JP2021522809A - 脂肪由来幹細胞を増大させるための方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、細胞移植の分野にあり、詳細には本発明は、インビトロで脂肪由来幹細胞を繁殖させるための方法を提供する。
本明細書に開示された主題に対して背景として関連すると見なされる参考資料を、以下に列挙する:
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腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーの一員であるFasリガンド(Fas−L)は、リンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞およびマクロファージなどの免疫細胞の表面で発現されるII型膜貫通タンパク質である。その受容体(CD95またはFas受容体(FasR))への結合時に、Fas−Lは、アポトーシスを誘導する。Fas−Lは長い間、その受容体および活性化カスパーゼへの結合によりアポトーシスを促進するデスリガンドと見なされてきた。しかし、データの蓄積は現在、Fasが様々な生理状態および疾患状態に対し広範囲に及ぶ関与を有し得る様々な非アポトーシス性シグナルを伝達し得ることを示唆する[1]。Fas−Lは、免疫系恒常性維持に関連づけられており、自己免疫に対する保護者であることが示唆されてきた。さらに、増えつつあるエビデンスは、炎症、増殖、再生および癌進行などの、追加的細胞応答の開始におけるFas−Lシグナル伝達の関与を実証している。種々の細胞および組織におけるCD95(FasR)のかなり普遍的な発現は、この新しい思想を裏付ける。
態様の第一において、本発明は、間葉系幹細胞(MSC)を繁殖させるための方法であって、
(a)身体組織または臓器から細胞を単離すること;および
(b)(i)少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドと、
(ii)少なくとも1種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、(a)で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりMSCが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
(a)脂肪吸引物から間質血管細胞群(SVF)の細胞を単離すること;および
(b)(i)少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドと、
(ii)少なくとも1種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、(a)で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりASCが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
a.細胞生育培地、TNFスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む、脂肪幹細胞生育培地または間葉系幹細胞生育培地を含有する容器と;
b.脂肪幹細胞または間葉系幹細胞をインビトロで増大させるために生育培地を使用するための説明書、
を含む、製品を提供する。
本発明は、Fas−L処置が脂肪由来幹細胞(ASC)の同時に起こるアポトーシスおよび増殖を促進し、細胞収率の増加および表現型シフト(phenotypic shift)を導くという驚くべき知見に基づく。細胞に及ぼすFas−Lの複雑な影響の理解は、本発明者らを、Fas−Lとアポトーシスを阻害する薬剤を含む、薬剤の組み合わせへの細胞の暴露を含む脂肪由来幹細胞を増大させるための新規な方法を考案するよう導いた。
(a)身体組織または臓器から細胞を単離すること;および
(b)(i)少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドと、
(ii)少なくとも1種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、(a)で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりMSCが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
(a)対象から得られた脂肪吸引物から間質血管細胞群(SVF)の細胞を単離すること;および
(b)(i)少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドと、
(ii)少なくとも1種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、(a)で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりASCが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
a.細胞生育培地、TNFスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む、脂肪幹細胞生育培地または間葉系幹細胞生育培地を含有する容器と;
b.脂肪幹細胞または間葉系幹細胞をインビトロで増大させるための生育培地を使用するための説明書、
を含む、製品を提供する。
さらなる労作を行わずとも、当業者は、上記の記載を用いることで本開示を最も完全な範囲まで利用し得ると考えられる。それゆえ、以下の好ましい具体的実施形態は、単に例示と解釈すべきであり、請求された本発明の限定と解釈すべきでない。
