KR20180120261A

KR20180120261A - 크론병의 난치성 복합 항문주위 누공 치료용 지방 조직 유래 기질 줄기 세포

Info

Publication number: KR20180120261A
Application number: KR1020187029414A
Authority: KR
Inventors: 에두아르도 브라보; 마리아 파스쿠알
Original assignee: 타이제닉스, 에스.에이.유.
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2018-11-05
Also published as: HRP20220539T1; CA3017694A1; RS63163B1; IL261730A; IL298107B1; RU2018131519A; US20190381106A1; DE102017002458A1; SG10202008992YA; MX2018010699A; RU2742308C2; IL261730B2; GB2548490B; US11273182B2; GB2548490A; RU2018131519A3; EP3219321B1; IL298107A; CN108883135A; JP2021119789A

Abstract

본 발명은 크론병에서 복합 항문주위 누공 치료에 사용하기 위한 확장된 동종 지방 조직 유래 기질 줄기 세포를 제공한다.

Description

크론병의 난치성 복합 항문주위 누공 치료용 지방 조직 유래 기질 줄기 세포

본 발명은 크론병 환자에서 난치성 복합 항문주위 누공 치료용 지방 조직 유래 줄기 세포에 관한 것이다.

일반적으로, 누공(fistula)은 정상적으로 연결하지 않는 기관 또는 혈관 사이의 비정상적인 연결 또는 통로이다. 누공은 신체의 여러 부분에서 발달할 수 있다. 예를 들어, 이들이 발생하는 신체의 부위로 명명된 누공의 유형은 항문 직장 치루(anorectal fistula) 또는 치루(fistula-in-ano) 또는 분변루(fecal fistula) (직장 또는 다른 항문 직장 및 피부 표면 사이), 동정맥루(arteriovenous fistula) 또는 동정맥루(A-V fistula) (동맥 및 정맥 사이), 담도루(biliary fistula) (종종 담낭 수술로 인한, 담낭 및 피부 표면 사이), 자궁 경부루(cervical fistula) (자궁 경부의 비정상적 개방), 두개동루(craniosinus fistula) (두개(intracranial) 내 공간 및 부비동(paranasal sinus) 사이), 창자사이루(enteroenteral fistula) (장의 두 부분 사이), 장피부루(enterocutaneous fistula) (장 및 피부 표면, 즉 십이지장 또는 공장 또는 회장과의 사이), 장질루(enterovaginal fistula) (장 및 질 사이), 위루(gastric fistula) (위장 및 피부 사이), 자궁복막루(metroperitoneal fistula) (자궁 및 복막강 사이), 외림프루(perilymph fistula) (중이 및 외이 사이의 막들 사이의 찢어짐), 폐동정맥루(pulmonary arteriovenous fistula) (혈액의 전환(shunting)을 초래하는 폐의 동맥 및 정맥 사이), 직장질루(rectovaginal fistula) (직장 및 질 사이), 제루(umbilical fistula) (배꼽 및 내장 사이), 기관식도루(tracheoesophageal fistula) (호흡 및 급식(feeding) 관(tubes) 사이) 및 방광질루(vesicovaginal fistula) (방광 및 질 사이)를 포함한다. 누공의 원인은 외상, 치료 및 질병으로 인한 합병증을 포함한다.

누공의 치료는 누공의 원인 및 정도에 따라 다르지만, 일반적으로 외과적 개입을 포함한다. 다양한 수술 절차가 일반적으로 사용되며, 가장 일반적으로 누공절제술(fistulotomy), 관선(seton)의 배치(누공의 경로를 통과하여 배액을 위해 열어두는 코드(cord)), 또는 직장 내 덮개 수술(endorectal flap procedure) (배설물 또는 다른 물질이 채널을 재감염시키는 것을 막기 위해 건강한 조직이 누공의 내부 면 위로 당겨지는 곳)이 있다. 항문 직장 누공 수술은 재발, 재감염, 및 요실금을 포함하는 부작용이 없다.

크론병 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질병은 항문 직장, 장 기관(enteroenteral), 및 장피부 누공의 주요 원인이다. 크론병에서 누공의 보고된 발생 정도는 17% 내지 50%의 범위이다. 크론병 환자의 누공 관리는 이러한 많은 누공이 사용 가능한 치료에 반응하지 않기 때문에 극도로 어려운 문제를 제시한다. 이러한 누공 및 이들의 재발현은 매우 고통스러운 합병증이며 영향을 받은 환자의 삶의 질을 현저하게 감소시킨다. 최근 의학적 치료(예를 들어 Infliximab®로 치료) 및 전문 외과 수술의 개선으로 복잡한 수술의 필요성이 감소되었다. 그러나, 많은 환자들은 치료되지 않았다. 누공의 치료 실패는 아마도 크론병에 의해 영향을 받은 조직의 차선의 품질 때문일 것이다. 실제로 크론의 누공은 최악의 가능한 조건의 일부 하에서 상처의 치료를 위한 모델 시스템을 제공한다.

항문 주위 누공은 크론병의 일반적인 합병증이며,^A1 진단 후 처음 20년 동안 환자의 28%까지, ^{A2, A3} 특히 결장 질병 및 직장 관련자에게 영향을 미치는 것으로 추정된다.^A4 이들은 환자의 삶을 심각하게 손상시키고 상당한 사망율을 초래한다.^{A5, A6} 항문 주위 누공의 약 70-80%는 복잡하며,^A3 ^{, A7} 이들은 통상적인 치료 전략(항생제, 면역억제제) 및 항종양 괴사 인자(항-TNF) 요법에 특히 불응하기 때문에 치료가 어렵다.^{A8- A12} 또한 환자의 60-70%가 치료를 중단할 때 재발하고, ^A13-A17 소수의 환자만이 장기적인 완화를 달성한다. ^A18

의료 요법의 실패 또는 견디기 어려움은 궁극적으로 전환 기문(diverting stoma) 또는 직장절제술(proctectomy)과 같이 심신을 약화시키는 수술적 접근을 초래할 수 있다. ^A19 따라서 대체 의학 치료에 대해 충족되지 않은 큰 필요성이 남아 있다.

중간엽 간질 세포(Mesenchymal stromal cells, MSCs)는 뼈, 연골, 근육, 인대, 힘줄, 및 지방과 같은 중간엽 조직으로 분화할 수 있는 비조혈성 간질 세포이다. MSC는 골수 또는 지방 조직과 같은 조직으로부터 용이하게 분리될 수 있으며 배양에서 빠르게 증식된다. WO-A-2006/136244는 지방 조직 유리 간질 줄기 세포 포함 조성물을 사용하여 누공을 치료하는 것을 기술한다. 지방 유래 중간엽 간질 세포는 항염증 및 조직 재생 잠재력으로 인해 복합 항문 주위 누공의 치료에 활용될 수 있는 유망한 새로운 치료 방법이다. ^A20-A22초기 개념의 증명은 치료 24주 후 외부 개구의 완전한 폐쇄 및 치료된 누공의 MRI로 측정된 수집물의 부재를 보이는 56.3%의 환자의 복합 항문주위 누공을 갖는 24병의 크론병 환자에서 동종(allogeneic), 확장된 지방 유래 줄기 세포 (eASC, Cx601)에 대한 공개-표지(label) 상(phase) 1/2a 임상 연구에서 이전에 얻어졌다.^A23

크론병의 복합 항문 주위 누공은 특히 치료가 어려워, 크론병에서 복합 항문 주위 누공의 치료를 위해 임상적으로 입증된 치료법을 확립할 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명은 크론병 및 치료-난치성, 배액 복합 항문주위 누공을 갖는 212명의 성인 환자의 eASC의 효능 및 안전성이 평가된 다센터(multicenter), 이중맹검(double-blind), 위약 대조(placebo-controlled) 연구 결과에 기초하여 크론병에 걸린 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하기 위한 임상적으로 입증된 요법의 제공에 관한 것이다. 본 발명의 실시예는 확장된 동종 지방 유래 줄기 세포 단독 또는 크론병 환자의 난치성 복합 항문주위 누공에 대한 현재의 의학 요법에 추가된 것의 효능 및 안전성을 평가하는 제1 위약-대조 제3상 연구를 기술한다. 본 발명에 보고된 결과는 24주의 제1 및 제2 종점이다.

새로운 임상 실험 데이터는 놀랍게도 지방 유래된 줄기 세포가 다중 장관 복합 항문주위 누공(multiple tract complex perianal fistulae)을 특히 효과적으로 치료하는 것으로 나타났다. 상기 데이터는 또한 누공 제조 시 항-TNF 및 면역 억제제 요법을 모두 받지 않거나 또는 모두 받은 환자에서 세포의 수치적으로 가장 큰 효과가 관찰되었음을 보여준다. 추가적으로, 임상적 완화는 치료 직후 놀랍게도 이루어졌으며, 치료군에서 임상적 완화까지 걸리는 평균(median) 시간은 6.7주였다. 유사하게, 반응까지의 평균 시간은 6.3주였다. 항문주위 질병 활성도 지수(perianal disease activity index, PDAI)의 개선은 6, 12 및 18주에서 현저하게 컸다. 전반적으로, 상기 데이터는 동종 eASC가 크론병 환자의 복합 항문주위 누공에 현저하게 효과적인 치료법인 것을 보여주며, 종래 약물 요법은 실패한 가장 치료하기 어렵고 매우 복합적인 누공에서도 단일 투여는 신속하고 지속적인 치료 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 제1 양태는 크론병을 갖는 환자에서 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하는 방법에 사용하기 위한 확장된 동종 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 제공한다.

본 발명의 제2 양태는 크론병을 갖는 환자에서 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하는 약제의 제조에 확장된 동종 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 용도를 제공한다.

본 발명의 제3 양태는 이러한 치료를 필요로 하는 환자에, 누공에 확장된 동종 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 크론병을 갖는 환자의 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하는 방법을 제공한다.

또한 다른 것들 가운데 본 발명의 개시는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물이다. 본 발명에 기술된 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 명확한 표현형을 가지고 표현형의 유익한 동질성을 나타내므로, 누공을 치료하는데 사용하기에 이들을 보다 적절하게 만든다. 상기 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 약학적 또는 의학적 장치, 예를 들어 봉합(sutures) 또는 접착제(adhesives)와 같은 것으로 제공되는 용액 또는 다른 물질과 함께 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명은 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 이용하여 복합 항문주위 누공을 치료하는 새로운 방법뿐만 아니라, 이를 수행하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 확장된 동종 지방 조직 유래 기질 줄기 세포는 크론병에서 복합 항문주위 누공의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 3상 임상 연구 설계를 나타낸다. Cx601, 동종, 확장된, 지방 유래 줄기 세포; ICF, 피험자 동의서(informed consent form); MRI, 자기 공명 이미지(magnetic resonance imaging).
도 2는 환자 성향(disposition)을 요약하였다. Cx601, 동종, 확장된, 지방 유래 줄기 세포; ITT, 치료 의도; mITT, 변형된 치료 의도; *심부정맥혈전(Deep vein thrombosis), 크론 플레어(Crohn's flare), 장폐색(intestinal obstruction), 크론병(Crohn's disease), 항문 농양(anal abscess) (n=3); †누공(Fistula), 직장통증(proctalgia), 항문 농양(anal abscess) (n=4); ‡증상 치유 또는 악화 없음; 항생제의 새로운 과정; 항문 주위부 새로운 수술; §치료에 변화가 필요한 크론병의 악화.
도 3은 제1(Primary) 종점을 보여준다: ITT 집단에서 24주째에 조합된 임상적 및 방사선학적 관해(remission)* (패널 A). mITT 집단에서 24주째에 조합된 임상적 및 방사선학적 관해* (패널 B). mITT 집단에서, 무작위 계층화(stratification) 인자, 즉 무작위화 시에 수용된 크론병의 치료에 따른 24주째에 조합된 관해* (패널 C). Cx601, 동종, 확장된, 지방 유래 줄기 세포; IS, 면역억제제(immunosuppressant); ITT, 치료 의도; mITT, 변형된 치료 의도; TNF, 종양 괴사 인자. *기준선에서 배액되는(draining) 모든 치료된 외부 개구의 폐쇄, 및 24주째에 중앙 블라인드(centrally blinded) MRI 평가에 2/3 이상에 치료된 항문주위 누공이 2 cm 초과되는 수집물의 부재의 임상적 평가. 폐쇄의 임상적 평가는 부드러운 손가락 압축(finger compression)에도 불구하고 배액이 없는 것으로 정의되었다.

발명의 상세한 설명

1. 정의:

본 발명에 사용된, 하기 용어 및 구문은 하기 개시된 의미를 가질 수 있다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 의미한다. 예를 들어, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 둘 이상의 요소를 의미한다.

"지방 조직"은 임의의 지방 조직을 의미한다. 상기 지방 조직은 피하, 망막/내장(omental/visceral), 유선, 생식선, 또는 다른 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 일반적으로, 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 이러한 세포는 일차 세포 배양물 또는 불멸화된 세포주를 포함할 수 있다. 지방 조직은 지방 조직을 갖는 임의의 유기체일 수 있다. 일반적으로, 지방 조직은 포유류이며, 가장 일반적으로 지방 조직은 인간이다. 지방 조직의 편리한 공급원은 지방 흡입 수술로부터이지만, 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 분리 방법은 본 발명에서 중요하지 않다.

"지방 조직 유래 간질 줄기 세포" 또는 "ASC"는 일반적으로 인간 지방 조직(hASCs)로부터 유래된 지방 조직의 간질 분획으로부터 기인한 중간엽 줄기 세포를 의미한다.

"접착제"라는 용어는 표면을 함께 결합 또는 부착시키는 임의의 물질을 의미한다; 예를 들어, 접착제(glue).

"생물 의약 제품"이라는 용어는 천연(비조작된) 생물 자원으로부터 직접 추출하는 것 이외의 방법을 통해 일반적으로 생산되는 치료용 단백질 또는 핵산 기초의 약학적 물질을 의미한다.

"세포 조성물"이라는 용어는 세포의 제제(preparation)을 의미하며, 상기 제제는 세포에 추가적으로, 세포 배양 배지, 예를 들어 단백질, 아미노산, 핵산, 뉴클레오티드, 보조효소, 항산화제, 및 금속 등과 같은 세포 이외의 성분을 포함할 수 있다. 또한, 세포 조성물은 세포 성분의 성장 또는 생존력에 영향을 주지 않으나, 예를 들어 캡슐화 또는 약학적 제제를 위한 중합체 기질과 같은 특정한 형태로 세포를 제공하는데 사용되는 성분을 가질 수 있다.

"복합 항문주위 누공"은 하기의 하나 이상을 갖는 항문주위 누공이다:

(i) 높은 간(high inter-), 관통(trans-), 외부(extra-) 또는 상(supra-) 괄약근(sphincteric) 근원;

(ii) ≥2 외부 개구(external openings); 또는

(iii) 관련된 수집물(collections).

복합 항문주위 누공은 선택적으로 최대 2개의 내부 및 3개의 외부 개구를 가질 수 있다. 또한, 복합 항문주위 누공은 본 발명에 따른 치료 전에 적어도 6주 동안 배액되었다.

