JP7011827B2 - 移植に用いる間葉系幹細胞（ｍｓｃ）を増殖させる方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞移植の分野に属する。詳細には、本発明は、間葉系幹細胞をインビトロで増殖させる方法を提供する。

本開示の主題に背景として関連すると考えられる参考文献を、以下に一覧にする：
［１］Ｂｕｎｎｅｌｌ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ４５（２）：１１５－１２０．
［２］Ｓｈｏｓｈａｎｉ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ２：ｅ７８０．
［３］Ｉｋｅｂｅ，Ｃ．ａｎｄ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．（２０１４）ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ５１５１２．
［４］Ｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２１：２１６－２２５．
［５］国際公開第２００７／１３８５９７号パンフレット．
［６］Ｒｉｐｐｏ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ４：ｅ５９４．
［７］Ｆｕｎｃｋｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．２９：３０６５－３０７５．
［８］米国特許第５，８５１，８３２号明細書．
［９］米国特許出願公開第２００２／００９８１６６号明細書．
［１０］Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ８（４）：３１５–３１７．
［１１］Ｓｃｈｒｅｍｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １１（７）：９４７－５７．
［１２］Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０８：６４－７６．
［１３］Ｍａｒｋ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１３（２０１３），Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ６９８０７６，８ ｐａｇｅｓ．
［１４］Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ８（１０）：ｅ７６９７９．

本明細書中での上記の参考文献の認定により、これらが、本開示の主題の特許性に何らかの形で関連することが意味されると推測されるべきでない。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞が挙げられる種々の特定の細胞型に分化することができる多能性の前駆細胞である。ＭＳＣは成体組織中に存続して、広い分化能を保持する（１）。

ＭＳＣは、最も一般的には骨髄から単離されるが、脂肪組織、胎盤、羊水、および臍帯血が挙げられる他の組織から単離されてもよい。しかしながら、研究によれば、異なるソースから単離されたＭＳＣの増殖能および分化能において、差異が報告された（２）。

同種異系または自己由来のＭＳＣが、移植片対宿主病、血液悪性腫瘍、心血管疾患、神経疾患、自己免疫性疾患、臓器移植、および骨疾患または軟骨疾患が挙げられる種々の疾患の処置に用いられ得る（３）。加えて、ＭＳＣは、美容用途に、そして形成外科に用いられ得る。

したがって、更なる臨床用の富化された細胞集団を得るための、ＭＳＣの単離および増殖のためのプロトコルの確立が所望されている。種々の組織から単離されたＭＳＣは、インビトロで増殖し得るのと同時に、特定の細胞系統に分化する能力を維持し得る（４）。ＴＮＦスーパーファミリーメンバは、カスパーゼ活性化の経路を媒介することによって、直接的または間接的な機構を介して、アポトーシスを媒介する。アポトーシス促進性ＴＮＦスーパーファミリーレギュレータとして、とりわけ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、およびアポトーシスの腫瘍壊死因子様の弱いインデューサ（ＴＷＥＡＫ）が挙げられる。

国際公開第２００７／１３８５９７号パンフレット（５）は、骨髄から単離された細胞の不均一集団をアポトーシス促進剤と接触させることによって、当該細胞集団から幹細胞を選択する方法に関する。Ｒｉｐｐｏ ｅｔ ａｌ（６）は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）のレベルが低いと、ヒト骨髄に由来するＭＳＣの増殖が促進され、そしてレベルが高いほど、脂肪細胞への分化が阻害されると報告している。著者らは、ＦａｓＬ／Ｆａｓ系が、骨髄ＭＳＣ生物学における役割を有しており、そして骨粗鬆症との臨床的な関連があり得ると結論している。Ｆｕｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ（７）は、ＴＲＡＩＬが、ＥＲＫ１／２活性化を介してヒト前脂肪細胞増殖を促進すると報告しており、脂肪組織ホメオスタシスの調節におけるＴＲＡＩＬの役割を提唱した。

一般的な記載
第１の態様において、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖させる方法を提供し、当該方法は：
（ａ）細胞を体の組織または臓器から単離するステップと；
（ｂ）（ａ）において得られた単離細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中で少なくとも３日間インキュベートすることによって、ＭＳＣが富化された細胞集団を得るステップと
を含む。

特定の実施形態において、本発明の方法は、インビトロで実行される。

特定の実施形態において、本発明の方法は、単離細胞で実行され、ステップ（ａ）を含まない。

別の態様において、本発明は、脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ）を増殖させる方法を提供し、当該方法は：
（ａ）間質血管細胞群（ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＳＶＦ）の細胞を脂肪吸引物から単離することと；
（ｂ）（ａ）において得られた単離細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中で少なくとも３日間インキュベートすることによって、ＡＳＣが富化された細胞集団を得ることと
を含む。

特定の実施形態において、ＭＳＣまたはＡＳＣは、移植に用いられる。

特定の実施形態において、前記アポトーシス誘導剤は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドである。

特定の実施形態において、前記アポトーシス誘導剤は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、アポトーシスの腫瘍壊死因子様の弱いインデューサ（ＴＷＥＡＫ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

特定の実施形態において、前記アポトーシス誘導剤はＦａｓＬである。

特定の実施形態において、前記増殖培地はさらに、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される更なる活性剤を含む。

他の実施形態において、前記増殖培地は、アポトーシス誘導剤以外の更なる活性剤を含まない。

一実施形態において、アポトーシス誘導剤との前記インキュベーションは、約３日から約２３日間なされる。特定の実施形態において、アポトーシス誘導剤との前記インキュベーションは、約３、５、７、１０、１４、１７、２０、または２３日間なされる。

特定の実施形態において、アポトーシス誘導剤との前記インキュベーションは、１４日間なされる。

一実施形態において、アポトーシス誘導剤を含む培地は、３日毎に、または４日毎にリフレッシュされる。

特定の実施形態において、細胞を単離した（先で開示される方法のステップ（ａ））後に、単離細胞は、アポトーシス誘導剤無しで、１、２、３、４、５、６、または７日間培養されてから、アポトーシス誘導剤とインキュベートされる。

一実施形態において、前記アポトーシス誘導剤はＦａｓＬであり、そしてＦａｓＬとのインキュベーションの前に、単離細胞は、ＴＮＦαとプレインキュベートされる。

一実施形態において、ＴＮＦαとの前記プレインキュベーションは、１～４日間実行される。

一実施形態において、前記アポトーシス誘導剤はＦａｓＬであり、そしてＦａｓＬの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲内にある。

一実施形態において、アポトーシス誘導剤とのインキュベーションの後に、前記アポトーシス誘導剤は除去されて、前記細胞は分化することができる。

特定の実施形態において、前記細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、または骨細胞に分化することができる。詳細には、前記細胞は、特定の系統分化に適した培地および試薬の存在下でインキュベートされる。

