ES2583371T3 - Composiciones, métodos, y dispositivos para tratar enfermedades hepáticas - Google Patents

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Abstract

Un dispositivo extracorpóreo de soporte hepático que comprende una población purificada de células estromáticas multipotentes (MSC) indiferenciadas.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones, metodos, y dispositivos para tratar enfermedades hepaticas Investigacion o desarrollo con subvencion federal
Esta invencion se hizo con el apoyo gubernamental en virtud de los numeros de concesion R01 DK43371, K18 DK076819, y K08 DK66040 otorgados por el National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos en la invencion.
Campo tecnico
Esta invencion se refiere a composiciones y metodos para tratar enfermedades y trastornos relacionados con la degeneracion del hngado.
Antecedentes
La insuficiencia hepatica es la incapacidad del hngado de realizar su funcion sintetica y metabolica normal como parte de la fisiologfa normal. La insuficiencia hepatica aguda puede aparecer en tan poco como 48 horas, y tipicamente coincide con la perdida o disfuncion del 80-90% de las celulas hepaticas. La insuficiencia hepatica es una afeccion potencialmente mortal que demanda cuidados medicos urgentes.
La insuficiencia hepatica aguda tiene una prevalencia estimada de 2000 casos al ano y una tasa de mortalidad de aproximadamente el 80%.
En muchos casos, el trasplante ortotopico de hngado es el unico tratamiento eficaz para la insuficiencia hepatica aguda. El uso de dichos trasplantes, sin embargo, esta limitado debido a la escasez de donantes, los altos costes, y la necesidad de inmunosupresion de por vida. Por tanto, existe una clara necesidad de tratamientos alternativos para el tratamiento de insuficiencia hepatica.
Sumario
La presente invencion se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que la terapia basada en celulas estromaticas multipotentes (MSC) proporciona soporte trofico al hngado lesionado. Por tanto, puede usarse la administracion de medio condicionado de mSc (MSC-CM), o el uso de un dispositivo de hngado bioartificial (BAL) con MSC, para tratar a sujetos con enfermedad hepatica.
La presente invencion proporciona un dispositivo extracorporeo de soporte hepatico que comprende una poblacion purificada de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas.
Se describen adicionalmente en este documento metodos de preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedad hepatica. En algunos ejemplos, los metodos incluyen proporcionar una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas, cultivar las MSC indiferenciadas en un medio, por ejemplo, a aproximadamente un 80% de confluencia, por ejemplo, usando aproximadamente 1 x 102 celulas/cm2 hasta 1 x 104 celulas/cm2, por ejemplo, durante un tiempo suficientes para que se produzca una cantidad deseada de factores activos, por ejemplo, 6, 12, 18, 24, 36, o 48 horas, por ejemplo, 12-48 horas, 12-36 horas, 24-36 horas, por ejemplo, 24 horas, obtener el medio (medio condicionado de MSC (MSC-CM)), fraccionar el medio usando metodos conocidos de fraccionamiento, por ejemplo, mediante uno o mas de (1) carga, (2) tamano, y/o (3) union a sulfato de heparina, seleccionar una fraccion del medio que sea capaz de promover la proliferacion de hepatocitos y/o inhibir la muerte de hepatocitos y, opcionalmente, formular la fraccion seleccionada para su administracion a un mairnfero, por ejemplo, para administracion sistemica, por ejemplo, por administracion intravenosa. Preferiblemente, las MSC se mantienen en cultivo en un estado indiferenciado. En general, el MSC-CM y las fracciones activas del mismo estaran libres de celulas. En algunos ejemplos, la composicion esta concentrada 25 veces. En algunos ejemplos, la composicion incluye un medio de cultivo tisular sin suero o PBS. Los metodos pueden incluir liofilizar la composicion.
Tambien se describen en este documento composiciones farmaceuticas que incluyen MSC-CM o una fraccion activa del mismo, por ejemplo, producida por un metodo descrito en este documento. La presente invencion destaca dispositivos extracorporeos de soporte hepatico que comprenden una poblacion purificada de MSC indiferenciadas. En algunas realizaciones, los dispositivos tambien incluyen una poblacion de hepatocitos primarios. Por tanto, la invencion proporciona sistemas para tratar la sangre o el plasma de un mamffero. Los sistemas incluyen un biorreactor extracorporeo (EB) que incluye un compartimiento de tratamiento de fluido y un compartimento de celulas, y una barrera selectivamente permeable que separa el compartimento de tratamiento de fluido y el compartimento de celulas, donde el compartimento de celulas comprende una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas. Ademas de las MSC, el compartimento de celulas tambien puede incluir una poblacion de hepatocitos primarios. La barrera selectivamente permeable puede ser, por ejemplo, un haz de fibras
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huecas, o una membrana plana; se conocen barreras adecuadas en la tecnica.
En general, el EB tambien incluye una entrada de fluido biologico y una salida de fluido biologico, donde la entrada y la salida de fluido biologico permiten la comunicacion fluida entre el compartimento de tratamiento de fluido y el torrente sangumeo de un mairnfero.
Los sistemas preferiblemente tambien incluiran una o una pluralidad de bombas para hacer circular la sangre o el plasma, por ejemplo, desde el sujeto a traves del compartimento de tratamiento de fluido del EB y de devuelta al sujeto.
Los sistemas tambien pueden incluir un cartucho de ultrafiltracion en comunicacion fluida con el sujeto y/o el compartimento de tratamiento de fluido, de modo que la sangre procedente del sujeto se separe en ultrafiltrado/plasma y componentes celulares, y el UF/plasma se hace circular a traves del compartimento de tratamiento de fluido del eB mientras los componentes celulares de la sangre se devuelven al sujeto.
Los sistemas descritos en este documento pueden usarse en metodos de tratamiento de enfermedad hepatica en un sujeto. Los metodos incluyen identificar un sujeto que tenga una enfermedad hepatica; proporcionar un sistema para tratar la sangre o el plasma de un marnffero, que incluye un biorreactor extracorporeo (EB) que incluye un compartimento de tratamiento de fluido y un compartimento de celulas, y una barrera selectivamente permeable que separa el compartimento de tratamiento de fluido y el compartimento de celulas, donde el compartimento de celulas incluye una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas (y opcionalmente una poblacion de hepatocitos primarios); y exponer el plasma o sangre del sujeto a las MSC en el eB.
Los sistemas tambien pueden usarse en metodos para tratar la sangre o el plasma de un sujeto que tiene una enfermedad hepatica. Los metodos incluyen identificar un sujeto que tenga una enfermedad hepatica; proporcionar un sistema como se describe en este documento; retirar la sangre o el plasma del sujeto; introducir la sangre o el plasma en el compartimento de tratamiento de fluido del EB; y permitir que la sangre o el plasma fluya a traves de y salga del compartimento de tratamiento de fluido, tratando de ese modo la sangre o el plasma.
Se describen en este documento metodos de tratamiento de enfermedad hepatica en un sujeto. En algunos ejemplos, estos metodos incluyen identificar un sujeto que necesita tratamiento, y administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que incluye MSC-CM o una fraccion activa del mismo, por ejemplo, producida por un metodo descrito en este documento. El sujeto puede identificarse, por ejemplo, evaluando el nivel de un marcador serico de funcion hepatica. Los metodos pueden incluir la seleccion de un sujeto sobre la base de que tienen una enfermedad hepatica, por ejemplo, determinada por evaluacion del nivel de un marcador serico de funcion hepatica.
Se conocen varios marcadores sericos de funcion hepatica en la tecnica, incluyendo, aunque sin limitacion, lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), bilirrubina serica, albumina y/o globulinas.
En ciertos ejemplos, el tratamiento continua hasta que el nivel del sujeto de un marcador serico de funcion hepatica esta dentro del intervalo normal determinado por el medico del sujeto, por ejemplo, durante un tiempo suficiente para mejorar un smtoma o corregir un parametro clmico de la enfermedad hepatica, por ejemplo, un tiempo seleccionado por un medico o profesional de asistencia sanitaria. En algunos ejemplos, la enfermedad hepatica a tratarse es insuficiencia hepatica aguda. En algunos ejemplos, la insuficiencia hepatica aguda es insuficiencia hepatica fulminante. En algunos ejemplos, la enfermedad hepatica a tratarse es fibrosis hepatica. En algunos ejemplos, la composicion se administra usando una tecnica de bolo intravenoso.
Se describen adicionalmente en este documento metodos adicionales para tratar la enfermedad hepatica en un sujeto. Estos metodos incluyen identificar un sujeto que necesita tratamiento, proporcionar un sistema que incluye un biorreactor extracorporeo (EB) que incluye una poblacion purificada de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas, y exponer el plasma o la sangre del sujeto a las MSC en el EB. En algunos ejemplos, el tratamiento puede continuar durante un tiempo suficiente para mejorar un smtoma o corregir un parametro clmico de la enfermedad hepatica, por ejemplo, un tiempo seleccionado por un medico o profesional de asistencia sanitaria. En algunos ejemplos, el sujeto se identifica evaluando el nivel de un marcador serico de funcion hepatica, por ejemplo, lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), bilirrubina serica, albumina, y/o globulinas. En algunos ejemplos, el dispositivo de soporte hepatico tambien incluye una poblacion purificada de hepatocitos primarios.
Tambien se describen en este documento metodos para identificar un componente biologicamente activo para el tratamiento de una enfermedad hepatica, mediante (i) obtencion de una muestra de un medio que contiene factores secretado de una poblacion purificada de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas, (ii) obtencion de una fraccion del medio usando metodos de fraccionamiento conocidos en la tecnica, (iii) ensayo de la capacidad de la fraccion de promover la proliferacion de hepatocitos o inhibir la muerte de hepatocitos, por ejemplo, in vitro o in vivo, (iv) seleccion de una fraccion del medio que es capaz de promover la proliferacion de hepatocitos o inhibir la
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muerte de hepatocitos, (v) opcionalmente repeticion de las etapas (i) a (iv), y (vi) identificacion de una o mas moleculas presentes en la fraccion seleccionada. En algunos ejemplos, se obtienen distintas fracciones de acuerdo con uno o ambos de tamano o carga. En algunos ejemplos, la muestra del medio es una fraccion del medio que se une a sulfato de heparina.
La expresion "insuficiencia hepatica aguda" incluye, aunque sin limitacion, las afecciones mencionadas por las expresiones insuficiencia hepatica hiperaguda, insuficiencia hepatica aguda, insuficiencia hepatica subaguda e insuficiencia hepatica fulminante (FHF).
"Tratar" significa reducir uno o mas smtomas de enfermedad hepatica, por ejemplo, para promover una mejora en la funcion hepatica evaluada usando uno o mas marcadores sericos de funcion hepatica (por ejemplo, lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), bilirrubina serica, albumina y globulinas) y, por tanto, para mejorar al menos un smtoma, por ejemplo, un smtoma asociado con perdida de celulas del parenquima en un organo, por ejemplo, el hngado.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para producir un resultado beneficioso o deseado. Por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz es una que consigue un efecto terapeutico deseado, por ejemplo, para mejorar un smtoma o corregir un parametro clmico de una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad hepatica. Esta cantidad puede ser iguala a o diferente de una cantidad profilacticamente eficaz, que es una cantidad necesaria para prevenir la aparicion de una enfermedad o smtomas de enfermedad.
Una "fraccion activa" es una fraccion que puede promover la proliferacion de hepatocitos o inhibir la muerte de hepatocitos, por ejemplo, en un cultivo de hepatocitos primarios.
Como se usa en este documento, los terminos "paciente", "sujeto" e "individuo" se usan de forma intercambiable para hacer referencia a un marnffero incluyendo, sin limitacion, seres humanos, animales de granja, animales de competicion, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratas y ratones. En algunos ejemplos, el sujeto es un mamffero no humano, por ejemplo, un animal experimental o sujeto de veterinaria.
Salvo que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invencion. Se describen metodos y materiales en este documento para su uso en la presente invencion; tambien pueden usarse otros metodos y materiales adecuados conocidos en la tecnica. Los materiales, metodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes. En caso de conflicto, dominara la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y las figuras, y a partir de las reivindicaciones.
Descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es un grafico de barras que muestra la incorporacion de Bromodesoxiuridina (5-bromo-2-desoxiuridina, BrdU) en SC activadas como una funcion de la relacion MSC:SC. Se inhibe la proliferacion de SC activadas por cocultivo indirecto con MSC. Los datos representan la media de dos experimentos realizados por triplicado. Las barras de error son la desviacion tfpica. *p<0,05 en comparacion con SC en solitario (MSC:SC = 0).
La FIG. 2 es una imagen de un gel de agarosa de RT-PCR representativo que muestra los niveles de expresion de ARNm de IL-10. GAPDH sirvio como control interno para el analisis de RT-PCr.
La FIG. 3 es un grafico de barras que muestra los resultados medios de ELISA de dos experimentos de independientes, cada uno de los cuales se realizo por triplicado. Las barras de error son la desviacion tfpica. **p<0,01 en comparacion con MSC no estimuladas.
La FIG. 4 es un grafico de barras que muestra la secrecion de citoquinas en monocultivos y cocultivo directo de SC y MSC (relacion 1:1). Se midieron las concentraciones de IL-6 y TNF-a por ELISA con anticuerpos espedficos de especie despues de 2 dfas de cultivo. Los resultados son la media de dos experimentos realizados por triplicado. Las barras de error son la desviacion tfpica.
La FIG. 5 es un grafico de barras que muestra la medicion por ELISA de la secrecion de IL-10 despues de 2 dfas de monocultivo o cocultivo directo 1:1 de MSC y SC.
La FIG. 6 es un grafico de barras que muestra la secrecion de IL-10 como una funcion de la cantidad de MSC despues de 4 dfas de cocultivo directo 1:1 con SC activadas, determinada por RT-PCR. Los resultados son la media de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras de error son la desviacion tfpica. **p<0,01 en comparacion con SC en solitario (MSC:SC = 0).
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La FIG. 7 es un grafico de barras que muestra la inhibicion de la secrecion de IL-10 por MSC en cocultivo directo (1:1) con SC activadas despues de tratamiento con anticuerpo neutralizante anti-IL-6. Los resultados son la media de dos experimentos realizados por triplicado. Las barras de erro son la desviacion tipica. **p<0,01 en comparacion con la ausencia de anticuerpo.
La FIG. 8 es un grafico de barras que muestra la secrecion de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) despues de 2 dfas de monocultivo o cocultivo directo 1:1 de SC y MSC. Los resultados son la media de dos experimentos realizados por triplicado.
La FIG. 9 es un modelo esquematico de los efectos paracrinos de factores derivados de MSC sobre SC activadas. Los factores autocrinos sintetizados por SC no estan representados en este modelo. La liberacion de IL-6 por SC activadas conduce a la secrecion de IL-10 por MSC. La IL-10 inducida, junto con la TNF-a secretada de forma constitutiva, inhiben la proliferacion de SC y la smtesis de colageno. El efecto marginal de IL-10 sobre la proliferacion de SC se indica por el tamano de fuente mas pequeno. Las SC experimentan apoptosis despues de cocultivo con MSC debido a los niveles aumentados de HGF.
La FIG. 10 es un analisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratas Gal-N despues de tratamiento con MSC-CM. * p = 0,017 (rango Log). MSC-CM, medio condicionado de celulas madre mesenquimaticas; FHF, insuficiencia hepatica fulminante; Gal-N, D-galactosamina.
Las FIG. 11A-11F son graficos de barras que muestran los niveles sistemicos de (11A) IL-1p; (11B) TNF-a; (11C) IL- 6; (11D) IL-2; (11E) IL-1ra; y (11F) IL-10 despues de exposicion a Gal-N. Los daros mostrados son la media ± desviacion tfpica de experimentos realizados por triplicado. * p<0,05, ** p<0,001.
FIG. 12A es un grafico de barras que muestra valores determinados por examen histologico semi-cuantitativo como se describe en el Ejemplo 6. Los datos mostrados son la media ± error tfpico de la media de 10 campos aleatorios de alta energfa por animal. Barra solida = 100 pm. * p = 0,024, ** p = 0,004.
La FIG. 12B es un grafico de barras que muestra la cuantificacion de celulas inmunitarias infiltrantes por analisis de imagenes digitales. Los datos mostrados son la media ± error tfpico de la media de 10 campos aleatorios de alta energfa por animal. Barra solida = 100 pm. * p = 0,024, ** p = 0,004.
La FIG. 13 es un grafico de barras que muestra los resultados de la cuantificacion de nucleos TUNEL-positivos usando analisis de imagenes digitales. Los datos se presentan como la media ± error tfpico de la media para 10 campos aleatorios por animal. * p = 0,009.
La FIG. 14 es un grafico de barras que muestra la apoptosis de hepatocitos aislados primarios de rata usando cultivo in vitro. Los datos se muestran como la media ± desviacion tfpica. * p = 0,005.
La FIG. 15 es un grafico de barras que muestra los nucleos PCNA-reactivos cuantificados por analisis de imagenes digitales. Los datos se presentan como la media ± error tfpico de la media para 10 campos aleatorios por animal. * p = 0,04.
La FIG. 16 es un grafico de barras que muestra los resultados de la cuantificacion de los cambios en la expresion genica por PCR a tiempo real (RT-PCR) despues de tratamiento con MSC-CM. Las abreviaturas son: oncostatina M (OSM); receptor a-1p adrenergico (AR); factor-a de crecimiento transformante (TGF-a); factor de crecimiento de hepatocitos (HGF); factor de necrosis tumoral-a (TNF-a); factor de crecimiento epidermico (EGF); interleuquina 6 (IL- 6); factor de celulas madre (SCF); factor de crecimiento de tipo factor de crecimiento epidermico de union a heparina (Hb-EGF); y metaloproteinasa tisular 3 (TIMP3).
La FIG. 17A es un grafico de barras que muestra la cuantificacion de hepatocitos BrdU-positivos por analisis de imagenes. Los datos se muestran como la media ± desviacion tfpica de dos experimentos diferentes por duplicado. * p<0,05, ** p<0,01; ns = no significativo.
La FIG. 17B es un grafico de barras que muestra la secrecion de albumina. Los datos se muestran como la media ± desviacion tfpica de dos experimentos diferentes por duplicado. * p<0,05, ** p<0,01; ns = no significativo.
La FIG. 17C es un grafico de barras que muestra la smtesis de urea. Los datos se muestran como la media ± desviacion tfpica de dos experimentos diferentes por duplicado. * p<0,05, ** p<0,01; ns = no significativo.
La FIG. 18 es un grafico lineal que muestra los resultados del analisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratas a las que se ha administrado Gal-N tratadas con trasplantes o lisados celulares. Los puntos temporales de las intervenciones se indican por encima de los diagramas de supervivencia. Los resultados son datos cumulativos de dos experimentos independientes (N = 8 por cada grupo) usando diferentes lotes de MSC. Valor P determinado por ensayos de rango Log.
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La FIG. 19A es un grafico lineal que muestra el analisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratas a las que se ha administrado Gal-N tratadas con MSC-CM concentrado.
La FIG. 19B es un grafico de barras que muestra la respuesta a dosis de la supervivencia de los animales 72 horas despues de la induccion de la insuficiencia hepatica como una funcion de la masa de MSC de la que se obtuvo MSC-CM. Los controles recibieron vehmulo o medio condicionado de fibroblastos (fibroblasto-CM). Los puntos temporales de las intervenciones se indican por encima de los diagramas de supervivencia. Los resultados para ambos paneles son datos cumulativos de dos experimentos independientes usando diferentes lotes de MSC-CM (N = 8 por cada grupo). Valor P determinado por ensayo de rango Log.