"배양(culture)"이라는 용어는 배지에서 세포, 유기체, 다세포 조직 또는 조직의 임의의 성장을 의미한다. "배양(culturing)"이라는 용어는 이러한 성장을 달성하는 임의의 방법을 의미하며, 다중 단계를 포함할 수 있다. "추가 배양"이라는 용어는 세포, 유기체, 다세포 독립체, 또는 조직을 특정한 성장 단계로 배양한 다음, 다른 배양법을 사용하여 상기 세포, 유기체, 다세포 독립체, 또는 조직을 다른 성장 단계로 유도하는 것을 의미한다. "세포 배양"은 인비트로(in vitro)에서 세포의 성장을 의미한다. 이러한 배양에서, 세포는 증식하지만 조직 자체(per se)로 조직화되지 않는다. "조직 배양"은 조직의 구조 및 기능을 보존하기 위해 인비트로에서 조직의 유지 또는 성장, 예를 들어 기관 원시(primordial)의 또는 성체 기관의 외식(explants)을 의미한다. "단일층 배양물"은 세포가 적당한 매질에서 증식하면서 주로 서로 및 기질에 부착되는 배양물을 의미한다. 또한, "현탁 배양"은 적절한 배지에서 현탁되는 동안 세포가 증식하는 배양을 의미한다. 유사하게 "연속 흐름 배양(continuous flow culture)"은 세포 성장, 예를 들어 생존력을 유지하기 위해 신선한 배지의 연속적인 흐름에서 세포 또는 외식물을 배양하는 것을 의미한다. "조건 배지(conditioned media)"라는 용어는 배양된 세포와 접촉하는 시간 이후 생성된, 상층액, 예를 들어 배양된 세포/조직이 없어서, 세포에 의해 생산되고 배양물로 배출된 특정한 주변분비(paracrine) 및/또는 자가분비(autocrine) 인자를 포함하도록 배지가 변형된 것을 의미한다. "컨플루언스(confluence) 배양"은 모든 세포가 접촉되고 이에 따라 배양 용기의 전체 표면을 덮은 세포 배양물이며, 컨플루언스는 분열이 중단되거나 또는 집단의 규모가 증가되지 않는 것을 반드시 의미하지 않더라도, 세포가 또한 그들의 최대 밀도에 도달하였음을 내포한다.

"배양 배지" 또는 "배지"라는 용어는 기술분야에서 인식되며, 살아있는 세포의 배양을 위해 사용되는 임의의 물질 또는 제제를 일반적으로 의미한다. 세포 배양과 관련하여 사용되는 "배지"라는 용어는 세포를 둘러싼 환경의 성분을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스 또는 상(phases) 및 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 성장 배지뿐만 아니라 세포 성장을 지속하지 않는 액체 배지를 포함한다. 배지는 또한 한천(agar), 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 기질과 같은 젤라틴성 배지를 포함한다. 예시적인 가스 배지는 페트리디쉬 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체 상에서 성장하는 세포가 노출되는 가스 상을 포함한다. "배지"라는 용어는 또한 세포와 아직 접촉되지 않더라도, 세포 배양물에 사용하기 위한 용도의 물질을 의미한다. 즉, 박테리아 배양을 위해 제조된 영양 풍부 액체는 배지이다. 유사하게, 물 또는 다른 액체와 혼합될 때 세포 배양을 위해 적절해지는 파우더 혼합물은, "파우더 배지"로 명명될 수 있다. "정의된 배지"는 화학적으로 정의된(보통 정제된) 성분으로 제조된 배지를 의미한다. "정의된 배지"는 효모 추출물 및 쇠고기 육수와 같은 좋지 못한 특징의 생물 추출물은 포함하지 않는다. "풍부 배지"는 특정한 종의 대부분 또는 모든 가능한 형태의 성장을 지원하도록 설계되는 배지를 포함한다. 풍부 배지는 보통 복합 생물 추출물을 포함한다. "고밀도 배양의 성장을 위해 적절한 배지"는 다른 조건(온도 및 산소 전달율과 같은)이 이러한 성장을 허용할 때 세포 배양물이 3 또는 그 이상의 OD600에 도달할 수 있도록 하는 임의의 배지이다. "기본 배지"라는 용어는 임의의 특정한 영양 보충을 요구하지 않는 많은 유형의 미생물의 성장을 촉진하는 배지를 의미한다. 대부분의 기본 배지는 일반적으로 네개의 기초 화학 그룹을 포함한다: 아미노산, 탄수화물, 무기염, 및 비타민. 기본 배지는 일반적으로 혈청, 버퍼, 성장 인자, 및 지질 등과 같은 보충물이 첨가된, 보다 복합적인 배지에 대한 기초로 제공된다. 기본 배지의 예시는 이글스 기본 배지(Eagles Basal Medium), 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium), 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 배지 199(Medium 199), 영양 혼합물 햄스 F-10(Nutrient Mixtures Ham's F-10) 및 햄스 F-12(Ham's F-12), 맥코이 5A(Mc Coy's 5A), 둘베코 MEM/F-I 2(Dulbecco's MEM/F-I 2), RPMI 1640, 및 이스코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

"포함" 및 "포함하는"이라는 용어는 포괄적이고 개방된 의미로 사용되며, 이는 부가적인 요소가 포함될 수 있음을 의미한다.

"Cx601"이라는 용어는 동종 근원의 인간 확장된 지방 유래 줄기 세포(eASC)를 포함하는 무균 완충 식염수 용액 내 세포 현탁액을 의미한다. 이러한 세포들은 보존제 없는 일회용 바이알로 제공된다. 상기 세포는 병변 내 주사를 위해 1억 2천만개의 세포(5백만개 세포/mL)의 투여량으로 주어진다.

"분화"라는 용어는 보다 구체화되고 추가적인 분열 또는 분화가 불가능하게 최종적으로 분화된 세포가 되는 것과 가까운 세포와 관련된 것으로 알려진 마커를 발현하는 세포의 형성을 의미한다. 예를 들어, 췌장과 관련하여, 분화는 증가된 양의 인슐린을 생산하는 베타-상피 세포의 증가된 비율을 포함하는 섬(islet)-유사 세포 집단(clusters)의 생성에서 관찰될 수 있다. "추가적" 또는 "보다 많은" 분화라는 용어는 이들이 배양된 것으로부터 세포에 비해 보다 구체화되고 추가적 분열 또는 분화가 불가능한 최종적으로 분화된 세포가 되는 것과 가까운 세포를 의미한다. "최종 분화"라는 용어는 추가적 분열 또는 분화가 불가능한 최종적으로 분화된 세포가 된 세포를 의미한다.

세포를 언급할 때 본 발명에 사용된 "확장된"이라는 용어는 기술분야에서 통상적인 의미를 갖는 것으로, 즉 인비트로에서 증식된 세포이다. eASC의 제조 방법은 기술분야에서 알려져 있으며, 예를 들어 WO2007/039150에서 기술되었다. ASC는 ASC의 적어도 하나의 생물학적 기능, 일반적으로 표준 배양 조건 하에 플라스틱 표면에 접착되는 능력을 보유하는 세포의 집단을 제공한다. 세포의 확장된 집단은 하나 또는 그 이상의 세포 유형으로 분화되는 능력을 보유할 수 있다.

"누공(fistula)"이라는 용어는 일반적으로 두개의 내부 기관 사이 또는 내부 기관으로부터 신체 표면으로 이어지는 비정상적 통로(passage) 또는 소통(communication) 또는 연결(connection)을 의미한다. 누공의 예시는 항문 직장 치루(anorectal fistula) 또는 치루(fistula-in-ano) 또는 분변루(fecal fistula), 동정맥루(arteriovenous fistula) 또는 동정맥루(A-V fistula), 담도루(biliary fistula), 자궁 경부루(cervical fistula), 두개동루(craniosinus fistula), 창자사이루(enteroenteral fistula), 장피부루(enterocutaneous fistula), 장질루(enterovaginal fistula), 위루(gastric fistula), 자궁복막루(metroperitoneal fistula), 외림프(perilymph), 폐동정맥루(pulmonary arteriovenous fistula), 직장질루(rectovaginal fistula), 제루(umbilical fistula), 기관식도루(tracheoesophageal fistula) 및 방광질루(vesicovaginal fistula)를 포함한다. 본 발명은 항문주위 누공에 관한 것이다.

"포함하는(including)"이라는 용어는 본 발명에서 "포함하지만 이에 한정되지 않음"을 의미하는 것으로 사용된다. "포함하는(Including)" 및 "포함하지만 이에 한정되지 않음은 교체적으로 사용되었다.

"마커(marker)"는 존재, 농도, 활성 또는 인산화 상태가 검출될 수 있고 세포의 표현형을 확인하는데 사용되는 생물학적 분자를 의미한다.

"중간엽 간질 세포(Mesenchymal stromal cells)"(또한 본 발명에서 "MSC"로 언급됨)는 일반적으로 결합 조직으로부터 유래되며, 비조혈 세포인 다능성 간질 세포(즉 이들은 다수의 상이한 유형의 세포를 생성할 수 있는 세포임)이다. MSC는 중배엽 세포(예를 들어 지방, 연골세포, 골아세포)와 같은 체세포로 및 선택적으로 내배엽 및/또는 외배엽 세포 유형 또는 계통으로 이들을 분화할 수 있는 능력을 갖는다. 일반적으로 상기 세포는 지방세포, 연골세포 및 골아세포 계통으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 두개 또는 모든 세포 유형으로 분화시키는 능력을 갖는다. ASC는 지방 조직의 간질 분획으로부터 수득된 MSC의 하나의 유형이다. MSC 및 ASC는 표준 배양 조건 하에 플라스틱에 접착된다.

"패치(patch)"는 상처(wound) 또는 다른 상처(sore)을 덮거나 또는 보호하기 위해 적용되는 드레싱 또는 커버링이다.

본 발명의 방법에 의해 치료되는 "환자", "대상" 또는 "숙주"는 인간 또는 비인간 동물을 의미할 수 있다.

"약학적으로 허용 가능한"이라는 문구는 본 발명에서 합리적인 이익/위험 비율에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적절한, 정상적인 의학적 판단의 범위 내의, 이들의 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 문구는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 상기 신체의 또 다른 기관, 또는 부분으로 대상 물질을 운반하거나 수송하는데 관련된 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 호환 가능하며 환자에게 해롭지 않은 의미에서 "허용 가능"해야 한다. "표현형"이란 용어는 세포의 관찰 가능한 특징, 예를 들어 크기, 형태, 단백질 발현 등을 의미한다.

"간세포(progenitor cell)"라는 용어는 자신보다 더 분화된 자손을 만들 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 예를 들어, 상기 용어는 증식 가능하며 많은 수의 모세포를 생성하는, 즉 분화된, 또는 분화 가능한 딸세포를 만들 수 있는 보다 많은 간세포를 만드는 능력을 갖는 미분화된 세포 또는 최종 분화가 되지 않은 정도로 분화된 세포를 의미할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 간세포라는 용어는 분화에 의해, 예를 들어 배아 세포 및 조직의 점진적 다양화에서 발생하는 것과 같이 완전히 개별적인 특성을 획득함으로써, 종종 상이한 방향으로 자손(descendants)(자손(progeny))이 특화되는 일반화된 모세포를 의미한다. 세포 분화는 많은 세포 분할에도 불구하고 일반적으로 일어나는 복합적인 과정이다. 분화된 세포는 그 자체가 다능성 세포 등으로부터 유래된, 다능성 세포로부터 유래할 수 있다. 이들 다능성 세포의 각각이 줄기 세포로 고려될 수 있는 반면, 각각 발생할 수 있는 세포 유형의 범위는 상당히 다를 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 더 큰 발달 잠재력을 갖는 세포를 생성할 수 있는 능력을 가진다. 이러한 능력은 자연적이거나 또는 다양한 요인과 함께 치료를 통해 인위적으로 유도될 수 있다. 이러한 정의에 따르면, 줄기 세포는 ?한 간세포뿐만 아니라 최종적으로 분화된 세포에 대한 보다 직전의 전구체일 수 있다.

"증식"은 세포수의 증가를 지칭한다. "증식하는" 및 "증식"은 유사분열을 겪는 세포를 지칭한다.

"난치성(Refractory)"은 질병의 치료에 사용될 때 현저한 임상적 이점이 없음, 예를 들어 증상의 현저한 개선 또는 완화가 없음을 의미하는 것으로 간주된다.

"관해(remission)"라는 용어는 누공의 성공적인 치료를 의미한다. "임상적 관해"는 부드러운 손가락 압축에도 불구하고 기준선에서 배액되는 모든 치료된 외부 개구의 폐쇄이다. 임상적 관해까지의 시간은 치료 시작으로부터 임상적 관해에 대한 첫번째 환자의 평가까지의 시간으로 정의된다. "조합된 관해"는 이러한 임상적 관해에 추가로 3차원 중 적어도 2개에 치료된 항문주위 누공에 2 cm 초과의 수집물 부재의 MRI(자기 공명 이미지)를 통해 확인한 것이다. 이는 전형적으로 맹검 중앙 MRI 판독에 의해 확인된다. 치유되지 않으면 새로운 누공이 유도되기 때문에 수집물 또는 농양의 부재는 중요하다.

“반응”이라는 용어는 부드러운 손가락 압축에도 불구하고 기준선에서 배액된 모든 처치된 외부 개구의 적어도 50%의 폐쇄를 의미한다(즉 임상적으로 평가된 것). 반응은 따라서 만약 기준선에서 EO의 수가 1 또는 2인 경우 1개 EO가 닫힐 때 충족되며, 및 만약 3개 EO가 기준선에서 존재하는 경우 2개 EO가 닫힐 때 충족된다. 반응 시간은 처리 시작으로부터 반응의 첫번째 평가까지의 시간으로 정의된다.

“재발(relapse)”이라는 용어는 사전 평가시 임상적 관해가 있는 환자에서 임상적으로 평가된 활성화 배액이 있는 치료된 외부 개구 중 임의의 것이 재개방된 것, 또는 또는 MRI에 의해 확인된 치료된 항문주위 누공(들)의 2cm 초과의 항문주위 수집물의 발달을 의미한다.

본 발명에 사용된, "용액"이라는 용어는 본 발명의 세포가 생존 가능한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 지방 조직 유래 줄기 세포 집단에 관하여 "실질적으로 순수한"이라는 용어는 총 세포 집단을 만드는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포에 관하여, 지방 조직 유래 줄기 세포의 집단이 적어도 약 75%, 전형적으로 적어도 약 85%, 더욱 전형적으로 적어도 약 90%, 및 가장 전형적으로 적어도 약 95% 순수함을 의미한다. 또한, "실질적으로 순수한"이라는 용어는 후속 배양 및 증폭 전에 원래의 비증폭되고 분리된 집단에서 계통(lineage) 수용된(committed) 세포의 약 20% 미만, 더욱 전형적으로 약 10% 미만, 가장 전형적으로 약 5% 미만을 포함하는 본 발명의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 집단을 의미한다.

본 발명에 사용된 "지지체(support)"는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 성장을 위한 기본 또는 기질로 제공될 수 있는 임의의 장치 또는 물질을 의미한다.

"봉합사(suture)"라는 용어는 상처를 서로 꿰매는데 사용될 수 있는 실 또는 섬유 또는 기타 고정 재료를 의미한다.

단일 "관(tract)" 누공은 하나의 내부 개구 및 하나의 외부 개구를 갖는다. "다중관(multiple tracts)"을 갖는 누공은 2개 이상의 외부 개구 및/또는 2개 이상의 내부 개구를 갖는다. 따라서 다중관 누공은 다른 가지를 가진다. 각각의 외부 개구는 전형적으로 관을 나타낸다.

본 발명에 사용된 "치료(treating)"라는 용어는 누공 또는 상처를 회복뿐만 아니라 누공 또는 상처가 악화 또는 반복되는 것을 방지하는 것을 의미한다.