一実施形態において、本発明の方法はさらに、前記分化細胞を移植することを必要とする患者に、これを実行することを含む。

一実施形態において、前記細胞は、脂肪組織、骨組織、または軟骨に分化する。

特定の実施形態において、前記細胞は脂肪組織に分化し、そして前記患者は、乳房修復を必要とする。

別の特定の実施形態において、前記細胞は骨組織に分化し、そして前記患者は、整形外科的損傷、骨再建、または骨修復の処置を必要とする。

別の特定の実施形態において、前記細胞は、軟骨組織に分化し、そして前記患者は、軟骨細胞移植、半月板の処置、または関節軟骨修復を必要とする。

一実施形態において、前記患者は、美容治療が必要である。

別の実施形態において、前記分化細胞を移植する前記ステップは、皮膚病変を処置するものである。

別の実施形態において、前記分化細胞を移植する前記ステップは、患者の免疫関連疾患を緩和するものである。特定の実施形態において、前記患者は、臓器移植／組織移植を経験している。

一実施形態において、前記臓器移植は、骨髄、肝臓、腎臓、血管、または心臓の移植からなる群から選択される。

一実施形態において、前記免疫関連疾患は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。

別の実施形態において、前記分化細胞を移植する前記ステップは、患者の卒中または心不全を処置するものである。

別の実施形態において、前記分化細胞を移植する前記ステップは、クローン病患者の痔瘻または肛門周囲瘻を処置するものである。

別の実施形態において、前記分化細胞を移植する前記ステップは、血管修復のためである。

特定の実施形態において、移植された前記分化細胞は、同種異系または自己由来である。

別の態様において、本発明は、細胞培養培地およびアポトーシス誘導剤を含む間葉系幹細胞増殖培地を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、以下を含む製品を提供する：
ａ．細胞増殖培地およびアポトーシス誘導剤を含む間葉系幹細胞増殖培地を含有する容器と；
ｂ．間葉系幹細胞をインビトロで増殖させるための、間葉系幹細胞増殖培地の使用説明書。

特定の実施形態において、前記間葉系幹細胞は、脂肪由来の幹細胞である。

一実施形態において、間葉系幹細胞増殖培地はさらに、血清または血清代用品を含む。

別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる細胞富化集団を提供する。

別の態様において、前記細胞富化集団は、移植を必要とする患者への移植術に用いられる。

本明細書中で開示される主題をよりよく理解するために、そして実際にどのように実行され得るかを例示するために、実施形態を、添付の図面を参照して、非限定的な例によってのみ説明する。

図１は、２０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬとインキュベートした細胞の収率の変化を示すグラフである。データは、ＦａｓＬに曝さなかった対照細胞と比較した、ＦａｓＬとインキュベートした細胞の変化倍率を示す。データは、細胞の１回、２回、または３回の継代（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）後の結果を示す。 図２は、培養におけるＦａｓＬによる処理の１４日後に収集した浮遊ＳＶＦ細胞の蛍光染色を示す概略図である。細胞を、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）アネキシンＶ（水平軸上に示す）およびフィコエリトリン（ＰＥ）ＰＩ（垂直軸上に示す）で染色して、蛍光を、フローサイトメータを用いて測定した。Ｕｎｓｔ細胞は非染色細胞である。 図３Ａは、ＦａｓＬ無し（対照）で、またはＦａｓＬ有りで培養した、蛍光染色されたＭＳＣのパーセンテージを示すグラフである。染色を、フローサイトメータを用いて分析した。 図３Ｂは、ＦａｓＬ無し（対照）で培養したＭＳＣの蛍光染色を示す概略図である。細胞を、ＣＤ１０５（水平軸上に示す）およびＣＤ７３（垂直軸上に示す）に対して向けられる抗体で染色した。細胞を、高ＣＤ７３発現細胞または低ＣＤ７３発現細胞に分けた。 図３Ｃは、ＦａｓＬ有りで培養したＭＳＣの蛍光染色を示す概略図である。細胞を、ＣＤ１０５（水平軸上に示す）およびＣＤ７３（垂直軸上に示す）に対して向けられる抗体で染色した。細胞を、高ＣＤ７３発現細胞または低ＣＤ７３発現細胞に分けた。 図４Ａは、大きなコロニーを示す写真である。 図４Ｂは、小さなコロニーを示す写真である。 図４Ｃは、ＳＶＦ細胞を処理しなかった（対照、上部のセット）、ＦａｓＬで２０日間処理した（「長期間処理」、中央のセット）、またはＦａｓＬで３日間処理した（「短期間処理」、下部のセット）プレートを示す写真である。 図４Ｄは、大きなコロニーの数を示すグラフである。 図４Ｅは、小さなコロニーの数を示すグラフである。 図４Ｆは、コロニーの総数を示すグラフである。 図５は、骨形成培地による培養で増殖したＭＳＣのアリザリンレッド染色を示すグラフである。細胞を、ＦａｓＬに予め曝し、または曝さなかった（対照）。Ｐ＜０．０１。実験を３回繰り返した。下部パネルの写真は、アリザリンレッドで染色した培養体中の分化骨芽細胞を示す；左の写真は、ＦａｓＬ無しで増殖した対照細胞、右の写真は、ＦａｓＬの存在下で増殖した細胞である。 図６は、脂肪生成培地による培養で増殖したＭＳＣのＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を示すグラフである。細胞を、ＦａｓＬに予め曝し、または曝さなかった（対照）。Ｐ＝０．４１９。実験を３回繰り返した。下部パネルの写真は、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した培養体中の分化脂肪細胞を示す；左の写真は、ＦａｓＬ無しで増殖した対照細胞、右の写真は、ＦａｓＬの存在下で増殖した細胞である。 図７は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の存在下で増殖した活性化マウス脾細胞の培地中のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の量（ＩＦＮγ ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。ＭＳＣを、ＦａｓＬに予め曝し、または曝さなかった（対照）。

本発明は、脂肪吸引物から単離されて、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）の存在下でインビトロ培養された間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞が、ＦａｓＬとインキュベートされなかった細胞と比較して、迅速に増殖して、培養中に比較的急速にコンフルエンスに達して、より多くのコロニー形成単位（ＣＦＵ）、特に大きなＣＦＵ（すなわち、より多くの細胞を含有するＣＦＵ）を発生させるという驚くべき観察に基づいている。

したがって、これらの細胞は、比較的短い培養期間にも拘らず、高い分化能を有すると思われる。

ゆえに、発明者らは、組織由来のヒト間葉系幹細胞を分化前に増殖させてから、当該間葉系幹細胞を、迅速かつ信頼性が高い方法で培養により増殖させて、所望される分化細胞に分化する準備ができている細胞を大量に生産するプロセスを開発した。

したがって、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖させる方法を提供し、当該方法は：
（ａ）細胞を体の組織または臓器から単離することと；
（ｂ）（ａ）において得られた単離細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中で少なくとも３日間インキュベートすることによって、ＭＳＣが富化された細胞集団を得ることと
を含む。