La FIG. 20 es una representacion esquematica de un circuito extracorporeo ejemplar. En resumen, los circuitos se cebaron con plasma de rata Sprague-Dawley heparinizado, esteril, que se filtro inmediatamente antes de su uso. Se administro a la rata 100 U de heparina (0,1 ml) de forma sistemica a traves de la lmea venosa 5 minutos antes del inicio de la perfusion. Las lmeas arterial y venosa se conectaron posteriormente al circuito extracorporeo. La sangre arterial se bombeo a 0,55-0,85 ml/minuto a traves del tubo de silicona n.° 13 MASTERFLEX (Cole-Palmer Instrument Co.) mediante un accionamiento de bomba peristaltica digital de velocidad variable (Cole-Palmer Instrument Co.). Se coloco un separador de plasma (MICROKROS, material de membrana: esteres mixtos de celulosa, tamano de poro de membrana: 0,2 um, area superficial de membrana: 16 cm2; Spectrum Laboratories Inc. Laguna Hills, CA) despues de la bomba. El plasma separado se bombeo a traves del BAL mediante una segunda y tercera bomba peristaltica a un caudal de 0,1 ml/minuto. El plasma separado y los componentes sangumeos restantes se reunieron antes de entrar en un colector de burbujas. La sangre reconstituida volvio al animal a traves de la canula venosa. Durante la perfusion, se administro heparina (41,5 U/ml) con solucion de dextrosa al 5% de forma continua a traves de la lmea venosa a una tasa de 0,2 ml/hora mediante una bomba de infusion de jeringa. En esta configuracion, el volumen muerto del sistema completo de perfusion fue de 12 ml, de los cuales, 6 ml estaban justificados por el BAL. Se establecio flujo de gas oxigenante (21% de O2, 5% de CO2, 74% de N2) a traves de la camara por encima de la camara interna del BAL.
Las FIG. 21A-21B son graficos de barras que muestran los datos recogidos de estudios de biorreactor extracorporeo (EB). Los animales se trataron con un MSC-EB, usando un biorreactor basado en fibroblastos 3T3 (fibroblasto-EB) y un biorreactor acelular (acelular-EB) como controles. Biomarcadores sericos de lesion hepatica, aspartato aminotransferasa (AST, 21A) y alanina aminotransferasa (ALT, 21B) previo ay 24 horas despues de tratamiento con un MSC-EB (n = 5) o un acelular-EB (n = 3). Debido a la mortalidad, n = 1 en el grupo acelular despues de tratamiento. Valor P determinado por analisis de ensayo t de student.
La FIG. 21C es un grafico lineal que muestra los resultados de analisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratas a las que se ha administrado Gal-N tratadas con EB. Los puntos temporales de las intervenciones se indican por encima de los diagramas de supervivencia. Cada resultado mostrado fue de un experimento independiente usando diferentes lotes de MSC. Valor P determinado por ensayo de rango Log.
La FIG. 22A es una ilustracion esquematica del diseno experimental de un estudio de transferencia adoptiva. Ratas lesionadas con Gal-N se trataron con vehmulo o MSC-CM seguido de infusion de leucocitos marcados con In111.
La FIG. 22B es un grafico de barras que ilustra el recuento y diferenciales de leucocitos. Se recogio sangre completa despues de canulacion y se analizo para celulas sangumeas perifericas usando un citometro de flujo disponible en el mercado (globulos blancos (WBC); neutrofilos (NE); linfocitos (LY); monocitos (MO); basofilos (BA); eosinofilos (EO)).
La FIG. 22C es un grafico de barras que muestra la distribucion in vivo de leucocitos radiomarcados despues de tratamiento subletal con Gal-N.
La FIG. 23A-C muestra que MSC-CM esta compuesto por altos niveles de quimioquinas que se correlacionan con beneficio de supervivencia observada en FHF. Se analizo MSC-CM sin suero usando una serie de anticuerpos para 174 protemas especificadas. La FIG. 23A es un grafico de barras que muestra los resultados o analisis de densitometna de resultados de serie de anticuerpos aplicados puntualmente. Los datos se presentan como intensidad de mancha respecto al control negativo y normalizados al control positivo. La FIG. 23B es un diagrama de sectores que muestra el analisis de grupos de protemas secretadas por MSC basandose en la funcion presentada. El MSC-CM se fracciono sobre una columna de heparina-agarosa en fracciones unidas y no unidas a heparina. La FIG. 23C es un grafico lineal que muestra los resultados del analisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratas a las que se ha administrado Gal-N tratadas con el MSC-CM (+) heparina y MSC-CM (-) heparina. Los puntos temporales de las intervenciones se indican por encima de los diagramas de supervivencia. Los resultados para (C) son datos cumulativos de dos experimentos independientes usando diferentes lotes de MSC-CM (N = 8 por cada grupo). Valor P determinado por ensayo de rango Log.
La FIG. 24 es un grafico de barras de la smtesis de urea en hepatocitos cultivados en fibroblastos NIH-3T3-J2 de crecimiento detenido durante 14 dfas, suplementado con 5 ng/ml de SDF-1a o AMD3100, un antagonista de CXCR4. Los datos representan la media ± error tfpico de la media (s.e.m.) de dos experimentos independientes realizados
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Las FIG. 25 y 26 son ilustraciones esquematicas de ejemplos de sistemas de hngado bioartificial.
La FIG. 27 es una ilustracion esquematica de un biorreactor de fibra hueca.
La FIG. 28 es una ilustracion esquematica de una seccion transversa en la lmea A-A a traves del biorreactor de fibra hueca mostrado en la FIG. 27.
La FIG. 29 es una ilustracion esquematica de un biorreactor de placa plana o dos compartimentos.
Descripcion detallada
La presente invencion se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que las celulas estromaticas multipotentes (MSC), y agentes secretados desde las mismas, proporcionan soporte trofico al hngado lesionado. Si el deseo de limitarse a teona alguna, se cree que este efecto terapeutico es un resultado de la inhibicion de la muerte hepatocelular y la estimulacion de la regeneracion hepatocelular. Por tanto, pueden usarse metodos de tratamiento que incluyen administracion parenteral de una composicion de medio condicionado de MSC sin celulas, o el uso de dispositivos de hngado artificial que incluyen MSC, para tratar a sujetos con enfermedad hepatica, como se describe en este documento.
Al menos en parte, los datos presentados en este documento demuestran que las MSC, y los agentes secretados desde la mismas, son capaces de modular la funcion de celulas estrelladas activadas mediante mecanismos paracrinos, de tratar una afeccion inflamatoria, y de proporcionar soporte trofico al hngado lesionado inhibiendo la muerte hepatocelular y estimulando de regeneracion de hepatocitos. Por consiguiente, la terapia basada en MSC, como se describe en este documento, es util en el tratamiento de cualquier afeccion aguda y/o cronica, incluyendo afecciones autoinmunitarias e inflamatorias, en que sena beneficiosa la inhibicion de la muerte celular y la estimulacion de la reparacion de tejidos. Dichas afecciones incluyen, aunque sin limitacion, por ejemplo, enfermedad hepatica (por ejemplo, fibrosis, cirrosis, insuficiencia hepatica aguda, insuficiencia hepatica fulminante (FHF), y cualquier otra enfermedad hepatica degenerativa), lesion isquemica (por ejemplo, infarto de miocardio y apoplejfa), insuficiencia renal, pancreatitis aguda, y enfermedad autoinmunitaria. La terapia basada en MSC tambien puede ser beneficiosa en cualquier afeccion o trastorno en que es beneficiosa la accion de moleculas secretadas troficas.
Terapia con MSC
Como se describe en este documento, las MSC y agentes secretados desde las mismas, por ejemplo, en una composicion de medio condicionado de MSC, pueden usarse para tratar enfermedades o trastornos hepaticos que implican la perdida o dano de las celulas del parenquima del hngado en un sujeto. En general, la etiologfa de estas enfermedades o trastornos puede ser una respuesta inflamatoria local o sistemica. Sin embargo, tambien se incluyen otras enfermedades o trastornos hepaticos asociados con la perdida o dano de celulas del parenquima del hngado.
Como se describe en este documento, las MSC y agentes secretados desde las mismas, por ejemplo, en una Composicion de medio condicionado de MSC, son particularmente utiles en el tratamiento de insuficiencia hepatica aguda en un sujeto, por ejemplo, FHF. En algunos ejemplos, se seleccionara un sujeto para tratamiento usando las composiciones y metodos descritos en este documento basandose en un diagnostico positivo de enfermedad hepatica. La enfermedad hepatica puede diagnosticarse usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, usando uno o mas de los ensayos de funcion hepatica descritos en este documento, o basandose en el criterio de un medico.
En algunos ejemplos, el tratamiento se realiza usando la administracion de una composicion de medio condicionado de MSC (MSC-CM), o una fraccion activa del mismo. En algunas realizaciones, el tratamiento se realiza usando un Biorreactor extracorporeo basado en MSC (MSC-EB).
Aislamiento de MSC
Las celulas estromaticas multipotentes (MSC) tambien se mencionan en la tecnica como celulas madre mesenquimaticas derivadas de medula osea, tejido adiposo, cordon umbilical, y placenta, y celulas estromaticas derivadas de medula osea, tejido adiposo, cordon umbilical, y placenta. Las MSC pueden aislarse usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, de celulas mononucleares de medula osea, sangre de cordon umbilical, tejido adiposo, tejido placentario, basandose en su adherencia a plastico de cultivo tisular. Por ejemplo, las MSC pueden aislarse de aspirados de medula osea disponibles en el mercado (vease el Ejemplo 1). La purificacion de las MSC puede conseguirse usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, los metodos descritos en este documento, incluyendo, aunque sin limitacion, FACS.
En algunos ejemplos, una preparacion de MSC incluira una solucion. Esta solucion puede contener aquellos
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componentes necesarios para soportar la supervivencia y crecimiento de MSC. Dichos componentes estan presentes, de forma rutinaria, en medio de cultivo tisular disponible en el mercado, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Dichos componentes incluyen, por ejemplo, aminoacidos, vitaminas, una fuente de carbono (natural y no natural), saltes, azucares, hidrolizados derivados de plantas, piruvato sodico, tensioactivos, amoniaco, lfpidos, hormonas o factores de crecimiento, tampones, aminoacidos no naturales, precursores de azucares, indicadores, nucleosidos y/o nucleotidos, butirato o agentes organicos, DMSO, productos derivados de animales, inductores genicos, azucares no naturales, reguladores del pH intracelular, betama u osmoprotector, elementos traza, minerales, vitaminas no naturales. Componentes adicionales que pueden usarse para suplementar un medio de cultivo tisular disponible en el mercado incluyen, por ejemplo, suero animal (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), suero de fetal de ternero (FCS), suero de caballo (HS)), antibioticos (por ejemplo, incluyendo, aunque sin limitacion, penicilina, estreptomicina, sulfato de neomicina, anfotericina B, blasticidina, cloranfenicol, amoxicilina, bacitracina, bleomicina, cefalosporina, clortetraciclina, zeocina, y puromicina), y glutamina (por ejemplo, L- glutamina). La supervivencia y crecimiento de las MSC tambien depende del mantenimiento de un entorno aerobico, pH, y temperatura apropiados. En algunas realizaciones, la solucion no incluira suero animal, por ejemplo, cuando las MSC se colocan en un dispositivo de tugado bioartificial.
En algunas realizaciones, una preparacion de MSC estara esencialmente libre de celulas o material celular no MSC. En algunas realizaciones, una preparacion de MSC contendra al menos un 80% de MSC identificadas por los criterios descritos en este documento, por ejemplo, al menos un 85%, 90%, 95%, 98%, 99% y mayor de MSC. En algunas realizaciones, las celulas en una preparacion de MSC seran 100% MSC. Una poblacion de celulas que es al menos un 80% de MSC puede denominarse una poblacion "purificada" de MSC. En general, los metodos, composiciones, y dispositivos descritos en este documento usaran poblaciones purificadas de MSC.
Como un ejemplo, las MSC pueden cultivarse usando medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero fetal de ternero al 10%, 100 U/ ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, aminoacidos no esenciales 0,1 mM y 1 ng/ml de factor basico de crecimiento de fibroblastos (Life Technologies, Rockville, MD). Despues de 4 dfas de cultivo, pueden retirarse las celulas hematopoyeticas no adherentes lavando con PBS. Las monocapas de MSC adherentes entonces se cultivan con cambios de medio 2-3 veces por semana. Las MSC pueden pasarse usando tripsina al 0,25%/EDTA al 0,1%. Las MSC pueden subcultivarse de forma rutinaria a una densidad de 5 x 103 celulas/cm2. Las MSC pueden mantenerse usando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).
En algunas realizaciones, las MSC pueden usarse de acuerdo con los metodos descritos en este documento durante los pases 1-7, por ejemplo, durante los pases 4-7, donde el pase uno es el primer pase despues del aislamiento. En general, no debe permitirse que las MSC en cultivo excedan una densidad celular mayor del 80% de confluencia. La confluencia puede estimarse de forma visual, por ejemplo, usando un microscopio optico convencional. Como alternativa, la confluencia celular puede determinarse realizando recuentos celulares usando, por ejemplo, un hemocitometro convencional. En algunas realizaciones, el 80% de confluencia corresponde a aproximadamente 1 x 106 MSC por matraz de calidad de cultivo tisular de 175 cm1 2. En algunas realizaciones, el 80% de confluencia corresponde a aproximadamente 5 x 103 celulas/cm2.
En general, sera deseable mantener las MSC en un estado indiferenciado. El estado de diferenciacion de MSC puede evaluarse usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, los metodos de caracterizacion de MSC descritos en este documento.
Caracterizacion de MSC
Una preparacion de MSC (es decir, una preparacion de MSC indiferenciadas) puede caracterizarse antes de su uso terapeutico para confirmar la identidad, pureza, y estado de diferenciacion de las celulas.
Las MSC presentan una morfologfa fibroblastoide unica y facilmente identificable y expresan una serie unica de antfgenos que reaccionan con anticuerpos monoclonales SH2 (CD105) y SH3 (CD73). Las MSC tambien tienen una capacidad unica de dar lugar, de forma reproducible, a adipocitos, osteoblastos, y condrocitos in vitro (Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).
Como se describe en este documento, una preparacion de MSC (por ejemplo, una preparacion de MSC indiferenciadas) puede caracterizarse realizando uno o mas de los siguientes ensayos, que pueden realizarse in vivo o in vitro (vease el Ejemplo 2):
(1) evaluando la capacidad de una MSC o una preparacion de MSC de diferenciarse en adipocitos, osteoblastos, y condrocitos. Las MSC indiferenciadas pueden dar lugar a todos estos tipos celulares.
(2) detectando la presencia o ausencia de uno o mas de los siguientes marcadores de superficie celular: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106, CD11b, CD14, CD18, CD34, CD36, y CD45 sobre una MSC aislada o en una preparacion de MSC, por ejemplo, usando una serie. Las MSC indiferenciadas expresan CD105, CD106, y CD44 y no expresan CD14, CD34, y CD45.
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En general, la identificacion positiva de una preparacion de MSC (por ejemplo, una preparacion de MSC indiferenciadas) requiere que al menos el 80%, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 95%, 98%, 99% y superior, o el 100% de las celulas en la preparacion de un resultado positivo en el ensayo para la expresion en superficie celular de CD105, CD106, y CD44 y de un resultado negativo en el ensayo para la expresion en superficie celular de CD14, CD34, y CD45 (es decir, CD105+; CD106+; CD44+; CD14-; CD34-; CD44-).
En algunos ejemplos, la identificacion positiva de una preparacion de MSC indiferenciadas requiere realizar solamente uno de los dos ensayos descritos anteriormente. Sin embargo, pueden realizarse ambos ensayos.
En algunos ejemplos, pueden realizarse ensayos adicionales, por ejemplo, antes del uso terapeutico de una preparacion de mSc para confirmar la ausencia de contaminantes incluyendo, por ejemplo, bacterias, virus, hongos, protemas infecciosas, y moleculas inmunologicas indeseadas. Dichos ensayos son conocidos en la tecnica.
Medio condicionado de MSC (MSC-CM)
Puede prepararse una composicion de MSC-CM usando una poblacion de MSC indiferenciadas entre los pases 4-7, donde el pase uno es el primer pase despues del aislamiento. Como se describe en este documento, puede prepararse una composicion de MSC-CM usando aproximadamente 1 x 105 a 1 x 107 celulas, por ejemplo aproximadamente 1 x 105 a 1 x 106 celulas, 1 x 106 a 1 x 107 celulas, 1 x 106 a 9 x 106 celulas, 1 x 106 a 8 x 106 celulas, 1 x 106 a 7 x 106 celulas, 1 x 106 a 6 x 106 celulas, 1 x 106 a 5 x 106 celulas, 1 x 106 a 4 x 106 celulas, 1 x 106 a 3 x 106 celulas, y 1 x 106 a 2 x 106 celulas. En algunos ejemplos, puede prepararse una composicion de MSC-CM usando 2 x 106 celulas.
En algunos ejemplos, se prepara una composicion de MSC-CM usando aproximadamente 1 x 102 celulas/cm2 a 1 x 104 celulas/cm2, por ejemplo, aproximadamente 1 x 102 celulas/cm2 a 1 x 103 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 1 x 104 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 9 x 103 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 8 x 103 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 7 x 103 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 6 x 103 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 5 x 103 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 4 x 103 celulas/cm2, 1 x 103 celulas/cm2 a 3 x 103 celulas/cm2, y 1 x 103 celulas/cm2 a 2 x 103 celulas/cm2. En algunos ejemplos, puede prepararse una composicion de MSC-CM usando aproximadamente 5 x 103 celulas/cm2. En algunos ejemplos, puede prepararse una composicion de MSC-CM usando dos poblaciones de 1 x 106 MSC por 175 cm2, es decir, puede prepararse una composicion de MSC-CM usando 2 x 106 celulas.
En algunos ejemplos, se prepara una composicion de MSC-CM del siguiente modo (vease tambien el Ejemplo 4):
(1) Se lavan minuciosamente MSC al 70-80% confluentes con solucion salina tamponada con fosfato (PBS);
(2) Se cultivan las MSC de (1) durante aproximadamente 12, 24, 36, o 48 horas, por ejemplo, 24 horas en un volumen apropiado de medio de cultivo sin suero que contiene DMEM, o un equivalente del mismo, suplementado con albumina serica bovina (BSA) al 0,05% (nota; el volumen del medio variara dependiendo del tamano del recipiente de cultivo celular) en un recipiente adecuado, por ejemplo, una matraz T175 cm2, con cada recipiente/matraz al 80% de confluencia, equivalente a aproximadamente 5 x 103 celulas/cm2; y
(3) Se recoge el medio de cultivo de MSC de (2).
La composicion de MSC-CM recogida puede concentrarse, por ejemplo, usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, unidades de ultrafiltracion con un punto de corte de 3 kD (AMICON Ultra-PL 3, Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Por ejemplo, la composicion de MSC-CM puede concentrarse al menos 2 veces hasta 10veces, 10veces hasta 20 veces, 20 veces hasta 30 veces, 30 veces hasta 49 veces, y por encima. Como un ejemplo, una composicion de MSC-CM se concentra 25 veces.