"치료제(therapeutic agent)" 또는 "치료(therapeutic)"는 숙주에 바람직한 생물학적 효과를 가질 수 있는 제제를 의미한다. 화학 치료제 및 유전 독성제는 생물학적인 것과 반대로 일반적으로 원래 화학적인 것으로 알려지거나, 또는 각각 특정한 작용 메커니즘에 의해 치료 효과를 유발하는 치료제의 예시이다. 생물학적 기원의 치료제의 예시는 성장인자, 호르몬 및 사이토킨을 포함한다. 다양한 치료제는 당해 분야에 공지되어 있으며 그의 효과에 의해 식별될 수 있다. 특정한 치료제는 세포 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 예시는 화학요법적 뉴클레오타이드, 약물, 호르몬, 비-특이성(비-항체) 단백질, 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 표적 핵산 서열(예를 들어 mRNA 서열)에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 펩타이드 및 펩타이드 유사물질을 포함한다.

2. 지방 조직-유래 간질 줄기 세포 포함 조성물

본 발명은 특정한 특성, 예를 들어 특정한 표현형을 갖는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 세포 조성물 내 지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 세포 표면 마커 발현, 크기, 글루코스 흡수, 젖산염 생산, 및 세포 수율/생존력을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 특정한 표현형을 갖는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포, 또는 이의 자손의 세포 성분과 같은 실질적으로 순수한 재료를 포함하는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물과 관련된다. 본 발명의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 간세포의 실질적으로 순수한 집단을 포함할뿐만 아니라, 또한 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 금속, 조효소 인자를 포함하는 배양 배지뿐만 아니라 다른 간질 세포의 작은 집단, 예를 들어 본 발명의 세포의 후속 분화에 의해 발생할 수 있는 일부를 포함할 수 있다. 추가로, 다른 비세포 성분은 특정한 환경 하에 지지체에 적절한 세포 성분을 주는 것, 예를 들어, 이식, 예를 들어 지속 배양, 또는 생물재료 또는 약학적 조성물로 사용되기에 적합한 것을 포함할 수 있다.

특정한 실시예에서, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 함유하는 조성물은 3 장(section 3)에서 기술된 배양 방법을 통해 생산된다.

바람직한 ASC는 Cx601 세포이다. 이러한 세포에 대해 제안된(그러나 확정되지 않음) 국제 비전매 명칭(International Nonproprietary Name)은 “아달렉스템셀(Adalextemcel)”이다.

ASC는 표준 배양 조건 하에 플라스틱에 접착된다.

확장된 ASC(eASC)는 배양물 내에서 섬유아세포와 유사한 형태를 나타낸다. 구체적으로, 이러한 세포들은 크기가 크고 길고 가느다란 세포 돌출(projections)이 거의 없는 얕은 세포 몸체인 형태학적인 특징이 있다. 핵은 핵을 선명하게 보이게 하는 현저한 핵인과 함께 크고 둥글다. 대부분의 eASCS는 이러한 스핀들 모양의 형태를 나타내지만, 일부 세포는 다각형 형태가 일반적이다(Zuk et al., 2002).

Cx601 eASC는 표면 마커 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105에 대해 양성이다. 따라서 일부 실시예는 eASC를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 또는 전형적으로 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 eASC는 표면 마커 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105를 발현한다. 전형적으로, 적어도 약 90%의 eASC는 표면 마커 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105를 발현한다. 보다 전형적으로 적어도 약 95%의 eASC는 표면 마커 HLA　I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105를 발현한다.

CX601 eASC는 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 및 CD86에 대하여 음성이다. 따라서 하나의 실시예는 eASC를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 eASC의 약 5% 미만은 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 및 CD86을 발현한다. 보다 전형적으로, 약 4%, 3% 또는 2% 미만의 eASC는 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 및 CD86을 발현한다. 일 실시예에서, 약 1% 미만의 eASC는 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 및 CD86을 발현한다.

일 실시예에서 eASC는 하나 또는 그 이상(예를 들어 둘 또는 그 이상, 셋 또는 그 이상, 넷 또는 그 이상, 다섯 또는 그 이상, 여섯 또는 일곱)의 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105를 발현시킬 수 있다. 일부 실시예에서, eASC는 하나 또는 그 이상(예를 들어 둘 또는 그 이상, 셋 또는 그 이 상, 넷 또는 그 이상, 다섯 또는 그 이상, 여섯 또는 그 이상, 일곱 또는 여덟)의 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80를 발현시키지 않을 수 있다. 일부 실시예에서, eASC는 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105의 넷 또는 그 이상을 발현시키며 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80의 넷 또는 그 이상을 발현시키지 않는다.

본 발명의 특정한 실시예예 따른 확장된 인간 ASC는 DelaRosa et al (“Requirement of IFN-gamma-mediated indoleamine 2,3-dioxygenase expression in the modulation of lymphocyte proliferation by human adipose-derived stem cells.”Tissue Eng Part A. 2009 Oct;15(10):2795-806. doi: 10.1089/ten.TEA.2008.0630) 및 Lopez-Santalla et al 2015 (“Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Modulate Experimental Autoimmune Arthritis by Modifying Early Adaptive T Cell Responses.”STEM CELLS, 33: 3493-3503. doi: 10.1002/stem.2113)에서 기술되었다.

일 실시예에서(Lopez-Santalla et al 2015에서 기술된), 건강한 기증자로부터 인간 지방 조직 흡입물은 인산염 완충 식염수로 두번 세척되고 0.075% 콜라게나제(I 타입; Invitrogen)로 소화된다. 소화된 샘플은 10% 소태아혈청(FBS)로 세척되고, 잔여 적혈구를 제거하기 위해 160mM NH4Cl로 처리되며, 10% FBS와 함께 배양 배지[둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에 현탁된다. 세포를 조직 배양 플라스크에 접종하고(2-3 · 104 cells/cm²) 3-4일마다 배양 배지를 교환하며 확장시켰다(37°C, 5% CO2). 세포가 90% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때 새로운 플라스크로 옮겼다(103 cells/cm2). 세포는 12-14 복제까지 확장하고 동결시켰다. 실험은 12-14 집단 배가(doublings) 시 두명의 남성 및 두명의 여성 성인 기증자로부터 얻은 세포로 수행하였다. ASC는 동일한 냉동저장기(cryobanks)로부터 해동되었고 각 실험 전에 시드되었다. ASC는 국제 세포 치료 학회(International Society for Cellular Therapy)의 기준에 따라 정의되며: HLA-I, CD73, CD90, 및 CD105에 대해 양성이며 CD11b, CD14, CD31, CD34, 및 CD45에 대해 음성이다.

다른 실시예에서(DelaRosa et al 2009에 기술된 것), 건강한 성인 기증자로부터 인간 지방 조직으로부터 수득된 지질흡인물(lipoaspirates)을 PBS로 두번 세척하고, PBS 내 18U=mL의 콜라게나제 I 타입으로 30분 동안 378C로 소화시켰다. 콜라게나제의 1개 유닛은 378C, pH 7.5에서 5시간 콜라겐으로부터 1 mM의 L-류신 동등물을 유리시킨다(Invitrogen, arlsbad, CA). 소화된 샘플을 10% 소태아혈청(FBS)로 세척하고, 160nM ClNH4로 처리하여, 배양 배지(10% FBS를 포함하는 DMEM)에 현탁시키고, 40 mm 나일론 메쉬를 통해 여과시켰다. 세포는 조직 배양 플라스크에 시드되고(2-3_104 cells=cm2) 7일마다 배양 배지를 교환하면서 378C 및 5% CO2에서 확장되었다. 배양물이 90%의 컨플루언스에 도달할 때, 세포는 새로운 배양 플라스크로 전달되었다(10008cells=cm2). 세포는 연골(chondro-), 골성(osteo-), 및 지방성(adipo-genic) 계통으로 분화되는 이들의 능력을 표현형적인 특징으로 한다. 추가로, hASC는 특이적 표면 마커로 염색을 통해 확인되었다. hASC는 HLA-I, CD90, 및 CD105에 대해 양성이며, HLA-II, CD40, CD80, CD86, 및 CD34에 대해 음성이다. 6명의 건강한 기증자(세명의 남성 및 세명의 여성, 35 내지 47세)의 집단이 본 연구에 사용되었다. 세포는 4-6 절(passages)에 사용되었다.

일부 실시예에서 ASC는 (i) APB로부터 특이적인 마커를 발현하지 않으며; (ii) 구성적으로 IDO를 발현하지 않으며 (iii) 구성적으로 MHC II를 현저하게 발현하지 않는다. IDO 또는 MHC II의 일반적인 발현은 IFN-γfh 자극을 통해 유도될 수 있다.

일부 실시예에서 ASC는 하나 또는 그 이상(예를 들어 둘 또는 그 이상, 넷 또는 그 이상, 다섯 또는 그 이상, 여섯 또는 그 이상, 일곱 또는 그 이상, 여덟 또는 그 이상, 아홉 또는 그 이상, 또는 열 또는 그 이상(예를 들어 13개 까지))의 마커 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105를 발현할 수 있다. 예를 들어 ASC는 마커 CD29, CD59, CD90 및 CD105, 예를 들어 CD59 및/또는 CD90의 하나 또는 그 이상(예를 들어 둘, 셋 또는 모두)을 발현할 수 있다.

일부 실시예에서 MSC는 하나 또는 그 이상(예를 들어 둘 또는 그 이상, 셋 또는 그 이상, 넷 또는 그 이상, 다섯 또는 그 이상, 여섯 또는 그 이상, 일곱 또는 그 이상, 여덟 또는 그 이상, 아홉 또는 그 이상, 또는 열 또는 그 이상(예를 들어 15개까지))의 마커 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100, 케라틴, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 및 CD133를 발현시키지 않을 수 있으며, 예를 들어 MSC는 마커 CD34, CD45, CD31 및 CD14, 예를 들어 CD31 및/또는 CD34의 하나 또는 그 이상(예를 들어 둘, 셋 또는 모두)를 발현시키지 않는다.

일 실시예에서, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 일반적으로 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 줄기 세포는 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및/또는 CD105 마커를 발현한다. 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물의 특정한 실시예에서, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 및 일반적으로 약 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 줄기 세포는 CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및/또는 CD133 마커를 발현한다.

다른 실시예에서, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 함유하는 조성물이 제공되며, 상기 줄기 세포의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 일반적으로 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%는 c-Kit, 비멘틴(vimentin) 및/또는 CD90 마커를 발현한다. 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물의 특정한 실시예에서, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 및 일반적으로 약 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 줄기 세포는 CD34, 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100 및/또는 케라틴 마커를 발현한다. 또한 c-Kit, 비멘틴 및 CD90 마커를 발현하며 CD34, 인자 VIII, 알파-액틴, 데스민, S-100 및 케라틴 마커를 발현하지 않는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포 집단이 제공된다.

표면 마커를 통해 세포 집단의 표현형 특성화는 일반적인 방법을 따라 수행되는, 개별적인 세포 염색(유세포 분석(flow cytometry)) 또는 인시추(in situ) 집단의 조직학적 절단(cuts)을 제조함으로써 수행될 수 있다. 항체를 통한 표면 마커의 발현 프로파일의 결정, 면역 표현형 특성은 표지된 항체를 사용하여 직접적이거나 또는 세포 마커의 1차 특이적 항체에 대한 제2 표지된 항체를 사용하여 간접적일 수 있으며, 이에 따라 신호 증폭이 달성된다. 반면, 항체에 결합의 존재 또는 부재는 면역형광 현미경 및 방사선 사진을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 방법을 통해 결정될 수 있다. 유사하게, 유세포 분석, 형광크롬의 수준을 표지된 항체에 특이적으로 결합된 세포 표면 상에 제시된 항원의 양과 관련되도록 하는 기술을 통해 항체의 결합 수준을 모니터링하는 것이 가능하다. 세포 집단에 일련의 표면 마커의 차등 발현은 상기 집단의 식별 및 동정 방법을 제공한다. 따라서, FACS(형광 활성화된 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting))가 전형적으로 사용될 수 있다.

특정한 실시예에서, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 예를 들어 하기 보다 상세하게 기술된 약제 또는 생물제로 사용하기 위한, 다양한 용액 또는 물질 내 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 현탁액이다. 일 실시예에서, 세포 조성물은 링거 용액 및 HAS 내 대상 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 현탁액을 포함한다. 다른 실시예에서, 세포 조성물은 폴리머, 접착제, 겔 등과 같은 물질 내 대상 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 현탁액을 포함한다. 이러한 현탁액은 예를 들어 배양 배지로부터 대상 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 침전시키고 바람직한 용액 또는 물질에 이들을 재현탁시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 세포는 예를 들어 원심분리, 여과, 한외여과 등을 통해, 침전 및/또는 배양 배지가 교환될 수 있다.

대상 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물 내의 대상 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 농도는 적어도 약 5 x 10⁶ cells/mL, 적어도 약 10 x 10⁶ cells/mL, 적어도 약 20 x 10⁶ cells/mL, 적어도 약 30 x 10⁶ cells/mL, 또는 적어도 약 40 x 10⁶ cells/mL일 수 있다. 전형적으로 약 1 x 10⁶ cells/mL 및 1 x 10⁷ cells/mL 사이, 예를 들어 약 5 x 10⁶ cells/mL 및 1 x 10⁷ cells/mL 사이의 농도이다. 실시예에서 보고된 임상 실험에서, eASC는 5백만개 cells / mL의 농도로 투여되었다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 대상 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 자손, 예를 들어 지방 조직 유래 간질 줄기 세포로부터 유도된 세포들과 관련된다. 이러한 자손은 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 후속 세대뿐만 아니라, 예를 들어 인비트로에서 유도된 외식편으로부터 이들의 분리 이후 대상 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 분화를 유도함으로써 발생된 계통 수용된(committed) 세포를 포함할 수 있다. 특정한 실시예에서, 자손 세포는 부모 집단으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10회 계대(passages) 이후 수득된다. 그러나, 자손 세포는 부모 집단으로부터 임의의 횟수의 계대 이후 얻어질 수 있다.

특정한 실시예에서, 본 발명의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 약학적 제제의 일부로서, 예를 들어 멸균된, 원치 않는 바이러스, 박테리아 및 다른 병원균의 존재가 없는 것뿐만 아니라 무피로겐 제제로 제공될 것이다. 즉 인간에 투여를 위해, 대상 조성물은 무균성, 발열원성뿐만 아니라 FDA 사무소의 생물학적 기준에서 요구되는 안전성 및 순도 기준을 충족시켜야 한다.

확장된 지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 이식 숙주에 관하여 동종이다. 충분한 자가 줄기 세포를 수득하는데 어려움이 있기 때문에, 동종 기증자로부터 지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 치료 용도를 위한 줄기 세포의 중요한 대체 원천을 구성한다. 골수 간질 줄기 세포 및 지방 조직 유래 간질 세포는 인비트로에서 동종 림프구의 반응을 일으키지 않으며, 결과적으로 기증자로부터 유래된 동종 지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 MHC 비호환성과 무관하게 임의의 환자에 대해 사용될 수 있음이 본 발명의 기술분야에 알려져 있다.

본 발명에 구체적으로 설명된 개체, 특히 인간 개체에 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 방법은 개체의 표적 부위에 세포의 주사 또는 이식을 포함하며, 상기 세포는 개체로 세포의 주사 또는 이식을 통해 도입을 촉진하는 전달 장치로 삽입될 수 있다. 이러한 전달 장치는 수용 개체의 신체로 세포 및 유체를 주사하기 위한 튜브, 예를 들어 카테터를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 튜브는 추가적으로 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물이 목표하는 위치로 개체에 도입될 수 있게 하는 바늘, 예를 들어 주사기를 가진다. 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 이러한 전달 장치, 예를 들어 다른 형태의 주사기로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 용액에 현탁되거나 또는 이러한 전달 장치에 포함될 때 지지체 기질에 내장된(embedded) 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 조성물을 포함한다.