本発明の方法の目的は、間葉系幹細胞の数を短い期間で大いに増大させて分化させることによって、移植するのに、そして再生治療が挙げられる種々の治療指標（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）に用いるのに適した細胞集団を得ることである。

したがって、本発明は、移植に用いられる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖させる方法を提供し、当該方法は：
（ａ）細胞を体の組織または臓器から単離することと；
（ｂ）（ａ）において得られた単離細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中で少なくとも３日間インキュベートすることによって、ＭＳＣが富化された細胞集団を得ることと
を含む。

当該技術において知られている用語「間葉系幹細胞」（ＭＳＣ）は、種々の細胞型に分化することができる多能性の間質細胞に関する。ＭＳＣは最近、国際細胞治療学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）によって、以下の特性を有すると定義された：（１）標準的な培養条件下で維持される場合に、プラスチック付着性である；（２）ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０を発現し、そしてＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ－ＤＲ表面分子の発現が欠如している。第３には、ＭＳＣは、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞にインビトロで分化する（１０）。培養体中のヒト間葉系幹細胞を単離して、精製して、増殖させる方法が、当該技術において知られている。例えば、骨髄からの間葉系幹細胞の単離に主に関係する米国特許第５，４８６，３５９号明細書参照。

骨髄は、長骨の骨髄腔、一部のハバーズ管、および海綿骨（ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ ｏｒ ｓｐｏｎｇｙ ｂｏｎｅ）の小柱間の空間を占有する軟組織である。研究によれば、骨髄は、軟骨、骨、および他の結合組織細胞に分化する能力を有する細胞を含有することが示唆されている（Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｊ．Ｎ．：Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２４０：２７０，１９８９）。これらの細胞は、多能性間質幹細胞または間葉系幹細胞と呼ばれ、活性化されるといくつかの異なる型の細胞系統（すなわち、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞その他）に分化する能力を有する。しかしながら、間葉系幹細胞は、組織中に非常に僅かな量で、多種多様な他の細胞（すなわち、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞その他）と共に存在する。

本明細書中で用いられる用語「体の組織または臓器」は、間葉系幹細胞を含有する、対象の体内のあらゆる組織または臓器に関し、脂肪組織、末梢血、骨髄、歯髄、羊水、羊膜、絨毛膜、絨毛膜絨毛、脱落膜、胎盤、臍帯、臍帯血、ホウォートンゼリーが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で用いられる用語「対象」は、哺乳類の対象、具体的にはヒトの対象に関する。

特定の実施形態において、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖させる方法であって、体の組織または臓器から得られた単離細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中でインビトロで少なくとも３日間インキュベートすることによって、ＭＳＣが富化された細胞集団を得ることを含む方法を提供する。

一実施形態において、本発明の間葉系幹細胞は、脂肪由来の幹細胞である。

したがって、特定の実施形態において、本発明は、脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ）を増殖させる方法を提供し、当該方法は：
（ａ）ＳＶＦ細胞を脂肪吸引物から単離することと；
（ｂ）（ａ）において得られた単離細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中で約３日から約２３日間インキュベートすることによって、ＡＳＣが富化された細胞集団を得ることと
を含む。

場合によっては、前記単離ステップ（ａ）は、組織を分解する（コラゲナーゼ消化とも呼ばれる）タンパク質分解酵素（例えばコラゲナーゼ、例えばコラゲナーゼＩ型）またはタンパク質分解酵素の混合物への曝露を含む。細胞のコラゲナーゼ消化を実行するためのプロトコルが、当該技術において周知であり、そしてコラゲナーゼ消化を実行するためのいくつかの化合物が市販されている（例えば、Ｃｙｔｏｒｉ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによるＣｅｌａｓｅ（登録商標）ＧＭＰ）。コラゲナーゼＩ型は、０．１％～０．３％のアレンジで加えられてよい。場合によっては、中性プロテアーゼ、例えばＤｉｓｐａｓｅ ＩＩが、消化反応に加えられてよい。例えば、以下の実施例で示されるように、コラゲナーゼは、０．３７５ｍｇ／ｍｌの濃度にて、３７℃での撹拌下で６０分間、加えられてよい。

本明細書で用いられる用語「増殖させる」は、体の組織または臓器から、例えば脂肪吸引物から単離された間葉系幹細胞のインビトロでの増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｎｕｍｂｅｒ）に関する。

用語「脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）」、および「脂肪由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」は、本明細書中で互換的に用いられ、そして脂肪組織から単離されたＭＳＣを指す。

本明細書中で用いられる「脂肪組織」は、ほとんど脂肪細胞で構成される結合組織を指す。脂肪細胞に加えて、脂肪組織は、前脂肪細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、種々の免疫細胞、例えば脂肪組織マクロファージ、幹細胞、および内皮前駆体細胞が挙げられる細胞の間質血管細胞群（ＳＶＦ）を含有する。

本明細書中で用いられる用語「間質血管細胞群（ＳＶＦ）」は、前脂肪細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、および脂肪組織マクロファージの豊富なソースである脂肪組織の調製に関する。

脂肪吸引物から脂肪由来の幹細胞またはＳＶＦ細胞を単離する方法が、当該技術において知られている（１、１１、および１２）。例えば、脂肪組織は、吸引アシスト脂肪形成術（ｌｉｐｏｐｌａｓｔｙ）、超音波アシスト脂肪形成術、および摘出脂肪切除術、またはそれらの組合せによって、患者から取り出されてよい。組織抽出は、滅菌的または無菌的に実行されるべきである。

吸引アシスト脂肪形成手順について、脂肪組織は、患者内に存在する脂肪組織デポー中への、またはその近くへのカニューレの挿入に続く、吸引装置中への脂肪組織の吸引によって、収集される。シリンジに連結した小型カニューレが、比較的中程度の量の脂肪組織（例えば、０．１ｍｌから数百ミリリットル）を収穫するのに適し得る。より大容量の組織が必要ならば、より大きなカニューレおよび自動化吸引装置が手順に使用されてよい。

脂肪由来の幹細胞またはＳＶＦ細胞を脂肪吸引物から単離するための例示的なプロトコルが、以下の実施例の節に記載されている。

本明細書中で用いられる用語「アポトーシス誘導剤」（「アポトーシス促進剤」とも定義される）は、プログラム細胞死を促進することができる剤（例えば、化学物質またはポリペプチド）を指す。本発明に従って用いられ得る例示的なアポトーシス誘導剤として、以下に限定されないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーリガンドが挙げられる。

ＴＮＦスーパーファミリーに属すると現在認識されている、４０を超える異なるリガンドレセプタ系が存在する。ＴＮＦスーパーファミリーに属して、本発明に従って用いられ得る例示的なアポトーシス誘導剤として、以下に限定されないが、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＮＦα、Ｔｒａｉｌ（Ａｐｏ２リガンド）、およびＴｗｅａｋ（Ａｐｏ３リガンド）が挙げられる。そのようなＴＮＦスーパーファミリーアポトーシス誘導剤は、組換えポリペプチドであってもよいし、生化学的に合成されてもよいし、細胞抽出物から精製されてもよい。これらは、モノマー、ダイマー、またはマルチマーの形態として投与されてよい。