En algunos ejemplos, la composicion de MSC-CM comprende medio de cultivo que contiene DMEM suplementado con albumina serica bovina (BSA) al 0,05%. En algunos ejemplos, la composicion de MSC-CM no contiene nada de suero animal. En algunos ejemplos, la composicion de mSC-Cm comprende PBS. Como alternativa, la composicion de MSC-CM se proporciona en forma liofilizada.
En algunos ejemplos, una composicion de MSC-CM puede fraccionarse por tamano o por carga. En algunos ejemplos, una composicion de MSC-CM puede fraccionarse en fracciones de union a sulfato de heparina y no de union a heparina. Por ejemplo, en experimentos de fraccionamiento en sulfato de heparina, una composicion de MSC-CM concentrada puede pasarse sobre una columna de heparina, u otras columnas, por ejemplo, un metodo de separacion cromatografica por intercambio ionico, por tamano, en fas inversa u otros metodos de separacion cromatografica segun las instrucciones del proveedor. Las fracciones de flujo continuo y eluidas pueden recogerse, entonces, por separado. Las fracciones eluidas (es decir, la fraccion de union a heparina) entonces pueden recoger y opcionalmente concentrarse, como se ha descrito anteriormente.
En algunos ejemplos, una composicion de MSC-CM esta al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 100% libre de material no de union a heparina.
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Metodos de tratamiento
Los metodos descritos en este documento pueden usarse para tratar una enfermedad hepatica en un sujeto. En algunos ejemplos, la etiologfa de la enfermedad hepatica a tratarse puede ser una respuesta inflamatoria local o sistemica. Los metodos descritos en este documento son de uso particular para el tratamiento de FHF en un sujeto. Los metodos incluyen tratar a un sujeto diagnosticado como que tiene FHF, o sospechoso de tener FHF, por ejemplo, un sujeto que se presenta a un medico con smtomas que son tfpicos de FHF. En algunos ejemplos, los metodos y composiciones descritos en este documento son de uso en el tratamiento de fibrosis hepatica.
Generalmente, los metodos descritos en este documento incluyen (1) administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion de MSC-CM (o fraccion activa del mismo) a un sujeto que necesita, o que se ha determinado que necesita dicho tratamiento; y/o (2) tratar a un sujeto identificado como que necesita, o que se ha determinado que necesita dicho tratamiento, con una dispositivo extracorporeo de soporte hepatico o un dispositivo de asistencia hepatica que contiene MSC (por ejemplo, un biorreactor extracorporeo (EB) que contiene MSC (MSC- EB)).
Terapia con MSC-CM
Los metodos descritos en este documento pueden incluir la administracion parenteral de una composicion que incluye uno o mas de (A) una fraccion purificada de una composicion de MSC-CM; (B) una o mas fracciones purificadas de una composicion de MSC-CM; (C) fracciones de una composicion de MSC-CM de pesos moleculares particulares, por ejemplo, 1-3 kDa, 3-6 kDa, 6-50 kDa, y 50 kDa y por encima, incluyendo combinaciones de estas fracciones; (D) una composicion no fraccionada de MSC-CM; y (E) cualquier combinacion de A-D. Cada uno de estos se menciona, de forma individual o colectiva, como la "composicion" o la "composicion de MSC-CM". Las fracciones biologicamente activas pueden identificarse in vitro exponiendo hepatocitos a estfmulos apoptoticos, tales como actinomiosina D y TNF-I. El nivel de apoptosis entonces puede determinarse usando, por ejemplo, ensayo TUNEL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fracciones biologicamente activas inhibiran la apoptosis en una cantidad estadfsticamente significativa en este sistema, por ejemplo, en un 25%, 30%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mas. Estas observaciones in vitro pueden complementarse usando ensayos in vivo en un modelo animal de insuficiencia hepatica aguda.
En algunos ejemplos, se administra una dosis terapeuticamente eficaz de una composicion de MSC-CM a un sujeto usando inyeccion sistemica en bolo intravenoso. La administracion de bolo (tambien mencionada como infusion en bolo) incluye la administracion de una dosis de farmaco sobre un corto periodo de tiempo, por ejemplo, mediante inyeccion en un vaso sangumeo.
En algunos ejemplos, se administra una dosis terapeuticamente eficaz de una composicion de MSC-CM a un sujeto usando un goteo intravenoso. Otros modos de administracion pueden incluir cualquiera de varias vfas diferentes incluyendo, aunque sin limitacion, inyeccion intravenosa, intradermica, subcutanea, y percutanea.
Una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion de MSC-CM puede darse al sujeto en una o mas administraciones, aplicaciones, o dosificaciones. Las composiciones pueden administrarse desde una o mas veces al dfa hasta una o mas veces a la semana; incluyendo una vez en dfas alternos. Los expertos en la materia apreciaran que ciertos factores pueden influir en la dosificacion y cronologfa necesarias para tratar de forma eficaz a un sujeto, incluyendo, aunque sin limitacion, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Ademas, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de las composiciones descritas en este documento puede incluir un unico tratamiento o una serie de tratamientos.
En algunos ejemplos, se administra una composicion de MSC-CM a un sujeto como una unica dosis diaria o como multiples dosis diarias, por ejemplo, 1, 2 o 3 dosis diarias. Las dosis pueden administrarse con o sin considerar la ingesta de alimento.
En algunos ejemplos, se administra una composicion de MSC-CM a un sujeto durante un periodo de 1 a 7 dfas. En algunos ejemplos, se administra una composicion de MSC-CM a un sujeto durante un periodo de al menos 1 semana hasta 1 mes, por ejemplo, al menos 1, 2, 3 o 4 semanas. En un ejemplo alternativo adicional, se administra una composicion de MsC-Cm a un sujeto durante un periodo de al menos 1 mes hasta 1 ano o mas tiempo. En algunos ejemplos, se administra una composicion de MSC-CM hasta que se ha conseguido el efecto terapeutico deseado (por ejemplo, recuperacion funcional del tngado, por ejemplo, hasta niveles normales o casi normales, o hasta niveles tratables por otros medios terapeuticos), segun decida el sujeto o el profesional medico del sujeto. En algunos ejemplos, la funcion hepatica puede evaluarse usando ensayos conocidos de funcion hepatica, por ejemplo, niveles en suero de lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), bilirrubina, niveles de protemas, tiempo de protrombina, tiempo de coagulacion activada (ACT), tiempo de tromboplastina parcial (PTT), y tiempo d consumo de protrombina (PCT) (analizado adicionalmente a continuacion).
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La dosificacion, toxicidad, y eficacia terapeutica de la composicion pueden determinarse, por ejemplo, por procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la ED50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion). La relacion de dosis entre efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la relacion LD50/ED50. Generalmente se prefieren compuestos que muestran altos indices terapeuticos. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios toxicos, debe tenerse cuidado de disenar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio de tejido afectado para minimizar el dano potencial a celulas no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.
En algunos ejemplos, puede validarse una composicion de MSC-CM y/o puede determinarse la eficacia terapeutica de una composicion de MSC-CM, por ejemplo, de un lote dado de una composicion de MSC-CM, usando un modelo experimental (por ejemplo, un modelo animal o un modelo in vitro), por ejemplo, como se describe en este documento.
Terapia y dispositivos con MSC-EB
Los metodos descritos en este documento pueden incluir el uso de dispositivos extracorporeos de soporte hepatico con MSC para tratar a sujetos con enfermedad hepatica. Dichos dispositivos estan dentro del alcance de la presente descripcion.
Los dispositivos extracorporeos de soporte hepatico son analogos a los dispositivos usados para realizar dialisis renal. Los dispositivos descritos en este documento son dispositivos de fngado bioartificial (BAL) que incluyen biorreactores extracorporeos (EB), que son cartuchos o recipientes que tienen al menos una entrada de perfusion y una salida de perfusion, y un compartimento de celulas, por ejemplo, una matriz, dentro del recipiente que proporciona un entorno adecuado para celulas vivas mientras se permite la perfusion del compartimento de celulas con medios adecuados para mantener las celulas. Dichos compartimentos de celulas pueden ser, por ejemplo, fibras huecas, con circulacion de sangre o plasma fuera de las fibras, o placas planas; vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.759.245.
Generalmente, los sistemas que comprenden EB tambien separan de forma continua el plasma de los componentes celulares de la sangre usando un generador de ultrafiltrado. El ultrafiltrado (por ejemplo, plasma) se hace circular a traves del cartucho que contiene celulas cultivadas, es decir, un EB. Como alternativa, puede tratarse la sangre completa en el EB.
Como se ha indicado anteriormente, los cartuchos de EB generalmente contienen una barrera semi-permeable hecha de un material que permite el paso de macromoleculas y otros productos derivados de celulas a y desde el plasma del sujeto. Sin embargo, las propias celulas no abandonan el EB. Despues de la circulacion y uno o multiples pases a traves del biorreactor, el ultrafiltrado tratado (por ejemplo, plasma) se recombina con los componentes celulares de la sangre del sujeto y se devuelve al sujeto mediante el acceso venoso. Generalmente, la sangre o plasma del sujeto se suplementa con heparina para evitar la coagulacion. Esta circulacion se mantiene de forma continua durante, por ejemplo, un periodo de soporte de 10 horas de terapia. En sistemas BAL actuales, la sangre o el plasma transporta toxinas desde el paciente hasta un biorreactor que contiene hepatocitos. Vease, por ejemplo, Yarmush et al., Cell Transplant, 1:323 (1992), y Arkadopoulos et al., Int'l J. Artif. Organs, 21:781 (1998).
Los presentes dispositivos incluyen a) un biorreactor que comprende un compartimento de tratamiento de fluido y un compartimento de celulas, y opcionalmente una barrera selectivamente permeable que separa el compartimento de tratamiento de fluido y el compartimento de celulas; y b) un deposito de celulas en comunicacion fluida con el compartimento de celulas del biorreactor, donde el deposito de celulas comprende una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas. La sangre o el ultrafiltrado procedente de un sujeto se hace pasar al compartimento de tratamiento de fluido, donde los agentes secretados por las MSC pasan a la sangre o el ultrafiltrado, por contacto directo entre las MSC y la sangre o el ultrafiltrado, o mediante el paso de los agentes a traves de la barrera selectivamente permeable opcional, cuando esta presente. En los presentes dispositivos, las MSC en un EB se usan en un estado indiferenciado, evaluado usando tecnicas descritas en este documento.
Los dispositivos extracorporeos de soporte hepatico que incluyen biorreactores se mencionan habitualmente como dispositivos de tngado artificial (BAL) o dispositivos bioartificiales de asistencia hepatica (BLAD). Se conocen varios de dichos dispositivos en la tecnica y pueden adaptarse para su uso con MSC. Dispositivos extracorporeos de soporte hepatico ejemplares disponibles en el mercado que pueden usarse como se describe en este documento incluyen, aunque sin limitacion, el sistema ELAD® actualmente comercializado por Vital Therapies, Incorporated (mostrado en la en Fig. 1 de la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0182349), HEPATASSIST® de Circe, BELS de Gerlach, y BLSS de Excorp Medical. Se describen dispositivos ejemplares adecuados adicionales en las patentes de Estados Unidos n.° 6.472.200, 5.605.835; 7.160.719; 7.273.465; 6.858.146; 6.582.955; 5.270.192; 6.759.245; y la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20030017142.
La FIG. 25 muestra un diagrama esquematico de un sistema extracorporeo de soporte hepatico ejemplar en que
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pueden usarse los EB que contienen MSC como se describe en este documento. El sistema incluye un biorreactor 1 ejemplar con multiples cartuchos 2. El biorreactor 1 incluye una entrada de fluido oxigenado 3 para introducir un fluido oxigenado desde un suministro de fluido oxigenado 4, una salida de fluido oxigenado 3', una entrada de lfquido 5 para introducir un lfquido biologico, suministrado por la bomba 6 desde la unidad de inmunoaislamiento 7, en el biorreactor, y una salida de lfquido 5' para retirar el lfquido biologico del biorreactor para devolverlo a la unidad de inmunoaislamiento 7. La sangre del paciente 9 fluye mediante la bomba 6' a una unidad de plasmaferesis 8, desde la cual entonces fluye una parte del plasma a la unidad de inmunoaislamiento 7, mediante la bomba 6''. El plasma tratado fluye desde la unidad de inmunoaislamiento 7 y se mezcla con la sangre de la unidad de plasmaferesis 8 antes de fluir de vuelta al paciente 9. Para detalles adicionales, vease la patente de Estados Unidos n.° 6.759.245.
Con referencia a la FIG. 26, se muestra otro ejemplo de un sistema de hngado bioartificial en forma esquematica (vease la patente de Estados Unidos n.° 7.160.719). El sistema 10 incluye un EB 42 que incluye MSC, y opcionalmente hepatocitos. Un fluido biologico a tratarse (por ejemplo, sangre o plasma) puede introducirse en el eB 42 mediante la via de entrada de fluido biologico 32 y puede salir mediante la via de salida de fluido biologico 33. Por ejemplo, puede usarse un cateter venovenoso para situar el torrente sangumeo de un mairnfero en comunicacion fluida con el EB 42 mediante la via de entrada de fluido biologico 32. En un ejemplo alternativo, un fluido biologico puede tratarse in vitro usando un deposito de fluido biologico (no mostrado) en lugar del marnffero 51. En algunos ejemplos, el dispositivo incluye un generador de ultrafiltrado (UF) 41. En esos casos, la sangre del mamffero 51 fluye a lo largo de la via de sangre 31 al generador de UF 41, donde los componentes celulares se separan del plasma. El plasma ultrafiltrado entonces fluye a lo largo de la via 32 al EB 42, mientras los componentes celulares se reincorporan al UF tratado mediante la via 34. El fluido biologico entonces vuelve al mamffero 51 o al deposito de fluido biologico mediante la via 35.
Aunque las FIG. 25 y 26 representan los diversos componentes en una orientacion espedfica y que tienen dimensiones similares, los componentes pueden estar en cualquier orientacion, tamano, o forma.
En algunas situaciones, para minimizar la diferenciacion de MSC, pueden hacerse funcionar dispositivos EB que contienen MSC individuales durante un maximo de 24 horas. En algunas realizaciones, las celulas MSC pueden combinarse con hepatocitos primarios en un EB convencional.
Por tanto, un sujeto que necesita terapia puede conectarse a un dispositivo BAL que tiene un EB que contiene MSC (MSC-EB), o que contiene una mezcla de hepatocitos y MSC. Estos metodos pueden usarse para tratar la sangre o el plasma del sujeto. El metodo incluye proporcionar un sistema, como se describe en este documento, que contiene un EB que incluye un compartimento de celulas que contiene una poblacion de MSC para tratar la sangre o el plasma; para retirar la sangre o el plasma del sujeto; introducir la sangre o el plasma en el compartimento de tratamiento de fluido del EB; y permitir que la sangre o plasma fluya a traves de y salga del compartimento de tratamiento de fluido, tratando de ese modo la sangre o el plasma.
El caudal del plasma de un sujeto a traves de un EB puede ajustarse segun lo necesario, por ejemplo, a una tasa de aproximadamente 50-500 ml/minuto, por ejemplo, 50, 100, 2O0, 300, 400, y 500 ml/minuto. En algunos ejemplos, el caudal se ajustara para optimizar el paso de agentes secretados desde las MSC indiferenciadas al ultrafiltrado. En algunos ejemplos, el caudal diana sera de 175 ml/minuto. El tratamiento del sujeto (por ejemplo, circulacion del plasma del sujeto a traves de un dispositivo) puede continuar durante un tiempo terapeuticamente eficaz, por ejemplo, entre 1 hora y 24 horas, por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, o 23 horas. Los sujetos pueden experimentar multiples rondas de terapia con MSC-EB durando cada ronda, por ejemplo, entre 1 hora y 24 horas. La terapia con MSC-EB puede continuar, por ejemplo, hasta que se ha conseguido un efecto terapeutico deseado (por ejemplo, recuperacion de funcion hepatica suficiente hasta niveles aceptables o casi normales), segun se decida por el sujeto o el profesional medico del sujeto, o hasta que esta disponible un tngado donante para su trasplante. En algunos ejemplos, la funcion hepatica puede evaluarse usando ensayos convencionales de funcion hepatica, por ejemplo, niveles en suero de LDH, aLp, AST, ALT, bilirrubina, protemas, tiempo de protrombina, ACT, PTT, y PCT. En algunos ejemplos, los ensayos de funcion hepatica se realizan antes de y/o despues de terapia con MSC-EB, para evaluar la eficacia de la terapia con MSC-EB. Dichas evaluaciones tambien pueden hacerse antes y/o despues de cada ronda de terapia con MSC-EB, asf como antes de que empiece la terapia y despues de haberse completado la terapia debido a que se esta consiguiendo el efecto terapeutico deseado o a la adquisicion de un organo donante.
Los dispositivos extracorporeos de soporte hepatico que incluyen biorreactores tambien se mencionan habitualmente como dispositivos de hngado artificial (BAL) o dispositivos bioartificiales de asistencia hepatica (BLAD). Se conocen varios de dichos dispositivos en la tecnica y pueden adaptarse para su uso con MSC. Dispositivos extracorporeos de soporte hepatico disponibles en el mercado ejemplares que pueden usarse como se describe en este documento incluyen, aunque sin limitacion, el sistema ELAD® actualmente comercializado por Vital Therapies, Incorporated (mostrado en la Fig. 1 de la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0182349), HePATASSIST® de Circe, BELS de Gerlach, y BLSS de Excorp Medical. Se describen dispositivos ejemplares adecuados adicionales en las patentes de Estados Unidos n.° 6.472.200, 5.605.835; 7.160.719; 7.273.465; 6.858.146; 6.582.955; 5.270.192; 6.759.245; y la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2003-0017142.
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Seleccion de sujetos
Los metodos descritos en este documento son de uso particular para el tratamiento de enfermedad hepatica (por ejemplo, insuficiencia hepatica aguda) en un sujeto que lo necesita. Los metodos incluyen: identificar a un sujeto con enfermedad hepatica (por ejemplo, insuficiencia hepatica aguda), y tratar al sujeto con las composiciones descritas en este documento usando los metodos descritos en este documento.
En algunos ejemplos, los metodos de tratamiento descritos en este documento incluyen una etapa de seleccion de un sujeto sobre la base de que tiene una enfermedad hepatica, por ejemplo, FHF o fibrosis hepatica. En algunos ejemplos, se administra un ensayo de funcion hepatica, por ejemplo, como se sabe en la tecnica o se describe en este documento, y el sujeto se selecciona para tratamiento usando un metodo descrito en este documento sobre la base del resultado de ese ensayo, por ejemplo, un resultado de ensayo que indica que el sujeto tiene una enfermedad hepatica (por ejemplo, una enfermedad hepatica asociada con la perdida de funcion hepatica y/o la perdida o dano de hepatocitos, por ejemplo, de celulas del parenquima del hngado).
Por tanto, en algunos ejemplos, un sujeto que necesita tratamiento con las composiciones y metodos descritos en este documento puede seleccionarse basandose en, por ejemplo, marcadores sericos de funcion hepatica. Un sujeto que necesita tratamiento con los metodos descritos en este documento tambien puede seleccionarse basandose en el diagnostico por un medico de enfermedad hepatica (por ejemplo, enfermedad hepatica aguda) en un sujeto.
