대, 심근형성, 내피(혈관), 췌장(내분비), 신경생성 및 간 트랜스-분화할 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법은 상기 분화된 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 이식하는 것을 더 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 전파된 미분화 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 이식하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이를 필요로 하는 환자"는 상기 분화된 세포를 이식함으로써 개선되거나, 치유되거나, 치료되거나, 또는 경감된 증상을 가질 수 있는 질환을 앓고 있는 대상체에 관한 것이다.
따라서, 상기 분화된 세포는 예를 들어 현재 III/IV상 임상 시험에 있는 하기 적응증에서와 같은 미용 응용예 및 성형 수술뿐만 아니라 과다한 임상 응용예에서 이식에 사용될 수 있다: 유방 재건(복원), 조기 난소 부전, 복합 항문주위 누공, 항문 누공 및 크론 병. 또한, ASC는 세포 뱅킹에도 사용될 수 있다. 추가 응용예에는 피부 재생, 피부학적 병태, 간 재생, 근육 재생, 혈관 복구, 정형외과적 손상 치료, 뼈 재건 또는 뼈 복구, 연골세포 이식, 반월상 연골 또는 관절 연골 복구 치료 및 골다공증 치료가 포함된다.
본 발명의 분화된 세포는 또한 면역억제를 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 분화된 세포는 뇌졸중 또는 심부전 치료에 사용될 수 있다.
상기 이식은 동종 또는 자가 이식일 수 있다.
본 명세서에 정의되는 용어 "이식"은 상기 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 수술 또는 주사에 의해 전달하는 것을 의미한다. 기증자와 수혜자는 단일 개체이거나 다른 개체들일 수 있다. 이러한 경우, 이식체는 각각 자가 또는 동종이다. 동종 이식이 시행될 때 이식체 거부 반응을 줄이기 위한 요법이 수행되어야 한다. 이러한 요법은 현재 인간 요법에서 실행되고 있고 본 기술분야에 잘 알려져 있다.
다음은 기관의 누락 또는 손상된 세포를 보충하기 위한 외부 세포 공급원으로서 사용되는 중간엽 기원 세포의 예이다: 미국 특허 제5,736,396호는 중간엽 조직 재생 또는 복구를 위해, 배양물-확장된 계통-유도된 중간엽 줄기 세포를 원 자가 숙주에 도입시키는 것을 기술한다.
미국 특허 제4,642,120호는 연골 및 뼈의 결함을 복구하기 위한 조성물을 제공한다. 이들은 젤 형태 그대로 제공되거나, 또는 자연 또는 인공 뼈에 매립된다.
세포의 이식은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하고 환자의 치료 적응증에 기초하여 의사의 재량에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 분화된 세포는 조직 결함 부위(예컨대, 골격 결함)에 주입되거나 생체적합성 스캐폴드 또는 매트릭스와 함께 시험관내에서 인큐베이션되고 결함 부위에 스캐폴드가 이식될 수 있다.
본 발명의 세포는 또한 유전자 요법에 사용될 수 있다. 성공적인 장기 유전자 요법을 위해, 원하는 이종 유전자를 안정적으로 발현하는 높은 빈도의 유전자 변형 세포가 필요로 된다. 따라서, 본 발명의 분화된 세포는 유전자 산물을 발현하도록 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 산물"은 단백질, 펩타이드 및 기능성 RNA 분자(즉, 폴리뉴클레오티드)를 의미한다. 이러한 유전자 산물의 예로는 인슐린, 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카복시펩티다아제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아클리글리세롤 리파아제, 엘라스타아제, 아밀라아제, 혈액 응고 인자, 예컨대, 혈액 응고 인자 VIII 및 인자 IX, UDP 글루쿠로닐 트랜스퍼라아제, 오르니틴 트랜스카바노일라아제, 및 사이토크롬 p450 효소, 혈청 아데노신의 처리 또는 저밀도 지단백질의 세포내이입을 위한 아데노신 데아미나아제, 혈청 흉선 인자, 흉선 체액 인자, 티모포이에틴, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 소마토스타틴, 세로토닌 및 물질 P를 포함한다.
다른 하나의 측면에서, 본 개시내용은 세포 배양 배지, 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 및 적어도 하나의 아폽토시스 저해제를 포함하는 지방 줄기 세포 (ASC) 성장 배지 또는 중간엽 줄기 세포(MSC) 성장 배지를 제공한다.
본 명세서에서 정의되는 "세포 배양 배지" 또는 "성장 배지"는 세포의 성장을 지지하도록 설계된 액체 또는 겔을 의미한다. 다양한 유형의 세포를 성장시키기 위해 다양한 유형의 배지가 사용된다. 세포 배양 배지의 예에는 둘베코의 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 및 이의 변형체, F10 영양소 혼합물(Nutrient Mixture), 햄의 F12 영양소 혼합물(Ham's F12 Nutrient Mixture), 최소 필수 배지(Minimum Essential Media: MEM), RPMI 배지 1640 및 이스코브의 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM)가 포함된다.