ゆえに、一部の実施形態において、本開示に従うアポトーシス誘導剤は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドである。更なる実施形態において、アポトーシス誘導剤は、ＦａｓＬ、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、およびＴＷＥＡＫからなる群から選択される。

特定の実施形態において、アポトーシス誘導剤はＦａｓＬである。本発明に従って用いられるＦａｓＬの非限定的な例として、ｓｕｐｅｒＦａｓＬ、ＡＰＯ０１０、またはＭｅｇａＦａｓＬ（Ｒ＆Ｄ）が挙げられ、これらは全て、ＦａｓＬのヘキサマーである。ＦａｓＬのヘキサマー形態は、トリマーよりも１００倍活性がある。ＦａｓＬの更なる形態、例えばＦｃ－ＦａｓＬまたはＦａｓＬのモノマーもまた、本発明によって包含される。

アポトーシス誘導剤の、培地中の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖから約１００ｎｇ／ｍｌのアポトーシス誘導剤の範囲内であり、例えば１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。アポトーシス誘導剤がＦａｓＬである特定の実施形態において、培地は、ＦａｓＬを約１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖから約１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、ＦａｓＬを１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌ含む。

先で示されるように、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖させる方法は、体の組織または臓器から単離された細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中で、示された期間、インキュベートすることを含む。当該技術において知られているように、用語「インキュベートする」は、細胞を、細胞インキュベータ内で適切な温度およびガス混合（典型的には、哺乳類の細胞について、３７℃、５％ＣＯ２）にて増殖させて維持することを指す。本発明の文脈において用いられる、「単離細胞を、アポトーシス誘導剤を含む増殖培地中でインキュベートする」は、単離された細胞をアポトーシス誘導剤と接触させることを意味する。

一部の実施形態において、本開示に従う方法は、アポトーシス誘導剤とのインキュベーションが、少なくとも３日間、すなわち３日間以上なされる。特定の実施形態において、インキュベーションは、約３日から約２３日間、具体的には約３、５、７、１０、１４、１７、２０、または２３日間なされる。

他の実施形態において、アポトーシス誘導剤とのインキュベーションは、１４日間なされる。特定の実施形態において、アポトーシス誘導剤はＦａｓＬであり、そして単離細胞は、ＦａｓＬと１４日間インキュベートされ、培地は、３～４日毎に補充される。特定の実施形態において、ＦａｓＬは、５０ｎｇ／ｍｌの量で提供される。

一部の実施形態において、アポトーシス誘導剤を含む培地は、３日毎に、または４日毎にリフレッシュされる。すなわち、内容物が同じフレッシュな培地によって交換される。

一部の実施形態において、ＦａｓＬとのインキュベーションは、細胞が単離された１～７日後に始められる。特定の実施形態において、本開示に従う方法では、ステップ（ａ）の後に、単離細胞が、アポトーシス誘導剤無しで、１、２、３、４、５、６、または７日間培養されてから、アポトーシス誘導剤とインキュベートされる。

特定の一実施形態において、ＦａｓＬとのインキュベーションは、細胞が単離された３日後に始められる。すなわち、この実施形態に従えば、細胞は、単離後の３日間、ＦａｓＬ無しの培地中でインキュベートされる。

一実施形態において、ＦａｓＬとのインキュベーション前に、単離細胞は、例えばＦａｓの発現を増大させることによって、ＦａｓＬに対する細胞応答に影響を及ぼす（すなわち、細胞をその作用に対して高感度化させる）ことができる分子と、プレインキュベートされる。ＴＮＦαは、そのような増感作用分子の一例である。

したがって、一部の実施形態において、本開示に従う方法は、アポトーシス誘導剤がＦａｓＬであり、ＦａｓＬとのインキュベーションの前に、単離細胞は、ＴＮＦαとプレインキュベートされる。更なる特定の実施形態において、ＴＮＦαとのプレインキュベーションは、１～４日間実行される。

一部の実施形態において、本開示に従う方法は、アポトーシス誘導剤がＦａｓＬであり、ＦａｓＬの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲内にある。

特定の実施形態において、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤に加えて、細胞は、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される更なる活性剤とインキュベートされる。特定の、非限定的な例において、細胞は、デスレセプタ３（ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５としても知られている））の１つまたは複数のアンタゴニストとインキュベートされてもよい。そのようなアンタゴニストとして、以下に限定されないが、例えばａｂｃａｍ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、および他の製造業者から市販されている抗ＤＲ３抗体が挙げられる。

以下の実施例において示されるように、１４日間のＦａｓリガンドによる処理は、未処理の細胞と比較して、ＣＤ３１－／ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージを増大させた。加えて、Ｆａｓリガンドによる処理は、ＣＤ２９＋／ＣＤ１０５＋からＣＤ２９＋／ＣＤ１０５－への移行を誘導した。

当該技術において知られている用語ＣＤ３４は、細胞表面糖タンパク質における分化のクラスタを指し、そして細胞－細胞付着因子として機能する。これはまた、幹細胞の、骨髄細胞外マトリックスへの、または直接的な間質細胞への付着を媒介し得る。表面糖タンパク質３４を発現する細胞（ＣＤ３４＋細胞）は、臍帯および骨髄において、造血細胞、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞等として一般に見出される。ＣＤ３４＋細胞は、内皮細胞、血小板、マクロファージおよびクップファー細胞、顆粒球、Ｔ／ＮＫ細胞、リンパ球、巨大核細胞、破骨細胞、好中球上で通常見られるＣＤ３１を発現しない（すなわち、ＣＤ３１－細胞）ならば、あまり分化していない細胞であると考えられる。

当該技術において知られている用語ＣＤ１０５（エンドグリン）は、血管形成内皮細胞において多量に発現される、増殖に関連する低酸素誘導タンパク質を指す。ヒト間葉系幹細胞は、無血清培地中での培養後のＣＤ１０５の発現の引下げを示すこと、そして当該細胞中のＣＤ２９の発現は高いことが報告されている（１３）。加えて、ＣＤ１０５－マウスＡＳＣは、ＣＤ１０５＋ＡＳＣと比較して、脂肪細胞および骨細胞に分化する能力がより高く、そしてＴ細胞増殖をインビトロで阻害するのがより優れていたことが報告されている（１４）。

したがって、理論に縛られることを望むものではないが、アポトーシス誘導剤とのインキュベーションにより、細胞集団は、あまり分化していない状態に移行して、「幹細胞らしさ（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」が増した。

先で示されるように、本開示は、本明細書中で定義される移植に用いられる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖させることによって、ＭＳＣが富化された細胞集団を得る方法を提供する。本明細書中で用いられる用語「富化された」は、細胞集団中のＭＳＣの相対数を、細胞集団の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％高め、増大させ、または上昇させることを指す。