약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 식염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이러한 담체 및 희석제의 사용은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 상기 용액은 일반적으로 멸균 상태이며 쉽게 주사 가능할 수 있는 정도로 유동적이다. 일반적으로, 용액은 제조 및 저장 상태에서 안정하며, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 및 티메로살(thimerosal) 등의 사용을 통해 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 활성으로부터 보존된다. 본 발명의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포 조성물인 용액은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및, 필요에 따라 상기 나열된 다른 성분 내에서, 본 발명에 기술된 것과 같은 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 병합하고, 이후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체로 제공될 수 있는 재료 및 용액의 일부 실시예는 하기를 포함한다: (1) 당류, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예를 들어 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스터, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; (15) 알긴산; (16) 무피로겐 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충된 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 다중무수물; 및 (22) 약학 제형에 사용되는 다른 무독성 상용성 물질.　

특정한 실시예에서, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 추가로 접착제를 포함한다. 특정한 실시예에서, 접착제는 피브린 기초의 접착제, 예를 들어 피브린 겔 또는 피브린 글루(glue) 또는 피브린 기초 폴리머 또는 접착제 또는 다른 조직 접착제 또는 수술용 글루, 예를 들어 시아노아크릴레이트, 콜라겐, 트롬빈, 및 폴리에틸렌글리콜이다. 사용될 수 있는 다른 물질은 칼슘 알긴산염, 아가로스, I, II, IV 또는 다른 타입의 콜라겐 동형체, 폴리-락트/폴리-글리콜산, 히알루론산염 유도체 또는 다른 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다 (Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechriest VF. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541; Chu CR et al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-1154; Hendrickson DA et al. (1994) Orthop. Res. 12:485-497). 다른 실시예에서, 접착제는 액체 결합제(bandage)이며, 상기 방법의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 액체 결합제 물질과 혼합된다. "액체 결합제(liquid bandage)"는 스프레이 또는 브러쉬와 함께 상처에 적용된 후, 이후 상처에 보호 필름을 제공하기 위해 증발을 통해 용매가 제거되는 화합물, 예를 들어 폴리머 물질을 포함하는 용액이다.

본 발명의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 또한 지지체, 예를 들어 의료 장치를 코팅하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 지지체는 봉합사(suture) 또는 실(thread)일 수 있다.

본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법으로, 예를 들어 담금(soaking), 분무, 도장, 각인 등을 통해 상기 지지체는 세포로 코팅될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 지지체는 봉합사, 스테이플(staple), 흡수성 실, 비흡수성 실, 천연 실, 합성 실, 단섬유 실 또는 다중섬유 실(소위 브라이드(braids))이다. 지방 조직 유래 간질 줄기 세포로 코팅된 상처를 닫는데 사용되는 봉합사 및 다른 지지체를 제조하는 바람직한 방법은 2005년 2월 14일에 출원된 미국 특허출원번호 11/056,241 "Biomaterial for Suturing"에 개시되어 있으며, 상기 출원은 이의 전체가 참고문헌으로 포함된다. 본 발명에 개시된 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물은 미국 특허출원번호 11/056,241에 개시된 방법과 함께 사용될 수 있는 신규 조성물을 나타낸다.

추가로, 임의의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물에서, 적어도 하나의 치료제가 조성물에 포함될 수 있다(비록 요구되지 않고 선택적으로 제외될 수 있더라도). 예를 들어, 조성물은 염증 또는 누공 부위의 통증을 치료하는 것을 돕는 진통제(analgesic), 또는 상기 조성물로 처리된 부위의 감염을 억제하는 항감염제를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 유용한 치료제의 비제한적인 예시는 하기 치료제(therapeutic) 카테고리를 포함한다: 진통제, 예를 들어 비스테로이드성 소염 약물, 아편양 작용물질 또는 살리실레이트; 항-감염제, 예를 들어 구충제, 항혐기성, 항생제, 아미노글리코사이드 항생제, 항진균성 항생제, 광범위 항생제, 세팔로스포린 항생제, 마크로리드 항생제, 다양한 β-락탐 항생제, 페니실린 항생제, 퀴놀론 항생제, 설폰아미드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 항마이코박테리아제, 항결핵성 항마이코박테리아제, 항원충제, 항말라리아성 항원충제, 항바이러스제, 항-레트로바이러스제, 옴벌레살충제, 소염제, 코르티코스테로이드성 소염제, 항소양제/국소 마취제, 국소 항-감염제, 항진균성 국소 항-감염제, 항바이러스성 국소 항-감염제; 전해성 및 신장약, 예를 들어 산성화제, 알칼리화제, 이뇨제, 카보닉 안하이드라제 억제제 이뇨제, 루프 이뇨제, 삼투성 이뇨제, 칼륨-보존 이뇨제, 티아지드 이뇨제, 전해질 대체제, 및 요산배설 촉진제; 효소, 예를 들어 췌장 효소 및 혈전용해 효소; 위장약, 예를 들어 항설사제, 항구토제, 위장 소염제, 살리실레이트 위장 소염제, 항산성 항-궤양제, 위산-펌프 억제제 항-궤양제, 위장 점막 항-궤양제, H2-차단제 항-궤양제, 담석용해제, 소화제, 구토제, 하제 및 대변 연화제, 및 위장운동촉진제; 일반 마취제, 예를 들어 흡입 마취제, 할로겐화된 흡입 마취제, 정맥내 마취제, 바비튜레이트 정맥내 마취제, 벤조디아제핀 정맥내 마취제, 및 아편양 작용물질 정맥내 마취제; 호르몬 또는 호르몬 변형제, 예를 들어 낙태제, 부신제, 코르티코스테로이드 부신제, 안드로젠, 항-안드로젠, 면역생물제, 예를 들어 면역글로불린, 면역억제제, 톡소이드, 및 백신; 국소 마취제, 예를 들어 아미드 국소 마취제 및 에스테르 국소 마취제; 근골격제, 예를 들어 항-통풍성 소염제, 코르티코스테로이드 소염제, 금 화합물 소염제, 면역억제성 소염제, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 살리실레이트 소염제, 미네랄; 및 비타민, 예를 들어 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K.

상기 카테고리로부터 유용한 치료제의 바람직한 분류는 하기를 포함한다: (1) 일반적인 진통제, 예를 들어 리도카인 또는 이의 유도체, 및 디클로페낙, 이부프로펜, 케토프로펜, 및 나프록센을 포함하는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs) 진통제; (2) 아편 작용 진통제, 예를 들어 코데인, 펜타닐, 하이드로몰폰, 및 모르핀; (3) 살리실산 진통제, 예를 들어 아스피린(ASA) (장용성 코팅된 ASA); (4) H₁-차단제, 예를 들어 클레마스틴 및 터페나딘; (5) 항감염제, 예를 들어 무피로신; (6) 항혐기성 항감염제, 예를 들어 클로람페니콜 및 클린다미신; (7) 항진균 항생제 항감염제, 예를 들어 암포테리신 b, 클로트리마졸, 플루코나졸, 및 케토코나졸; (8) 마크롤라이드 항생제 항감염제, 예를 들어 아지스로마이신 및 에리스로마이신; (9) 다양한 b-락탐 항생제 항감염제, 예를 들어 아즈트레오남 및 이미페넴; (10) 페니실린 항생제 항감염제, 예를 들어 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 및 페니실린 V; (11) 퀴놀론 항생제 항감염제, 예를 들어 시프로플록사신 및 노르플록사신; (12) 테트라사이클린 항생제 항감염제, 예를 들어 독시사이클린, 미노사이클린, 및 테트라사이클린; (13) 항결핵균 항마이코박테리아 항감염제 예를 들어 이소니아지드(INH), 및 리팜핀; (14) 항원충 항감염제, 예를 들어 아토바쿠온 및 댑손; (15) 항말라리아 항원충 항감염제, 예를 들어 클로로퀸 및 피리메타민; (16) 항레트로바이러스 항감염제, 예를 들어 리토나비르 및 지도부딘; (17) 항바이러스 항감염제, 예를 들어 아시클로비르, 간시클로비르, 인터페론 알파, 및 리만타딘; (18) 항진균 국소 항감염제, 예를 들어 암포테리신 B, 클로트리마졸, 미코나졸, 및 니스타틴; (19) 항바이러스 국소 항감염제, 예를 들어 아시클로비르; (20) 전해성 및 신장약, 예를 들어 락툴로스; (21) 루프 이뇨제, 예를 들어 푸로세미드; (22) 칼륨 보존 이뇨제, 예를 들어 트리암테렌; (23) 티아지드 이뇨제, 예를 들어 하이드로클로로티아지드(HCTZ); (24) 요산 배설제, 예를 들어 프로베네시드; (25) 효소 예를 들어 RNase 및 DNase; (26) 구토 방지제, 예를 들어 프로클로페라진; (27) 살리실산염 위장 항염증제, 예를 들어 설파살라진; (28) 위산 펌프 억제제 항궤양 제제, 예를 들어 오메프라졸; (29) H₂-차단제 항궤양제, 예를 들어 시메티딘, 파모티딘, 니자티딘, 및 라니티딘; (30) 소화제, 예를 들어 판크레리파제; (31) 위장운동 촉진제, 예를 들어 에리스로마이신; (32) 에스터 국소 마취제, 예를 들어 벤조카인 및 프로카인; (33) 근골격제 코르티코스테로이드 항염증제, 예를 들어 베클로메타손, 베타메타손, 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 및 프레드니손; (34) 근골격 항염증 면역억제제, 예를 들어 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 및 메토트렉세이트; (35) 근골격 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs), 예를 들어 디클로페낙, 이부프로펜, 케토프로펜, 케톨락, 및 나프록센; (36) 미네랄, 예를 들어 철, 칼슘, 및 마그네슘; (37) 비타민 B 화합물, 예를 들어 시아노코발라민(비타민 B₁₂) 및 니아신(비타민 B₃); (38) 비타민 C 화합물, 예를 들어 아스코르브산; 및 (39) 비타민 D 화합물, 예를 들어 칼시트리올.

특정한 실시예에서, 치료제는 세포 분화 및/또는 증식에 영향을 주는 성장 인자 또는 다른 분자일 수 있다. 최종 분화 상태를 유도하는 성장 인자는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 최종 분화 상태를 유도하는 것으로 나타난 임의의 이러한 인자로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 기술된 방법에서 사용하기 위한 성장 인자는, 특정한 실시예에서, 자연 발생 성장 인자의 변이체 또는 절편일 수 있다. 예를 들어, 변이체는 보존적 아미노산 변화를 만들고 상기 기술된 기능적 분석의 하나 또는 본 기술분야에 알려진 다른 기능적 분석에 결과물 변이체를 시험함으로써 발생될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 호환성을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이며; 지방족 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드 포함 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라진 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이며; 황을 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라진-글루타민이다.

본 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 폴리펩타이드 성장 인자의 변이체 또는 절편은 종래의 기술, 예를 들어 불연속 점 돌연변이(들)을 생성하거나, 또는 절단에 의한 것과 같은 돌연변이를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 그것이 유래된 폴리펩티드 성장 인자의 생물학적 활성의 실질적으로 동일하거나, 또는 단지 서브세트(subset)를 보유하는 변이체를 야기할 수 있다.

3. 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물의 제조 방법

eASC를 제공하기 위한 ASC의 분리 및 배양 방법과 본 발명의 세포 집단, 및 본 발명의 세포 집단을 포함하는 조성물은 본 기술분야에 알려져 있다. 세포 집단을 포함하는 조성물의 일반적인 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:

(i) 지방 조직의 간질 분획으로부터 ASC를 분리하고 적절한 표면, 예를 들어 플라스틱에 접착을 통해 선별하는 단계

(ii) eASC를 포함하는 본 발명의 세포 집단을 제공하기 위해 ASC를 확장하는 단계.

선택적으로 본 발명의 세포 집단은 확장 단계 (ii) 동안 및/또는 이후에 동결 보존될 수 있다. 선택적으로 본 발명의 세포 집단의 표현형은 확장 단계 (ii) 동안 및/또는 이후에 평가될 수 있다. 선택적으로 본 발명의 세포 집단은 확장 단계 (ii) 이후에 분리되고 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제에 재현탁될 수 있다.

ASC는 본 기술분야에서 표준이 되는 임의의 방법을 통해 얻을 수 있다. 전형적으로 콜라게나제와 같은 소화 효소로 조직을 처리함으로써, 전형적으로 상기 세포는 원천 조직(지질 흡인물 또는 지방 조직)으로부터 세포를 분리함으로써 얻을 수 있다. 소화된 조직 물질은 이후에 전형적으로 약 20 마이크론 내지 1mm 사이의 필터를 통해 여과된다. 상기 세포는 이후 분리되며(전형적으로 원심분리에 의해) 접착 표면(전형적으로 조직 배양 플레이트 또는 플라스크) 상에 배양된다. 이러한 방법은 본 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허번호 6777231에 개시된 바와 같다. 이러한 방법론에 따르면, 지질 흡인물은 이것이 유래된 지방 조직 및 세포로부터 얻는다. 이러한 방법론의 과정에서, 상기 세포는 오염된 파편 및 적혈구 세포를 제거하기 위해 세척될 수 있으며, 바람직하게 PBS로 세척될 수 있다. 상기 세포는 PBS에서 콜라게나제로 소화된다(예를 들어 30분 동안 37℃, 0.075% 콜라게나제; I형, Invitrogen, Carlsbad, CA). 잔여 적혈구 세포를 제거하기 위해, 소화된 샘플은 세척되고(예를 들어 10% 소 태아 혈청으로), 160 mmol/L ClNH4로 처리되며, 최종적으로 DMEM 완전 배지에 현탁된다 (10% FBS, 2 mmol/L 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM). 상기 세포들은 40 μm 나일론 메쉬를 통해 여과될 수 있다.

상기 세포는 ASC의 접착을 위해 적절현 표면(예를 들어 플라스틱)을 포함하는 적절한 조직 배양 용기(vessel)에서 배양된다. 접착 간질 세포(예를 들어 ASC)의 분리된 집단을 제공하기 위해, 비접착 세포는 예를 들어 적절한 버퍼에서 세척을 통해 제거된다. 이러한 방식으로 분리된 세포는 조직 배양 플라스크에 접종될 수 있으며 (바람직하게 2-3x104 cells/cm2) 매 3-4일마다 배양 배지를 교체하면서 37℃ 및 5% CO2에서 확장된다. 세포는 바람직하게 접착 표면으로부터 탈락되며(deatxhed) (예를 들어 트립신의 수단을 통해) 배양물이 약 90%의 컨플루언스에 도달할 때 새로운 배양 플라스크(1,000 cells/cm2)로 통과되었다(passed)(“계대(passaged)”).

세포 분리는 바람직하게 멸균 또는 GMP 조건 하에서 수행되었다.

일 실시예에서, 방법은 하기를 포함한다: (a) 대상으로부터 지방 조직을 수집하는 단계; (b) 효소 소화를 통해 세포 현탁물을 얻는 단계; (c) 세포 현택물을 침전시키고 배양 배지 내에 세포를 재현탁하는 단계; (d) 적어도 약 10일 동안 세포를 배양하는 단계; 및 (g) 적어도 두번의 배양 계대(passages)로 세포를 확장하는 단계.

지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 동종이며, 즉 최종 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물이 도입되는 대상의 지방 조직으로부터 분리되지 않는다.

특정한 실시예에서, 상기 세포는 적어도 약 15, 적어도 약 20일, 적어도 약 25일, 또는 적어도 약 30일 동안 배양된다. 일반적으로 배양물 내 세포의 확장은 세포 집단 내 세포 표현형의 균질성을 증진시켜, 실질적으로 순수한 또는 균질한 집단이 얻어지도록 한다.