間質血管細胞群(SVF)の細胞に及ぼすFas−L処置の影響を評価するために、SVF細胞を、以下に記載される通り脂質吸引物から得た。
次に、細胞表現型に及ぼすFas−L処置の影響を検査した。この目的のために、継代0代目および1代目のFas−L処置(50ng/ml)SVF細胞の表面マーカプロファイルを、7色のフローサイトメトリーパネルを利用して非処置対照のものと比較した。実験は、2名の独立した患者からの細胞を用いて2回繰り返され、同じ傾向を与えた。
個別の表面マーカ発現を特徴とする異なるASC亜集団が、異なる分化能を実証することが知られている。非処置対Fas−L処置で、脂肪および骨への継代0代目ASCの分化を比較した。ヒトSVF細胞を、通常の培養条件下でまたは50ng/mlFas−Lと共に14日間培養した。処置および非処置細胞をその後、P1に継代し、P1で指定された分化培地を用いて脂肪または骨の分化を受けるように誘導した。骨および脂肪への分化を、それぞれアリザリンレッドおよびオイルレッドO染色により検出した。脂肪(図3A〜C)および骨(図3D〜F)に分化された細胞をその後、撮影し、染色物を抽出および定量した。実験は、3名の独立した患者からの細胞を用いて3回繰り返し、同じ傾向を与えた。
次に、コロニー形成単位線維芽細胞(CFU−F)を形成するFas−L処置および非処置SVF細胞の能力を評価した。ヒトSVF細胞を、21日間、通常の培養条件下でまたは50ng/mlのFas−Lと共に低密度で培養した。その後、コロニーをギムザ染色し、カウントした。コロニーを撮影し、コロニーおよび大きなコロニー(>100細胞)の総数を、Fas−L処置細胞と非処置細胞で比較した。実験は、2名の独立した患者からの細胞を用いて2回繰り返され、同じ傾向を与えた。
ここまでの実験は全て、脂肪からのそれらの単離直後に、初期SVF細胞に及ぼすFas−L処置の影響を評価した。Fas−Lが「成熟した」ASCに添加された場合に類似の結果を誘導し得るか否かを検査するために、継代3代目(P3)細胞を通常の培養条件下でまたは増加濃度のFas−Lの存在下で6日間培養した。細胞数(図5A)およびsub−G1の割合(図5B〜5D)を、それぞれ、標準的細胞カウントにより、およびヨウ化プロピジウム(PI)細胞周期フローサイトメトリー解析により検査した。実験を、3名の独立した患者からの細胞を用いて3回繰り返した。データを、平均±標準偏差として表す。加えて、CD29、CD105およびCD73の表面マーカ発現を、通常の培養条件下でまたは50ng/mlのFas−Lと共に培養されたP3 ASCでのフローサイトメトリーにより検査した。
ASCのアポトーシスおよび増殖に及ぼすFas−Lの二重の影響は、古典的Fas−Lシグナル伝達のみにより、または2つの個別の経路を通して媒介され得る。これらの可能性を識別するために、ASCを、4日間、未処置で放置するか、Fas−Lのみで処置するか、またはFas−Lおよび汎カスパーゼ阻害剤Z−VAD−fmkで同時に処置した。重要なことに、Fas−Lのアポトーシスのきっかけをよりよく評価するために、継代3代目ASCにおいてアポトーシスを高率で誘導する異なるFas−L誘導体(メガFas−L)を、この実験で使用した。sub−G1の割合および細胞数を、それぞれPI細胞周期フローサイトメトリー解析および標準的細胞カウントにより決定した。実験を、3名の独立した患者からの細胞を用いて3回繰り返した。
Fas−Lに誘導されるASC増殖を制御する細胞内経路を同定するために、過去にFas−Lにより活性化されることが示された様々なシグナル伝達経路[16〜20]を、独立して阻害した。これらは、PI3K/Akt、ERK−1/2およびJNKシグナル伝達経路を含んだ。
材料
組換えヒトスーパーFas−Lを、Enzo Life Sciences(ドイツ レラハ所在)から得て、組換えヒトメガFas−Lを、AdipoGen(米国カリフォルニア州サンディエゴ所在)から得た。zVAD.fmk(汎カスパーゼ阻害剤)、LY294002(PI3K阻害剤)およびSP600125(JNK阻害剤)を、Merck Biosciences(ドイツ ダルムシュタット所在)から得て、AZD6244(ERK−1/2阻害剤)は、Cayman Chemical(米国ミシガン州所在)から得た。
皮下脂肪組織試料を、形成外科手術を受けた患者から得た。全ての処置を、ヘルシンキ宣言を遵守して実施し、Tel Aviv Sourasky Medical Centerの倫理委員会により認可した。記入されたインフォームドコンセントを、前もって全ての患者から得た。試料は全て、種々の副産物として収集された廃棄材料であった。患者の平均年齢は、46.1±11.7歳であり、平均BMIは、29.3±4.8kg/m2であった。
脂肪組織からのヒト初代SVF細胞を、10%仔牛血清(FCS)(Thermo Scientific HyClone、ニュージーランド タウランガ所在)、60μg/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、50μg/mlカナマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L−グルタミンおよび非必須アミノ酸を補充された高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco、英国スコットランド ペイズリー所在)中、未分化状態で10%CO2および大気中酸素条件下で保持した。培地を、週に2回換えて、細胞を、それらがコンフルエントに達したら継代した。
SVFを、6ウェルプレートに播種し(150,000細胞/ウェル)、通常の生育培地中または異なるFas−L濃度を補充された生育培地中で14日間培養した。培地を、この14日培養の間に4回更新した。
表面マーカ分析