Enfermedad hepatica
La expresion "enfermedad hepatica" se aplica a muchas enfermedades y trastornos que causan que el hfgado funcione inapropiadamente o deje de funcionar, y esta perdida de funcion hepatica es indicativa de enfermedad hepatica. Por tanto, frecuentemente se usan ensayos de funcion hepatica para diagnosticar enfermedad hepatica. Ejemplos de dichos ensayos incluyen, aunque sin limitacion, los siguientes;
(1) Ensayos para determinar los niveles de enzimas sericas tales como lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), y alanina aminotransferasa (ALT), donde un aumento en los niveles de enzimas indica enfermedad hepatica. Los expertos en la materia comprenderan razonablemente que estos ensayos enzimaticos indican solamente que el hfgado has sido danado. No evaluan la capacidad del hfgado de funcionar. Pueden usarse otros ensayos para ensayar la capacidad del hfgado de funcionar.
(2) Ensayos para determinar los niveles sericos de bilirrubina. Los niveles sericos de bilirrubina se presentan como bilirrubina total y bilirrubina directa. Los valores normales de bilirrubina serica total son 0,1 - 1,0 mg.dl (por ejemplo, aproximadamente 2 - 18 mmol/l). Los valores normales de bilirrubina directa son 0,0 - 0,2 mg/dl (0 - 4 mmol/l). Aumentos en la bilirrubina serica son indicativos de enfermedad hepatica.
(3) Ensayos para determinar los niveles sericos de protemas, por ejemplo, albumina y las globulinas (por ejemplo, alfa, beta, gamma). Los valores normales para protemas sericas totales son 6,0-8,0 g/dl (60-80 g/l). Una disminucion en la albumina serica es indicativa de enfermedad hepatica. Un aumento en la globulina es indicativo de enfermedad hepatica.
Otros ensayos incluyen tiempo de protrombina, relacion normalizada internacional, tiempo de coagulacion activada (ACT), tiempo de tromboplastina parcial (PTT), tiempo de consumo de protrombina (PCT), fibrinogeno, factores de coagulacion; alfa-fetoprotema, y alfa-fetoprotema-L3 (porcentaje).
Un tipo clmicamente importante de enfermedad hepatica es la hepatitis. La hepatitis es una inflamacion del hugado que puede estar causada por virus (por ejemplo, virus de la hepatitis A, By C (HAV, HBV, y HCV, respectivamente), agentes qmmicos, farmacos, alcohol, enfermedades hereditarias, o el propio sistema inmunologico del paciente (hepatitis autoinmunitaria). Esta inflamacion puede ser aguda y resolverse en unas pocas semanas a meses, o cronica, y persiste durante muchos anos. La hepatitis cronica puede persistir durante decadas antes de causar smtomas significativos, tales como cirrosis (cicatrizacion y perdida de funcion), cancer de hugado, o muerte.
Otros ejemplos importantes de diferentes enfermedades o trastornos abarcados por la expresion "enfermedad hepatica" incluyen, aunque sin limitacion, abscesos hepaticos amebianos, atresia biliar, fibrosis, cirrosis, coccidioidomicosis, agente delta, carcinoma hepatocelular (HCC), enfermedad hepatica alcoholica, cirrosis biliar primaria, absceso hepatico piogenico, smdrome de Reye, colangitis esclerosante, y enfermedad de Wilson. En algunos ejemplos, las composiciones y metodos descritos en este documento son adecuados para el tratamiento de enfermedad hepatica caracterizada por la perdida o dano de celulas del parenquima del hfgado. En algunos aspectos, la etiologfa de esto puede ser una respuesta inflamatoria local o sistemica.
Insuficiencia hepatica
La insuficiencia hepatica aparece cuando grandes partes del hfgado quedan danadas y el hfgado ya no es capaz de realizar su funcion fisiologica normal. En algunos aspectos, la insuficiencia hepatica puede diagnosticarse usando los ensayos descritos anteriormente de funcion hepatica. En algunos ejemplos, la insuficiencia hepatica puede
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diagnosticarse (por ejemplo, diagnosticarse inicialmente) basandose en los smtomas de un sujeto. Los smtomas que estan asociados con la insuficiencia hepatica incluyen, por ejemplo, uno o mas de los siguientes, nauseas, perdida de apetito, fatiga, diarrea, ictericia, hemorragia anormal/excesiva (por ejemplo, coagulopatfa), abdomen hinchado, desorientacion mental o confusion (por ejemplo, encefalopatfa hepatica), somnolencia, y coma.
La insuficiencia hepatica cronica aparece en meses a anos y esta muy habitualmente causada por virus (por ejemplo, HBV y HCV), consumo a largo plazo/excesivo de alcohol, cirrosis, hemocromatosis, y malnutricion.
La insuficiencia hepatica aguda es la aparicion de complicaciones graves despues de los primeros signos de enfermedad hepatica (por ejemplo, ictericia). La insuficiencia hepatica aguda incluye varias afecciones, todas las cuales implican lesion grave o necrosis de los hepatocitos. En la mayona de los casos de insuficiencia hepatica aguda, sucede necrosis masiva de los hepatocitos; sin embargo, la insuficiencia hepatocelular sin necrosis es caractenstica del tngado graso de las embarazadas y el smdrome de Reye. Un estado mental alterado (encefalopatfa hepatica) y coagulopatfa en el ambito de una enfermedad hepatica generalmente define insuficiencia hepatica aguda. Por consiguiente, la insuficiencia hepatica aguda generalmente se define clmicamente como el desarrollo de coagulopatfa, habitualmente una relacion normalizada internacional (una medida del tiempo que tarda la sangre en coagular en comparacion con un valor promedio - INR) de mas de 1,5, y cualquier grado de alteracion mental (encefalopatfa) en un paciente sin cirrosis preexistente y con una enfermedad de menos de 26 semanas de duracion. La insuficiencia hepatica aguda indica que el tngado ha mantenido un dano grave provocando la disfuncion del 80-90% de las celulas hepaticas.
La insuficiencia hepatica aguda aparece cuando el tngado falla rapidamente. La insuficiencia hepatica hiperaguda se caracteriza como fallo del tngado en una semana. La insuficiencia hepatica aguda se caracteriza como el fallo del tngado en 8-28 dfas. La insuficiencia hepatica subaguda se caracteriza como el fallo del tngado en 4-12 semanas.
En algunos ejemplos, las composiciones y metodos descritos en este documento son particularmente adecuados para el tratamiento de insuficiencia hepatica hiperaguda, aguda, y subaguda, todas las cuales se mencionan en este documento como "insuficiencia hepatica aguda." Las causas comunes para insuficiencia hepatica aguda incluyen, por ejemplo, hepatitis vmca, exposicion a ciertos farmacos y toxinas (por ejemplo, hidrocarburos fluorados (por ejemplo, tricloroetileno y tetracloroetano), Amanita phalloides (por ejemplo, encontrada habitualmente en el "hongo de la muerte"), acetaminofeno (paracetamol), halotanos, sulfonamidas, fenitomas), isquemia hepatica relacionada con enfermedad cardiaca (por ejemplo, infarto de miocardio, parada cardiaca, cardiomiopatfa, y embolia pulmonar), insuficiencia renal, oclusion del flujo saliente venoso hepatico (por ejemplo, smdrome de Budd-Chiari), enfermedad de Wilson, tngado graso aguda del embarazo, abscesos amebianos, y tuberculosis diseminada.
La insuficiencia hepatica aguda abarca tanto insuficiencia hepatica fulminante (FHF) como insuficiencia hepatica subfulminante (o insuficiencia hepatica de aparicion tardfa). La FHF se usa generalmente para describir el desarrollo de encefalopatfa en 8 semanas desde la aparicion de smtomas en un paciente con un tngado previamente sano. La insuficiencia hepatica subfulminante se reserva para pacientes con enfermedad hepatica durante hasta 26 semanas antes del desarrollo de encefalopatfa hepatica.
La FHF se define habitualmente como la alteracion grave de las funciones hepaticas en ausencia de enfermedad hepatica preexistente. La FHF puede resultar de la exposicion de un individual susceptible a un agente capaz de producir lesion hepatica grave. Ejemplos de dichos agentes incluyen agentes infecciosos, alcohol excesivo, metabolitos hepatotoxicos, y compuestos hepatotoxicos (por ejemplo, farmacos). Otras causas incluyen anormalidades congenitas, enfermedad autoinmunitaria y enfermedad metabolica. En muchos casos la etiologfa precisa de la afeccion es desconocida (por ejemplo, idiopatica). La FHF puede diagnosticarse, por ejemplo, usando los ensayos de funcion hepatica descritos anteriormente.
Fibrosis hepatica
La fibrosis hepatica es la acumulacion excesiva de protemas de la matriz extracelular incluyendo colageno que aparece en la mayona de enfermedades hepaticas cronicas. La fibrosis hepatica avanzada provoca cirrosis, insuficiencia hepatica e hipertension portal, y a menudo requiere trasplante de tngado. Un evento clave en la etiologfa de la fibrosis hepatica es la activacion inapropiada o excesiva de celulas estrelladas hepaticas (Abdel-Aziz et al., Am. J. Pathol., 137:1333-1342, 1990; Iredale et al., J. Clin. Invest., 102:538-549, 1998).
Disfuncion multiorganica
La insuficiencia organica se define generalmente como perdida de celulas del parenquima asociada con una respuesta inflamatoria local y sistemica. Mas espedficamente, la insuficiencia organica es el fallo de un sistema esencial en el organismo que requiere intervencion medica. El smdrome de disfuncion multiorganica (MODS) es funcion organica alterada en un paciente gravemente enfermo, que requiere intervencion medica para realizar la homeostasis. El MODS habitualmente implica dos o mas organos.
El MODS tfpicamente resulta de infeccion, lesion (accidente, cirugfa), hipoperfusion e hipermetabolismo. Despues de
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un evento iniciador, se produce una respuesta inflamatoria incontrolada, que causa lesion tisular y desencadena respuestas locales y sistemicas. La insuficiencia respiratoria es habitual en las primeras 72 horas despues de la lesion original, la insuficiencia hepatica es habitual en los primeros 5-7 dfas, la hemorragia gastrointestinal puede suceder a los 10-15 d^as, y la insuficiencia renal es habitual a los 11-17 dfas. Las tasas de mortalidad para MODS vanan del 30% al 100%. Actualmente no existe regimen terapeutico eficaz disponible para revertir el MODS establecido.
En algunos ejemplos, las composiciones y metodos descritos en este documento pueden usarse para el tratamiento de insuficiencia organica, por ejemplo, insuficiencia multiorganica.
Formulaciones farmaceuticas
Las composiciones descritas en este documento, por ejemplo, una composicion de MSC-CM y agentes activos aislados a partir de la misma, pueden incorporarse en composiciones farmaceuticas adecuadas para su administracion a un sujeto, por ejemplo, un mairnfero, por ejemplo, un ser humano. Como se usa en este documento, la expresion "vehfculo farmaceuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es conocido. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, dichos medios pueden usarse en las composiciones de la invencion. Tambien pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Una composicion farmaceutica generalmente se formulara para que sea compatible con su via pretendida de administracion. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicacion parenteral pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito sodico; agentes quelantes tales como acido etilendiaminatetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sodico o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clorhfdrico o hidroxido sodico. La preparacion parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de multiples dosis hechos de vidrio o plastico.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion improvisada de soluciones inyectables esteriles o dispersiones. Para administracion intravenosa, los vehfculos adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composicion debe ser esteril y debe ser fluida al grado que exista facil capacidad de inyeccion. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe estar conservada contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehfculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula necesario en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sodico en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, un agente descrito en este documento) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun lo necesario, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehfculo esteril que contiene un medio basico de dispersion y los otros ingredientes necesarios entre los enumerados anteriormente. En caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacfo y secado por congelacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente filtrada a esterilidad del mismo.
En un ejemplo, las composiciones de MSC-CM se preparan con vehfculos que protegeran a las composiciones contra la rapida eliminacion desde el organismo, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhfdridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Los metodos para la preparacion de dichas formulaciones seran evidentes para los expertos en la materia. Los materiales tambien pueden obtenerse de forma comercial en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Tambien pueden usarse suspensiones liposomicas (incluyendo liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales contra antfgenos vmcos) como vehfculos farmaceuticamente aceptables. Estos pueden
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prepararse de acuerdo con metodos conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.522.811.
Las composiciones farmaceuticas pueden incluirse en un recipiente, envase, o dispensador junto con instrucciones para su administracion. En un aspecto, las composiciones farmaceuticas pueden incluirse como parte de un kit. Dichos kits tambien estan dentro del alcance de la presente invencion.
Metodos de deteccion
Se describen en este documento metodos para identificar los compuestos activos contenidos en una composicion de MSC-CM, por ejemplo, en la fraccion de union a heparina de una composicion de MSC-CM.
En algunos ejemplos, los compuestos activos contenidos en una composicion de MSC-CM, por ejemplo, en la fraccion de union a heparina de una composicion de MSC-CM, pueden obtenerse analizando sistematicamente cada uno de los compuestos contenidos en una composicion de MSC-CM. Como alternativa, una composicion de MSC- CM puede fraccionarse, por ejemplo, por tamano y/o carga, y pueden identificarse las fracciones activas. Entonces, cada una de las fracciones activas puede fraccionarse adicionalmente, e identificarse las fracciones activas de las mismas. Esto puede repetirse una cantidad deseada de veces, y despues pueden identificarse los componentes de la fraccion activa, por ejemplo, usando metodos conocidos en la tecnica (por ejemplo, HPLC, espectrometna de masas), y despues pueden ensayarse algunos o todos los componentes para su actividad en el sistema de ensayo. Si se identifican dos o mas compuestos activos, pueden combinarse para formar una composicion combinada para conseguir algo de o toda la eficacia del MSC-CM completo, por ejemplo, una composicion combinada con al menos el 40%, por ejemplo, el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mas de la eficacia del MSC-CM. En algunos ejemplos, se ensaya la actividad terapeutica de componentes individuales de una composicion de MSC-CM, o fracciones de diferente tamano de una composicion de MSC-CM usando ensayos in vitro y/o in vivo, por ejemplo, de crecimiento, proliferacion, supervivencia, morfologfa y funcion de hepatocitos; varios de dichos ensayos son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los ensayos in vitro adecuados pueden incluir ensayos para analizar la proliferacion de hepatocitos, por ejemplo, mediante la incorporacion de BrdU; la apoptosis de hepatocitos, por ejemplo, analizando los cambios morfologicos asociados con la apoptosis/necrosis, o usando, por ejemplo, el ensayo TUNEL; RT-PCR para detectar alteraciones en los niveles de expresion de ARNm de IL-10, IL-6, HGF, EGF, y tNF-I; proliferacion de celulas estrelladas; apoptosis de celulas estrelladas; ELISA para detectar expresion alterada de IL-10, TNF-I, IL-1-9, IL-6, IL-2, IL-1ra, y quimiotaxis de celulas inmunitarias. Dichos ensayos in vivo incluyen analisis de histologfas hepaticas, por ejemplo, despues de biopsia del tngado o despues del sacrificio de un modelo animal y estudios de supervivencia de un modelo animal. El objetivo de dicha experimentacion de deteccion es identificar el componente biologicamente activo de una composicion de MSC-CM. La expresion "componente biologicamente activo de una composicion de MSC-CM", como se usa en este documento, se refiere a un componente de una composicion de MSC-CM que produce uno o mas de los efectos beneficiosos descritos en este documento, por ejemplo, modula la senalizacion de celulas estrelladas, promueve la proliferacion de hepatocitos, inhibe la muerte celular de hepatocitos, o induce cualquier cambio en los niveles de ARNm o protemas en hepatocitos como se describe en este documento. Los ensayos in vitro e in vivo para detectar dichos efectos son conocidos en la tecnica y se describen en este documento.
Kits
Se describen adicionalmente en este documento kits. En algunos ejemplos, los kits comprenden una o mas dosis de una composicion de MSC-CM. La composicion, forma, y tipo de forma de dosificacion para el regimen de induccion y el regimen de mantenimiento pueden variar dependiendo de las necesidades del sujeto. Por ejemplo, la forma de dosificacion puede ser una forma de dosificacion parenteral (por ejemplo, administracion en bolo intravenoso), una forma de dosificacion oral, una forma de dosificacion de liberacion retardada o controlada, una forma de dosificacion topica y a la mucosa, incluyendo cualquier combinacion de las mismas.
En un ejemplo particular, un kit puede contener uno o mas de los siguientes en un envase o recipiente: (1) una o mas dosis de una composicion de MSC-CM, por ejemplo, en forma de solucion lfquida o congelada o liofilizadas; (2) uno o mas tampones farmaceuticamente aceptables; (3) uno o mas vehfculos para la administracion de la dosis, tal como una o mas jeringas, un cateter, una bomba, un hidrogel, y una forma de administracion de formulacion de deposito; (4) uno o mas agentes bioactivos adicionales para administracion concurrente o secuencial con una composicion de MSC-CM, tales como ingredientes active suplementarios (SAI); y (5) instrucciones para su administracion. Tambien pueden usarse kits en que se encuentran dos o mas, incluyendo todos, los componentes
(1)-(5), en el mismo recipiente.
Cuando se suministra un kit, los diferentes componentes de las composiciones incluidos pueden envasarse en recipientes diferentes y mezclarse inmediatamente antes de su uso. Dicho envasado de los componentes por separado puede permitir un almacenamiento a largo plazo sin perdida de las funciones de los componentes activos. Cuando se incluye mas de un agente bioactivo en un kit particular, los agentes bioactivos pueden (1) envasarse por separado y mezclarse por separado con adyuvantes o excipientes apropiados (similares o diferentes, pero compatibles) inmediatamente antes de su uso, (2) envasarse juntos y mezclarse juntos inmediatamente antes de su
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uso, o (3) envasarse por separado y mezclarse juntos inmediatamente antes de su uso. Si los compuestos elegidos permanecen estables despues de la mezcla, los compuestos pueden mezclarse en un momento antes de su uso diferente a inmediatamente antes de su uso incluyendo, por ejemplo, minutos, horas, d^as, meses, anos, y en el momento de la fabricacion.
Las composiciones incluidas en kits particulares pueden suministrarse en recipientes de cualquier tipo de modo que se conserve de forma optima la vida de los diferentes componentes y no se adsorban o alteren por los materiales del recipiente. Los materiales adecuados para estos recipientes pueden incluir, por ejemplo, vidrio, polfmeros organicos (por ejemplo, policarbonato y poliestireno), ceramica, metal (por ejemplo, aluminio), una aleacion, o cualquier otro material tipicamente empleado para alojar reactivos similares. Recipientes ejemplares pueden incluir, sin limitacion, tubos de ensayo, viales, matraces, frascos, jeringas, y similares.
Como se ha indicado anteriormente, los kits tambien pueden suministrarse con materiales de instruccion. Estas instrucciones pueden estar impresas y/o pueden suministrarse, sin limitacion, como un medio legible electronico, tal como un disquete, un CD-ROM, un DVD, un disco Zip, una cinta de video, una cinta de audio, y un dispositivo de memoria flash. Como alternativa, las instrucciones pueden publicarse en un sitio web de Internet o pueden distribuirse al usuario como un correo electronico.