アポトーシス誘導剤とのインキュベーションの期間が終了すると、増殖した細胞が培養体から取り出されて、再播種されて、培養条件に応じて、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、または筋細胞の何れか１つに直ちに分化し得る。それぞれの所望の細胞型に分化するための条件は、当該技術において周知であり、特定の試薬を含有する培地中での細胞のインキュベーションが挙げられる。

したがって、一部の実施形態において、本開示に従う方法では、アポトーシス誘導剤とのインキュベーション後に、前記アポトーシス誘導剤が除去されて、前記細胞は分化することができる。他の特定の実施形態において、細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、または骨細胞に分化することができ、本明細書中で「分化細胞」と呼ばれる。

本明細書中で用いられる用語「分化することができる」は、所望の細胞型の何れかへの分化に適した条件下での細胞のインキュベーションに関する。そのような条件は、当該技術において周知であり、特に、典型的なセットの試薬を含有する培地中でのインキュベーションが挙げられる。

例えば、間葉系幹細胞脂肪生成培地は、間葉系幹細胞を脂肪生成系統に容易に分化させる試薬（すなわち、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、インスリン、およびインドメタシン）を含有する。そのような培地は市販されており、例えば、Ｌｏｎｚａ’ｓ ｈＭＳＣ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）ＭｅｄｉｕｍまたはＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’ ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍがある。その後、脂肪生成分化の量に関連する定量的値を与える種々の方法によって、脂肪細胞への分化が確認されてよい。他の培地が、他の細胞型への分化を誘導するのに用いられてもよい（例えば、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、またはＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ））。増殖したＡＳＣはまた、それ自体のもの以外の胚起源の細胞にも分化転換（ｔｒａｎｓ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）し得、例えば、血液生成も補助しながらの、心筋原性（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｉｃ）、内皮（血管）、膵臓（内分泌）、神経形成、そして肝臓の分化転換がある。

更なる実施形態において、本開示に従う方法はさらに、分化細胞を、それを必要とする患者に移植することを含む。

本明細書中で用いられる用語「を必要とする患者」は、分化細胞を移植することによって改善、治療、処置され得る疾患に苦しむ、またはその症候が緩和される対象に関する。

したがって、分化細胞は、多数の臨床用途、ならびに美容用途および形成外科での、例えば、現在、ＩＩＩ／ＩＶフェーズの臨床試験にある以下の指標での移植に用いられ得る：乳房再建（修復）、早期卵巣不全、複雑な肛門周囲瘻（Ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｅｒｉａｎａｌ ｆｉｓｔｕｌａ）、痔瘻、およびクローン病。ＡＳＣはまた、細胞バンクに用いられ得る。追加の用途として、皮膚再生、皮膚病変、肝再生、筋肉再生、血管修復、整形外科的損傷の処置、骨再建または骨修復、軟骨細胞移植、半月板の処置または関節軟骨修復、および骨粗鬆症の処置が挙げられる。

本発明の分化細胞はまた、免疫抑制に用いられ得る。例えば、付随する臓器移植、例えば、骨髄、肝臓、腎臓、血管、または心臓の移植を受ける患者において、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を軽減するために用いられる。他の実施形態において、本発明に従う分化細胞は、卒中または心不全を処置するのに用いられ得る。

移植は、同種異系間移植であっても自家移植であってもよい。

本明細書中で定義される用語「移植」は、分化細胞を、それを必要とする患者に、外科手術または注射によって移すことを指す。ドナーおよびレシピエントは、単個体であっても異なる個体であってもよい。そのような場合、移植はそれぞれ、自家移植または同種異系間移植である。同種異系間移植が実施される場合、移植拒絶を引き下げるレジームが行われるべきである。そのようなレジームは現在、ヒト治療において実施されており、当該技術において周知である。

以下は、欠けた臓器細胞、または損傷を受けた臓器細胞を補充するために、細胞の外部ソースとして用いられる間葉系起源の細胞の例である：米国特許第５，７３６，３９６号明細書は、間葉系組織の再生または修復のために、培養増殖系統によって誘導された間葉系幹細胞を、元の自己宿主中に導入することを記載している。

米国特許第４，６４２，１２０号明細書は、軟骨および骨の欠損を修復する組成物を提供する。これは、それ自体が、または天然骨もしくは人工骨に埋め込まれて、ゲルの形態で提供される。

分化細胞の移植は、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて、そして患者の治療指標に基づく医師の判断で、実行されてよい。例えば、分化細胞は、組織欠損（例えば骨格欠損）部位に注射されてもよいし、生体適合性のスカフォールドまたはマトリックスとインビトロでインキュベートされて、スカフォールドを欠損部位に移植してもよい。

本発明の分化細胞はまた、遺伝子治療に使用されてもよい。良好な長期の遺伝子治療のために、所望の外来遺伝子を安定して発現する、高頻度の遺伝子改変細胞が必要とされる。したがって、本発明の分化細胞は、遺伝子産物を発現するように改変されてよい。

本明細書中で用いられる用語「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチド、および機能的ＲＮＡ分子（すなわちポリヌクレオチド）を指す。そのような遺伝子産物の例として、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、例えば血液凝固因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸ、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、シトクロムｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ（血清アデノシンのプロセシングまたは低密度リポタンパク質のエンドサイトーシス用）、血清胸腺因子、胸腺液性因子、サイモポエチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロトニン、およびＰ物質が挙げられる。

その態様の別の１つにおいて、本開示は、細胞培養培地およびアポトーシス誘導剤を含む間葉系幹細胞増殖培地を提供する。

本明細書中で定義される「細胞培養培地」または「増殖培地」は、細胞の増殖を支持するように設計された液体またはゲルを指す。様々な培地型が、様々な細胞型を増殖させるのに用いられる。細胞培養培地の例は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびその変形、Ｆ１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０培地、ならびにイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を包含する。

これらの培地は全て周知であり、市販されている。例えば、ＤＭＥＭは典型的に、アミノ酸、無機塩、グルコース、フェノールレッド、Ｈｅｐｅｓピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを含む。培地は多くの場合、抗生剤／抗真菌剤、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢが補われている。培地は、様々なグルコース量を含んでよい。一実施形態において、培地は、高グルコース量であり、例えば、ＧｉｂｃｏによるＨｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭがある。