특정한 실시예에서, 상기 세포는 적어도 3회 배양 계대(passages)로 또는 “적어도 3회 계대(passaged)”로 배양물 내에 확장된다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 또는 적어도 10회 계대된다. 세포 집단 내에서 세포 표현형의 균질성을 증진시키기 위해 세포는 3회 초과로 계대되는 것이 바람직하다. 실제로, 세포 표현형의 균질성이 증진되고 차등 용량이 유지되는 한 상기 세포는 배양물에서 무기한 확장될 수 있다.

특정한 실시예에서, 상기 세포는 적어도 세번 집단 배가(doubling)되도록 배양물에서 증대된다. 특정한 실시예에서, 상기 세포는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20회 집단 배가되도록 배양물에서 증대된다. 특정한 실시예에서, 상기 세포는 7, 8, 9, 10, 15 또는 20회 미만 집단 배가되도록 배양물에서 증대된다. 특정한 실시예에서, 상기 세포는 약 5 내지 10회 집단 배가되도록 배양물에서 증대된다. 특정한 실시예에서, 상기 세포는 약 10 내지 15회 집단 배가되도록 배양물에서 증대된다.

특정한 실시예에서, 상기 세포는 약 15 내지 20회 집단 배가, 예를 들어 약 16회 집단 배가되도록 배양물에서 증대된다.

세포는 줄기 세포 배양을 위한 본 기술분야에 알려진 임의의 기술을 통해 배양될 수 있다. 다양한 배양 기술에 대한 논의뿐만 아니라 이들의 규모 확대는 Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, Wiley-Liss 2000에서 찾을 수 있다. 세포는 배양 플라스크 또는 대규모 확장에 적절한 생물반응기를 사용하여 확장될 수 있다. 중간엽 간질 세포의 대규모 확장에 적절한 생물반응기는 시판중이며 2D(즉 실질적으로 평면) 및 3D 확장 생물반응기 모두를 포함할 수 있다. 이러한 생물반응기의 예시는 플러그 유동 생물반응기, 관류 생물반응기, 연속 교반 탱크 생물반응기, 고정-바닥(stationary-bed) 생물반응기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시예에서, 상기 세포는 단일층 배양을 통해 배양된다. 일 실시예에서, 상기 세포는 하기 실시예 A에 기술된 것처럼 배양 및 계대된다(passaged).

조직 배양물 내 간질 세포를 지지할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다. 섬유아세포의 성장을 돕는 배지 제형은 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM), 알파 변형된 최소 필수 배지(alpha.MEM), 및 로스웰 파크 기념 연구 배지(Roswell Park Memorial Institute Media) 1640 (RPMI 배지 1640) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로 0 내지 20% 소 태아 혈청(FBS) 또는 1-20% 말 혈청은 간질 세포 및/또는 연골세포의 성장을 돕기 위해 상기 배지에 첨가될 것이다. 그러나, 간질 세포 및 연골세포를 위해 FBS 내에서 성장 인자, 사이토카인, 및 호르몬이 식별되고 성장 배지에서 적절한 농도로 제공되는 경우에, 정의된 배지가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 배지는 하나 또는 그 이상의 관심 화합물을 포함할 수 있으나, 간질 세포에 대한 항생물질 유사분열 또는 분화 화합물에 한정되지 않는다. 상기 세포는 습윤한 배양기에서 31℃ 내지 37℃ 사이의 온도로 자랄 것이다. 이산화탄소 함량은 2% 내지 10% 사이 및 산소 함량은 1% 내지 22% 사이로 유지될 것이다. 세포는 4주까지의 기간 동안 이러한 환경에서 유지될 수 있다.

배지로 보충될 수 있는 항생물질은 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 화학적으로 정의된 배양 배지 내 페니실린의 농도는 ml 당 약 10 내지 약 200 유닛이다. 화학적으로 정의된 배양 배지 내 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200 ug/ml이다.

상기 지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 플라스미드, 바이러스 또는 대안적 벡터 전략을 사용하여 핵산이 안정하게 또는 일시적으로 형질전환 또는 형질도입될 수 있다. 관심 핵산은 회복되는 조직 유형, 예를 들어 장벽 또는 질벽에서 발견되는 세포외 기질 성분의 생산을 증진시키는 유전자 산물을 코딩하는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

간질 줄기 세포로 조절 유전자를 수송하는 바이러스 벡터의 형질도입은 염화세슘 밴딩 또는 10:1 내지 2000:1 (바이러스 유닛:세포)사이의 감염의 다양성에서 다른 방법에 의해 정제된 바이러스 벡터(아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 다른 벡터)로 수행될 수 있다. 1시간 내지 24시간의 기간 동안 폴리에틸렌이민 또는 리포펙타민.TM.과 같은 양이온성 세제의 부재 또는 존재 하에 무혈청 또는 혈청을 포함하는 배지에서 세포는 바이러스에 노출될 것이다(Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49).

줄기 세포로 벡터 또는 플라스미드를 전달하는 다른 적절한 방법은 지질/DNA 복합체, 예를 들어 미국 특허출원번호 5,578,475; 5,627,175; 5,705,308; 5,744,335; 5,976,567; 6,020,202; 및 6,051,429에 기술된 것들이다. 적절한 시약은 리포펙타민, 폴리-양이온성 지질 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스-아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA)의 3:1 (w/w) 리포좀 제형(화학 요약 등록 명칭: N-[2-(2,5-비스[(3-아미노프로필)아미노]-1―옥스펜틸}아미노)에틸]-N,N-디메틸-2,3-비스(9-옥타데세닐옥시)-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트), 및 막 여과된 물 내 중성 지질 디올레오일 포스파티딜에타놀아민(DOPE)를 포함한다. 예시는 제형 리포펙타민 2000TM이다(Gibco/Life Technologies # 11668019로부터 활용 가능). 다른 시약은 하기를 포함한다: FuGENETM 6 형질전환 시약 (Roche Diagnostics Corp. # 1814443로부터 얻을 수 있는 80% 에탄올 내 비-리포좀 형태 내 지질 및 다른 화합물의 혼합물); 및 LipoTAXITM 형질전환 시약(Invitrogen Corp., #204110로부터 지질 제형). 줄기 세포의 형질전환은 전기천공, 예를 들어 M.L. Roach and J.D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1에 기술된 것을 통해 수행될 수 있다. 안정한 유전적 변화를 갖는 줄기 세포를 생산하기 위한 적절한 바이러스 벡터 시스템은 아데노바이러스 및 레트로바이러스에 기초할 수 있으며, 상업적으로 활용 가능한 바이러스 성분을 사용하여 제조될 수 있다.

줄기 간질 세포로 조절 유전자를 수송하는 플라스미드 벡터의 형질전환은 칼슘 포스페이트 DNA 침전 또는 양이온성 세제 방법(리포펙타민.TM., DOTAP)을 사용함으로써 또는 생물적합성 폴리머에 플라스미드 DNA 벡터를 직접적으로 병합(Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5:753-759)함으로써 3차원 배양으로 단일층 배양물 내 세포로 도입될 수 있다.

이들 유전자의 의해 코딩된 기능적 단백질의 추적 및 검출을 위해, 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터는 용이하게 검출 가능한 마커 유전자, 예를 들어 조직 화학적 수단을 통해 추적될 수 있는 녹색 형광 단백질 또는 베타 갈락토시다제 효소 모두를 포함할 것이다.

4. 복합 항문주위 누공의 치료

본 발명은 확장된 동종 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 사용하여 크론병 환자의 복합 항문주위 누공을 치료하는 것에 관한 것이다. 지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 전형적으로 본 발명에 설명된 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물, 종종 “Cx601”로 언급되는 것을 포함한다. 그러나, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 다른 제조는 본 발명에 기술된 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들어 미국 특허출원번호 6,777,231 및 6,555,374 및 2005년 2월 25일에 출원된 미국 특허출원번호 11/065,461 “Identification and Isolation of Multipotent Cells From Non-Osteochondral Mesenchymal Tissue”가 있다.

실시예는 동종 eASC가 놀랍게도 크론병 환자에서 복합 항문주위 누공에 대한 효과적인 치료법인 한편, 단일 투여는 종래의 치료법에서는 반응하지 않은 치료가 가장 어려운 매우 복잡한 누공에서도 빠르고 지속적인 치료 효과를 제공할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 유익한 효과는 전형적으로 약 6주 정도에 나타나며, 유익한 효과는 전형적으로 치료로부터 24주까지 지속된다.

일 실시예에서, 크론병 환자의 복합 난치성 항문주위 누공을 치료하는 방법은 누공의 모든 관으로 약 1억 2천만개의 확장된 동종 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 주사하는 단계를 포함한다. 의심을 회피하기 위해, 본 실시예에서 1억 2천만개의 세포는 각각의 누관이 이러한 투여의 적어도 일부분을 수여받도록, 단일 절차로 환자에게 투여되었다. 투여량의 약 절반은 내부 개구 또는 개구 주변의 조직으로 주사되었다. 다른 절반은 모든 누관(들)을 따라 누공벽(깊이 2 mm 미만)으로 주사되어 몇몇의 미세 기포(micro-blebs)를 만든다. 실시예의 데이터는 이러한 단일 투여가 24주 또는 그 미만, 약 6주 또는 약 8주 내에 조합된 관해(remission)을 제공할 수 있음을 나타내었다. 따라서, 일 실시예에서, 치료법은 이러한 1억 2천만개의 eASC의 병변 내 단일 투여로 이루어진다.

병변 내(intraesional) 주사는 전형적으로 예시적인 임상 실험에서와 같이 수행되는 한편, 세포 현탁물은 내부 개구(들)(항문을 통해 진입하는 주사기로) 및 누관 벽(누공의 외부 개구를 통해 진입하는 주사기로)을 통해 주사된다.

환자는 남성 또는 여성일 수 있다. 환자는 일반 성인이다.

일 실시예에서, 존재할 수 있는 임의의 관선(setons)이 먼저 제거된다. 전형적으로, 누공은 eASC의 투여 전에 큐렛을 통해 제거된다(curetted). 내부 개구는 선택적으로 봉합될 수 있다. eASC는 이후 세밀하고 긴 바늘로 투여된다. 상기 언급한 바와 같이, 투여량의 약 절반은 봉합된 내부 개구(들) 주변의 조직으로 주사된다. 나머지 절반은 모든 누관(들)을 따라 누관벽(깊이 2 mm 미만)으로 주사되어 미세-기포(micro-blebs)를 만든다.

본 발명에 따른 치료 전에, 골반 MRI 스캔이 수술 절차를 가이드하기 위한 검진에서 수행될 수 있다. 환자들은 또한 시험(investigational) 제품 투여 2주 이상 전에 임상적으로 지시된 누공 소파(curettage) 및 관선 배치를 받을 수 있다(도 1). 만약 관선이 배치되는 경우, 시험 제품 투여 직전에 이것이 취소되었다.

치료되는 환자는 크론병, 전형적으로 내강(luminal) 크론병을 갖는다. 전형적으로 환자는 예를 들어 크론병 활성도 지수(CDAI) =220^A24으로 정의된 것처럼, 비활성 또는 약한 활성의 내강 크론병을 갖는다. 상기 환자는 적어도 6개월 동안 크론병을 가질 수 있다.

상기 환자는 적어도 하나의 복합 항문주위 누공을 갖는다. 일 실시예에서, 상기 환자는 직장질루, 직장 협착증(rectal stenosis), 항문 협착(anal stenosis), 활성 중증 직장염(active severe proctitis)(궤양의 표피 또는 깊은 곳에 존재하는 것으로 정의), 전환기문(diverting stomas), 또는 수술적 준비 절차에 의해 해결되지 않은 >2cm 농양 또는 수집물을 갖지 않는다.

환자는 적어도 하나의 종래의 약물 치료법에 내성이다. 종래 치료법은 소분자 약물 또는 생물학적 의료 제품일 수 있다. 전형적으로 환자는 적어도 약 4, 6, 12, 18, 24 또는 36주 동안 상기 치료를 받으며, 활성 질병의 증상을 여전히 나타낸다. 다시 말해, 적어도 약 4, 6, 12, 18, 24 또는 36주 동안 치료 이후에도, 누공의 심각도가 완화되지 않는다. 종래 치료법은 항생제 치료, 예를 들어 시프로플록사신 또는 메트로니다졸, 면역억제 치료(예를 들어 퓨린 유사체, 예를 들어 아자티오퓨린 또는 6-메르캅토퓨린, 피리미딘 유사체, 예를 들어 플루오로우라실, 또는 엽산 유사체, 예를 들어 메토트라세이트), 또는 항-TNF 치료, 예를 들어 아달리무맙(Humira), 세르톨리주맙(Cimzia), 에타널셉트(Enbrel), 골리무맙(Simponi), 또는 인플릭시맙(Remicade)일 수 있다. 자격이 있는 환자는 일반적으로 하기 치료의 적어도 하나에 내성(미반응)이다: 항생제(예를 들어 시프로플록사신, 메트로니다졸)의 1개월 이후; 및/또는 면역억제제(예를 들어 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린) 3개월 이후; 및/또는 적절한 투여량으로 항-TNF 치료법(예를 들어 인플릭시맙, 에타넬셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙)의 유도 또는 유지.

일 실시예에서 환자는 면역억제제(예를 들어 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린) 및 TNF-α 억제자(예를 들어 인플릭시맙 또는 아달리무맙)에 대해 치료 내성이다.

따라서 전형적인 환자는 항생제, 면역억제제 또는 항-TNF 치료의 하나 또는 그 이상에 불충분한 반응을 나타낸 환자이며, 1 또는 2개 내부 개구 및 2 또는 3개 외부 개구를 갖는 복합 항문주위 누공을 가지며, 적어도 6개월 동안 진단받은 비활성 내강 크론병(CDAI =220)을 갖는다. 1개 또는 2개 내부 개구 및 3개 외부 개구를 갖는 누공은 매우 복합적이며 현재까지 치료가 매우 어렵다. 추가적인 실시예에서, 본 발명에 따른 치료 기간에서, 환자는 (a) 항-TNF 치료법을 받지 않고 면역억제 치료법을 받지 않거나, 또는 (b) 항-TNF 요법 및 면역억제 치료법을 모두 받는다. eASC가 항-TNF 및 면역억제 치료법을 모두 받는 환자에서 조합된 관해(24주)를 현저하게 증진시킬 수 있음은 특히 놀라우며, 이는 현재 활용 가능한 치료법 중 최선이다(도 3C 참조).

복합 항문주위 누공은 적어도 2개의 외부 개구, 예를 들어 3개 또는 그 이상의 외부 개구를 갖는다. 일부 누공은 4개 또는 5개 외부 개구를 가질 수 있다.

복합 항문주위 누공은 전형적으로 다중관, 적어도 2개의 내부 개구, 또는 3개의 외부 개구를 갖는다. 상기 누공은 선택적으로 2개 또는 3개의 이러한 특징을 포함할 수 있으며, 예를 들어: 다중관 및 적어도 2개의 내부 개구; 다중관 및 3개의 외부 개구; 적어도 2개 내부 개구 및 3개 외부 개구; 또는 다중관, 적어도 2개 내부 개구 및 3개 외부 개구. 일 실시예에서, 복합 항문주위 누공은 2개 미만의 내부 개구 및 3개 외부 개구를 포함하며, 예를 들어 상기 누공은 1개 또는 2개의 내부 개구 및 2개 또는 3개의 외부 개구(예를 들어 1IO/2EO, 1IO/3EO, 2IO/2EO, 또는 2IO/3EO)로 이루어진다.

eASC 투여 이후, 환자는 4주 미만 동안 항생제로 선택적으로 치료될 수 있다. 면역억제제 및 항-TNF는 치료 과정 중에, 예를 들어 반응, 임상적 관해 또는 조합된 관해까지 안정한 투여량으로 유지될 수 있다.