이들 배지는 모두 잘 알려져 있으며 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, DMEM은 일반적으로 아미노산, 무기 염, 글루코스, 페놀 레드, HEPES, 피루브산 나트륨 및 비타민을 포함한다. 상기 배지에는 종종 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B와 같은 항생제/항진균제가 보충된다. 상기 배지는 다양한 글루코스 함량을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 배지는 높은 글루코스 함량을 갖는 것으로서, 예컨대, Gibco의 고 글루코스 DMEM이다.
상기 세포 배양 배지는 혈청 또는 혈청 치환물을 더 포함할 수 있다.
본 개시내용의 정황에서 용어 "혈청" 또는 "혈청들"은 광범위한 거대분자, 지질 물질 및 미량 원소에 대한 담체 단백질, 부착 및 확산 인자, 저 분자량 영양소, 및 호르몬 및 성장 인자를 제공하는 세포 배양 배지에 첨가된 보충제를 의미한다. 전형적으로, 혈청들은 포유류 혈액 제조물로부터 분리된다. 본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 혈청의 비제한적인 예는 송아지 태아 혈청(FCS) 또는 소 태아 혈청(FBS)이다. 혈청 치환물도 사용될 수 있다. 용어 "혈청 치환물"은 배양물에서 세포 성장을 지지하는데 필요한 단백질을 함유하는 혈청 대체물에 관한 것으로, 예를 들어 혈청 치환물은 정제된, 바람직하게는 열 처리된 혈청 알부민, 트랜스페린 및 인슐린을 포함할 수 있다. 이러한 단백질은 임의의 기원일 수 있으며, 예를 들어 포유류 단백질, 예컨대, 소 혈청 알부민, 트랜스페린 및 인슐린일 수 있다. 이러한 혈청 치환물은 예를 들어 Sigma-Aldrich에서 상업적으로 입수 가능하다. 배지 내의 혈청 농도는 세포 성장에 일반적으로 사용되는 범위, 즉, 약 1% 내지 약 20% 사이이다. 특정 실시형태에서, 혈청의 농도는 약 10% 부피/부피이다. 추가 특정 실시형태에서, 상기 배지는 10% FCS 또는 FBS, 예컨대, Hyclone™의 태아 소 혈청을 포함한다.
MSC 성장 배지 또는 ASC 성장 배지의 정황에서 사용된 TNF 상과 리간드는 본 명세서에 정의된 바와 같고, 예컨대, FasL, TNFα, TRAIL(Apo2 리간드) 또는 TWEAK(Apo3 리간드)이다. 상기 배지 내의 TNF 상과 리간드의 농도는 약 0.1 ng/㎖ 및 약 100 ng/㎖ w/v 범위, 예를 들어 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 20 ng/㎖, 30 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖ w/v의 TNF 상과 리간드이다. 특정 실시형태에서, 상기 TNF 상과 리간드는 FasL이다. 추가 특정 실시형태에서, 상기 배지는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖ w/v FasL, 예를 들어 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 20 ng/㎖, 30 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖ 또는 100 ng/㎖ w/v FasL을 포함한다.
상기 MSC 성장 배지 또는 상기 ASC 성장 배지의 정황에서 사용된 아폽토시스 저해제는 카스파제 저해제, 세린 프로테아제 저해제(예컨대, HTRA2), 아폽토시스 단백질 저해제(IAP)(예컨대, XAF1), NF-카파 B 저해제, Smac 저해제 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 특정 실시형태에서, 상기 카스파제 저해제는 Z-VAD-fmk이다.
일부 실시형태에서, 상기 배지 중의 상기 아폽토시스 저해제의 농도는 약 1μM 내지 약 50μM의 범위, 또는 약 5μM 내지 약 25μM의 범위이다.
본 발명의 MSC 또는 ASC 성장 배지는 성장 인자, 사이토카인, 항생제 및 담체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포 성장에 적합한 다른 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 MSC 또는 ASC 성장 배지는 사용 시까지 4℃에서 제조 및 저장하고 사용하기 전에 37℃로 가온될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 제조 물품을 제공한다:
a. 지방 줄기 세포 성장 배지 또는 중간엽 줄기 세포 성장 배지를 포함하되, 상기 성장 배지가 세포 배양 배지, TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제를 포함하는 용기; 및
b. 시험관내에서 지방 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 확장시키기 위한 상기 성장 배지의 사용에 대한 지침서.
일 실시형태에서, 상기 성장 배지는 혈청 또는 혈청 치환물을 더 포함한다.
본 명세서에서 정의되는 용어 "용기"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 중간엽 줄기 세포 성장 배지를 함유하고 저장하기 위해 사용될 수 있는 용기, 백(bag), 비이커, 병, 보울, 박스, 생물반응기, 캔, 플라스크 또는 바이알을 의미한다.