細胞培養培地はさらに、血清を含んでもよい。

本開示の文脈における用語「血清（ｓｅｒｕｍ ｏｒ ｓｅｒａ）」は、広範囲の巨大分子、脂質物質および微量元素のためのキャリアタンパク質、付着拡散因子、低分子量の栄養分、ならびにホルモンおよび増殖因子を供給する、細胞培養培地に加えられる補助剤を指す。典型的には、血清は、哺乳類の血液製剤から単離される。本発明に関連した使用に適した血清の非限定的な例として、ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）またはウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）がある。血清代用品が用いられてもよい。用語「血清代用品」は、培養での細胞増殖を支持するのに必須のタンパク質を含有する血清代替品を指し、例えば、血清代用品は、精製された、好ましくは熱処理された血清アルブミン、トランスフェリン、およびインスリンを含み得る。そのようなタンパク質は、あらゆる起源のものであってよく、例えば哺乳類のタンパク質、例えばウシ血清アルブミン、トランスフェリン、およびインスリンであってよい。そのような血清代用品は、例えばＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。培地中の血清濃度は、細胞を増殖させるのに一般的に用いられる範囲内、すなわち、約１％から約２０％までである。特定の実施形態において、血清濃度は、約１０容量／容量％である。更なる特定の実施形態において、培地は、１０％ＦＣＳまたはＦＢＳ、例えばＨｙｃｌｏｎｅ（商標）によるウシ胎仔血清を含む。

間葉系幹細胞増殖培地の文脈において用いられるアポトーシス誘導剤は、本明細書中で定義される通りである。すなわち、プログラム細胞死を促進することができる剤である。先で示されるように、用いられ得る例示的なアポトーシス誘導剤として、以下に限定されないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーリガンド、例えばＦａｓＬ、ＴＮＦα、Ｔｒａｉｌ（Ａｐｏ２リガンド）、およびＴｗｅａｋ（Ａｐｏ３リガンド）が挙げられる。アポトーシス誘導剤の、培地中の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖから約１００ｎｇ／ｍｌのアポトーシス誘導剤の範囲内であり、例えば１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。特定の実施形態において、アポトーシス誘導剤はＦａｓＬである。更なる特定の実施形態において、培地は、ＦａｓＬを約１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖから約１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、ＦａｓＬを１ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌ含む。

本発明の間葉系幹細胞増殖培地は、細胞増殖に適した追加の構成成分をさらに含んでもよく、以下に限定されないが、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、およびキャリアが挙げられる。

本発明の間葉系幹細胞増殖培地は、調製されてから、用いられるまで４℃にて保存され、そして用いられる前に３７℃に温められ得る。その態様のさらに別の１つにおいて、本開示は、以下を含む製品を提供する：
ａ．細胞増殖培地およびアポトーシス誘導剤を含む間葉系幹細胞増殖培地を含有する容器と；
ｂ．間葉系幹細胞を増殖させるための、間葉系幹細胞増殖培地の使用説明書。

特定の実施形態において、前記増殖培地はさらに、血清または血清代用品を含む。

本明細書中で定義される用語「容器」は、本明細書中で定義される間葉系幹細胞増殖培地を含有し、かつ保存するのに用いられ得るコンテナ、バッグ、ビーカー、ボトル、ボウル、ボックス、バイオリアクタ、缶、フラスコ、またはバイアルを指す。

本明細書中で定義される用語「約」は、最大１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、そして一部の場合では最大２０％、言及される値よりも高く、または低く外れてもよい値を示し、偏差範囲は整数値を、そして当てはまるならば、連続的範囲を構成する非整数値を同様に含む。

更なる詳細がなくとも、当業者であれば、先の記載を用いて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の好ましい特定の実施形態は、単なる例示であると解釈されるべきであり、いかなる形であれ、特許請求される本発明を限定しない。

本明細書中で詳細に記載されない、当該技術において知られている標準的な分子生物学のプロトコルは一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１に本質的に従う。

本明細書中で詳細に記載されない、当該技術において知られている標準的な医薬化学方法は一般に、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓによって出版されている、様々な著者および編集者によるシリーズ「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」に本質的に従う。

実験手順
脂肪吸引
Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０８：６４－７６に詳述されるように、肥満である、または以前に肥満であった、脂肪吸引を経験したドナーから、インフォームドコンセントの後、ＩＲＢ認可プロトコルを用いて、脂肪吸引物を得た。脂肪吸引物は主に、生理食塩水、血液、および脂肪組織断片を含む。

脂肪吸引物は、１２００ｒｐｍにて５分間の遠心分離によって２つの部分に分離された：脂肪質の流動性脂肪部分（「吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）」とも呼ぶ）および流体部分。脂肪質部分を、清潔な管中に吸引した。脂肪質部分から単離した細胞を、「処理済み吸引脂肪細胞」（ＰＬＡ、６０万細胞／脂肪吸引物１ｍｌ）と呼び、流体部分から単離した細胞を「脂肪吸引物流体細胞」（ＬＡＦ、６万細胞／脂肪吸引物１ｍｌ）と呼ぶ。

処理済み吸引脂肪細胞から間質血管細胞群の細胞を得る
脂肪質部分から単離した細胞（ＰＬＡ細胞）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。細胞を再懸濁させて、コラゲナーゼ（０．３７５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、３７℃での撹拌下で６０分間消化した。次に、コラゲナーゼを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えることによって中和して、間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞を、１４００ｒｐｍにて１５分の更なる遠心分離ステップによって、脂肪および脂肪細胞から分離した。次に、ＳＶＦ細胞を計数して、６ｃｍの皿あたり２×１０５細胞の密度で、または６つのウェルプレート中のウェルあたり２×１０５細胞の密度で、プレーティングした。

ＦａｓＬの存在下での細胞増殖
異なるドナーから得た異なる吸引脂肪（脂肪質部分）から単離したＳＶＦ細胞を、細胞インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２にて、Ｆａｓリガンドの存在下で、以下で記載する条件下で、数回繰返してインキュベートした。８枚のプレート上に細胞を播種することを含む例示的なインキュベーションプロトコルにおいて、４枚のプレートを、１０％ＦＣＳおよび５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓリガンド（Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と共にインキュベートし、そして対照として、４枚のプレートを、１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭと共にインキュベートした。

これ以外にも、６つのウェルにＳＶＦ細胞を播種した。このような場合、３つのウェルを、１０％ＦＣＳおよび５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓリガンドを補ったＤＭＥＭと共にインキュベートし、そして対照として３つのウェルを、１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭと共にインキュベートした。

対照群および処理群の双方において、約７２時間毎に培地を同時に変えた。播種後約１４日目に、処理したプレートおよび未処理のプレートの双方がコンフルエント状態に達すると、細胞をトリプシンによってプレートから取り出して、自動化細胞カウンターで計数した。各プレート／ウェルを、別々に計数した。試験した細胞について、更なるパラメータ、例えば、生細胞および死細胞の数、ならびにコロニー形成単位のサイズおよび数を評価した。また、以下で詳述するように、フローサイトメトリを用いて、細胞を、表面分子発現について調査した。

また、異なるドナーから得た異なる吸引脂肪（脂肪質部分）から単離したＳＶＦ細胞を、より短い期間、すなわち、播種時（０ｈ）から７２時間（第１の培地交換まで）、先に記載したＦａｓリガンドの存在下でインキュベートした。