Cartuchos de biorreactor extracorporeo con MSC
Tambien se incluyen dentro de la presente invencion EB, y cartuchos para su uso en los mismos que incluyen MSC (cartuchos de MSC-EB). Cada cartucho puede suministrarse como un cartucho individual para su uso en un dispositivo extracorporeo de soporte hepatico, descrito anteriormente. Los cartuchos de MSC-EB pueden suministrarse para uso unico con un paciente durante una franja de tiempo de hasta 24 horas. Pueden suministrarse multiples cartuchos para su uso en un unico paciente, estipulado por el regimen de tratamiento de un sujeto. Se conocen en la tecnica varias configuraciones adecuadas de cartuchos, veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.270.192; 7.160.719; 6.858.146; 6.582.955; 6.759.245; Dixit y Gitnick, Eur. J. Surg. Suppl. (582):71-6 (1998); y Legallais et al., J. Memb. Sci. 181:81-95 (2001). Dichos cartuchos pueden incluir, por ejemplo, fibras huecas o placas planas. Generalmente, una membrana semi-permeable separara el fluido biologico a tratarse de las celulas, y dicha membrana puede formar parte de los cartuchos, por ejemplo, una pared exterior del cartucho. Los cartuchos se configuran para que se inserten en un dispositivo BAL, por ejemplo, como parte de un biorreactor o como un biorreactor completo.
La FIG. 27 es una ilustracion esquematica de un cartucho de biorreactor de nucleo hueco 100, que contiene varias fibras huecas 140, y una entrada 110 y salida 120. Las fibras huecas seran semi-permeables, permitiendo el paso de los factores activos secretados por las MSC a la sangre o el plasma. La FIG. 28 es una vista en seccion transversal del biorreactor 100 en la lmea A-A, que ilustra las fibras huecas 140, que tienen un lumen interior del capilar 130 y estan rodeadas por el espacio extracapilar 150. En biorreactores de fibra hueca, las MSC pueden estar en el lumen 130, mientras que la sangre o el plasma fluye a traves del espacio extracapilar 150, o viceversa. En este caso, el compartimento que incluye las MSC se considera el compartimento de celulas, mientras que el compartimento a traves del cual fluye la sangre o el plasma es el compartimento de tratamiento de fluido.
La FIG. 29 es una ilustracion esquematica de un biorreactor de placa plana o de dos compartimentos 200, que incluye un compartimento de tratamiento de fluido 210 y un compartimento de celulas 220, separados por una membrana semi-permeable 230. La sangre o el plasma fluye a traves del compartimento de tratamiento de fluido 210 a lo largo de la via 250. El compartimento de celulas 220 incluye las MSC 240 (y, opcionalmente, hepatocitos). Este tipo de biorreactor se describe en mayor detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6.759.254.
Tambien se proporcionan kits que pueden contener uno o mas de los siguientes en un envase o recipiente: (1) un cartucho de MSC-EB; (2) uno o mas tampones farmaceuticamente aceptables; (3) instrucciones para instalar el MSC-EB en un BAL espedfico. Tambien pueden usarse realizaciones en que dos o mas, incluyendo todos, los componentes (1)-(3), se encuentran en el mismo recipiente.
Ejemplos
La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion descrita en las reivindicaciones.
Ejemplo 1 - Aislamiento, cultivo y expansion ex vivo de MSC
Se aislaron MSC humanas de aspirados de medula osea disponibles en el mercado (MSC derivadas de medula osea) obtenidos de un unico donante varon de 25 anos de edad (Clonetics-Poietics, Walkersville, MD), como se ha descrito previamente (Mauney et al., Biomaterials, 26:6167-6175, 2005). En resumen, se sembraron en placa aspirados de medula osea completa a una densidad de 8-10 pl de aspirado/cm2 en matraces de cultivo tisular de 175 cm2 y se cultivaron hasta confluencia en medio de expansion a 37°C y 5% de dioxido de carbono. El medio de expansion consistfa en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero fetal de ternero al 10%,
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100 U/ml de penicilina, 100 |jg/ml de estreptomicina, aminoacidos no esenciales 0,1 mM y 1 ng/ml de factor basico de crecimiento de fibroblastos (Life Technologies, Rockville, MD). Despues de 4 dfas de cultivo, se retiraron las celulas hematopoyeticas no adherentes lavando con PBS, y se cultivaron las monocapas de celulas adherentes con cambios de medio 2-3 veces a la semana. Las celulas se pasaron usando tripsina al 0,25%/EDTA al 0,1%, se subcultivaron a una densidad de 5 x 103 celulas/cm2 y se usaron para experimentos durante los pases 4-7. Las MSC aisladas se mantuvieron como se ha descrito previamente (Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).
Ejemplo 2 - Caracterizacion de MSC derivadas de medula osea
Las celulas madre mesenquimaticas (MSC) poseen varias caractensticas unicas y bien establecidas que permiten que estas celulas se distingan de otras celulas. Dichas caractensticas incluyen la capacidad de las celulas de dar lugar de forma reproducible (es decir, diferenciarse) en adipocitos, osteoblastos, y condrocitos in vitro (Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999); y la capacidad de las celulas de recuperar trastornos tisulares mesenquimaticos en seres humanos (Horwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:8932-8937, 2002). Ademas, las mSc humanas pueden identificarse adicionalmente evaluando la expresion en superficie celular de CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106, CD11b, CD14, CD18, CD34, CD36, y CD45 (Pittenger et al., Circ. Res., 95:9-20, 2004).
Las MSC aisladas usando los metodos descritos anteriormente se caracterizaron usando dos tecnicas distintas.
En primer lugar, se evaluo la multipotencia de las MSC derivadas de medula osea in vitro cultivando las celulas en medio de induccion de (1) osteogenesis, (2) adipogenesis o (3) condrogenesis durante 2-3 semanas, con cambios de medio cada 3 dfas, del siguiente modo.
(1) . El medio osteogenico consistfa en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con dexametasona 0,1 jM, fosfato de p-glicerol 10 mM, acido ascorbico (AsA) 0,2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina.
(2) . El medio de adipogenesis consistfa en IMDM suplementado con 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM, hidrocortisona 1 jM, indometacina 0,1 mM, suero de conejo al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina.
(3) . Para estudios de condrogenesis, las celulas se transfirieron a un tubo de polipropileno de 15 ml y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos para formar una micromasa sedimentada que despues se trato con medio condrogenico. El medio de condrogenesis consistfa en DMEM de alto contenido en glucosa (Chemicon International, Temecula, CA) suplementado con dexametasona 0,1 jM, 50 jg/ml de AsA, 100 jg/ml de piruvato sodico, 40 jg/ml de prolina, 10 ng/ml de TGF-p1, 50 mg/ml de ITS+ premezcla (Becton Dickinson; 6,25 jg/ml de insulina, 6,25 jg/ml de transferrina, 6,25 ng/ml de acido selenioso, 1,25 mg/ml de albumina serica bovina, y 5,35 mg/ml de acido linoleico), 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina.
El fenotipo de las celulas diferenciadas se evaluo despues de 2-3 semanas de induccion, del siguiente modo.
(1) . Se determino el contenido mineral en condiciones osteogenicas usando coloracion de Von Kossa, del siguiente modo. En resumen, las celulas se fijaron con paraformaldel'ndo al 4% durante 15 minutos, se lavaron dos veces con PBS, se tineron con nitrato de plata al 1% bajo luz de 100 W durante 60 minutos y se lavaron con agua desionizada (DI).
(2) . Se determino la acumulacion de lfpidos despues de condiciones adipogenicas por tincion con aceite Red O, del siguiente modo. En resumen, las celulas se fijaron con paraformaldel'ndo al 4%, se lavaron dos veces con PBS, se tineron con aceite Red O durante 15 minutos y se lavaron con agua DI.
(3) . Se evaluo el contenido de proteoglicanos despues de condiciones condrogenicas por tincion con safranina- O, del siguiente modo. En resumen, el microsedimento se fijo en paraformaldel'ndo al 4%, se diluyo en serie en etanol y se incorporo en bloques de parafina. Los bloques se seccionaron y se tineron con safranina-O.
Todas las imagenes se capturaron en un microscopio Nikon Eclipse E800 Upright.
Los resultados mostraron que se indudan la osteogenesis, adipogenesis y condrogenesis en sus respectivos medios de induccion. La tincion para osteogenesis, adipogenesis y condrogenesis se visualiza por deposicion de minerales, gotas de lfpidos y sulfato de condroitina, respectivamente.
En segundo lugar, las MSC se inmunofenotiparon por citometna de flujo (FACS Calibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). El panel de antfgenos de superficie inclma CD14, CD34, CD44, CD45, y CD106 (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ).
Como se esperaba, el perfil de antfgenos de superficie de las MSC aisladas fue CD14-, CD105+, CD34-, CD45-, CD106+ y CD44+. Estas observaciones son coherentes con los informes previos de expresion de marcadores superficiales de MSC indiferenciadas (Pittenger et al., Circ. Res., 95:9-20, 2004).
Por tanto, los metodos usados eran adecuados para el aislamiento de MSC.
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Ejemplo 3 - Inmunomodulacion de celulas estrelladas por MSC
Este ejemplo demuestra que las MSC son capaces de modular las celulas estrelladas hepaticas activadas (SC), probablemente mediante mecanismos paracrinos.
Generalmente se cree que la fibrosis hepatica, el precursor de cirrosis, es el resultado de un desequilibrio en la smtesis de matriz extracelular (ECM) y de degradacion mediada principalmente por SC.
Las SC son pericitos frecuentemente encontrados en el espacio perisinusoidal localizado entre los sinusoides y los hepatocitos en el tugado. En un tugado normal y sano, las Sc son quiescentes y estan principalmente implicadas en el almacenamiento de vitamina A. Despues de lesion hepatica, las Sc experimentan un cambio fenotipico en celulas proliferativas, de tipo miofibroblasto, positivas a a-actina de musculo liso, con capacidad aumentada de smtesis de colageno. Las SC pueden distinguirse facilmente por las grandes gotas de lfpidos observadas en el citoplasma de estas celulas.
La activacion in vivo de SC se divide en una respuesta fibrogenica e hiperplasica que esta mediada por muchas senales autocrinas y paracrinas. Se ha informado de la resolucion espontanea de la fibrosis hepatica en diferentes modelos de rata de lesion hepatica cronica (Abdel-Aziz, et al., Am. J. Pathol., 137:1333-1342, 1990; Iredale et al., J. Clin. Invest. 102:538-549, 1998). Esta resolucion se ha correlacionado con smtesis disminuida de colageno de tipo I e inhibidor tisular de los transcritos 1 y 2 de metaloproteinasas de matriz (TIMP), con una disminucion concomitante en la cantidad de SC a-SMA positivas (Iredale et al., J. Clin. Invest. 102:538-549, 1998). No esta claro si la disminucion en la cantidad de SC activadas se debe a apoptosis selectiva o a reversion a un estado quiescente por indicios microambientales.
Estos datos demuestran que la terapia con MSC es util en el tratamiento de trastornos causados por SC activadas en un sujeto, por ejemplo, fibrosis hepatica.
3A- Aislamiento de SC
Se aislaron SC primarias de rata de ratas Lewis hembra adultas de 2-3 meses de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) que pesaban 180-200 g, como se ha informado previamente en detalle para el aislamiento de hepatocitos (Dunn et al., FASEB J., 3:174-177, 1989). En resumen, se obtuvo el sobrenadante de las etapas de purificacion de hepatocitos, que contema celulas no del parenquima del tugado y se trato con DNasa I durante 15 minutos a 37°C, se centrifugo a 300 g durante 20 minutos, y despues se resuspendio en PBS. Esta suspension celular se sometio a una separacion en gradiente de densidad estratificando cuidadosamente la suspension sobre la parte superior de un gradiente discontinuo del 40%-60% de Percoll isotonico. Las capas despues se centrifugaron de 900 g durante 25 minutos. La capa de densidad mas baja, enriquecida en SC, despues se retiro, se diluyo con PBS y se centrifugo a 900 g durante 25 minutos. Las celulas se resuspendieron en medio SC (medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con FBS al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) y se cultivaron en matraces de cultivo tisular de 175 cm2. Las SC se cultivaron durante 10-14 dfas en plastico de cultivo tisular, que condujo a su activacion, antes de su uso en los experimentos. La pureza y diferenciacion de cultivos SC se evaluaron realizando inmunofluorescencia para desmina, un marcador de miofibroblastos, y a-SMA, un marcador para miofibroblastos en un estado mas avanzado de diferenciacion.
Se realizo deteccion inmunofluorescente despues de 15 minutos de fijacion en solucion de paraformaldetudo al 4% preparada en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de un unico lavado con PBS. Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente. Las celulas se permeabilizaron incubando con tampon de bloqueo (suero de caballo normal al 10%, Triton X-100 al 0,025% y dimetilsulfoxido al 0,5% en PBS) durante 45 minutos. Posteriormente, las celulas se incubaron con anticuerpo monoclonal de raton anti-a-SMA (GeneTex Inc, San Antonio, TX; dilucion 1:100) o anticuerpo policlonal de cabra anti-desmina (Santa Cruz Biotechnology-clon C18; dilucion 1:100) en tampon de bloqueo durante 60 minutos. Despues de lavar tres veces con tampon de bloqueo, se realizo incubacion con anticuerpo secundario de cabra anti-raton conjugado con rodamina red-X (dilucion 1:250) o anticuerpo secundario de burro anti-cabra conjugado con FITC (dilucion 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 60 minutos, respectivamente. Se realizaron tres lavados con tampon de bloqueo, incubando con 5 pg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Molecular Probes, Leiden, Pafses Bajos) durante 5 minutos durante el primer lavado. Las muestras sin anticuerpo primario se usaron como controles negativos. Se realizo microscopfa fluorescente y de contraste de fase en un microscopio invertido Zeiss AXIOVERT 200 M.
Todas las celulas se tineron positivamente tanto para desmina como a-SMA despues de 10 dfas de cultivo, lo que demuestra aislamiento y purificacion satisfactorios de celulas SC.
3B - Sistemas de cultivo de MSC y SC
Se cocultivaron SC aisladas con MSC, se aislaron y se caracterizaron como se describe en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2, usando sistemas directos o indirectos, del siguiente modo.
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Sistema de cocultivo directo: se sembraron SC y MSC juntas a una relacion de 1:1 en cada pocillo de una placa de seis pocillos (Corning Costar, Acton, MA).
Sistema de cocultivo indirecto: se cocultivaron SC y MSC usando una configuracion Transwell. Se sembraron aproximadamente 1,0 x 105 SC en la camara inferior con 0-1,0 x 105 MSC sembradas en los insertos de membrana. Las MSC se remplazaron con celulas endoteliales de vena umbilical humana para los controles. Los cocultivos se mantuvieron en medio SC durante 4 dfas.
3C - Las MSC inhiben la sintesis de colageno en celulas estrelladas activadas
Se midio la secrecion por SC de peptido C de procolageno tipo-I (PIP), un fragmento peptidico escindido de colageno precursor tras secrecion extracelular, despues de cuatro dfas de cocultivo indirecto como una funcion de la relacion de MSC a SC, permaneciendo la cantidad de SC constante.
Se cuantifico la smtesis de colageno usando un ELISA para el peptido C de procolageno tipo-I (Takara-Bio Inc., Shiga, Japon). Despues del periodo de cocultivo, el inserto Transwell que contema MSC se retiro y se remplazo el medio en las SC con medio fresco. Veinticuatro horas despues, se recogio el medio y se midio la concentracion de peptido C de procolageno tipo-I por ELISA.
Los niveles de PIP secretados por SC activadas (101 ± 11 pg/106 celulasMa) estaban significativamente reducidos a una relacion MSC:SC de cocultivo de 1:10 (41 ± 18 pg/106 celulas/dfa; p = 0,0491), con una reduccion del 66% a una relacion 1:1 de cocultivo (34 ± 5 pg/106 celulas/dfa; p = 0,004).
No se observo secrecion reducida de PIP en cocultivos de SC con celulas endoteliales de vena umbilical humana (MVEC), lo que sugiere un efecto espedfico de MSC. Estos resultados sugieren que factores solubles liberados por MSC inhiben la sintesis de procolageno en SC activadas.
3D - Las MSC inducen apoptosis en SC activadas
La disminucion en la fibrosis hepatica observada despues del trasplante de MSC esta acompanada por una reduccion en la cantidad de celulas a-SMA+ (estrelladas activadas) observada por tincion inmunohistologica (Sakaida et al., Hepatology, 40:1304-1311, 2004; Fang et al., Transplantation, 78:83-88, 2004; Zhao et al., World J. Gastroenterol., 26:6167-6175, 2005). El mecanismo por el cual sucede la reduccion en la cantidad de celulas estrelladas activadas no esta claro; existen evidencias de capacidad proliferativa disminuida, una reversion a un fenotipo quiescente y de muerte de celulas apoptoticas. Por lo tanto, se examino el destino de las SC activadas cocultivadas indirectamente con MSC midiendo el grado de desdiferenciacion, proliferacion y muerte de SC.
La desdiferenciacion o reversion de nuevo de las SC a un estado quiescente se determino por analisis de la expresion de a-SMA, como se ha descrito anteriormente. La expresion de a-SMA no disminuyo despues de cocultivo. Esta observacion sugiere que las SC no revierten a un fenotipo quiescente en presencia de MSC.
Se evaluo la proliferacion de SC usando citometna de flujo para cuantificar la poblacion de SC que entra en la fase S del ciclo celular, medida por incorporacion de BrdU, despues de cocultivo con MSC.
En resumen, veinticuatro horas antes del analisis, se retiro el inserto de Transwell que contema MSC y los cultivos de SC se trataron con BrdU 10 pM. Despues se lavaron las celulas con PBS tres veces, se trataron con tripsina y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos. Para la fijacion, se resuspendio el sedimento en etanol al 70% durante 45 minutos a temperatura ambiente, se centrifugo y se lavo dos veces con PBS. Las celulas se incubaron con HCl 4 M durante 15 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con un tampon de bloqueo compuesto por PBS y FBS al 10% durante 10 minutos. Despues se incubaron las celulas con anticuerpo anti-BrdU conjugado con colorante Alexa-Fluor 488 durante 60 minutos a 37°C, se centrifugaron y se lavaron con PBS. Los controles negativos consistfan en celulas incubadas sin el anticuerpo. Las celulas marcadas de forma fluorescente se analizaron por citometna de flujo.
Como se muestra en la FIG. 1, se observo una disminucion, del 30 ± 9% al 15 ± 4%, en SC BrdU+ a una relacion 1:1 de cocultivo (p = 0,043).
La observacion microscopica de cocultivos indirectos indico una disminucion en la cantidad de SC que se adhieren a la placa de poliestireno. Para determinar si la apoptosis justificaba los cambios observados en la cantidad de SC despues del cocultivo, se uso tincion con Anexina-V-FITC y citometna de flujo.
En resumen, se determino la cuantificacion de apoptosis/necrosis celular usando el kit de Anexina-V FLUOS (Roche, Indianapolis, IN) segun las instrucciones del proveedor. Despues de cocultivo, se recuperaron las SC y se tineron con Anexina V durante 20 minutos y se analizaron usando citometna de flujo. SC privadas de suero sirvieron como control positivo para apoptosis. Los resultados se sincronizaron con las senales fluorescentes mayores de
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autofluorescencia de SC.
En SC cultivadas en solitario, hubo un nivel basal de apoptosis (25%). Usando el sistema de cocultivo indirecto con una relacion de 1:1, hubo un aumento aproximado de 2,5 veces en la apoptosis (55%). El cocultivo con fibroblastos provoco un nivel de apoptosis que fue similar a SC en solitario (32%), lo que demuestra que el efecto proapoptotico era espedfico de MSC.