본 명세서에서 정의되는 용어 "약"은 언급된 값보다 최대 1%, 보다 구체적으로 5%, 보다 구체적으로 10%, 보다 구체적으로 15%, 일부 경우 최대 20% 더 높거나 더 낮게 편차가 있을 수 있는 값을 나타내고, 상기 편차 범위는 연속 범위를 구성하는 정수 값 및 해당되는 경우 비-정수 값도 포함한다.
실시예
추가 설명없이도, 본 기술분야의 기술자는 전술한 설명을 사용하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있다고 생각된다. 따라서, 이하 바람직한 특정 실시형태는 어떤 식으로든 청구된 발명을 제한하는 것이 아니라 단지 예시하는 것으로서 해석되어야 한다.
본 명세서에 구체적으로 설명되지 않은 본 기술분야에 공지된 표준 분자생물학 프로토콜은 일반적으로 Sambrook & Russell, 2001에 기술된 절차를 본질적으로 따른다.
본 명세서에 구체적으로 설명되지 않은 본 기술분야에 공지된 표준 의약 화학 방법은 일반적으로 Pergamon Press에 의해 출판된 다양한 저자 및 편집자에 의한 "Comprehensive Medicinal Chemistry"시리즈의 방법을 본질적으로 따른다.
실시예 1: Fas-L 처리 후 동시 SVF 세포 증식 및 아폽토시스
기질 혈관 분획(SVF) 세포에 대한 Fas-L 처리의 효과를 평가하기 위해, SVF 세포는 하기 설명된 바와 같이 지방흡입 흡인물로부터 수득하였다.
인간 SVF 세포는 증가하는 Fas-L 농도의 존재 대 부재하에 이하에 명시된 바와 같은 정상 성장 배지에서 14일 동안 배양하였고, 세포수율 및 아폽토시스율을 측정하였다. 실험은 3명의 독립적인 환자의 세포를 사용하여 3회 반복하였다. 도 1A 및 1B에 나타낸 바와 같이, 25 ng/㎖ 이하의 Fas-L 농도에 대해서는 어떠한 반응도 기록되지 않았다. 대조적으로, 25 ng/㎖ 및 그 이상의 농도에서 SVF 세포는 아폽토시스율의 용량 의존적 증가를 입증하였다(도 1B). 그럼에도 불구하고, 상기 세포 계수치는 두 배 이상이었다(도 1A). 도 1C 및 도 1D는 요오드화 프로피듐(PI) 세포 주기 유세포분석에 의해 계산했을 때 대조군 SVF 세포(Fas-L 처리 없이)(1C) 및 50 ng/㎖ Fas-L로 처리된 세포(1D)에서 아폽토시스가 유도되었음을 보여준다. 아폽토시스 세포의 수는 50 ng/㎖ FasL과 함께 인큐베이션 후 5.4%에서 20.5%로 증가하였다. 도 1E 및 도 1F는 50 ng/㎖ Fas-L과 함께(1F) 또는 Fas-L 없이(대조군)(1E) 배양된 SVF 세포의 이미지를 보여준다. 도 1G는 처리된 세포의 부유 세포에 대한 아넥신/PI 유세포 분석을 그래픽으로 표현한 것이다(도 1F에서 화살표로 표시됨). 도 1H 및 1I는 유세포 분석에 의해 조사했을 때 Fas-L 처리 세포 및 미처리 세포에 대한 CD95(Fas) 발현을 그래픽으로 표현한 것이다. 50 ng/㎖ Fas-L 처리 후 이배화된 세포수율은 10 명의 독립적인 환자로부터 추출된 SVF 세포에서 입증되었다(표 1). 따라서, Fas-L 처리(≥25 ng/㎖)는 배양물에서 SVF 세포의 아폽토시스 및 증식을 모두 촉진한다.
Figure pct00004
실시예 2: SVF 세포의 Fas-L 처리는 0회 계대 및 1회 계대된 ASC의 CD105-저 및 CD73-고 세포 집단의 증가를 유도한다
다음으로, Fas-L 처리가 상기 세포의 표현형에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위해, 0회 계대 및 1회 계대 시의 Fas-L 처리(50 ng/㎖)된 SVF 세포의 표면 마커 프로파일을 7색 유세포 분석 패널을 사용하여 미처리 대조군과 비교하였다. 상기 실험은 동일한 경향을 보이는 2명의 독립적인 환자의 세포를 사용하여 2회 반복하였다.