フローサイトメトリ
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーター）分析のために、細胞をトリプシン処理して、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ管に分けて（１×１０５細胞／管）、ＶｉＶｉＤアミン反応性色素（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉｏｌｅｔ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ）により、１．５μｌ／サンプルで、暗所において３７℃にて３０分間染色した。洗浄後、細胞を、
５μｌのＰＥ／Ｃｙ７ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ７３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
５μｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
５μｌのＰＥ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
５μｌのＡＰＣ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
５μｌのＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３１（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
５μｌのＢＶ６５０ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
を含有する６色パネルと、暗所において３７℃にて３０分間、インキュベートした。

標識細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。

アネキシンＶ染色
細胞を、低温のＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．Ｎｏ ４２０２０１）で２回洗浄してから、アネキシンＶ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．Ｎｏ ４２２２０１）中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度にて再懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液を５ｍｌの試験管に移した。５μｌのＡＰＣアネキシンＶを加えてから、１０μｌのＰＩ溶液（Ｃａｔ．Ｎｏ ４２１３０１）または７－ＡＡＤ（Ｃａｔ．Ｎｏ ４２０４０３／４２０４０４）を加えた。細胞を穏やかにボルテックスして、室温（２５℃）にて１５分間、暗所においてインキュベートした。４００μｌのアネキシンＶ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４２２２０１）を、各管に加えて、フローサイトメトリによって分析した。

ギムザ染色
コロニーを１００％メタノールで固定して、洗浄して、ギムザ染色してから、別の洗浄をして、顕微鏡下で観察した。

実施例１ ＦａｓＬの存在下で間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞を培養する
先に記載したように、脂肪吸引物の脂肪質部分からＳＶＦ細胞を得て、播種した。次に、細胞を、３つの実験群に分けた：細胞の一群は、ＦａｓＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間（３日間）インキュベートし、細胞の別の群は、先の濃度のＦａｓＬの存在下で約１４日間インキュベートし、そして第３の群は、ＦａｓＬ無しでインキュベートして、対照として用いた。生じた細胞集団を分析して、結果を以下に示す。

細胞数
播種後１４日目に、処理済みプレートおよび未処理のプレートの双方が、コンフルエント状態に達した（Ｐ０）。細胞をトリプシンによってプレートから取り出して、自動化細胞カウンターで計数した（各プレートを別々に計数した）。試験した群のそれぞれ１つについて得た生存細胞数を、以下の表１に示す。

表１から明らかなように、ＦａｓＬで１４日間処理した群の細胞数は、対照群の細胞数よりも約１．５倍多く（Ｐ＝０．００４３）、そしてＦａｓＬで３日間処理した群の細胞数よりも２倍多かった。

細胞数に及ぼすＦａｓＬ処理の影響は、以下の表２で示すように、細胞を２４個のウェルプレート内に１．５×１０４細胞／ウェルの濃度で接種した場合に、さらに顕著であった。これらの条件下では、ＦａｓＬで１４日間処理した群の細胞数は、対照群の細胞数よりも約２．５倍多かった（Ｐ＝０．００３）。

脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ、本明細書中で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とも呼ぶ）を、数回継代した。コンフルエンスに達すると直ぐに、細胞をトリプシン処理して、１、２、または３回の細胞継代（Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３と呼ぶ）用に再培養した。各培養期間に約１０～１４日を費やして、細胞の８０～９０％がコンフルエンスに達したときに、細胞を継代した。細胞は、各継代でより大きくなった。試験した各継代で、細胞が約９０％のコンフルエンスに達した後に、２０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬで６日間処理した。次に、トリプシン処理によってＭＳＣを分離して、細胞カウンターを用いて計数した。図１で分かるように、ＦａｓＬ処理は、細胞が受けた継代数に関係なく、ＦａｓＬでインキュベートしなかった対照と比較して、ＭＳＣの数を増大させた。細胞数は、２０～８０％増大した。

加えて、培養の１４日後、浮遊細胞を収集して、アポトーシス検出マーカーである蛍光標識アネキシンＶで、そして変性細胞の蛍光マーカーであるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色して、培養体中の死細胞の数を評価した。分析は、フローサイトメータを用いて実行した。図２に示すように、細胞をアネキシンＶおよびＰＩで染色することで、ＦａｓＬで処理した細胞の９３％が、遅かれ早かれアポトーシスを経験することが示された。明らかに、ＦａｓＬで１４日間処理した群における死細胞の数は、他の群におけるよりも１４倍多い。

理論に縛られることを望むものではないが、これらの結果は、ＦａｓＬによるインキュベーションが、感受性細胞において高い割合のアポトーシス細胞死を誘導するので、以下で示すように、より力強く増殖することができ、かつまた大きなコロニー形成単位を生じさせることができる細胞で培養体を富化することを示唆している。

表面分子の発現
表面分子の発現を、先で詳述したように実行するフローサイトメトリを用いて調査した。以下の表３に示すように、Ｆａｓリガンドによる１４日間の処理により、未処理の細胞と比較して、ＣＤ３１－／ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージが増大した。加えて、Ｆａｓリガンドによる１４日間の処理により、ＣＤ２９＋／ＣＤ１０５＋からＣＤ２９＋／ＣＤ１０５－への移行が継代で誘導されたが、これは対照群では見られなかった。

得られた細胞は、間葉系幹細胞ＭＳＣの特性を有する。

ＭＳＣを、Ｐ０以後に、ＦａｓＬの有り無しで培養した。ＭＳＣ表面マーカーＣＤ７３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＣＤ１０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）をフローサイトメトリによって、メーカーの説明書に従って分析した。図３で分かるように、Ｐ０でのＦａｓＬ処理は、増殖ＭＳＣ内の細胞亜集団の変化の原因となる。処理は、ＣＤ７３を発現するＭＳＣのパーセンテージを、ほぼ２倍にした。同時に、ＦａｓＬ処理は、ＣＤ１０５陽性細胞のパーセンテージを、ほぼ半分に減少させた。すなわち、ＦａｓＬ処理は、ＣＤ７３高集団を増大させて、ＣＤ１０５（＋）細胞を減少させる。

コロニー形成単位（ＣＦＵ）の特徴付け
次に、図４で実証されるように、ＦａｓＬでインキュベートした培養体のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を評価した。このアッセイのために、細胞を、６ｃｍの皿あたり２，０００細胞の密度で３通りプレーティングした。細胞を、ＦａｓＬの存在下で２０日間、または３日間インキュベートした。播種後２０日目に、Ｆａｓリガンド処理したプレートおよび未処理のプレートを固定して、ギムザで染色した。ＣＦＵの大きなコロニー（図４Ａ）およびＣＦＵの小さなコロニー（図４Ｂ）を、培養中に検出することができる。

図４Ｃに示すように、コロニー形成単位が、全てのアッセイ条件下で形成された。明らかに、コロニー形成単位の総数は、以下の表４にも示すように、未処理の細胞におけるよりも処理群において多く、そして、ＦａｓＬで長い処理期間（２０日間）、そして短い処理期間（３日間）処理した培養体で、類似していた。