Tabla 1: Apoptosis de SC activadas como una funcion de la cantidad de MSC
Relacion MSC:SC
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Media (%) Des. tip. (%) Valor p
0
12,24 18,47 16,23 15,87 15,68 2,54 -
1:103
18,37 34,16 22,24 14,95 22,43 8,37 0,1008
1:102
25,54 26,53 26,00 25,96 26,01 0,41 8,63 x 10'J
1:10
34,22 23,2 36,31 38,08 32,95 6,69 3,56 x 10'J
1:1
53,53 44,71 45,85 36,92 42,97 11,64 6,98 x 10'4
Como se muestra en la tabla 1, tambien sucedio muerte significativa de SC a relaciones de cocultivo de MSC:SC de 1:100 o mayores, lo que sugiere que pequenas cantidades de MSC pueden liberar potentes moleculas proapoptoticas que inducen muerte de Sc.
Tomados juntos, estos resultados in vitro implican que el trasplante de MSC in vivo puede mejorar o resolver la fibrosis hepatica a traves de un mecanismo que implica un efecto proapoptotico altamente selectivo sobre SC activadas.
3E - Las MSC secretan IL-10 y TNF-a
Se expusieron MSC a IL-1, IL-6, o factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), todos los cuales son citoquinas que se sabe que estan implicadas en fibrosis hepatica, durante 24 horas. La secrecion de protema IL-10 y los niveles de ARNm se determinaron por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y RT-PCR, respectivamente.
En resumen, se trataron MSC humanas con medio de expansion de MSC suplementado con 2,5 ng/ml de IL-6 (R&D Systems, Minneapolis, MN), 5 ng/ml de IL-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN), o 25 ng/ml de TNF-a (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante 24 horas. Las MSC cultivadas en medio de expansion sirvieron como control negativo. Despues del tratamiento, se recogieron las celulas y se analizaron para los cambios en la expresion genica.
Se determino la cuantificacion de IL-10 humana usando un ELISA segun las instrucciones del proveedor (Endogen, Rockford, IL). Los sobrenadantes se muestrearon despues de 48 horas de cocultivo y se almacenaron at -20°C hasta el analisis.
Se extrajo el ARN de 0,1-1,0 x 106 MSC usando el kit de purificacion de ARN NUCLEOSPIN (BD Biosciences, Palo Alto, CA) segun las instrucciones del fabricante. Se transcribio de forma inversa aproximadamente 1 |jg de ARNm total a ADNc usando el kit de RT-PCR ONESTEP (Qiagen, Valencia, CA) segun las instrucciones del fabricante y se amplifico en un termociclador Perkin Elmer-Cetus 480. Las condiciones de ciclado fueron: 1) 50°C durante 30 minutos; 2) 95°C durante 15 minutos; 3) 30 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto; y 4) una etapa de extension final a 72°C durante 10 minutos. Se amplifico IL-10 usando una combinacion de los oligonucleotidos con sentido y antisentido SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, para producir un producto de PCR de 364 pares de bases (pb). Se amplifico gliceraldettido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) usando una combinacion de los oligonucleotidos con sentido y antisentido SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, para producir un producto de PCR de 238 pb.
5'-AAGCCTGACCACGCTTTCTA-3' SEQ ID NO: 1 5'-GTAGAGCGGGGTTTCACCA-3' SEQ ID NO: 2 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3' SEQ ID NO: 3 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' SEQ ID NO: 4
Como se muestra en las FIG. 2-3, la exposicion a IL-6 (2,5 ng/ml) o TNF-a (25 ng/ml), citoquinas que estan significativamente elevadas en modelos de lesion hepatica, condujo a regulacion positiva tanto del ARNm de IL-10 (FIG. 2) como de la secrecion de protemas en el medio de cultivo (FIG. 3).
Como se muestra en la FIG. 4, se descubrio que IL-6 y TNF-a estaban ambos presentes en el sistema de cocultivo directo de SC/MSC, como se determina por ELISA, como se ha descrito anteriormente. Se secreto IL-6 por SC activadas (65 ± 1 pg/106 celulas/dfa), mientras que se secreto TNF-a por MSC (23 ± 1 pg/106 celulas/dfa).
Como se muestra en la FIG. 5, las SC activadas son capaces de inducir que las MSC secreten IL-10 cuando las celulas se cocultivan directamente a una relacion de 1:1 (54 pg/106 celulas/dfa). Estos niveles fueron similares a los niveles observados en la FIG. 6.
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Como se muestra en la FIG. 6, a una relacion de MSC:SC de al menos 1:10, las SC eran capaces de inducir expresion elevada de ARNm de IL-10 en MSC cuando se cultivaban indirectamente usando la configuracion Transwell descrita anteriormente. Usando el mismo sistema, la secrecion de protema IL-10 aumento hasta 32 ± 7 pg/106 celulasMa (p < 0,01).
Como se detecto tanto IL-6 como TNF-a en cocultivos de MSC-SC, se realizo neutralizacion por anticuerpos monoclonales para determinar el papel de IL-6 y TNF-a sobre la liberacion de IL-10 por MSC.
Se realizo la neutralizacion de citoquinas espedficas durante cocultivos indirectos. Para todos los experimentos de neutralizacion, la relacion de MSC a SC fue 1:1. Se diluyeron anticuerpo anti-IL-10 (BioLegend, San Diego, CA), TNF-a, (BioLegend, San Diego, CA), o HGF humana y anti-IL-6 de rata (Cell Sciences, Canton, MA) en medio SC basandose en las concentraciones de la mitad de inhibicion maxima dadas por el fabricante. Se anadio medio fresco con anticuerpos neutralizantes despues de 48 horas de cocultivo.
Como se muestra en la FIG. 7, se observo una disminucion significativa en la liberacion de IL-10 (48 ± 4 a 18 ± 1 pg/106 celulas/dfa; p < 0,01) cuando los cocultivos indirectos se trataron con 1250 ng/ml de anticuerpos neutralizante anti-IL-6. No se observo diferencia significativa despues del tratamiento con anticuerpo neutralizante anti-TNF-a. Tomados juntos, estos datos implican que las SC activadas secretan IL-6, que induce que las MSC secreten IL-10.
3F - Las MSC inhiben la sintesis de colageno por SC activadas y la proliferacion mediante senalizacion paracrina de IL-10 y TNF-a
Para determinar si la supresion previamente observada de la sintesis de colageno y la proliferacion en SC activadas, despues de cocultivo indirecto con MSC, estaba mediada por IL-10 y TNF-a derivados de MSC, se midieron los niveles de secrecion de PIP por SC activadas despues de cuatro dfas de cocultivo indirecto con MSC en presencia de anticuerpos neutralizantes contra IL-10, TNF-a, o ambos.
Se observo normalizacion parcial de la secrecion de PIP despues de neutralizacion de IL-10 o TNF-a a concentraciones de anticuerpos de 1000 ng/ml y 500 ug/ml o mayores, respectivamente. La neutralizacion tanto de IL-10 como de TNF-a en cocultivo condujo a una elevacion sinergica en los niveles de PIP desde 79 ± 9 pg/106 celulas/dfa hasta 215 ± 20 pg/106 celulas/dfa (p = 0,002) a concentraciones maximas de anticuerpos.
Se analizaron los efectos de TNF-a e IL-10 derivados de MSC sobre la proliferacion de SC activadas. La neutralizacion de los efectos de IL-10 en un cocultivo 1:1 condujo a una elevacion marginal en la cantidad de celulas BrdU-positivas, desde el 12% hasta el 15% a la concentracion maxima de anticuerpos. La neutralizacion de TNF-a provoco un efecto mas significativo sobre la proliferacion con un aumento en las celulas BrdU-positivas desde el 13% hasta el 33% (p = 0,0197). La neutralizacion de ambas citoquinas condujo al aumento mas significativo de la poblacion en proliferacion (del 13% hasta el 44%).
Estos datos sugieren una sinergia entre las rutas de senalizacion de TNF-a e IL-10 (p = 0,009).
3G - El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) derivado de MSC induce la apoptosis en SC activadas
Dada la observacion de que una cantidad relativamente pequena MSC podna causar apoptosis de SC, se analizaron sobrenadantes de cocultivo indirecto para potentes senales pro-apoptoticas.
Como se muestra en la FIG. 8, se detecto una cantidad considerable de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en mono- y cocultivos y se produjo a niveles aproximadamente equivalentes tanto por SC como por MSC.
Tabla 2: Apoptosis de SC activadas como una funcion de la neutralizacion de HGF
Anti-HGF (pg ml'1)
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Media (%) Des. tip. (%) Valor p
0
53,53 44,71 45,85 36,92 42,97 11,64 -
0,05
43,66 22,11 25,67 21,5 28,24 10,45 0,2056
0,5
39,32 11,87 19,26 23,94 23,59 11,60 0,1136
1,5
18,47 21,17 15,9 17,25 18,20 2,24 0,0390
5,0
13,81 17,76 14,38 - 15,32 2,14 0,0413
Como se muestra en la tabla 2, se observo una disminucion en la apoptosis como una funcion del anticuerpo neutralizante contra HGF. Esta disminucion en la apoptosis no sucedio cuando los cultivos se incubaban con un anticuerpo de control sin especificidad por HGF. Estos datos apoyan un papel para HGF derivado de MSC en la aceleracion de la tasa de apoptosis de SC.
En resumen, los datos presentados en el Ejemplo 3 demuestran que las MSC son capaces de inhibir la funcion proliferativa y fibrogenica de SC activadas de un modo paracrino y como una funcion de la cantidad de MSC. Esta
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inhibicion esta causada por IL-10 y TNF-a derivados de MSC, que actuan de forma sinergica. La secrecion de IL-10 por MSC es una respuesta dinamica a la secrecion de IL-6 por SC activadas. La secrecion de IL-10 por MSC en respuesta a TNF-a se observo despues de estimulacion exogena, pero no durante mono- o cocultivo. Este resultado refleja, probablemente, los altos niveles de estimulacion usados in vitro (por ejemplo, aproximadamente 25 ng ml-1) en comparacion con los niveles bajos medidos en cocultivo (por ejemplo, aproximadamente 2,5 ng ml-1). Esta observacion implica fuertemente que es necesaria una concentracion umbral de TNF-a para inducir la expresion de IL-10 en MSC. IL-6 y TNF-a tambien aumentan la senalizacion factor nuclear (NF)-kappaB en diversos tipos celulares. Por tanto, NF-kappaB tambien puede desempenar un papel en la expresion de citoquinas de MSC durante la inflamacion.
Las MSC tambien indujeron apoptosis en SC activadas, que esta mediada por HGF. El efecto de HGF e IL-10 derivados de MSC es, probablemente, suplementario a la senalizacion autocrina de estas protemas en SC. Los datos descritos anteriormente se resumen en la FIG. 9.
Estos estudios demuestran, por primera vez, que las MSC actuan a traves de multiples mecanismos para coordinar una respuesta dinamica, integrada a la inflamacion, particularmente fibrosis. Mecanismo inmunoprotectores similares tambien pueden influir en el fenotipo de los hepatocitos, celulas de Kupffer, celulas endoteliales sinusoidales, y celulas inmunitarias que se infiltran en el Imgado durante la inflamacion.
Ejemplo 4 - Terapia acelular basada en MSC - Generacion de medio condicionado de MSC (MSC-CM) acelular Este ejemplo demuestra la produccion de una composicion de MSC-CM.
Se aislaron las MSC y se caracterizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1 y Ejemplo 2. En algunas realizaciones, las MSC se caracterizaron basandose en la deteccion de marcadores expresados en superficie celular (por ejemplo, CD14-, CD105+, CD34-, CD45-, CD106+ y CD44+). Las celulas que no satisficieron el criterio de caracterizacion descrito en el Ejemplo 2 se descartaron. En algunas realizaciones, se proporcionaron MSC humanas por el Tulane Center for Gene Therapy.
Se genero una composicion de MSC-CM cultivando MSC hasta una densidad celular maxima del 70-80% de confluencia. No se permitio que las celulas experimentaran diferenciacion. En otras palabras, las MSC se mantuvieron en un estado indiferenciado. En algunas realizaciones, se controlo la diferenciacion de las MSC usando el criterio de caracterizacion descrito en el Ejemplo 2. En algunas realizaciones, una confluencia del 70-80% corresponde a 1 x 106 MSC por matraz de calidad de cultivo tisular de 175 cm2. En algunas realizaciones, se genero una composicion de MSC-CM usando 2 x 106 MSC, que se obtuvieron usando dos matraces de calidad de cultivo tisular de 175 cm2 conteniendo cada matraz 1 x 106 celulas.
El MSC-CM se preparo del siguiente modo;
(1) Se lavaron minuciosamente MSC al 70-80% confluentes con solucion salina tamponada con fosfato (PBS);
(2) Se cultivaron las MSC de (1) en 15 ml de DMEM sin suero suplementado con albumina serica bovina al 0,05% para evitar la agregacion de protemas;
(3) Las MSC se cultivaron durante 24 horas;
(4) Se recogio el medio de cultivo de (3); y
(5) El medio de cultivo recogido se concentro a factor 25 (por ejemplo, 25 veces) usando ultrafiltracion con un punto de corte de 3 kD.
La composicion de MSC-CM se concentro usando unidades de ultrafiltracion (Amicon Ultra-PL 3, Millipore, Bedford, MA, EE.UU.).
La composicion de MSC-CM se fracciono en fracciones de union a heparina y no de union a heparina. Para los experimentos de fraccionamiento, se paso una composicion de MSC-CM concentrada sobre una columna de heparina-agarosa segun las instrucciones de proveedor. En resumen, las columnas se cebaron con 10 equivalentes de tampon de union (fosfato sodico 10 mM, pH 7,0). La muestra se aplico, seguida de 10 volumenes equivalentes de tampon de union, que se considero como la fraccion no unida a heparina. La fraccion unida se eluyo con 10 volumenes de tampon de union suplementado con NaCl 1 M. Se recogieron por separado las fracciones de flujo continuo y eluidas. Las fracciones de flujo continuo y eluidas se recogieron y se reconcentraron, como se ha descrito anteriormente.
Eiemplo 5 - Induccion de FHF experimental y regimenes de tratamiento
Este ejemplo demuestra la induccion de FHF en un modelo animal experimental.
Se ha informado de la induccion de insuficiencia hepatica fulminante (FHF) previamente (Shinoda et al., J. Surg. Res., 137:130-140, 2007). En resumen, se usaron ratas Sprague-Dawley macho que pesaban 250-300 g para los experimentos de FHF. Se aislaron hepatocitos de ratas Lewis hembra de 150-200 g. Todos los animales (Charles
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River Laboratories, Boston, MA) se manipularon de acuerdo con las directrices expuestas por el Committee on Laboratory Resources, National Institutes of Health.
Se indujo FHF usando dos inyecciones de Gal-N (Sigma Aldrich, St Louis, MO), recien disuelto en solucion de NaCl al 0,9% y se administro i.p. con un intervalo de 12 horas. Se eligieron diferentes dosificaciones de Gal-N para analisis de tejidos (0,6 g/kg) y estudios de supervivencia (1,2 g/kg), basandose en los estudios previos. Cuando era apropiado, veinticuatro horas despues de la induccion de FHF, se inyectaron 0,9 ml de MSC-CM o solucion de NaCl al 0,9% (control de vefnculo) a traves de la vena del pene bajo anestesia con ketamina/xilazina (110 mg/kg y 0,4 mg/kg i.p. respectivamente). Los animales que recibieron 0,6 g/kg se sacrificaron 36 horas despues para la recogida de tejido. La supervivencia se controlo cada 12 horas durante 28 dfas.
Ejemplo 6 - La terapia con MSC-CM inhibe el cambio hepatico tosco
Este ejemplo demostro un efecto hepatoprotector de MSC-CM.
La FHF inducida por Gal-N esta acompanada tfpicamente por cambios caractensticos en el aspecto tosco del fngado, que consiste en palidez aumentada y una consistencia blanda y encogida.
Se indujo FHF en ratas Sprague-Dawley usando Gal-N, como se ha descrito en el Ejemplo 5. Los animales se trataron con infusiones sistemicas de MSC-CM concentrado o con vefnculo (control). Se uso una dosis subletal de Gal-N (0,6 g/kg) para el analisis de tejidos 36 horas despues del tratamiento y se administraron 1,2 g/kg de Gal-N para estudios de supervivencia. Se analizaron las histologfas hepaticas del siguiente modo.
Se seccionaron muestras de fngado incrustadas en parafina, fijadas en formalina a 4 pm y se tineron con hematoxilina y eosina (H&E). La evaluacion histologica se realizo por un observador no informado, que valoro las secciones hepaticas usando los siguientes criterios: "0" para histologfa normal, "1" para muerte e inflamacion hepatocelular minoritaria, "2" para necrosis en parches ampliamente distribuida con inflamacion, "3" para alteracion lobular completa y necrosis difusa de hepatocitos con inflamacion panlobular, y "4" para mortalidad.
En este ensayo, uno de cuatro animales de control murio antes de sacrificar a los animales, confirmando que el grado de lesion en el modelo usado podna ser rapidamente letal. No se realizo necropsia en este animal, pero basandonos en nuestra experiencia previa con este modelo, esperamos que el aspecto tosco fuera anormal.
Dos de los tres fngados de control restantes eran blandos y estaban encogidos con un aspecto palido anormal y una superficie de textura rugosa. El fngado de una rata tratada con vefnculo parecfa normal. En contraste, ninguno de los 4 hfgados tratados con MSC-CM mostraron cambios patologicos toscos. En contraste con los fngados de control afectados, los fngados de animales tratados con MSC-CM eran mas grandes con coloracion oscura y una superficie brillante tfpica de un fngado sano.
Como se muestra en la FIG. 10, 2 de 16 animales de control (12,5%) sobrevivieron al periodo completo de observacion. Todas las demas ratas tratadas con vefnculo (87,5%) murieron en 60 horas. En el grupo de MSC-CM, 2 de 8 animales (25%) murieron en las primeras 60 horas. Cuatro (50%) sobrevivieron al periodo de 28 dfas de estudio. Globalmente, el tratamiento con MSC-CM mejoro significativamente la supervivencia de FHF inducida por Gal-N (p = 0,017).
Ejemplo 7- El tratamiento con CM regula negativamente la informacion sistemica
La lesion hepatica grave (por ejemplo, despues de tratamiento con Gal-N) puede provocar una respuesta inflamatoria local y sistemica que finalmente puede conducir a insuficiencia multiorganica y muerte. Para investigar la respuesta inflamatoria sistemica en animales expuestos a Gal-N, se recogieron muestras de suero de animales Gal- N 36 horas despues de tratamiento con una inyeccion sistemica de MSC-CM (n = 4) o vefnculo (n = 3) y se analizaron por ELlSA, del siguiente modo.
Se centrifugaron las muestras de sangre a 12.000 rpm durante 15 min en una microcentnfuga y se recogio el suero para analisis. La cuantificacion de IL-1p, TNF-a, IL-6, IL-2, antagonista del receptor de interleuquina-1 (IL-1ra) e IL- 10 de rata se determino usando ELISA segun las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN).
Como se muestra en las FIG. 11A-F, el analisis de los niveles sistemicos de citoquinas revelo una disminucion no significativa para IL-1p (p = 0,054), pero niveles significativamente disminuidos de TNF-a (64%) (p = 0,0002) e IL-6 (54%) (p = 0,0002), todas las cuales son citoquinas proinflamatorias que se sabe que estan reguladas positivamente despues de lesion hepatica. Los niveles de IL-2 no cambiaron (p = 0,43). En contraste, la concentracion de IL-1ra soluble fue un 87% inferior en animales tratados con MSC-CM (p = 0,0002). Los niveles de la citoquina anti- inflamatoria IL-10 estaban aumentados 4 veces en animales tratados con MSC-CM (p = 0,032).