항생제를 포함하는 항문주위 누공(fistulizing) 크론병에 대해 사전 치료를 받지 않은 환자들, 및 배약 또는 관선 배치보다 활성 누공에 대해 사전 수술을 받은 이들은 일반적으로 제외되었다. 일반적으로 eASC 치료 직전 4주 내에 글루코코르티코스테로이드를 받는 환자의 경우 치료 자격이 없다. 스테로이드 절차는 최대 12주 동안 40 mg의 시작 용량으로 추적 검사 중에 내강 질병의 발병을 치료할 수 있다.

특정한 실시예에서, 예를 들어 세포의 제1 전달이 불충분하면, 상기 방법은 추가로 eASC의 추가적인 투여를 포함할 수 있다. 이러한 추가적 투여는 하기를 포함할 수 있다: (c) 적어도 약 20 x 10⁶개 세포, 적어도 약 30 x 10⁶, 또는 적어도 약 40 x 10⁶개 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 제2 투여량을 전달하는 단계, 예를 들어 본 발명의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물 내, 예를 들어 약 1억 2천만개 세포를 (선택적으로 봉합 폐쇄된) 내부 구멍 및 누공벽으로 전달하는 단계.

일부 실시예에서, 개체의 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하는 방법은 하기를 포함한다: (a) 동종 eASC를 포함하는 봉합으로 내부 구멍을 폐쇄하는 단계. 이러한 개체 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물 내 세포로 코팅된 봉합사는 구체적으로 2005년 2월 14일에 출원된 미국 특허출원번호 11/056,241에 기술되며, 이는 참고문헌으로 본 발명에 포함된다.

상기 방법은 일부 실시예에서 추가로 하기를 추가로 포함할 수 있다: 적어도 하나의 누관의 깊은 스크래핑(scraping); 및/또는 물질로 상기 누관을 채우는 단계. 특정한 실시예에서, 상기 방법은 예를 들어 개체 세포 조성물로부터 물질로, 적어도 약 10 x 10⁶개의　지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 전달하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 물질은 피브린 기초의 폴리머 또는 접착제, 예를 들어 피브린 글루(glue) 또는 겔이다. 특정한 실시예에서, 적어도 약 10 x 10⁶개 지방 조직 유래 간질 줄기 세포의 투여량은 상기 물질 내에 이미 포함되어, 예를 들어 상기 물질은 지방 조직 유래 줄기 세포를 포함하는 조성물을 포함하도록 한다.

추가적 실시예에서, 개체 내 누공을 치료하는 방법은 하기를 포함한다:

예를 들어 본 발명의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물에서,

(i) 적어도 하나의 누관의 깊은 스크래핑하는 단계

(ii) 봉합사로 스크랩된 관의 내부 구멍을 폐쇄하는 단계

(iii) (선택적으로 봉합 폐쇠된) 내부 개구 및 누관벽으로 약 1억 2천만개의 동종 확장된 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 전달하는 단계.

세포의 추가적인 투여는 필요로 하지 않으며 선택적으로 제외될 수 있다. 그러나, 특정한 실시예에서 상기 방법은 추가로 하기를 포함할 수 있다:

(iv) 전형적으로 봉합 폐쇄된 내부 개구에, 적어도 약 20 x 10⁶개의 세포, 적어도 약 30 x 10⁶개, 또는 적어도 약 40 x 10⁶개의 지방 조직 유래 간질 줄기 세포, 예를 들어 약 1억 2천만개의 eASC의 제2 투여량을 전달하는 단계.

(i) 단계는 전형적으로 치료되는 모든 누관을 깊게 스크래핑함으로써 수행되며, 예를 들어 소파(curettage) 바늘은 누관으로 도입되고, 유도된 출혈은 누관벽을 스크래핑함으로써 생산되어, 누관을 채우게 되는 천연 피브린을 수득한다. 발명자들에 의한 종래 임상 연구는 이러한 스크래핑 방법을 통해 생산된 천연 피브린이 인공 피브린 실런트(sealants)의 사용에 비해 바람직한 선택임을 제안하며, 따라서 본 발명의 방법의 바람직한 실시예에서 치료되는 누관은 이러한 물질로 채워지지 않는다.

(iv) 단계는 누관을 따라 누공벽으로 주사를 통해, 세포, 예를 들어 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물의 국소 전달을 통해 수행된다. 예를 들어 누관의 3 cm를 따라 1천만개 세포의 다중 주사.

상기 누공은 본 기술분야에 알려진 임의의 방법을 통해, 예를 들어 절개(incision), 카테트 등을 통해 수술적 회복으로 접근될 수 있다.

상기 방법은 치료되는 개체에 치료제를 투여하는 단계, 예를 들어 전신으로 또는 봉합 부위에 국소적으로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시예에서, 지방 조직 유래 간질 줄기 세포는 상기 기술된 치료제를 포함하는 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다. 다른 실시예에서, 치료제는 개별적으로 투여되며, 예를 들어 상기 방법과 동시에, 상기 방법이 수행되기 전에, 또는 상기 방법이 수행된 이후에 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법 전, 도중 및 이후에 개체에 투여되는 치료제는 개체에서 수행된다. 예시적인 치료제는 상기 설명된다. 바람직한 실시예에서, 크론병의 치료를 위한 치료제는 개체에 투여된다. 예시적인 크론병 치료제는 메살라민을 포함하는 제제와 같은 항염증제, 6-메르캅토퓨린 및 아자티오프린과 같은 면역억제제; 인플릭시맙(Remicade®)과 같은 생물제제, 항생제, 및 디페녹실레이트, 로페라미드, 및 코데인과 같은 지사제이다.

보조적인 치료가 필요할 수 있다. 예를 들어 면역억제제는 본 기술분야에 알려진 방법에 따라, GVHD를 예방하기 위해 치료 전, 도중 및/또는 이후에 투여될 수 있다. 투여 전, 상기 세포는 또한 본 기술분야에 알려진 방법에 따라, 개체로부터 세포로 면역 반응을 억제하기 위해 또는 역으로 하기 위해 변형될 수 있다.

임의의 치료제의 투여는 환자의 증상, 연령 및 체중, 치료 또는 예방되는 질환의 성질 및 심각도, 투여 경로, 및 제제의 형태에 따라 다양할 것이다. 임의의 대상 제형은 단일 투여 또는 분할된 투여로 투여될 수 있다. 치료제의 투여는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려지거나 또는 본 발명에 개시된 기술에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 하나 이상의 치료제의 혼합물은 투여될 수 있거나, 또는 다중 치료제가 별도의 조성물로 투여될 수 있다.

주어진 환자에게 가장 효과적인 치료를 생성하는 정확한 투여 시간 및 임의의 특정한 제제의 양은 특정한 화합물의 활성, 약물동태학, 및 생체 이용률, 환자의 생리학적 상태(연령, 성별, 질병 타입 및 단계, 일반 신체 조건, 주어진 투여량에 대한 반응성 및 치료의 유형), 투여 경로 등에 따른다. 본 발명에 제시된 가이드라인은 치료를 최적화하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 최적 시간 및/또는 투여량을 결정하는데 사용될 수 있으며, 개체를 모니터링하고 투여량 및/또는 시기를 조절하는 것으로 이루어진 통상적인 실험 이외에는 요구하지 않는다.

개체가 치료되는 동안, 환자의 건강은 24시간의 기간 동안 미리 예정된 시간으로 하나 이상의 관련 지표를 측정함으로써 모니터링 될 수 있다. 투여 보충, 양, 시간 및 제형을 포함하는 치료는 이러한 모니터링의 결과에 따라 최적화될 수 있다. 환자는 동일한 파라미터를 측정함으로써 개선의 정도를 결정하기 위해 주기적으로 재평가될 수 있으며, 첫번째 이러한 재평가는 전형적으로 치료의 시작으로부터 4주 종료시에 이루어지며, 후속적인 재평가는 치료 동안 매 4 내지 8주에 및 이후 3개월마다 이루어진다. 치료는 인간에 대한 일반적인 치료 기간인 최소 1개월로, 몇 달 또는 몇 년 동안 지속될 수 있다. 투여된 제제의 양 및 아마 투여 시간에 대한 조절은 이러한 재평가에 기초하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 예시된 누공의 조합된 관해는 임상적 및 방사선학적 관해를 모두 포함한다. 방사선학적 관해의 평가는 전형적으로 잘 알려진 기술인 MRI에 의해 수행된다. 그렇지 않으면 다른 이미지화 기술, 예를 들어 직장 내 초음파 검사가 사용될 수 있다. 이러한 이미지화 기술은 농양(ascesses) 또는 수집물의 존재를 측정한다.

치료는 화합물의 최적 투여량 미만의 보다 적은 투여량으로 시작될 수 잇다. 그 다음, 투여량은 최적 치료 효과에 이를 때까지 작은 증량(increments)에 의해 증가될 수 있다.

몇몇 치료제의 조합된 사용은 임의의 개별적인 성분에 대해 필요한 투여량을 감소시킬 수 있으며, 다른 성분의 효과 발현 및 기간이 상보적일 수 있기 때문이다. 이러한 조합된 치료에서, 다른 활성제는 함께 또는 개별적으로, 및 동시에 또는 하루 내에 다른 시간에 전달될 수 있다.

대상 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차를 통해 예를 들어 LD₅₀ 및 ED₅₀을 측정함으로써 결정될 수 있다. 큰 치료 지표를 나타내는 조성물이 바람직하다. 비록 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용되더라도, 관리(care)는 부작용을 감소시키기 위해 전달 시스템이 목표하는 부위에 제제를 표적화하도록 설계되어야 한다.

세포 배양물 분석 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량의 범위를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 치료제 또는 임의의 대안적인 성분의 투여량은 전형적으로 독성이 적거나 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내이다. 투여량은 수행되는 투여 형태 및 활용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 것이다. 본 발명의 제제에 대하여, 치료학적으로 효과적인 투여량은 세포 배양물 분석으로부터 초기에 측정될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 세포 배양에서 결정된 것처럼 IC₅₀(즉 증상의 최대 절반의 억제를 달성하는 실험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도를 달성하기 위해 제조될 수 있다. 이러한 정보는 인간에 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 측정될 수 있다.

5. 임상 반응 및 관해(remission)

본 발명의 동종 eASC는 크론병 환자의 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하는데 놀랍게도 효과적이다. 제1 종점, 24주째에 조합된 관해는 통계적으로 충족된다; Cx601은 통계적으로 플라시보에 비해 우수하다. 주요 제2 종점 모두, 24주째에 임상 관해 및 반응은, 경계선 통계적 유의성을 충족시킨다 (각각 ITT 집단 내에서 p=0.064 & p=0.054, mITT 집단 내에서 p=0.057 & 0.045)

상기 데이터는 eASC의 단일 투여를 받은 환자는 임상적 관해를 달성하는 확률이 플라시보에 비해 30% 우수함을 가리킨다. 상기 데이터는 또한 eASC를 받은 환자는 임상적 반응을 달성하는 확률이 플라시보에 비해 약 35% 우수함을 가리킨다.

특정한 실시예에서, 임상적 관해는 24주 내에, 전형적으로 18주 내에 달성된다. 임상적 관해는 12주 내, 또는 그 미만, 예를 들어 10주 내, 또는 8주 내에 달성될 수 있다. 임상적 관해는 6주 후에 선택적으로 달성될 수 있다. 상기 데이터는 임상적 관해까지의 중간(median) 시간이 플라시보에 비해 Cx601로 약 2배 짧음을 나타낸다(6.7주 v 14.6주). 따라서, 일 실시예에서 임상적 관해는 14주 내에 달성된다.

일부 실시예에서, 조합된 관해는 24주 내, 전형적으로 18주 내에 달성된다. 조합된 관해는 선택적으로 12주, 또는 그 미만, 예를 들어 10주 내, 또는 8주 내에 달성될 수 있다. 조합된 관해는 선택적으로 6주 후에 달성될 수 있다.

특정한 실시예에서, 임상적 반응은 11주 또는 그 미만에 달성된다. 상기 데이터는 임상적 반응까지의 평균 시간이 플라시보에 비해 약 2배 짧음을 나타낸다(6.3주 v 11.7주). 임상적 반응까지의 시간은 특정한 실시예에서 10주 또는 그 미만, 9주 또는 그 미만, 8주 또는 그 미만일 수 있다. 임상적 반응까지의 시간은 선택적으로 7주 또는 그 미만, 예를 들어 약 6주일 수 있다.

이러한 결과들은 이러한 개선들이 eASC의 단일 투여 이후에 발견된 점을 볼 때, 특히 놀랍다.

항문주위 질병 활성도 지수 “PDAI”는 다섯가지 카테고리를 포함한다: 분비물(discharge), 통증, 성활동 제한, 항문주위 질병의 유형 및 경화 정도. 각 카테고리는 증상이 없음(0점) 내지 심각한 증상(4점)의 범위로 5점 규모로 등급화된다. 항문주위 질병 활성도 지수 점수에 개선은 6, 12 및 18주에서 플라시보에 비해 eASC에서 보다 현저하게 관찰된다. 따라서, 특정한 실시예에서, PDAI에 개선은 6주, 12주 또는 18주 내에 달성된다. PDAI에 개선은 선택적으로 1.5 이상의 PDAI 점수, 선택적으로 적어도 2 PDAI 점수의 개선일 수 있다. PDAI에 개선은 선택적으로 지수의 다섯개 성분의 각각에 감소(개선)일 수 있다.

6. 키트

다른 실시예에서, 본 발명은 지방 조직 유래 간질 줄기 세포를 포함하는 조성물 및 선택적으로 이의 사용을 위한 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다. 약학적 조성물 및 본 발명의 생물물질을 포함하는 키트는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 키트 구성요소는 상기 방법의 수동 또는 부분적 또는 완전히 자동화된 실시를 위해 포장될 수 있다. 이러한 키트는 예를 들어 치료, 회복, 생물질의 제조 및 다른 적용을 포함하는 다양한 용도를 가질 수 있다.

실시예 (Exemplification)

이제 본 발명을 일반적으로 설명하지만, 이는 하기 실시예에 참조로 보다 용이하게 이해될 것이며, 이는 본 발명의 특정한 양태 및 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 포함되며, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.

3상 임상 실험(PHASE III CLINICAL TRIAL )

본 연구는 크론병 환자에서 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하기 위해, Cx601의 단독 또는 현재의 의학적 치료에 추가된 것의 효능 및 안정성을 평가하는 첫번째 플라시보 대조 3상 연구이다.

결과적으로, 실험 결과는 적어도 하나의 종래 또는 생물학적 치료에 누공(들)이 불충분하게 반응하는 것으로 나타날 때, 동종 eASC는 비-활성/보통의 활성 내강 크론병을 갖는 성인 환자에서 복합 항문주위 누공(들)을 치료하기에 적절함을 입증한다.

방법

연구 감독 ( Study oversight )

본 3상, 무작위화된, 이중맹검, 병렬-그룹, 플라시보 대조 연구(NCT01541579; EUDRACT 2011-006064-43)는 2012년 7월부터 2015년 7월까지 7개 유럽 국가 및 이스라엘에서 49개 의료 센터에서 수행되었다. 프로토콜은 중앙 또는 지방 윤리 위원회의 승인을 받았다. 모든 환자는 서면 동의를 받았다.