예상대로, 0회 계대 시에, 미처리 세포의 2% 미만이 CD45, CD31및 CD34를 발현하였고, 거의 100%는 MSC 세포 마커 CD29 및 CD73 및 CD105를 발현하였다(도 2A 내지 도 2H). 유사한 발현 프로파일이 계대 1회의 미처리 세포에서 기록되었다(도 2I 내지 도 2L). 미처리 및 Fas-L 처리된 계대 0개 세포의 표면 마커 발현 패턴에서 상당한 유사성에도 불구하고, Fas-L 처리된 세포에서는 미처리 대조군 세포에 비해 낮은 수준의 CD105를 발현하는 CD105-양성 세포의 높은 비율이 관찰되었다(CD105-저 (각각 66.9% vs 50.1%)). 또한, Fas-L 처리된 계대 0개 세포는 높은 CD73 수준(CD73 고)을 발현하는 CD73-양성 세포를 미처리 대조군 세포에 비해 더 높은 비율(88.3% vs. 50.4%)로 나타내었다(도 2A 내지 도 2H). 상기 두 하위집단의 상대적 퍼센트의 추가 증가는 계대 1에서 확인되었고, 89.6%의 Fas-L 처리된 CD105 양성 세포는 CD105-저(low)를 입증하고 92.8%의 CD73 양성 세포는 CD73-고(high)를 입증한 반면, 계대 1 미처리 대조군에서는 각각 49.9% 및 52.5%만을 나타내었다(도 2I 내지 도 2L). 따라서, SVF 세포의 Fas-L 처리는 CD105-저 및 CD73-고 세포의 농축을 초래한다.
실시예 3: Fas-L 처리된 배양된 SVF 세포는 미처리 세포와 비교 시, 유사한 지방 분화 및 더 높은 뼈 분화를 나타낸다
상이한 표면 마커 발현을 특징으로 하는 다른 ASC 하위집단은 다른 분화 잠재력을 입증하는 것으로 알려져 있다. Fas-L 처리 대 미처리 계대 0 ASC의 지방 및 뼈로의 분화를 비교하였다. 인간 SVF 세포는 정상적인 배양 조건에서 또는 50 ng/㎖ Fas-L와 함께 14일 동안 배양하였다. 처리된 세포 및 미처리 세포를 그 다음 P1로 계대배양하였고 P1에서 지정된 분화 배지를 사용하여 지방 또는 뼈 분화를 진행하도록 유도하였다. 뼈 및 지방으로의 분화는 각각 Alizarin red 및 Oil red O 염색에 의해 검출하였다. 지방(도 3A 내지 도 3C) 및 뼈(도 3D 내지 도 3F)로 분화된 세포를 그 다음 촬영하였고, 염색을 추출하여 정량하였다. 동일한 경향을 보이는 3명의 독립적인 환자의 세포를 사용하여 실험을 3회 반복하였다.
비교 결과, Fas-L 처리된 세포 및 미처리 세포에서 유사한 지방 분화가 나타 났지만, Fas-L 처리 후 골 분화는 향상되었다.
실시예 4: SVF 세포의 Fas-L 처리는 큰 CFU-F의 생성을 촉진한다
다음으로, Fas-L 처리 및 미처리 SVF 세포가 콜로니 형성 단위 섬유아세포 (CFU-Fs)를 형성하는 능력을 평가하였다. 인간 SVF 세포를 일반 배양 조건에서 또는 50 ng/㎖ Fas-L과 함께 21일 동안 낮은 밀도로 배양하였다. 그 다음, 콜로니를 Giemsa에 의해 염색하고 계수하였다. 콜로니를 촬영하고 총 콜로니 수와 큰 콜로니(> 100개 세포)의 수를 Fas-L 처리된 세포 및 미처리 세포 간에 비교하였다. 동일한 경향을 보이는 2명의 독립적인 환자의 세포를 사용하여 실험을 2회 반복했다.
언뜻 보기에는 Fas-L 처리된 세포가 미처리 세포보다 훨씬 많은 CFU-F를 형성한 것처럼 보였지만(도 4A), 세밀한 현미경 평가 결과 상기 CFU-F 집단은 큰 CFU-F 및 작은 CFU-F를 모두 포함하고 있는 것으로 밝혀졌고, 여기서 큰 콜로니는 100개 세포 초과인 것이었다(도 4B 및 도 4C 하부). 도 4D 및 도 4E에서 관찰할 수 있듯이, 콜로니의 총 수는 Fas-L-처리된 세포 및 미처리 세포 간에 큰 차이를 나타내지 않았지만, 큰 콜로니는 미처리 세포에 비해 Fas-L 처리된 SVF 세포에서 훨씬 더 많은 수가 발견되었다.