Estos estudios muestran que la infusion de sobrenadantes de MSC regula negativamente la inflamacion sistemica tipicamente asociada con FHF.
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Ejemplo 8 - MSC-CM mejora la patoloaia hepatica
Treinta y seis horas despues de tratamiento sistemico con MSC-CM concentrado o vefuculo, se analizaron muestras de l^gado de ratas Gal-N por tincion con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones incrustadas en parafina.
La evaluacion microscopica de secciones hepaticas tenidas con H&E revelo profunda muerte hepatocelular con vacuolizacion citoplasmatica, infiltracion panlobular de leucocitos mononucleares y deformacion grave de la arquitectura tisular en animales tratados con vefuculo. En contraste, los fngados de animales tratados con MSC-CM mostraron solamente infiltracion minoritaria de celulas inmunitarias periportales con edema y deposicion de fibrina, caractenstica de la reparacion de tejidos.
La FIG. 12A muestra un examen histologico semi-cuantitativo que confirmo diferencias significativas entre los grupos. El valor promedio en el grupo de MSC-CM fue 1,5 ± 0,6 y 3,0 ± 0,8 para animales tratados con vefuculo (p = 0,024).
La cuantificacion de celulas inmunitarias infiltrantes se realizo usando el software ImageJ disponible al publico (rsb.info.nih.gov/ij/). Como se muestra en la FIG. 12B, se observo una disminucion del 58% en la cantidad de celulas inmunitarias infiltrantes despues de infusion con MSC-CM (33 ± 9,3 en comparacion con 84 ± 37 en controles) (p = 0,004).
Estos resultados demuestran que la terapia con MSC-CM inhibe el dano hepatico y la infiltracion de celulas inmunitarias en FHF inducida por Gal-N.
Ejemplo 9 - MSC-CM inhibe la apoptosis hepatocelular in vivo
Se analizo la apoptosis hepatocelular de acuerdo con los siguientes procedimientos.
Se desparafinizaron secciones de cuatro micrometres de grosor de tejido hepatico fijado en formalina y se rehidrataron despues de cocerlas a 60°C durante 1 hora. Se bloqueo la actividad peroxidasa usando peroxido de hidrogeno al 3% en etanol durante 15 minutos.
Se realizo marcaje de extremo libre por desoxinucleotidil transferasa terminal Biotina-dUTP (TUNEL) usando el kit de deteccion de apoptosis in situ con peroxidasa APOPTAG (Chemicon International, Temecula, CA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las secciones se revelaron usando 3,3'-diaminobencidina y tincion de contraste con hematoxilina de Gill.
La cuantificacion de reactividad a TUNEL y las celulas inmunitarias infiltrantes se realizo usando el software ImageJ disponible al publico (rsb.info.nih.gov/ij/). Se analizaron diez imagenes aleatorias 40x por animal. Las partreulas se cuantificaron usando criterios apropiados para los tamanos correspondientes de los nucleos. Se analizaron las partreulas de area mayor de 700 pm2 para identificar espedficamente hepatocitos de celulas no del parenquima e inflamatorias.
Para determinar si la infusion de MSC-CM disminuye la muerte de celulas apoptoticas, se determino la cantidad de nucleos reactivos a TUNEL en secciones hepaticas. En secciones de ratas tratadas con vehreulo, se observaron muchos nucleos apoptoticos. En contraste, habfa pocos nucleos TUNEL-positivos presentes despues de tratamiento con MSC-CM. La cuantificacion revelo una reduccion del 90% en nucleos TUNEL-positivos (8,3 ± 12/campo de vision) cuando se comparaban con animales de control (81 ± 52) (p = 0,009). Estas observaciones confirman que la terapia con MSC-CM reduce de forma eficaz la muerte hepatocelular en este modelo de lesion hepatica aguda.
Ejemplo 10 - MSC-CM inhibe la apoptosis de hepatocitos in vitro
La inhibicion de la muerte hepatocelular por terapia con MSC-CM in vivo puede ser un efecto directo de moleculas troficas con conservan las celulas hepaticas, o un efecto indirecto, por ejemplo, a traves de la inhibicion de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, se ensayo la capacidad de MSC-CM de inhibir directamente la apoptosis en hepatocitos cultivados, del siguiente modo.
Se aislaron hepatocitos primarios de rata usando un procedimiento de perfusion de colagenasa de dos etapas como se ha descrito previamente (Dunn et al., FASEB J., 3:174-177, 1989). El rendimiento fue, de forma rutinaria, de 200300 millones de hepatocitos con viabilidad mayor del 90% determinada por exclusion de azul tripan. El medio de cultivo de hepatocitos consistfa en DMEM suplementado con FBS al 10%, 14 ng/ml de glucagon, 0,5 U/ml de insulina, 20 ng/ml de factor de crecimiento epidermico (EGF), 7,5 pg/ml de hidrocortisona, 200 pg/ml de estreptomicina y 200 U/ml de penicilina. Las condiciones de cultivo fueron medio de hepatocitos para experimentos de control; medio de hepatocitos mezclado a una relacion 50:1 con el MSC-CM concentrado 25 veces (2% de MSC- CM); y medio de hepatocitos mezclado a una relacion 12,5:1 para un 8% de MSC-CM.
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Se cultivaron hepatocitos primarios de rata aislados como se ha descrito anteriormente durante un total de 7 d^as en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 x 105 celulas/cm2 en una configuracion de tipo sandwich en gel de colageno. Se indujo la apoptosis usando Actinomicina D (1 hora) y TNF-a (8 horas). Durante la exposicion a TNF-a, los hepatocitos se cultivaron en medio de hepatocitos solamente o medio de hepatocitos suplementado con un 2% u 8% de MSC-CM concentrado 25x. Los hepatocitos se tineron usando un ensayo fluorescente Live Dead (Molecular Probes). La muerte celular se cuantifico usando analisis de imagenes digitales de 4 imagenes por pocillo. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Como se muestra en la FIG. 14, se observo un aumento del 22% en la fraccion de celulas viables cuando el medio de hepatocitos se suplementaba con un 2% de MSC-CM (46% viable en comparacion con 38% viable en cultivos de control) (p = 0,005). No se observo aumento significativo en la viabilidad de los hepatocitos con un 8% de MSC-CM (43%) (p = 0,15). Estos experimentos demuestran que el MSC-CM a bajo nivel tiene un efecto anti-apoptotico directo sobre los hepatocitos. Por lo tanto, MSC-CM es directamente hepatoprotector. En otras palabras, MSC-CM tiene un efecto conservador directo sobre los hepatocitos.
La recuperacion/proteccion de la apoptosis hepatocelular fue mas prominente in vivo que in vitro. Esta observacion se debe probablemente a inhibicion local y sistemica de la respuesta apoptotica.
Ejemplo 11 - MSC-CM potencia la regeneracion hepatica
La estimulacion de programas de reparacion endogena tambien es un mecanismo potencial del efecto terapeutico inducido por MSC-CM descrito anteriormente.
Se analizaron muestras de hngado de ratas Gal-N 36 horas despues de la induccion de FHF con MSC-CM o vehfculo. Se realizo tincion con antfgeno nuclear de celulas en proliferacion (PCNA) tratando las secciones con tampon citrato 10 mM a pH 6,0 usando un horno digital de presion. Posteriormente, las secciones se bloquearon con suero de caballo al 1,5% durante 15 minutos y se incubaron con anticuerpo monoclonal de raton anti-pCNA (Clon 24, BD Transduction Laboratories, San Jose, CA) a una dilucion 1:500 durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detecto el anticuerpo primario usando el kit Vectastain Elite ABC (Vector laboratories, Burlington, CA). Las secciones se revelaron usando 3,3'-diaminobencidina y se tineron con contraste con hematoxilina de Gill.
Se cuantificaron las celulas reactivas a PCNA y se compararon con animales tratados con vehfculo. Como se muestra en la FIG. 15, se observaron 3 veces mas celulas PCNA-reactivas en hfgados tratados con MSC-CM que hfgados de control.
Se realizaron perfiles de expresion de ARNm de 10 genes que se sabe que estan regulados positivamente durante la regeneracion hepatica usando RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 3E. Se muestran combinaciones de oligonucleotidos directos e inversos en la tabla 3.
Tabla 3: Oligonucleotidos de RT-PCR
Gen
SEQ ID NO: Directo (5'-3') SEQ ID NO: Inverso (5'-3') Amplicon (pb)
OSM
5 caactgggtgctttcagaca 6 aacccatgaagcgatggtag 253
AR
7 gtctttgtctccgccgtaag 8 ctgaacttctggagccttcg 244
TGF-a
9 gcaagttctgcctgttcctc 10 gcactgaaccaacccacttt 161
HGF
11 cgagctatcgcggtaaagac 12 tgtagctttcaccgttgcag 165
TNF
13 actcccagaaaagcaagcaa 14 cgcaggaatgagaagagg 211
EGF
15 acaccgaaggtggctatgtc 16 tagagtcagggcaaggcagt 195
IL-6
17 ccgeagaggaacttcacag 18 cagaattgccattgcacaac 134
SCF
19 caaaactggtggcgaatctt 20 gccacgaggtcatccactat 217
HG-EBF
21 gcctcctgtaattgctctgc 22 gccaaaaatcctggagcata 207
TIMP3
23 tgtacaccccagcctctttc 24 cttctcgccaagacctcaac 182
18s
25 atgacatcaagaaggtggtg 26 cataccaggaaatgagcttg 177
Se observaron bandas visiblemente mas fuertes para cada uno de los genes analizados. Como se muestra en la FIG. 16, esta observacion se confirmo usando analisis cuantitativo. Los aumentos variaron de 4 veces a 27 veces.
Estos resultados demuestran que la administracion de factores solubles derivados de MSC potencia los programas de regeneracion hepatica durante FHF.
Ejemplo 12 - MSC-CM estimula la proliferacion de hepatocitos in vitro
La duplicacion de hepatocitos, un componente principal de la regeneracion hepatica, esta regulada por una interaccion compleja de senales paracrinas y endocrinas que implican tipos de celulas no del parenquima del hngado, asf como organos extra-hepaticos. Para determinar si los factores derivados de MSC pueden potenciar directamente la replicacion de hepatocitos, se exploro el efecto de MSC-CM sobre la proliferacion in vitro de
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hepatocitos primarios aislados.
Se aislaron hepatocitos primarios de rata como se ha descrito en el Ejemplo 9. Los hepatocitos posteriormente se sembraron a una baja densidad (1,25 x 103 celulas/cm2) en una capa de alimentacion de fibroblastos 3T3 J2 (8 x 104 celulas/cm2) previamente expuesta a 12 pg/ml de mitomicina-C durante 2,5 horas para detener el crecimiento. Se permitio que los hepatocitos proliferaran con cambios diarios de medio. El medio de cultivo de hepatocitos se describe en el Ejemplo 9.
Las celulas se cultivaron con bromodesoxiuridina (BrdU; Sigma) 10 pM. Despues de 48 horas, los cultivos se fijaron en etanol al 70% durante 45 minutos y se trataron con HCl 4 N y TRITONX-10 al 0,2%. Las celulas despues se incubaron en tampon de bloqueo durante 30 minutos y se incubaron durante 60 minutos con anticuerpo anti-BrdU- Alex594 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y de conejo anti-albumina de rata (ICN Pharmaceuticals, Aurora, OH) a 37°C, seguido de anti-IgG de conejo conjugado con FITC (ICN Pharmaceuticals) a temperatura ambiente. Las celulas BrdU positivas en cada colonia de hepatocitos se contaron en imagenes de microscopfa de fluorescencia. Se determino el contenido de albumina en muestras de sobrenadante mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando albumina de rata purificada y un anticuerpo anti-albumina conjugado con peroxidasa (MP Biomedicals, Aurora, OH). Se determino el contenido de urea con un kit disponible en el mercado (StanBio Laboratory, Boerne, TX) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
La proliferacion de colonias de hepatocitos de rata sobre una capa de alimentacion de fibroblastos 3T3 de crecimiento inhibido se visualizo por tincion doble de inmunofluorescencia para BrdU y albumina. Como se muestra en la FIG. 17A, con suplementacion de un 2% de MSC-CM (representada en el grafico como 2), se observo un aumento del 79% en los hepatocitos BrdU-positivos (9 3± 12 por campo de vision con MSC-CM frente a 52 ± 14 en cultivos de control) (p = 0,001). Cuando el medio se suplemento con un 8% de MSC-CM (mostrado en el grafico como "8"), no se midio aumento significativo (59 ± 14 BrdU) (p = 0,37).
Como se muestra en la FIG. 17B, en paralelo a estos hallazgos, la cantidad total de albumina secretada y urea sintetizada por pocillo estuvo aumentada en cultivos suplementados con un 2% de MSC-CM. Los niveles de albumina fueron de 29 ± 2,4 pg/mlMa, en comparacion con 20 ± 1,2 pg/mlMa en condiciones de control (p = 0,006). No se observo diferencia significativa en comparacion con el control en condiciones de un 8% de MSC-CM (23 ± 2,2 pg/mlMa) (p = 0,14).
Como se muestra en la FIG. 17C, la smtesis de urea se desplazo de 69 ± 8,1 pg/mlMa en los cultivos de control a 90 ± 10 pg/mlMa en condiciones de un 2% de MSC-CM (p = 0,019), pero no se altero significativamente en presencia de un 8% de MSC-CM (53,1 pg/mlMa) (p = 0,063).
En general, por lo tanto, los marcadores de proliferacion y funcion de hepatocitos estaban significativamente mas elevados en presencia de un 2% de MSC-CM in vitro. Aunque un 8% de MSC-CM tambien tuvo un efecto sobre la proliferacion y funcion de hepatocitos in vitro, no era tan pronunciado como los niveles observados con un 2% de MSC-CM.
Los datos presentados en este documento demuestran claramente que MSC-CM es capaz de aumentar la proliferacion de hepatocitos. MSC-CM aumento la cantidad de celulas en proliferacion al menos 3 veces en el ligado lesionado, en regeneracion. Las celulas MSC no son necesarias para las observaciones descritas anteriormente. Los factores secretados contenidos en MSC-CM son suficientes en la proteccion de los hepatocitos de la apoptosis y la promocion de la proliferacion de hepatocitos. Por tanto, la infusion sistemica de MSC-CM representa una estrategia eficaz para la terapia con MSC.
Ejemplo 13 - Factores derivados de MSC revierten la insuficiencia hepatica fulminante
Este ejemplo demuestra que moleculas derivadas de MSC proporcionan beneficios de supervivencia contra la perdida de celulas del parenquima, donde la perdida de celulas esta integrada con una respuesta inmunitaria local y sistemica, despues de administracion en bolo intravenoso de MSC-CM y/o perfusion extracorporea con un biorreactor que contiene MSC (por ejemplo, MSC indiferenciadas).
Se administro por via intraperitoneal a ratas Sprague-Dawley un total de dos inyecciones de 1,2 g/kg de una hepatotoxina, D-galactosamina (Gal-N), cada una separada por 12 horas, como se ha descrito en el Ejemplo 5.
Los animales se trataron 24 horas despues con inyecciones intravenosas en la vena del pene de (1) MSC completas o (2) lisados de MSC. Se aislaron las MSC y se caracterizaron como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2.
Se administro un total de 2 x 106 a cada sujeto para terapia con MSC de celulas completas. El volumen de MSC completas fue de 500 pl.
Los lisados celulares se prepararon por sonicacion. La dosis de celulas sonicadas administrada fue de 2 x 106 celulas por sujeto. El volumen de lisado de MSC fue de 500 pl. A diferencia de MSC-CM, el lisado de MSC no esta
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concentrado.
Se administro veldculo (PBS) y lisado celular de fibroblastos NIH 3T3-J2 como controles. El volumen de cada control fue de 500 pl.
Como se muestra en la FIG. 18, no se observo beneficio significativo despues de la infusion intravenosa de 2 x 106 MSC humanas. Esta observacion se debe muy probablemente a un mal implante, entrampamiento en el lecho capilar alveolar, y/o rechazo inmunologico de las celulas. En contraste, el tratamiento con lisados celulares, derivado de la misma masa celular usada para el trasplante, mostro una tendencia de supervivencia aumentada en comparacion con controles de vedculo (P < 0,47) y lisado de fibroblastos (P < 0,36).
Ejemplo 14 - Componentes derivados de MSC revierten la FHF
Los experimentos descritos en este ejemplo demuestran que componentes derivados de MSC promueven la supervivencia en modelos de FHF y que este efecto no es espedfico de especie, por ejemplo, el potencial terapeutico de MSC-CM no es espedfico de especie.
Como se muestra en la FIG. 19A, un estudio longitudinal usando MSC-CM de 2 x 106 MSC humanas revelo un beneficio de supervivencia distinto en comparacion con medio concentrado de vedculo (P < 0,032) y fibroblastos (P < 0,026).
Se controlo la supervivencia de 72 horas de ratas con FHF inducida como una funcion de la masa de MSC de la que se recogio el MSC-CM. Como se muestra en la FIG. 19B, el MSC-CM fue mas eficaz cuando derivada de una masa de MSC de 2 x 106 celulas.
La observacion de que lisados y sobrenadantes de MSC xenogenicas disminman la mortalidad animal sugiere que estos factores pueden cruzar las barreras de especie. Por tanto, el potencial terapeutico de MSC-CM no es espedfico de especie.
Ejemplo 15 - La funcion metabolica y secretora combinada en MSC-EB proporciona hepatoproteccion y beneficio de supervivencia
Se revelo que un biorreactor extracorporeo con MSC (MSC-EB) combina la eficacia de celulas completas MSC y MSC-CM en un unico dispositivo.
Se informo previamente del funcionamiento de dispositivos extracorporeos (Shinoda et al., J. Surg. Res., 137:130140, 2007). En resumen, se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho que pesaban entre 280 y 370 gramos usando inyecciones intraperitoneales de ketamina y xilazina a 110 y 0,4 mg/kg, respectivamente. Se canularon la arteria carotida izquierda y la vena yugular derecha y el animal se puso en una jaula metabolica. Veinticuatro horas despues, se inyectaron i.p. 1,2 g/kg de Gal-N recien disuelto en solucion salina fisiologica y ajustado a pH 7,3 con NaOH 1 N, seguido de una segunda inyeccion igual 12 horas despues, como se ha descrito en el Ejemplo 5. Veinticuatro horas despues de la primera inyeccion de Gal-N, se conectaron las lmeas arterial y venosa a un circuito extracorporeo. Se separo el plasma usando un separador de plasma (MicroKros, tamano de poro de 0,2 micrometres). El plasma se perfundio a traves del biorreactor de placa plana de policarbonato y posteriormente se reunio con los componentes celulares de la sangre y se devolvio al animal. El biorreactor extracorporeo se hizo funcionar durante 10 horas. Los animales que murieron durante el funcionamiento del reactor y no lograron recibir el tratamiento adecuado (MSC-EB, N = 3 y Fibroblasto-EB, N = 2) se censuraron del analisis. Se controlo la supervivencia de los animales cada 12 horas. Se analizo el plasma o la sangre completa para biomarcadores de lesion hepatica (por ejemplo, alanina aminotransferasa (ALT) en suero, aspartato aminotransferasa (AST) en suero) usando un ensayo metabolico microfluidic (Picollo, Abaxis, Union City, CA). Se muestra una representacion esquematica ejemplar de un circuito extracorporeo en la FIG. 20.