연구는 ADMIRE 운영 위원회(ADMIRE Steering Committee) (보충 부록 참조)에 의해 설계 및 실행되었다. 스폰서는 칠턴 인터네셔널(Chiltern International)의 생물통계 부서에 의해 분석된 데이터를 수집하고, 스폰서는 운영위원회와 함게 데이터를 해석하였다. 모든 저자는 데이터에 대한 완전한 접근권을 가지며, 공개를 위한 최종 원고를 제출하기 위한 결정에 동의하였으며, 보고된 데이터의 정확성 및 완정성을 보장한다. 상기 원고는 제1 저자 및 후속 초안에 기여한 모든 저자에 의해 작성되었다.

환자

적합한 환자는 18세 이상의 성인이며, 6개월 이상의 비-활성 또는 보통 약한 활성의 내강 크론병을 가지며, 220 이하의 크론병 활성도 지수(CDAI)^A24로 정의되며, 포함되기 전에 6주 이상 배액된, 최대 2개의 내부 및 3개의 외부 개구를 갖는 복합 항문주위 누공을 가진다(하기의 하나 또는 그 이상으로 정의됨: 높은 간(high inter-), 관통(trans-), 외부(extra-) 또는 상(supra-) 괄약근(sphincteric) 근원; 2개 이상의 외부 개구; 또는 관련된 수집물). 만약 직장질 누공, 직장 및/또는 항문 협착증 및/또는 활성 중증 직장염(궤양 상피 또는 깊은 곳에 존재하는 것으로 정의됨), 전환 기문, 또는 수술 준비 절차에 의해 해결되지 않는 2 cm 초과의 농양 또는 수집물을 갖는 환자의 경우 제외되었다. 적합한 환자는 항생제(시프로플록사신, 메트로니다졸)의 1개월 이후 및/또는 면억억제제(아자티오프린, 6-메르캅토퓨린) 및/또는 안정한 투여량으로 항-TNF 치료의 유도 또는 유지의 3개월 이후에 반응이 없는 것으로 기록된 적어도 하나의 치료에 난치성(refractory)을 갖는다. 항생제에 대한 환자의 내성만이 총 집단의 25% 미만으로 나타났다.

연구 제품의 투여 이후, 환자들은 4주 이상 항생제로 치료될 수 있다. 면역억제제 및 항-TNF는 연구 전체에 걸쳐 안정한 투여량으로 유지되었다. 이러한 제제의 시작 및 투여량 증가는 허용되지 않았다.

항생제를 포함하는 항문주위 누공을 형성하는 크론병에 대한 종래의 치료를 받지 않은 환자, 및 배액 또는 관선 배치 외에 활성 누공에 대한 사전 수술을 받은 환자는 또한 제외되었다. 4주 이내에 글루코코르티코스테로이드를 수여받은 환자는 적합하지 않았다. 스테로이드 과정은 최대 12주 동안 40 mg의 시작 투여량으로 추적 검사 중에 내강 질병의 유발을 치료하는데 허용되었다.

무작위화 및 치료

골반 MRI 스캔은 외과적 시술 및 중앙 블라인드 판독 평가된 수집을 가이드하기 위한 스크리닝에서 수행되었다. 추가로, 환자들은 조사 제품 투여 2주 이상 전에 임상적으로 지시된 바에 따라 마취, 누공 소파, 및 관선 배치 하에 실험을 수행하였다 (도 1). 만약 관선이 배치되는 경우, 조사 제품 투여 직전에 취소되었다.

환자들은 조사 제품 투여 2주 이상 전에 누공 준비 방문 이후 Cx601 또는 플라시보로 1:1 비율로 무작위 할당되었다 (도 1). 환자들은 무작위 배정에서 수반되는 약제에 기초하여 계층화되었다 (항-TNF 및/또는 면억억제제 또는 둘 다 아닌). 치료는 생물통계 부서, Linical에 의해 만들어진 사전 설정된 무작위 추출 목록을 사용하여 지정되었다.

Cx601 부문(arm)의 환자는 누관으로 병변 내 분산된 1억 2천만개의 Cx601의 단일 주사를 맞았다. Cx601의 분리 및 확장은 종래에 설명된 바와 같이 수행되었다. ^A23 플라시보 부문의 환자는 식염수 용액의 동일한 부피를 수용하였다. 연구 치료는 관선(들)을 제거, 및 만약 존재한다면 누공을 큐렛팅(curetting)한 이후 미세하고, 긴 바늘로 투여된다. 투여량의 절반은 봉합된 내부 개구(들) 주변의 조직으로 주사되었다. 다른 절반은 누관(들)을 모두 따르는 누공 벽(깊이 2 mm 미만)으로 주사되어, 몇몇 미세-기포(blebs)를 만들었다.

세포 현탁액은 식염수 용액과 명백하게 달라, 치료의 블라인딩은 불가능하였다. 이중 블라인드 연구 설계는 블라인드되지 않은 외과의 및 블라인드된 위장병 전문의에 의해 투여된 치료를 통해 유지되었고, 방사선사는 반응을 평가하였다.

연구 절차 및 후속 조치 ( Study procedures and follow-up )

누공 폐쇄는 치료된 외부 개구에서 자발적인 배액의 존재 및 부드러운 손가락 압축 이후에 대해 실험하는 조사자들에 의해 6, 12, 18 및 24주째에 임상적으로 평가되었으며,^A1224주째에 블라인드된, 중앙-판독 골반 MRI 스캔에 의해 방사선학적으로 평가되었다; 중앙 판독자들은 치료된 누공을 식별하기 위한 도면이 제공되었으나, 환자 데이터, 실험의 순서 및 받은 치료에 대해서는 블라인드되었다. 치료-응급 유해 이벤트(TEAEs)는 모든 연구 방문에서 평가되었다. 항문주위 크론병의 심각도는 기준선 및 항문주위 질병 활성 지표(PDAI)와 함께 모든 연구 방문에서 평가되었다. ^A25 삶의 질은 기준선 및 24주째에서 염증성 장 질환 설문지(Inflammatory Bowel Disease Questionnaire, IBDQ)^A26으로 평가되었으며, CDAI에서와 같다. ^A24

효율 및 안정성 종점 ( Efficacy and safety endpoints )

제1(primary) 종점은 블라인드된 중앙 MRI 판독(Bioclinica GmbH, Munich, Germany)에 의해 확인된, 기준선에서 배액되고 모든 치료된 외부 개구 폐쇄, 및 3차원 중 2 이상에서 치료된 항문주위 누공의 2 cm 초과하는 수집물의 부재의 임상적 평가로 정의된 24주째에 조합 관해이다. 폐쇄의 임상적 평가는 부드러운 손가락 압축에도 불구하고 배액이 없는 것으로 정의된다.^A12

주요 제2 효율성 종점이 두가지 있다: 24주째에 임상적 관해(즉 부드러운 손가락 압축에도 불구하고 기준선에서 배액되는 모든 치료된 외부 개구의 폐쇄) 및 반응(즉 기준선에서 배약되는 모든 처리된 외부 개구의 50% 이상의 폐쇄). 다른 제2 효율성 종점은 24주까지의 임상적 관해까지의 시간, 반응까지의 시간, PDAI, CDAI 및 IBDQ 점수가 포함된다.

TEAE는 Medical Dictionary for Regulatory Activities version 17.0에 따라 코딩된다.

통계적 분석

스크리닝되는 계획된 샘플 크기는 208명의 환자를 무작위 추출하기 위해 278명의 환자였다 (각 그룹 당 104명). 상기 샘플 크기는0.025의 알파 오차 및 80%의 힘으로Cx601 및 플라시보 사이의 조합된 관해를 갖는 환자의 백분율에서 최소 25% 차이를 검출하기에 충분하였으며(예상된 최소 조합된 관해 비율은 Cx601에 대해 50% 및 플라시보에 대해 25%였다 ^{A8, A12, A23, A27}), 20%의 환자는 연구를 중단하였다.

효율성 분석은 모든 무작위 추출된 환자를 포함하는 치료 의도(ITT) 집단, 연구 치료를 받은 모든 무작위 추출된 환자를 포함하며 1 이상의 포스트-베이스라인 효능 평가를 갖는 변형된 ITT(mITT) 집단, 및 주요한 프로토콜 편차가 없는 모든 치료된 환자를 포함하는 프로토콜(PP) 집단 마다에서 수행되었다. TEAE는 연구 치료를 받은 모든 환자에서 정의된 안정성 집단에서 분석되었다.

제1 종점은 계층화된 코크란-멘텔-헨젤(Cochran-Mantel-Haenszel) 테스트를 사용하여 분석되었으며, 무작위 계층화를 위해 조절되었다(즉, 무작위화에서 크론병 치료). 주요 분석은 ITT 집단을 사용하여 수행되었다. 또한 이의 정의가 다른 무작위화된 임상적 실험에서 ITT 집단과 보다 가깝게 유사하고 치료 효과에 대해 보다 신뢰할 수 있는 평가를 제공하기 때문에 mITT 집단에 대한 결과를 제공한다. 누락된 데이터는 LOCF(last-observation-carried-forward)를 사용하여 입력되었다. 무-반응/무-관해는 기준선 후 MRI 스캔 또는 임상적 평가가 24주까지 내에 수행되지 않는 경우에 입력되었다. 무-반응/무-관해는 또한 구조 이벤트가 24주 전에 발생한다면 입력되었다. 구조 이벤트의 효과 및 효과에 손실 데이터의 관례(conventions)는 제1 종점의 심각성 분석에서 조사되었다.

다중성(multiplicity)의 문제를 해결하기 위해, 두가지 주요 제2 종점(24주째에 임상적 관해 및 반응)은 게이트키퍼로 작용하는 제1 효율성 종점과 함께, 전체 I형 오류를 제어하기 위해 호크버그(Hochberg's) 실험 절차^A28 를 사용한 게이트 키핑 방법으로 단기 패밀리로 그룹화되었다. 통계적 유의성은 0.05의 양면 타입 I 오차 수준으로 평가되었다. 다중성에 대한 통계적인 조정은 비주요 제2 종점에 대해 이루어지지 않았다. 백분율 및 치료의 차이는 왈드 점근선 방법(Wald's asymptotic method)으로 계산된 95% 신뢰도 구간(CI)으로 나타났다. 임상적 관해 및 반응까지의 시간은 카플란-메이어 측정(Kaplan-Meier estimates)으로 분석되었다. 안정성 결과는 설명 통계로 제시되었다.

SAS 시스템 v9.1.3. 또는 이상은 통계 분석에 사용되었다(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

결과

총 289명의 환자가 스크리닝되었으며, 이들 가운데 212명은 Cx601 또는 플라시보로 무작위 추출되었다 (도 2). 2개 그룹의 기준선 특징은 유사하다(표 1). 환자의 대부분은 지난 6개월 동안 크론병에 대해 1회 이상의 치료를 받았다. Cx601 그룹의 환자의 비율이 높을수록 플라시보 그룹에 비해 다중관 누공을 가졌다 (46.6% 및 30.4%, 각각). 총 171명의 환자(80.7%)는 24주 추적 관찰을 완료하였다. 연구 동안 Cx601 그룹의 1명의 환자 및 플라시보 그룹의 4명의 환자는 크론병의 발병에 대해 스테로이드를 투여받았다.

효능

Cx601로 치료된 환자의 현저하게 많은 비율은 ITT(각각 49.5% 및 34.3%; 차이 [97.5% CI]: 15.2% [0.2-30.3]; p=0.024]) 및 mITT 집단(51.5% 및 35.6%; 15.8% [0.5-31.2]; p=0.021; 도 3A 및 B) 내에서 플라시보 대비 24주째에 조합된 관해의 제1 종점을 달성하였다. 이러한 결과들은 PP 집단 및 추가적인 민감도 분석에서 확인되었다(표 S1). Cx601의 효과는 무작위화에서 항-TNF 및 면역억제제 치료를 모두 받지 않거나 모두 받은 환자에서 관찰되는 Cx601의 수치상 가장 큰 효과와 함께, 4가지 무작위화 단계에서 플라시보에 비해 크다(치료 차이 33.1% 및 20.0%, 각각; 도 3C).

mITT 집단에서, Cx601 vs 플라시보 그룹 내에서 수치적으로 큰 환자의 비율은 임상적 관해를 달성하였으며 (55.3% 및 42.6%, 각각; 차이 [95% CI]: 12.8% [-0.8-26.4]; p=0.057) 24주째에 반응(68.9% 및 55.4%, 각각; 13.5% [0.3-26.7] p=0.045)을 가졌다.

임상적 관해에 평균 시간은 플라시보에 비해 Cx601에서 약 2배 짧으며 (6.7 [95% CI, 6.4-11.9] 주 및 14.6 [11.9-22.9] 주), 반응까지의 평균 시간과 같다 (6.3 [6.0-6.6] 주 및 11.7 [6.7-12.9] 주).

mITT 집단 내 Cx601로 PDAI에 개선은 6주째에 (기준선 치료 차이 [95% CI]: -1.0 [-1.7 내지 -0.3]), 12주째에 (-1.2 [-2.0 내지 -0.4]), 및 18주째에 (-1.2 [-2.0 내지 -0.3]) 플라시보에 비해 현저하게 우수하였으나, 24주째는 우수하지 않았다 (-0.8 [-1.8 내지 0.2]). 전체 및 하위도메인 IBDQ 및 CDAI 점수에서, 치료 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (표 S2).

안정성

TEAE를 경험한 Cx601 및 플라시보 그룹 내 환자의 백분율은 유사하였다 (각각 66.0% 및 64.7%; 표 2). 대부분의 일반적으로 보고된 TEAE는 직장 통증, 항문 농양 및 비인두염이었다. 플라시보 vs Cx601 그룹의 환자의 높은 비율은 치료 관련된 TEAE(29.4% 및 17.5%, 각각)를 경험하였으며, 이들 대부분은 보통 항문 농양 및 직장 통증이었다. TEAE의 대부분은 약한 또는 보통의 강도였다. 일부 환자는 TEAE로 인해 연구에서 제외된 반면(4.9% 및 5.9%), Cx601 그룹의 환자 중 약간 높은 비율은 심각한 TEAE를 경험하였다(17.5% 및 13.7%). 가장 일반적인 심각한 TEAE는 항문 농양이었다(Cx601: 8.7%; 플라시보: 6.9%). 사망은 없었다.

논의 및 개요

이는 크론병 환자에서 복합 치료-난치성 항문주위 농양의 치료의 첫번째 대규모, 무작위화된, 플라시보-조절된 임상 연구이다. 복합 항문주위 누공을 가지며 종래의 또는 생물학적 치료에 실패한 환자의 치료가 어려운 연구 집단에서, Cx601 단독 또는 현재 의학적 치료에 추가된 Cx601로 치료된 2명 중 1명의 환자는 24주째에 조합된 임상 및 방사선학적 관해를 달성하였다. 이러한 결과는 Cx601 그룹의 환자가 보다 많은 다중관 누공을 가짐에도 불구하고, 모든 통계 집단에서 일관되었다. 연구 결과는 따라서 Cx601이 치료 난치성 환자에게 과격한 수술적 접근에 비해 복합 항문주위 누공에 대해 첫번째 실제 폐쇄 대안을 제공하는 것을 보여준다.