しかしながら、興味深いことに、図４Ａおよび図４Ｂでそれぞれ実証されるように、ＦａｓＬと２０日間インキュベートした細胞で大きなコロニーが形成されたが、ＦａｓＬと３日間インキュベートした細胞で小さなコロニーが形成された。

明らかに、以下の表４に示すように、Ｆａｓリガンドの存在下で３日間のみインキュベートした細胞培養体のＣＦＵの総数は、Ｆａｓリガンドの存在下で２０日間インキュベートした細胞培養体のＣＦＵの数に類似したが、大きなコロニーのパーセンテージは、ＦａｓＬと２０日間インキュベートした細胞で、より高かった。

コロニー（ＣＦＵ）の数を、顕微鏡計数を用いて評価した。これらの結果もまた、図４Ｄ（大きなコロニーの数）、図４Ｅ（小さなコロニーの数）、および図４Ｆ（コロニーの総数）において実証される。

先の結果から、ＦａｓＬによる２０日間の処理が、未処理の細胞および３日間のみの処理を受けた細胞の双方と比較して、大きなコロニーの数を増大させたことが明らかである。加えて、Ｆａｓリガンドで３日間のみ処理した細胞は、ＦａｓＬで２０日間処理した細胞と比較した、小さなコロニーの数の増大によって特徴付けられた。大きなコロニーは、初期前駆細胞（例えば、幹細胞および前駆細胞）から形成されることが知られている。ゆえに、ＦａｓＬは、初期前駆幹細胞を優先して支持／選択し得ると思われる。

全細胞のおおよそ２％が、コロニーに発達する。

実施例２ 分化の誘導
骨分化－先に記載したように、脂肪吸引物の脂肪質部分からＳＶＦの細胞を得て、播種した。次に、細胞を、２つの実験群に分けた：細胞の一方の群は、ＦａｓＬ（ＳｕｐｅｒＦａｓＬ ５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートし、第２の群は、ＦａｓＬ無しでインキュベートして、対照として用いた。

インキュベーション（ＦａｓＬ有り、または無し）の７～１０日後に、細胞培養体がコンフルエンスに達すると、ＭＳＣを、種々の誘導培地中で培養して、骨細胞または脂肪細胞への分化を誘導した。

実験の一セットにおいて、ＭＳＣを、骨形成誘導培地、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。このキットは、ヒト間葉系幹細胞の、骨細胞へのインビトロ分化を誘導するのに必要とされる種々の試薬を含有する。誘導培地は、全ての場合において、３～４日毎に交換した。

分化培地の存在下での２１日後、細胞を４％ホルマリン（ＲＴにて２０分）で固定して、２％Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ４．２（ＲＴにて１０分）で染色した。アリザリンレッドは、ヒト間葉系幹細胞の分化した培養体中のカルシウム含有骨細胞を同定するのに一般的に用いられる染色剤である。図５で分かるように、ＦａｓＬ処理済みＭＳＣは、未処理の対照よりも多数の骨分化を実証する。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡を用いて、ＤＰ５１カメラで写真を撮った。

脂肪細胞への分化－実験の別のセットにおいて、ＭＳＣを、１０μｇ／ｍＬインスリン、１×１０－６Ｍデキサメタゾン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－イソブチル－１－メチルキサンチン）、および５０μＭインドメタシン（全てＳｉｇｍａ由来）を含有する脂肪生成培地中で培養した。２１日後、細胞を、４％ホルマリン（室温［ＲＴ］にて２０分）によって固定して、０．５％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｓｉｇｍａ）でＲＴにて１０分間、染色した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏは、培養細胞中の中性脂質の選択的な染色および検出に一般的に用いられる。図６で分かるように、ＦａｓＬ処理済みのＭＳＣは、未処理の対照に匹敵する脂肪分化を実証する。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡を用いて、ＤＰ５１カメラで写真を撮った。

免疫抑制－次に、ＦａｓＬの存在下でのＭＳＣの増殖が、免疫抑制特性に影響を及ぼすかを試験するのに、細胞の免疫抑制特性を調査した。

初代マウス脾細胞を用いるアッセイで、細胞の免疫抑制特性を試験した。脾臓の機械的粉砕および１００μｍストレーナによる濾過を含む標準プロトコルを用いて、マウス脾細胞を得て、細胞を、赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファに曝してから、培地（ＲＰＭＩ）で洗浄した。先に記載したようにして得たコンフルエントヒトＭＳＣ（すなわち、ＦａｓＬ有りまたは無しで増殖したＭＳＣ）上に、ウェルあたり０．３×１０６細胞を（３００万×１０６細胞／ＲＰＭＩ１ｍｌを含有する溶液を用いて）播種した。対照は、ＭＳＣの不在下で増殖した脾細胞を含んだ。マウス抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を９６時間用いて、脾細胞を活性化した。ＥＬＩＳＡを用いて、培地に分泌されたＩＦＮガンマのレベルを測定することによって、脾細胞の活性化レベルを判定した。メーカーの説明書（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）に従って、測定を実行した。図７に示すように、未処理のＭＳＣおよびＦａｓＬ処理済みＭＳＣは双方とも、ＭＳＣ無しでインキュベートした活性化脾細胞と比較して、活性化脾細胞からのＩＦＮガンマ分泌を有意に弱めた。

明らかに、ＦａｓＬ処理は、脾細胞活性化アッセイによって判定して、対照ＭＳＣと比較して、ＭＳＣの免疫抑制特性を損なわない。

Claims (7)

1. 脂肪由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖させる方法であって：
   体の組織または臓器から単離した細胞を、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）を含む増殖培地中で少なくとも３日間インキュベートするステップであって、ＦａｓＬ濃度が５ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲内にあり、これによって、ＭＳＣが富化された細胞集団を得るステップを備えることを特徴とする方法。
2. 脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ）を増殖させる方法であって：
   （ａ）間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞を脂肪吸引物から単離するステップと；
   （ｂ）（ａ）で得られた単離細胞を、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）を含む増殖培地中で少なくとも３日間インキュベートするステップであって、ＦａｓＬ濃度が５ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲内にあり、これによって、ＡＳＣが富化された細胞集団を得るステップと
   を備えることを特徴とする方法。
3. 請求項１または２に記載の方法において、前記増殖培地はさらに、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される更なる活性剤を含むことを特徴とする方法。
4. 請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）との前記インキュベーションは、３、５、７、１０、１４、１７、２０、または２３日間なされることを特徴とする方法。
5. 請求項４に記載の方法において、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）との前記インキュベーションは、１４日間なされることを特徴とする方法。
6. 請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、体の組織または臓器または脂肪吸引物から単離された後に、単離細胞は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）無しで、１、２、３、４、５、６、または７日間培養されてから、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）とインキュベートされることを特徴とする方法。
7. 請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）とのインキュベーションの後に、前記Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は除去されて、前記細胞は分化することができることを特徴とする方法。

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