Los animales se trataron 24 horas despues de la induccion de FHF con un MSC humana-EB conectado a la circulacion sistemica del animal. Biorreactores sembrados con fibroblastos (fibroblasto-EB) y biorreactores acelulares (acelular-EB) sirvieron como controles. Despues de 10 horas de perfusion extracorporea, se animales se quitaron del soporte asistido y se controlaron para la supervivencia. Se obtuvo el plasma al inicio de, y 24 horas despues de, el tratamiento con biorreactor y se analizo para la liberacion de enzimas de hepatocitos. Como se muestra en las FIG. 21A-B, las serologfas hepaticas, incluyendo aspartato aminotransferasa (AST; P < 0,02) y alanina aminotransferasa (ALT; P < 0,001) se mejoraron en animales tratados con el MSC-EB. Estos datos demuestran un efecto hepatoprotector de la terapia con el dispositivo como se muestra por la reduccion en los marcadores bioqmmicos de muerte de hepatocitos. Como se muestra en la FIG. 21C, el 71% de los animales tratados con el MSC-EB sobrevivieron, en comparacion con el 14% en los controles tanto acelular (P < 0,037) como de fibroblastos (P < 0,05). La tabla 5 muestra las serologfas hepaticas despues de tratamiento con MSC-EB.
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Tabla 5: Las serologias hepaticas estan mejoradas despues de tratamiento con MSC-EB
Parametro
MSC Pre MSC-EB Post MSC-EB (24 h) Post MSC-EB (48 h) % de cambio
TB (mg/dl)
- 0,73 ± 0,75 0,9 N/A +23
+
0,76 ± 0,26 1,16 ± 0,83 1,2 ± 0,84 +58
AST (U/l)
- 2007 ± 837,4 1999 N/A 0
+
1513,2 ± 513,2 888 ± 272,6 940,8 ± 330,53 -41
ALT (U/l)
- 1222,33 ± 710,4 1233 N/A 0
+
859,2 ± 125,7 168 ± 61,9 358,8 ± 198,4 -80
ALP (U/l)
- 216 ± 39,1 106 N/A -51
+
192,8 ±41 91,2 ±23,2 98,4 ±24,6 -53
Los datos se expresan como la media ± error tipico de la media (SEM). El porcentaje de cambio se refiere a post MSC-EB (24 horas) respecto a pre MSC-EB. (-) es EB sin MSC. N = 5 para (-). N = 3 para (+). No hay datos adquiridos debido a la mortalidad (N/A).
Como se muestra en la tabla 5, las serologfas hepaticas se mejoraron despues de tratamiento con MSC-EB.
Ejemplo 16 - La terapia con MSC-CM inhibe la invasion panlobular de leucocitos, la duplicacion del conducto biliar, y la muerte hepatocelular
Se evaluaron los cambios histopatologicos post MSC-CM usando un regimen subletal de Gal-N (0,6 g/kg) para inducir lesion hepatica aguda, asegurando al mismo tiempo la supervivencia en el grupo tratado de control para la comparacion. Debe apreciarse que a esta dosis de Gal-N, apareda mortalidad en un grupo tratado con vehnculo (N = 1). Esto confirma que el grado de lesion en este modelo aun puede ser letal. Las ratas lesionadas con Gal-N se trataron con vehnculo (N = 4) o MSC-CM (N = 4) 24 horas despues de la lesion y se recogieron sus hngados 36 horas despues de ello para analisis patologico.
Se recogio tejido hepatico de ratas inducidas con un regimen subletal de Gal-N (0,6 g/kg), 36 horas despues de tratamiento con MSC-CM. El tejido se fijo en formalina tamponada al 10%, se incorporo en parafina, se secciono a un grosor de 6 pm, y se tino con hematoxilina y eosina.
La evaluacion microscopica del tejido hepatico de las ratas tratadas con vehnculo revelo una profunda apoptosis hepatocelular, duplicacion del conducto biliar e infiltracion panlobular de leucocitos mononucleares con vacuolizacion citoplasmatica y distorsion grave de la arquitectura tisular. Las ratas tratadas con MSC-CM no mostraron signos de inflamacion diseminada, aunque se observo infiltracion periportal minoritaria con edema y deposicion de fibrina coherente con la reparacion del tejido.
La histopatologfa se valoro usando los criterios descritos en el Ejemplo 6 ("0" para histologfa normal, "1" para muerte e inflamacion hepatocelular minoritaria, "2" para necrosis en parches ampliamente distribuida con inflamacion, "3" para alteracion lobular completa y necrosis difusa de hepatocitos con inflamacion panlobular, y "4" para mortalidad). Claramente, los hngados tratados con MSC-CM presentaban un valor mas bajo que los hngados tratados con vehnculo.
Se observaron cantidades inferiores de leucocitos infiltrantes en hngados tratados con MSC-CM.
Ejemplo 17 - MSC-CM altera la migracion de celulas inmunitarias al hngado
Para investigar si la ausencia de infiltracion panlobular de leucocitos observada en tngados tratados con MSC-CM puede deberse a la desviacion dependiente de MSC-CM de la migracion de celulas inmunitarias desde un organo diana inflamado, se transfirieron de forma adoptiva leucocitos radiomarcados directamente despues del tratamiento con MSC-CM o vehnculo, en ratas lesionadas con Gal-N (0,6 g/kg). En resumen, se aislaron los leucocitos de sangre completa de rata por lisis de eritrocitos con NH4Cl. Las celulas se sedimentaron, se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en solucion salina al 0,9% que contema el isotopo In111 oxina (GE Healthcare Biosciences Corp., Piscataway, NJ). Las celulas se marcaron a una eficacia del 92% con alta viabilidad. Se infundieron aproximadamente 15 x 106 celulas en la vena del pene de ratas lesionadas con Gal-N (0,6 g/kg) directamente despues del tratamiento con vehnculo o MSC-CM.
Despues se controlo el trafico de leucocitos en estos animales usando tomograffa computarizada de emision de un unico foton (SPECT) en el tiempo. Se capturaron imagenes SPECT usando un sistema de camara M.CAM gamma (Siemens Medical Systems, Malvern, PA) a 0, 3 y 24 horas despues de la infusion de leucocitos. Se proporciona una ilustracion de este protocolo en la FIG. 22.
De forma cualitativa, se observaron mas leucocitos migrando al hngado en los animales tratados con vehnculo en el tiempo. En contraste, hubo una disminucion distinta en la intensidad de senal en el hngado de animales tratados con MSC-CM en el tiempo. Estos resultados sugieren que habfa una presion selectiva sobre los leucocitos para que emigraran desde el hngado debido a MSC-CM, a diferencia de las condiciones de control donde los leucocitos
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finalmente migraron al organo lesionado.
Como se muestra en la FIG. 22B, en ratas a las que se administro una dosis subletal de Gal-N (0,6 mg/kg), se observaron cambios drasticos en los recuentos y diferenciales de leucocitos en poblaciones de celulas de sangre periferica en animales tratados con MSC-CM.
Tambien se evaluo la distribucion de leucocitos a nivel organico. Los animales se sacrificaron en los puntos temporales de 0,5 horas, 8 horas y 24 horas. Los niveles de leucocitos se determinaron para los organos indicados usando recuentos de centelleo.
Como se muestra en FIG. 22C, los organos linfoides y el Imgado son los sitios principales de actividad de MSC-CM (50% de los organos solidos totales a las 24 horas). Se observo, sin embargo, actividad considerable de MSC-CM en cada organo analizado.
Estos datos apoyan la idea de que la migracion alterada de leucocitos puede ser una diana potencial de la terapia con MSC-CM. Estos datos tambien apoyan el uso sistemico de terapia con MSC-CM, por ejemplo, para el tratamiento de insuficiencia multiorganica en un sujeto. Por tanto, la terapia con MSC-CM puede proporcionar un efecto beneficioso en los siguientes organos, el pulmon, el corazon, el pancreas, el GI, el timo, el ganglio linfatico, la medula osea, el bazo, el hngado, y la sangre.
Ejemplo 18 - Caracterizacion de MSC-CM
En un esfuerzo por comprender los mediadores moleculares de los efectos observados de la terapia con MSC, se examino el MSC-CM usando una serie de protemas de alta densidad.
En resumen, se prepararon sobrenadantes de MSC recogiendo medio sin suero despues de cultivo de 24 horas de aproximadamente 2 x 106 MSC. Los sobrenadantes se analizaron para un panel de protemas especificadas usando una serie de anticuerpos (RAYBIO Human Cytokine Antibody Array C Series 2000, RayBiotech Inc., Norcross, GA) como se especifica por el proveedor.
Como se muestra en la FIG. 23A, el MSC-CM contema 69 de las 174 protemas ensayadas, que inclman un amplio espectro de moleculas implicadas en la inmunomodulacion y la regeneracion hepatica. Como se muestra en la FIG. 23B, el analisis de grupos revelo que una fraccion grande (30%) de MSC-CM estaba compuesta por quimioquinas, michas de las cuales se expresaban a altos niveles.
El MSC-CM entonces se fracciono basandose en la funcionalidad usando metodos basados en afinidad en lugar de otros criterios moleculares arbitrarios tales como el tamano o hidrofobicidad, del siguiente modo. El MSC-CM se paso sobre una columna de afinidad impregnada con sulfato de heparina, un ligando conocidos para todas las quimioquinas y se separo en fracciones unidas y no unidas. Cada fraccion se infundio en ratas con FHF inducida con supervivencia global como criterio de valoracion del estudio.
Como se muestra en la FIG. 23C, la actividad terapeutica de MSC-CM se restringio a la fraccion unida a heparina, proporcionando una fuerte correlacion en las quimioquinas y el beneficio de supervivencia despues de infusion de MSC-CM en ratas con FHF inducida.
El MSC-CM no aumentaba los niveles de ARNm del factor de transcripcion Foxp3 en celulas mononucleares de sangre periferica. La expresion de Foxp3 esta restringida a celulas T reguladoras, una poblacion de linfocitos supresores endogenos.
El MSC-CM es quimiotacticamente activo, mientras que Fibroblasto-CM es inerte. Esto se evaluo usando una camara de quimiotaxis microfluidic previamente descrita (Jeon et al., Nat. Biotech., 20:826-830, 2002). Neutrofilos expuestos a Fibroblasto-CM no muestran cambios morfologicos implicados con la quimiotaxis, mientras que neutrofilos expuestos a MSC-CM tienen extensiones filopodiales prominentes y estan quimiotacticamente sensibilizados.
Un componente de MSC-CM que puede ser responsable de la replicacion aumentada de hepatocitos es SDF-1a. Se hicieron proliferar hepatocitos usando tecnicas mencionadas anteriormente en medio convencional de cultivo en solitario o suplementado con 5 ng/ml de SDF-1a (FIG. 29B) o el antagonista del receptor de SDF-1a, AMD3100 a 1 uM. Estimulacion aumentada de SDF-1a condujo colonias mas grandes, mientras que el bloqueo de la senalizacion de SDF-1a condujo a colonias mas pequenas. La FIG. 24 muestra la smtesis de urea en celulas tratadas con SDF- 1a y AMD3100. La smtesis de urea es un biomarcador sustituto para la masa de hepatocitos; los resultados muestran diferencias significativas entre condiciones de control y modulacion de la ruta de senalizacion de SDF-1a.
Tambien se describe en este documento:
(1) Un sistema para tratar la sangre o el plasma de un mairnfero, comprendiendo el sistema un biorreactor
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extracorporeo (EB) que comprende un compartimento de tratamiento de fluido y un compartimento de celulas, y una barrera selectivamente permeable que separa el compartimento de tratamiento de fluido y el compartimento de celulas, donde el compartimento de celulas comprende una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas.
(2) El sistema de (1), donde el compartimento de celulas comprende adicionalmente una poblacion de hepatocitos primarios.
(3) El sistema de (1), donde la barrera selectivamente permeable comprende un haz de fibras huecas.
(4) El sistema de (1), donde el EB comprende adicionalmente una entrada de fluido biologico y una salida de fluido biologico, donde la entrada y la salida de fluido biologico permiten comunicacion fluida entre el compartimento de tratamiento de fluido y el torrente sangumeo de un mairnfero.
(5) El sistema de (1), que comprende adicionalmente una pluralidad de bombas para hacer circular la sangre o el plasma a traves del compartimento de tratamiento de fluido.
(6) El sistema de (1), comprendiendo adicionalmente el sistema un cartucho de ultrafiltracion en comunicacion fluida con el compartimento de tratamiento de fluido.
(7) Un metodo de tratamiento de una enfermedad hepatica en un sujeto, comprendiendo el metodo:
(a) identificar a un sujeto que tiene una enfermedad hepatica;
(b) proporcionar un sistema para tratar la sangre o el plasma de un marnffero, comprendiendo el sistema un biorreactor extracorporeo (EB) que comprende un compartimento de tratamiento de fluido y un compartimento de celulas, y una barrera selectivamente permeable que separa el compartimento de tratamiento de fluido y el compartimento de celulas, donde el compartimento de celulas comprende una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas; y
(c) exponer el plasma o la sangre del sujeto a las MSC en el EB.
(8) El metodo de (7), donde el sujeto se identifica evaluando el nivel de un marcador serico de funcion hepatica.
(9) El metodo de (8), donde el marcador serico de funcion hepatica se selecciona del grupo que consiste en lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), bilirrubina serica, albumina y globulinas.
(10) El metodo de (7), donde el EB comprende adicionalmente una poblacion de hepatocitos primarios.
(11) Un metodo para tratar la sangre o el plasma de un sujeto que tiene una enfermedad hepatica, comprendiendo el metodo:
(a) identificar a un sujeto que tiene una enfermedad hepatica;
(b) proporcionar un sistema que comprende un biorreactor extracorporeo (EB) que comprende un compartimento de tratamiento de fluido y un compartimento de celulas, y una barrera selectivamente permeable que separa el compartimento de tratamiento de fluido y el compartimento de celulas, donde el compartimento de celulas comprende una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas;
(c) retirar la sangre o el plasma del sujeto;
(d) introducir la sangre o el plasma en el compartimento de tratamiento de fluido del EB; y
(e) permitir que la sangre o el plasma fluya a traves de y salga del compartimento de tratamiento de fluido, tratando de ese modo la sangre o el plasma.
(12) El metodo de (11), donde el sujeto se identifica evaluando el nivel de un marcador serico de funcion hepatica.
(13) El metodo de (12), donde el marcador serico de funcion hepatica se selecciona del grupo que consiste en lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), bilirrubina serica, albumina y globulinas.
(14) El metodo de (12), donde el EB comprende adicionalmente una poblacion de hepatocitos primarios.
(15) Un metodo de preparacion de una composicion para el tratamiento de una enfermedad hepatica, comprendiendo el metodo:
(i) obtener una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas;
(ii) cultivar las MSC en un medio;
(iii) obtener el medio;
(iv) fraccionar el medio;
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(v) seleccionar una fraccion del medio que tiene capacidad de una o ambas de promocion de la proliferacion de hepatocitos o inhibicion de la muerte de hepatocitos; y
(vi) opcionalmente, formular la fraccion seleccionada para su administracion a un mairnfero.
(16) El metodo de (15), donde la composicion se concentra 25 veces.
(17) El metodo de (16), donde el medio comprende un medio de cultivo tisular sin suero o solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
(18) El metodo de (15), que comprende adicionalmente liofilizar la composicion.
(19) Una composicion proporcionada por el metodo de (15).
(20) Un metodo de tratamiento de enfermedad hepatica en un sujeto, comprendiendo el metodo identificar a un sujeto que necesita tratamiento, y administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composicion que comprende medio condicionado de MSC (MsC-CM).
(21) El metodo de (20), donde el sujeto se identifica evaluando el nivel de un marcador serico de funcion hepatica.
(22) El metodo de (21), donde el marcador serico de funcion hepatica se selecciona entre el grupo que consiste en lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), bilirrubina serica, albumina y globulinas.
(23) El metodo de (21), donde el tratamiento continua hasta que el nivel del sujeto de un marcador serico de funcion hepatica esta dentro del intervalo normal determinado por el medico del sujeto.
(24) El metodo de (21), donde la enfermedad hepatica a tratarse es insuficiencia hepatica aguda, insuficiencia hepatica fulminante, o fibrosis hepatica.
(25) El metodo de (21), donde la composicion se administra usando una tecnica de bolo intravenoso.
(26) El metodo de (21), donde el MSC-CM se obtiene por un metodo que comprende:
(a) obtener una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas;
(b) cultivar las MSC en un medio;
(c) obtener el medio;
(d) opcionalmente, formular la fraccion seleccionada para su administracion al sujeto.
(27) El metodo de (21), donde el MSC-CM se obtiene por un metodo que comprende:
(a) obtener una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas;
(b) cultivar las MSC en un medio;
(c) obtener el medio;
(d) fraccionar el medio;
(e) seleccionar una fraccion del medio que tiene capacidad de una o ambas de promocion de la proliferacion de hepatocitos e inhibicion de la muerte de hepatocitos; y
(f) opcionalmente, formular la fraccion seleccionada para su administracion al sujeto.
(28) Un metodo para identificar un compuesto biologicamente activo para el tratamiento de una enfermedad hepatica, comprendiendo el metodo;
(a) obtener una o mas fracciones de un medio que contiene factores secretado desde una poblacion de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas;
(b) ensayar la capacidad de una o mas de las fracciones de promover una o ambas de la proliferacion de hepatocitos o inhibicion de la muerte de hepatocitos;
(c) seleccionar una fraccion del medio que promueve una o ambas de la proliferacion de hepatocitos o inhibicion de la muerte de hepatocitos; y
(d) identificar una o mas moleculas presentes en la fraccion seleccionada.
(29) El metodo de (28), donde las fracciones se obtienen de acuerdo con el tamano.
(30) El metodo de (28), donde las fracciones se obtienen de acuerdo con la carga.
(31) El metodo de (28) donde la fraccion del medio es una fraccion de union a sulfato de heparina del medio.
Otras realizaciones
Debe apreciarse que, aunque la invencion se ha descrito junto con la descripcion detallada de la misma, la descripcion anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invencion, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones estan dentro del alcance de las siguientes 5 reivindicaciones.

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un dispositivo extracorporeo de soporte hepatico que comprende una poblacion purificada de celulas estromaticas multipotentes (MSC) indiferenciadas.
    5
  2. 2. Un dispositivo extracorporeo de soporte hepatico de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la poblacion purificada de MSC indiferenciadas
    a. esta esencialmente libre de material celular no MSC, o 10 b. es 100% MSC, o
    c. permanece indiferenciada, o
    d. esta en solucion que no comprende suero animal, o
    e. deriva de medula osea.
    15 3. Un cartucho de biorreactor extracorporeo que comprende celulas estromaticas multipotentes (MSC)
    indiferenciadas y una barrera semi-permeable que permite el paso de macromoleculas, pero no MSC.
  3. 4. Un cartucho de biorreactor extracorporeo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que el cartucho se suministra para un unico uso con un paciente.
    20
  4. 5. Un kit que comprende el cartucho de la reivindicacion 3, uno o mas tampones farmaceuticamente aceptables, e instrucciones para instalar el cartucho en un dispositivo extracorporeo de soporte hepatico.
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