실시예 5: 계대 3 ASC의 Fas-L 처리는 SVF 세포에서 관찰된 것과 유사한 표현형 변위를 초래한다
지금까지의 모든 실험은 지방으로부터 분리한 직후 초기 SVF 세포에 대한 Fas-L 처리 효과를 평가하였다. Fas-L이 "성숙한" ASC에 첨가되었을 때 유사한 효과를 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 계대 3(P3) 세포를 정상 조건 또는 증가하는 농도의 Fas-L 존재하에 6일 동안 배양하였다. 세포수(도 5A) 및 서브-G1 비율(도 5B 내지 도 5D)은 각각 표준 세포 계수치 및 요오드화 프로피듐(PI) 세포 주기 유세포 분석에 의해 조사하였다. 실험은 3명의 독립적인 환자의 세포를 사용하여 3회 반복하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 제시된다. 또한, CD29, CD105 및 CD73의 표면 마커 발현은 정상 배양 조건에서 또는 50 ng/㎖ Fas-L과 함께 배양된 P3 ASC에서 유세포 분석법에 의해 조사하였다.
SVF 세포와 마찬가지로 Fas-L 처리는 증식의 농도 의존적인 증가(도 5A) 및P3 ASC의 CD105-저 및 CD73-고 집단의 증가(도 5E 내지 도 5J)를 초래하였다. Fas-L은 또한 P3 ASC의 아폽토시스를 유도했지만(도 5B 내지 도 5D), SVF 세포의 Fas-L 처리 후에 나타난 비율에 비해 훨씬 낮은 비율이었다.
실시예 6: 카스파제 저해는 Fas-L 의존적 아폽토시스를 약화시키지만 증식은 약화시키지 않는다
ASC의 아폽토시스 및 증식에 대한 Fas-L의 이중 효과는 전적으로 표준형의 Fas-L 신호전달에 의해 또는 두개의 상이한 경로를 통해 매개될 수 있다. 이러한 가능성을 구별하기 위해 ASC를 4일 동안 미처리 상태로 두거나, Fas-L로만 처리하거나, 또는 Fas-L과 범-카스파제 저해제 Z-VAD-fmk로 동시에 처리하였다. 중요한 것은 Fas-L의 아폽토시스 신호를 더 잘 평가하기 위해, 계대 3 ASC에서 높은 아폽토시스율을 유도하는 다른 Fas-L 유도체(mega-Fas-L)를 본 실험에 사용하였다. 서브-G1 비율 및 세포수는 각각 PI 세포 주기 유세포 분석 및 표준 세포 계수치에 의해 결정하였다. 상기 실험은 3명의 독립적인 환자의 세포를 사용하여 3회 반복하였다.
예상한 것처럼, Fas-L 처리는 처리된 세포의 서브-G1 집단의 증가에 의해 입증되는 바와 같이 ASC 아폽토시스의 급증을 초래하였다(도 6A 및 도 6C 내지 도 6E). 아폽토시스는 Z-VAD-fmk의 첨가에 의해 상당히 약화되었지만(도 6A 및 도 6C 내지 도 6E), Fas-L 유도된 ASC 증식은 영향을 받지 않았으며 4일 처리 기간 동안 세포수율이 이배화되었다(도 6B). 이러한 증가된 확장은 Z-VAD-fmk로만 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 본 실험에서 Fas-L만의 처리는 미처리 세포에 비해 세포수율의 증가를 입증하지 못하였다(도 6B). 이것은 7일 동안 mega-Fas-L에 의한 처리가 이배화된 세포수율을 초래하였으므로(표 2)(평균 1.9, SD 0.2), Fas-L 유도체의 변화로 인한 것이 아니라, 이전 실험(7 내지 14일)에 비해 상기 실험 기간(4일)이 더 짧았기 때문이었다.
Figure pct00005
실시예 7: JNK가 아닌 PI3K 및 MAP 키나제 ERK-1/2의 저해는 ASC의 Fas-L- 유도 증식을 억제한다
ASC에서 Fas-L-유도 증식을 조절하는 세포내 경로를 확인하기 위해 종래 Fas-L에 의해 활성화되는 것으로 밝혀진 다양한 신호전달 경로[16 내지 20]를 독립적으로 저해하였다. 그 예에는 PI3K/Akt, ERK-1/2 및 JNK 신호전달 경로가 포함된다.
따라서, 배양된 계대 2-4 ASC를 mega Fas-L, Z-VAD-fmk, LY294002(PI3K 저해제), AZD6244(ERK-1/2 저해제) 및 SP600125(JNK 저해제)의 조합으로 4일 동안 처리하였다.