表面マーカ分析のために、細胞を収集し、抗CD31、抗CD34、抗CD29、抗CD105、抗ヒト73および抗CD45抗体を含有する7色パネルと共にインキュベートした(暗所で1時間)。死細胞を除外するために、試料を、製造業者のプロトコルに従いViViD(violet viability dye、Molecular Probes、Invitrogen、米国オレゴン州ユージーン所在)で染色した。CD95染色を、抗CD95抗体およびViViDを含有する2色パネルを用いて実施した。全ての抗体を、製造業者により推奨された希釈率で使用した。適当な単一染色対照およびアイソタイプ対照を調製し分析した。
細胞を収集し、70%エタノール/PBSで固定し、RNaseA 0.4mg/ml(Sigma)で処置し、ヨウ化プロピジウム(PI)0.1mg/ml(Sigma)で染色した。
細胞を、専用のキット(Biolegend)を用いてアネキシン−APC/PIで染色した。
脂肪細胞分化
コンフルエント細胞を、10μg/mlインスリン、1×10−6Mデキサメタゾン、0.5mM 3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)および50μMインドメタシン(全てSigmaから)を含有する脂肪生成培地中で培養した。誘導培地を、3〜4日ごとに入れ替えた。21日後に、細胞を4%ホルマリンで固定し(室温(RT)で20分)、0.5%オイルレッド(Sigma)で染色した(RTで10分)。染色後に、細胞を、DP73カメラを備えたOlympus IX71顕微鏡(Olympus、日本 東京所在)で撮影した。オイルレッドOをその後、イソプロパノール中の4% IGEPAL(Sigma)で抽出し、その後、TECAN Infinite M200プレートリーダー(TECAN、スイス メンネドルフ所在)を用いて520nmで定量した。
コンフルエント細胞を、StemPro骨生成分化培地(Gibco)中で培養した。誘導培地を、3〜4日ごとに入れ替えた。21日後に、細胞を4%ホルマリンで固定し(RTで20分)、pH4.2の2%アリザリンレッド(Sigma)で染色した(RTで10分)。写真を、DP73カメラを備えたOlympus IX71顕微鏡で撮影した。アリザリンレッドを、抽出溶液(0.5N HCl/5%SDS)で抽出し、TECAN Infinite M200プレートリーダー(TECAN、スイス メンネドルフ所在)を用いて415nmで定量した。
SVF細胞(2,000個)を、6cm皿に播種して、通常の培養条件下でまたは50ng/mlのFas−Lを補充された培地中で21日間培養した。コロニーをその後、メタノールで固定し、ギムザ染色し(Sigma)、カウントしてCFU−F形成を評価した。コロニーおよび大きなコロニー(>100細胞)の総数を定量し(Olympus IX71顕微鏡を用いて)、Fas−L処置細胞と非処置細胞で比較した。これらの実験を、三重測定で実施した。
統計解析を、Minitab 18ソフトウエア(Minitab Inc.、ペンシルバニア州所在)を用いて実施した。データを、一元配置分散分析(ANOVA)に、および次にダネット(対照群との比較の場合)またはテューキー多重比較検定に供した。一変量データを、対応のあるt検定を用いて解析した。p≦0.05を、統計学的に有意と見なした。
Claims (40)
- 間葉系幹細胞(MSC)を繁殖させるための方法であって、
(a)身体の組織または臓器から細胞を単離すること;および
(b)(i)少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドと、
(ii)少なくとも1種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で(a)で得られた前記単離細胞をインキュベートし、それによりMSCが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法。 - 脂肪由来幹細胞(ASC)を繁殖させるための方法であって、
(a)脂肪吸引物から間質血管細胞群(SVF)の細胞を単離すること;および
(b)(i)少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドと、
(ii)少なくとも1種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で(a)で得られた前記単離細胞をインキュベートし、それによりASCが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法。 - ステップ(b)の前に前記SVFが、少なくとも2継代の間培養において保持される、請求項2に記載の方法。
- 前記TNFスーパーファミリーリガンドが、Fas−リガンド(FasL)、腫瘍壊死因子(TNF)α、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、腫瘍壊死因子様アポトーシス弱誘発因子(TWEAK)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TNFスーパーファミリーリガンドが、FasLである、請求項4に記載の方法。
- 前記生育培地が、成長因子、ホルモン、サイトカインおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される追加の活性剤をさらに含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、少なくとも1時間である、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、約1時間、2時間、3時間もしくはより長い時間、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、17、20、もしくは23日間である、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、2時間である、請求項8に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、4日間である、請求項8に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、14日間である、請求項8に記載の方法。