조합된 임상 및 방사선학적 관해의 제1 종점은 크론병의 항문주위 누공에 대한 치료의 다른 무작위 임상 연구에서 사용된 것보다 엄격하며, 이는 전형적으로 임상적 반응(즉, 누공을 배액하는 횟수에 50% 이상 감소) 또는 임상적 관해를 평가한 것이다^A8 ^{, A12}. 이는 누공 폐쇄의 임상적 평가 및 유럽 크론 및 콜리티스 조직 지침(European Crohn's and Colitis Organisation guidelines)에서 추천된 농양 부재의 MRI 평가에 사용하기 위한 첫번째 대규모 무작위화된 임상적 실험이다. ^A29

제2 효능 분석은 Cx601의 임상적 이점을 강화한다. Cx601을 사용하면 임상적 관해 및 반응까지의 시간이 빨라지며, 플라시보 군의 경우에 비해 절반의 시간으로 일어났다. Cx601 및 플라시보 군 사이의 임상적 관해 비율에 차이는 이전 연구에서 예상되고 관찰된 것(13-19%)보다 상당히 높은 "플라시보" 효과(42.6%) 때문에 통계적 유의성에 도달하지 않았다. ^{A8, A12, A27} 무작위화 계층에 따른 플라시보 효과는(즉 항-TNF 및 면역억제제 병용에서 가장 높음 [46.7%] 및 둘 다를 처리되지 않은 경우 가장 낮음 [21.1%]) 본 연구에서 보다 높은 플라시보 효과는 병용 약제의 사용에 의해 일어난 것일 수 있음을 제안한다. 수술적 배액 및 내부 구멍 폐쇄는 또한 위약 반응을 증가시킬 수 있다. PDAI 점수에 유익한 개선이 Cx601 그룹에서 나타난 반면, 치료 군 사이에 IBDQ 및 CDAI 점수에 차이는 없었다. 이는 아마도 기준선에서 낮은 CDAI(포함 기준(an inclusion criterion)) 및 높은 IBDQ 때문이다.

안정성 데이터는 Cx601이 사전 1/2a 상 연구의 결과와 일치하여 연구 집단 내에서 내약성(tolerated)이 우수함을 보여준다. ^A23치료 관련된 TEAE는 플라시보 군에서 보다 높은 빈도로 발생하였으며, 따라서 질병의 자연적인 과정 또는 수술적 연구 절차와 관련될 수 있다. 바람직한 안정성 프로파일은 약물에 대한 면역원성으로부터 초래되는 몇몇 심각한 안정성 문제 및 결핵(tuberculosis)을 포함하는 증가된 감염 위험과 관련된 항-TNF 치료에 비해 유리한 것으로 나타날 수 있다.^A30,A31

크론병 및 복합 항문주위 누공을 갖는 환자의 효과적이고 잘 견딜 수 있는(tolerated) 새로운 치료 선택지에 대한 필요성을 고려할 때, 본 연구의 결과는 고무적이다. 본 연구는 또한 치료 내성 복합 항문주위 누공을 갖는 크론병 환자의 관리에 주요한 영향을 가지며, 이들의 많은 수는 현재 배변 실금을 초래하는 괄약근에 손상 위험을 갖는 반복된 수술을 반드시 겪기 때문이다. 결과적으로, 항문주위 누공 질병을 갖는 환자의 12-38%는 직장 절제술을 필요로 한다.^A32 대조적으로, Cx601의 투여는 최소한으로 침습적이며 외래환자 환경에서 수행될 수 있다.

이러한 시도의 한계는 2개 초과 내부 개구 및 3개 초과 외부 개구를 갖는 환자뿐만 아니라 배액 및 관선 배치 외에 사전 수술을 받은 이들을 배제하는 것이다. 또한 TEAE가 수술 절차와 관련되는지 여부도 확립되지 않았다.

결론적으로, Cx601은 종래 및/또는 생물학적 치료에 반응이 실패한 크론병에서 복합 항문주위 누공에 대한 효과적이며 안전한 치료이다.

환자 특성 (안전 집단).

변수	Cx601(N=103)	플라시보(N=102)
연령 - 년생(yr)	38.9 (13.1)	37.6 (13.2)
남성 - 수 (%)	57 (55.3)	54 (52.9)
인종 - 수 (%) 코카시안 흑인 기타 누락	96 (93.2) 4 (3.9) 0 3 (2.9)	93 (91.2) 1 (1.0) 1 (1.0) 7 (6.9)
체중 - kg	73.3 (14.4)	71.4 (15.0)
CD 기간 - 년	11.8 (9.8)	11.4 (9.0)
지난 6개월 간 사전 CD 약물 치료 - 수 (%) 항생제 면역억제제 항-TNF	78 (75.7) 87 (84.5) 80 (77.7)	72 (70.6) 74 (72.5) 82 (80.4)
수반 CD 약물 치료 (계층(stratification) 인자) - 수 (%) 항-TNF 면역억제제 항-TNF + 면역억제제 둘다 받지 않음	36 (35.0) 16 (15.5) 27 (26.2) 24 (23.3)	32 (31.4) 21 (20.6) 30 (29.4) 19 (18.6)
항문주위 크론병 활성도 지수*	6.7 (2.5)	6.5 (2.9)
누관 개구 - 수 (%) 0개 내부 + 1 개 외부 1 개 내부 + 1 개 외부 1 개 내부 + 2 개 외부 1 개 내부 + 3 개 외부 2 개 내부 + 1 개 외부 2 개 내부 + 2 개 외부 2 개 내부 + 3 개 외부	0 55 (53.4) 23 (22.3) 4 (3.9) 3 (2.9) 14 (13.6) 4 (3.9)	1 (1.0) 70 (68.6) 17 (16.7) 3 (2.9) 2 (2.0) 8 (7.8) 1 (1.0)
크론병 활성도 지수†	87.8 (48.3)	92.5 (55.3)
염증성 장 질환 설문지‡	173.5 (31.6)	169.8 (36.2)
C 반응 단백질 - mg/L	7.9 (11.5)	6.3 (9.5)
헤모글로빈 - mmol/L	8.3 (0.8)	8.3 (0.8)

CD, 크론병; Cx601, 동종, 확장된, 지방 유래 줄기 세포; TNF, 종양 괴사 인자.

달리 명시되지 않는 한 데이터는 평균(표준 편차)이다.

*항문주위 크론병 활성도 지수에 대한 점수는 0 내지 20의 범위일 수 있다; 점수가 높을수록 보다 심각한 질병임을 가리킨다.

†크론병 활성도 지수에 대한 점수는 0 내지 600점의 범위일 수 있다; 점수가 높을수록 보다 심각한 질병임을 가리킨다.

‡염증성 장 질환 설문지에 대한 점수는 32 내지 224점의 범위일 수 있다; 점수가 높을수록 삶의 질이 보다 나은 것을 가리킨다.

24주까지의 치료에 나타난 부작용 이벤트 (안전 집단).

TEAE - 수 (%)	Cx601 (N=103)	플라시보 (N=102)
전체	68 (66.0)	66 (64.7)
연구 철회를 유도하는 TEAE	5 (4.9)	6 (5.9)
심각한 TEAE	18 (17.5)	14 (13.7)
5.0% 이상 환자에서 TEAEs*
직장 통증	13 (12.6)	11 (10.8)
항문 농양	12 (11.7)	13 (12.7)
비인두염	10 (9.7)	5 (4.9)
설사	7 (6.8)	3 (2.9)
복부 통증	4 (3.9)	6 (5.9)
누공	3 (2.9)	6 (5.9)
치료-관련된 TEAE	18 (17.5)	30 (29.4)
2.0% 이상의 환자에서 치료 관련된 TEAE*
항문 농양	6 (5.8)	9 (8.8)
직장 통증	5 (4.9)	9 (8.8)
수술 통증	1 (1.0)	2 (2.0)
누공 배출	1 (1.0)	2 (2.0)
경화	0	2 (2.0)

TEAE, 치료 발현 부작용 이벤트; Cx601, 동종, 확장된, 지방 유래 줄기 세포; *두 치료군에서.

[표 s1] 제1 종점에 대한 보조 및 민감도 분석: 조합된 관해.*

분석 유형	분석 세트	손실 데이터 처리에 대한 세부 정보	Cx601 (%)	플라시보 (%)	차이(%) (97.5% CI)	p-값
보조	ITT	모든 손실 데이터에 대해 및 구조 치료 이후 귀속된 무-반응/무-관해(no LOCF)	48.6	32.4	16.2(1.3-31.1)	0.014
보조	PP1†	LOCF 적용됨무-반응/무-관해가 구조 치료 이후 귀속됨	57.0	36.9	20.1 (3.3-36.9)	0.010
보조	PP2‡	무-반응/무-관해가 구조 치료 이후 귀속됨	63.2	39.7	23.4(5.6-41.3)	0.005
민감도	ITT	손실 = LOCF 적용 이후 무-반응/무-관해.실패로 고려되지 않은 구조 약품	49.5	34.3	15.2 (0.2-30.3)	0.024
민감도	ITT	손실 = LOCF 적용 이후 무-반응/무-관해.인자로 계층화 인자 및 기준선 외부 개구의 수를 포함하는 논리적 분석	49.5	34.3	NA	0.017

CI, 신뢰 구간; Cx601, 동종, 확장된, 지방 유래 줄기 세포; ITT, 치료 의도; LOCF, 앞으로 이동된 최종 관찰(last observation carried forward); NA, 적용 불가능한; PP, 프로토콜 당; TNF, 종양 괴사 인자.

구조 요법은 12주 이상 동안 40 mg 프레드니손 동등량에 코르티코이드로 정의된다; 8주 이상의 기준선 치료와 비교하여 새로운 항-TNF; 12주 이상 기준선 치료와 비교하여 새로운 면역억제제; 또는 치료된 누공에 대한 외과적 개입.

*기준선에 배액되는 모든 치료된 외부 개구의 폐쇄의 임상적 평가, 및 24주째에 중앙 블라인드된 MRI 측정에 3차원 중 2개 이상에서 치료된 항문주위 누공의 2 cm 초과의 수집물의 부재. 폐쇄의 임상적 측정은 부드러운 손가락 압축에도 불구하고 배액의 부재로 정의된다.

†PP1 집단은 주요 프로토콜 편차가 없는 것들을 포함한다 (Cx601, n=86; 플라시보, n=84).

‡PP2 집단은 24주째 방문을 완성한 PP1 환자를 포함한다 (Cx601, n=76; 플라시보, n=73).

[표 s2] 24주째까지 크론병 활성도 지수(CDAI)* 및 염증성 장 질환 설문지(IBDQ)† 점수로부터 환자 보고된 결과 (mITT 집단).

CDAI	Cx601 (N=103)	플라시보(N=101)	치료 차이 (95% CI)
총 기준선 24주 기준선으로부터 변화	87.8 (48.3) 92.5 (66.5) 5.7 (62.2)	93.3 (55.0) 94.1 (76.1) 2.2 (65.5)	1.8 (-16.0 내지 19.7)
액체 대변의 수 기준선 24주 기준선으로부터 변화	9.8 (12.3) 9.5 (12.6) -0.0 (9.5)	9.3 (9.4) 10.0 (12.6) 0.9 (10.7)	-0.7 (-3.4 내지 2.1)
복부 통증 기준선 24주 기준선으로부터 변화	1.6 (2.9) 2.7 (4.5) 1.1 (4.4)	2.0 (3.1) 3.0 (4.1) 0.9 (4.0)	-0.1 (-1.2 내지 1.1)
일반 웰빙(well being) 기준선 24주 기준선으로부터 변화	2.7 (3.7) 3.1 (4.6) 0.6 (4.5)	3.2 (4.1) 3.3 (4.7) 0.3 (4.5)	0.1 (-1.1 내지 1.3)
IBDQ	Cx601 (N=103)	플라시보 (N=101)	치료 차이 (95% CI)
총 기준선 24주 기준선으로부터 변화	173.5 (31.6) 178.3 (34.6) 3.8 (25.5)	169.4 (36.1) 174.7 (36.2) 4.0 (25.6)	0.3 (-6.6 내지 7.3)
대장 기능 기준선 24주 기준선으로부터 변화	57.1 (9.2) 57.2 (10.2) 0.0 (7.6)	56.6 (9.9) 56.4 (9.8) -0.6 (8.2)	0.5 (-1.6 내지 2.7)
감정 상태 기준선 24주 기준선으로부터 변화	62.9 (14.5) 64.7 (15.6) 1.7 (11.3)	61.4 (15.2) 63.9 (15.3) 2.1 (11.2)	-0.3 (-3.3 내지 2.7)
전신 증상 기준선 24주 기준선으로부터 변화	25.8 (5.2) 26.2 (5.9) 0.3 (4.7)	24.9 (6.5) 25.6 (6.3) 0.6 (5.1)	-0.1 (-1.4 내지 1.2)
사회적 기능 기준선 24주 기준선으로부터 변화	27.7 (6.9) 29.5 (7.3) 1.6 (6.4)	26.5 (8.4) 28.4 (8.0) 1.7 (6.0)	0.3 (-1.3 내지 2.0)

CI, 신뢰도 구간; Cx601, 동종, 확장된, 지방 유래 줄기 세포; mITT, 변형된 치료 의도.

데이터는 평균(표준 편차)이다.

*크론병 활성도 지수(CDAI)에 대한 점수는 0 내지 600의 범위일 수 있다; 점수가 높을수록 보다 심각한 질병임을 가리킨다.

‡염증성 장 질환 설문지 (IBDQ)에 대한 점수는 32 내지 224의 범위일 수 있다; 점수가 높을수록 삶의 질이 우수함을 가리킨다.

참고문헌

본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 본 기술분야의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술들은 논문에서 완전히 설명된다. 예를 들어, Molecular Cloning　A Laboratory　Manual, 2^nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조.

하기 나열된 항목들을 포함하여 본 발명에 기술된 모든 공개문헌 및 특허는 개별적인 공개문헌 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참고문헌으로 포함되도록 표시되는 것처럼 이들의 전체는 참고문헌으로 본 발명에 포함된다. 충돌이 있는 경우, 본 발명 내에 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 우선된다.

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등가물(Equivalents)

본 발명은 다른 것들 가운데, 누공을 치료 및 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 특정한 실시예들이 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이며 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변형들은 본 명세서의 관점에서 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구항들은 모든 이러한 실시예 및 변형들을 청구하는 것은 아니며, 본 발명의 전체 범위는 청구항을 참조하여 등가물, 및 명세서의 전체 범위에 따라, 이러한 변형과 함께 결정되어야 한다.

Claims

크론병 환자의 난치성 복합 항문주위 누공 치료 방법에 사용하기 위한 확장된 동종(allogeneic) 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항에 있어서, 상기 누공은 다중 관(tracts), 2개의 내부 개구(openings) 및 3개의 외부 개구의 하나, 둘 또는 셋 모두를 포함하는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 누공은 (i) 항생제, (ii) 면역억제제 및 (iii) 항 TNF 치료의 하나 이상에 대해 난치성인, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 항-TNF 치료 및 면역억제 치료를 모두 받지 않거나 또는 모두 받은 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 (a) 비활성 또는 약한 활성의 크론병; 및/또는 (b) 내강(luminal) 크론병을 갖는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 병소 내(intralesional) 주사된, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1억 2천만개의 세포가 단일 투여로 투여되는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 조합된 관해(remission) 또는 임상적 관해를 유도하는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제8항에 있어서, 상기 조합된 관해 또는 임상적 관해는 24주 내, 18주 내 또는 12주 내 달성되는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제9항에 있어서, 상기 조합된 관해 또는 임상적 관해는 8주 내 또는 6주 내 달성되는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 누공은 MRI에 의해 모니터링되는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포의 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%는 표면 마커 HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, 및 CD105를 발현하는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포의 약 5% 미만은 표면 마커 HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 및 CD86을 발현하는, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포.
크론병을 갖는 환자의 난치성 복합 항문주위 누공 치료용 약제의 제조용 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포의 용도.
이러한 치료를 필요로 하는 환자에게, 확장된 동종 지방 조직-유래 기질 줄기 세포를 누공에 투여하는 단계를 포함하는, 크론병 환자에 난치성 복합 항문주위 누공을 치료하는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 추가로 제2항 내지 제13항 중 어느 하나의 특징을 추가로 포함하는 제14항에 따른 용도 또는 제15항에 따른 방법.