저해제 농도는 기저 ASC 증식을 방해하지 않는 최대 용량으로 보정하였다(도 7A 내지 도 7C). 4일 후, 트립신을 이용하여 평판으로부터 세포를 제거하였고, 표준 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하였다. 실험은 3명의 독립적인 환자의 세포를 사용하여 3회 반복하였다. Fas-L 및 PI3K(도 7A) 또는 ERK-1/2(도 7B) 저해제가 함께 사용된 배양물에서 4일 후, Fas-L만으로 처리된 세포에 비해 감소된 ASC 계수치가 측정되었고(각각 도 7A 및 도 7B), 이는 상기 저해제들에 의한 Fas-L의 프로-아폽토시스 효과가 아닌 프로-증식성을 저해한다는 것을 시사한다. 이러한 발견은 ASC를 Fas-L, Z-VAD-fmk 및 PI3K(도 8A) 또는 ERK-1/2(도 7B) 저해제와 함께 배양 시에 확인되었으며, 이는 미처리 대조군과 비슷한 세포 양을 산출한 반면, Fas-L 및 Z-VAD-fmk 처리 후에는 대략 이배화된 세포수율이 입증되었다(도 8A 및 도 8B). 이에 반해, Fas-L 자극에 수반되는 JNK 저해는 Fas-L 처리 후에만 수득되는 것과 유사한 세포수를 산출하였다(도 7C). 이와 유사하게, Fas-L, Z-VAD-fmk 및 JNK 저해제의 동시 첨가는 Fas-L 및 Z-VAD로 처리했을 때 수득된 집단의 이배화를 초래하였다(도 8C).
재료 및 방법
재료
재조합 인간 수퍼 Fas-L은 Enzo Life Sciences(독일 뢰어라흐 소재)에서 입수하고, 재조합 인간 mega Fas-L은 AdipoGen(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 입수하였다. zVAD.fmk(범-카스파제 저해제), LY294002(PI3K 저해제) 및 SP600125(JNK 저해제)는 Merck Biosciences(독일 다름슈타트 소재)로부터 입수하였고 AZD6244(ERK-1/2 저해제)는 Cayman Chemical(미국 미시간주 소재)로부터 입수하였다.
이하 항체를 유세포 분석 염색에 사용하였다: 항-인간 CD95(APO-1/Fas) APC 및 APC 마우스 IgG1 k 아이소타입 대조군(eBioscience, 캘리포니아주 샌디에고 소재), 항-인간 CD31 APC 및 마우스 IgG1 아이소타입 대조군 APC, 항-인간 CD34 PE 및 마우스 IgG1k 아이소타입 대조군 PE(PeproThec, 영국 런던 소재), 항-인간 CD29 Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 488 마우스 IgG1k 아이소타입 대조군, 항-인간 CD105 PerCP/Cy5.5 및 PerCP/Cy5.5 마우스 IgG1k 아이소타입 대조군, 항-인간 73 PE/Cy7 및 PE/Cy7 마우스 IgG1k 아이소타입 대조군(BioLegend(캘리포니아주 샌디에고 소재), 항-인간 CD45 BD Horizon BV650 및 BV650 마우스 IgG1, k 아이소타입 대조군 BD Biosciences(캘리포니아주 산호세 소재).
인간 1차 SVF 세포 분리
성형 수술을 받은 환자로부터 피하 지방 조직 샘플을 수득하였다. 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행하였고 Tel Aviv Sourasky Medical Center 윤리위원회의 승인을 받았다. 사전에 모든 환자로부터 서면 동의를 얻었다. 모든 샘플은 수술 부산물로 수집된 폐기물이었다. 환자의 평균 연령은 46.1+-11.7세였고, 평균 BMI는 29.3+-4.8 kg/㎡였다.
SVF 세포는 0.1% 콜라게나제(Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 사용하여 피하 인간 지방흡입물로부터 분리하였고 원심분리(15분, 400g)에 의해 지방으로부터 분리하였다.
세포 배양
지방 조직으로부터의 인간 1차 SVF 세포는 10% 송아지 태아 혈청(FCS)(Thermo Scientific HyClone, 뉴질랜드 타우랑가 소재), 60 ㎍/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50 ㎍/㎖ 카나마이신, 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민 및 비-필수 아미노산이 보충된 고-글루코스 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(Gibco, 영국 스코틀랜드주 페이즐리 소재)에서 10% CO2 및 대기 산소 조건 하에 미분화 상태로 유지시켰다. 배지는 일주일에 두 번 교체하고 융합성(confluence)에 도달하는 즉시 세포를 계대배양하였다.
세포 증식
SVF를 6-웰 평판(150,000개 세포/웰)에 접종하고 정상 성장 배지 또는 다른 Fas-L 농도가 보충된 성장 배지에서 14일 동안 배양하였다. 이 14일 배양 동안 배지를 4회 새로 교체하였다.
성숙한 ASC(P2-P3 ASC)는 6cm 평판(90,000개 세포/평판)에 접종하고 24시간 동안 부착하고 성장하도록 두었다. 이후, 배지를 신선한 정상 성장 배지 또는 상이한 Fas-L 농도가 보충된 성장 배지로 변경하고 세포를 7일 동안 추가로 배양하였다. 실험 기간 동안 배지는 2회 새로 교체하였다.
성숙한 ASC(P2 및 P3 ASC)의 증식에 대한 저해제의 효과를 시험하기 위해 세포를 24 웰 평판(10,000개 세포/웰)에 접종하고 24시간 동안 부착 및 성장하도록 두었다. 그 후, 배지를 Fas-L이 보충되거나 또는 Fas-L 및 저해제들 중 하나가 보충된 성장 배지 또는 신선한 정상 성장 배지로 교환하였다. 그 후, 세포를 4일 동안 배양하였다.