- 前記培地が、3日ごとにまたは4日ごとに更新される、請求項11に記載の方法。
- 前記アポトーシス阻害剤が、前記少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドの前に、前記リガンドと一緒に、または前記リガンドの後に投与される、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アポトーシス阻害剤が、カスパーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ(例えば、HTRA2)阻害剤、アポトーシス阻害タンパク質(IAP)(例えば、XAF1)、NF−カッパB阻害剤、Smac阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カスパーゼ阻害剤が、Z−VAD−fmkである、請求項14に記載の方法。
- 前記アポトーシス阻害剤の量が、約1μM〜約50μMの範囲、または約5μM〜約25μMの範囲である、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドの濃度が、約0.1ng/ml〜約100ng/mlの範囲である、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドおよび前記アポトーシス阻害剤とのインキュベーションに続いて、前記少なくとも1種のTNFスーパーファミリーリガンドおよび前記アポトーシス阻害剤が、除去され、かつ前記細胞が、分化させられる、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、または骨細胞に分化させられる、請求項18に記載の方法。
- それを必要とする患者に前記分化または未分化細胞を移植することをさらに含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、脂肪組織、骨組織、筋肉、結合組織または軟骨に分化する、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞が、脂肪組織に分化しかつ前記患者が、乳房復元を必要としている、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞が、骨組織に分化しかつ前記患者が、整形外科的傷害、骨再建または骨修復の処置を必要としている、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞が、軟骨組織に分化しかつ前記患者が、軟骨細胞の植え込み、半月板、回旋筋腱板または関節軟骨修復の処置を必要としている、請求項21に記載の方法。
- 前記患者が、美容的処置を必要としている、請求項20に記載の方法。
- 前記分化細胞を前記移植することが、皮膚科の病気を処置するためである、請求項20に記載の方法。
- 前記分化細胞を前記移植することが、患者における免疫関連疾患を緩和するまたは処置するためである、請求項20に記載の方法。
- 前記患者が、臓器または組織の移植を受ける、請求項20に記載の方法。
- 記臓器の移植が、骨髄、肝臓、腎臓、血管または心臓移植からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記分化細胞を前記移植することが、患者における心臓障害を処置するためである、請求項20に記載の方法。
- 前記心臓障害が、卒中、狭心症および心不全からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記分化細胞を前記移植することが、クローン病患者における痔瘻または肛門周囲瘻孔を処置するためである、請求項20に記載の方法。
- 前記分化細胞を前記移植することが、血管修復のためである、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞が、同種または自家である、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞生育培地、TNFスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む脂肪幹細胞(ASC)または間葉系幹細胞(MSC)生育培地。
- 血清または血清代替品をさらに含む請求項35に記載のASCまたはMSC生育培地。
- a.脂肪幹細胞または間葉系幹細胞生育培地を含有する容器であって、前記生育培地が、細胞生育培地、TNFスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む、容器と;
b.インビトロで脂肪幹細胞または間葉系幹細胞を増大させるために生育培地を使用するための説明書、
を含む製品。 - 前記生育培地が、血清または血清代替品をさらに含む、請求項37に記載の製品。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法により得られる細胞の富化された集団。
- それを必要とする患者への移植処置における使用のための請求項39に記載の細胞の富化された集団。
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