모든 처리에 대해 중복 웰/평판을 준비하였다.
인큐베이션 기간이 끝나면 부착 세포를 트립신 처리하고 수집하여 TC10 Automated Cell Counter(Bio-rad)로 계수하였다.
유세포 분석
표면 마커 분석
표면 마커 분석을 위해, 세포를 수확하고 항-CD31, 항-CD34, 항-CD29, 항-CD105, 항-인간-73 및 항-CD45 항체를 포함하는 7색 패널을 이용하여 인큐베이션하였다(암실에서 1시간). 사세포를 제외하기 위해 샘플은 ViViD(바이올렛 생육성 염료, Molecular Probes, Invitrogen, 미국 오리건주 유진 소재)로 제조업체의 프로토콜에 따라 염색하였다. CD95 염색은 항-CD95 항체 및 ViViD를 포함하는 2색 패널을 사용하여 수행하였다. 모든 항체는 제조업체가 권장하는 희석율로 사용하였다. 적절한 단일 염색된 샘플 및 아이소타입 대조군 샘플을 제조하고 분석하였다.
세포주기 분석
세포를 수확하고 70% 에탄올/PBS로 고정하고 RNaseA 0.4 ㎎/㎖(Sigma)로 처리하고 요오드화 프로피듐(PI) 0.1 ㎎/㎖(Sigma)로 염색하였다.
아넥신/PI 분석
세포는 전용 키트(BioLegend)를 사용하여 Annexin-APC/PI로 염색하였다.
모든 표지된 세포는 FACS Canto II 유세포 분석기(Becton Dickinson, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 분석하였다. 최소 10,000개의 이벤트가 기록되었다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star, 미국 오리건주 애슐랜드 소재)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
분화
지방생성 분화
융합성 세포를 10 ㎍/㎖ 인슐린, 1×10-6M 덱사메타손, 0.5mM 3-아이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) 및 50μM 인도메타신(모두 Sigma 제품)을 함유하는 지방생성 배지에서 배양하였다. 유도 배지는 3 내지 4일마다 교체하였다. 21일 후, 세포를 4% 포르말린(실온(RT)에서 20분)으로 고정시키고 0.5% Oil Red(Sigma)(RT에서 10분)로 염색하였다. 염색 후, DP73 카메라가 장착된 Olympus IX71 현미경(Olympus, 일본 도쿄 소재)으로 세포를 촬영하였다. 그 다음, Oil Red O를 아이소프로판올 중의 4% IGEPAL(Sigma)로 추출한 다음, TECAN Infinite M200 평판 판독기(TECAN, 스위스 만도르프 소재)를 사용하여 520nm에서 정량하였다.
골형성 분화
융합성 세포를 StemPro 골형성 분화 배지(Gibco)에서 배양하였다. 유도 배지는 3 내지 4일마다 교체하였다. 21일 후, 세포를 4% 포르말린으로 고정시키고(RT에서 20분), 2% Alizarin red(Sigma), pH 4.2(10분, RT에서)로 염색하였다. DP73 카메라가 장착된 Olympus IX71 현미경을 사용하여 사진을 촬영하였다. Alizarin red를 추출 용액(0.5N HCL/5% SDS)으로 추출하고 TECAN Infinite M200 평판 판독기(TECAN, 스위스 만도르프 소재)를 사용하여 415㎚에서 정량하였다.
CFU-F 분석
SVF 세포(2,000개)를 6cm 접시에 파종하고 정상 배양 조건에서 또는 50 ng/㎖ Fas-L이 보충된 배지에서 21일 동안 배양하였다. 콜로니를 그 다음 메탄올로 고정하고 Giemsa(Sigma)로 염색하고 계수하여 CFU-F 형성을 평가하였다. 총 콜로니 수와 큰 콜로니(> 100개 세포)의 수를 정량하고(Olympus IX71 현미경 사용) Fas-L 처리된 세포와 미처리 세포를 비교하였다. 이 실험은 3회 반복으로 수행하였다.
통계적 평가
통계 분석은 Minitab 18 소프트웨어(Minitab Inc., 펜실베이니아주 소재)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett(대조군과 비교) 또는 Tukey의 다중비교 검정으로 처리하였다. 일변량 데이터는 쌍을 이룬 t 검정을 사용하여 분석하였다. p ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

Claims (40)

  1. 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)를 전파시키는 방법으로서,
    (a) 신체 조직 또는 기관으로부터 세포를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 분리된 세포를
    (i) 적어도 하나의 TNF 상과(superfamily) 리간드, 및
    (ii) 적어도 하나의 아폽토시스 저해제(apoptosis inhibitory agent)
    를 포함하는 성장 배지에서 인큐베이션하여, MSC가 농축된 세포 집단을 수득하는 단계
    를 포함하는, MSC를 전파시키는 방법.
  2. 지방 유래 줄기 세포(adipose derived stem cell: ASC)를 전파시키는 방법으로서,
    (a) 지방흡입 흡인물로부터 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction: SVF) 세포를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 분리된 세포를
    (i) 적어도 하나의 TNF 상과 리간드, 및
    (ii) 적어도 하나의 아폽토시스 저해제
    를 포함하는 성장 배지에서 인큐베이션하여, ASC가 농축된 세포 집단을 수득하는 단계
    를 포함하는, ASC를 전파시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단계 (b) 전에, 상기 SVF 세포는 적어도 2회의 계대 동안 배양물에서 유지되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 상과 리간드는 Fas-리간드(FasL), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) α, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand: TRAIL), 종양 괴사 인자-유사 약한 아폽토시스 유도제(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis: TWEAK), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 TNF 상과 리간드는 FasL인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 배지는 성장 인자, 호르몬, 사이토카인 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 활성제를 더 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 적어도 1시간 동안인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 약 1시간, 2시간, 3시간 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 20 또는 23일 동안인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인큐베이션은 2시간 동안인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 인큐베이션은 4일 동안인, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 인큐베이션은 14일 동안인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배지가 3일마다 또는 4일마다 새로 교체되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아폽토시스 저해제가 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 이전에, 상기 리간드와 함께 또는 상기 리간드 이후에 투여되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아폽토시스 저해제는 카스파제 저해제, 세린 프로테아제(예를 들어, HTRA2) 저해제, 아폽토시스 단백질 저해제(IAP)(예를 들어, XAF1), NF-카파 B 저해제, Smac 저해제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 카스파제 저해제는 Z-VAD-fmk인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아폽토시스 저해제의 양은 약 1μM 내지 약 50μM의 범위, 또는 약 5μM 내지 약 25μM의 범위인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드의 농도는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖의 범위인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제와 인큐베이션한 후, 상기 적어도 하나의 TNF 상과 리간드 및 상기 아폽토시스 저해제는 제거되고 상기 세포는 분화되도록 하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포는 지방세포, 연골세포 또는 골세포로 분화되도록 하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 세포 또는 미분화 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 이식하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포가 지방 조직, 뼈 조직, 근육, 결합 조직 또는 연골로 분화되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포는 지방 조직으로 분화되고, 상기 환자는 유방 복원을 필요로 하는 환자인, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 세포는 뼈 조직으로 분화되고, 상기 환자는 정형외과 적 손상, 뼈 재건 또는 뼈 복구의 치료를 필요로 하는 환자인, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 세포는 연골 조직으로 분화되고, 상기 환자는 연골세포 이식, 반월상 연골, 회전근개 또는 관절 연골 복구의 치료를 필요로 하는 환자인, 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 환자는 미용 시술을 필요로 하는 환자인, 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 분화된 세포의 이식은 피부학적 병태의 치료용인, 방법.
  27. 제20항에 있어서, 상기 분화된 세포의 이식은 환자의 면역 관련 질환을 완화 또는 치료하기 위한 것인, 방법.
  28. 제20항에 있어서, 상기 환자는 기관 또는 조직 이식을 받은 환자인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 기관 이식은 골수, 간, 신장, 혈관 또는 심장 이식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제20항에 있어서, 상기 분화된 세포의 이식은 환자의 심장 장애를 치료하기위한 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 심장 장애는 뇌졸중, 협심증 및 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제20항에 있어서, 상기 분화된 세포의 이식은 크론병 환자의 항문 또는 항문 주위 누공을 치료하기 위한 것인, 방법.
  33. 제20항에 있어서, 상기 분화된 세포의 이식은 혈관 복구를 위한 것인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 동종 또는 자가인, 방법.
  35. 세포 배양 배지, TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제를 포함하는, 지방 줄기 세포(ASC) 또는 중간엽 줄기 세포(MSC) 성장 배지.
  36. 제35항에 있어서, 혈청 또는 혈청 치환물을 더 포함하는, ASC 또는 MSC 성장 배지.
  37. 제조 물품으로서,
    a. 지방 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포 성장 배지를 함유하되, 상기 성장 배지가 세포 배양 배지, TNF 상과 리간드 및 아폽토시스 저해제를 포함하는 용기; 및
    b. 시험관내에서 지방 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 확장(expanding)시키기 위한 상기 성장 배지의 사용에 대한 지침서
    를 포함하는, 제조 물품.
  38. 제37항에 있어서, 상기 성장 배지가 혈청 또는 혈청 치환물을 더 포함하는 제조 물품.
  39. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득한, 농축된 세포 집단.
  40. 제39항에 있어서, 필요로 하는 환자 내로의 이식 절차에 사용하기 위한, 농축된 세포 집단.
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