CN108289916A - 用于诱导细胞的抗细胞凋亡、存活或增殖的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于诱导细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、存活、保护、增殖和/或表型调节，以及治疗受试者的疾病的组合物和方法。

Description

用于诱导细胞的抗细胞凋亡、存活或增殖的组合物和方法

相关申请的交叉引用

根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2015年6月15日提交的美国临时专利申请序列号62/175,947和2015年11月6日提交的美国临时专利申请序列号62/252,219的优先权权益，所述临时专利申请的全部内容以引用的方式整体并入本文。

背景

发明领域

本发明总体上涉及细胞生物学，并且更具体地涉及一种用于诱导细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、存活、保护、增殖和/或表型调节以及治疗受试者的疾病的组合物和方法。

背景技术

包括但不限于细菌、病毒、物理损伤、化学损伤(例如，酒精、药物等)、癌症、化学疗法和放射疗法的各种药剂可取决于具体药剂和暴露于其的动物的遗传组成引起对细胞和组织的直接损伤，或者产生长时间和过度炎症的环境。在正常情况下，炎症是帮助动物从受伤中恢复的过程。急性炎症是组织对有害刺激的初始反应。它涉及复杂、高度调控的过程，所述过程在损伤组织中存在的细胞(包括巨噬细胞、树突细胞、组织细胞、库柏法细胞(Kupffer cell)和肥大细胞)感测与损伤相关的分子并变得活化时开始。在活化后，这些细胞释放炎性介质，如血管舒张剂。血管舒张剂诱导损伤附近的血管的血流量和通透性增加。这进而导致血浆和白细胞(包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞)从血液向损伤组织中的移动增加。因为炎性介质通常快速降解，所以急性炎症需要不断的刺激才能持续。因此，一旦有害刺激被除去，急性炎症就结束。

慢性炎症据信是许多普遍和衰弱疾病的促成因素，包括肝病(如肝炎、肝硬化和脂肪性肝病)、心脏病、癌症、呼吸系统疾病、中风、神经系统疾病如阿尔茨海默氏病、糖尿病和肾病。慢性炎症的结果是正常组织的破坏及其被富含胶原的结缔组织置换。富含胶原的结缔组织(也被称为瘢痕组织)表现出与正常组织相比减弱的组织功能。瘢痕组织的持久和长时间形成进而导致纤维化。纤维化是影响肺、皮肤、肝、心脏和骨髓的疾病的常见症状，并且是诸如特发性肺纤维化、硬皮病、瘢痕疙瘩、肝硬化、心肌纤维化、糖尿病性肾病、骨髓增生异常综合征的疾病和其他病症中的关键因素。

慢性炎症和纤维化的研究已经表明，无论活化剂和受影响的组织，信号传导蛋白的共同网络倾向于共同起作用以建立促炎性状态。信号传导蛋白的这种网络包括许多不同的细胞因子、细胞因子受体、转录因子等。

为了治疗目的，包括炎性肝病诸如肝炎，已经进行了血液处理以除去各种血液成分。血液处理方法的实例包括血液透析，其允许从患有肾功能不足的患者的血液中除去代谢废物。从患者流的血液被过滤以除去这些废物，且然后返回至患者。血浆除去法的方法也使用切向流膜分离来处理血液，以治疗多种疾病状态。可选择膜孔径来除去不想要的血浆成分。血液也可使用各种利用生物化学反应的装置进行处理，以改变存在于血液中的生物成分。例如，血液组分如胆红素或酚类可通过血浆体外循环跨过与膜表面结合的酶而进行葡糖酸化或硫酸化。

例如，目前使用的技术关于支持肝功能受损的患者通常是不足的。常规系统和方法遭受与维持此类患者相关的各种问题，直到可找到合适的供体器官用于移植或直到患者的天然肝脏可再生至健康状态。

肝脏在损伤时具有巨大的能力来再生和代替组织损失。肝细胞主要通过细胞表面受体活化，如MET(肝细胞生长因子(HGF)的受体和与各种配体相互作用的表皮生长因子受体(EGFR))提供大部分肝功能并对再生刺激做出反应。如果驻留的肝细胞不能增殖，则肝细胞功能可从据信来源于位于胆管附近的转分化的胆管上皮细胞的再生细胞池替代。在由于长期酒精消耗、病毒感染或暴发性毒物所致的肝炎患者中，驻留肝细胞的复制能力降低。

尽管越来越多的关于涉及过度炎症和/或减少的细胞增殖或存活的病状的知识，但是用于此类病状的治疗仍然是难以捉摸的。因此需要更先进的组合物和方法来治疗此类疾病。

发明概述

一方面，本公开提供一种用于诱导细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、存活、保护、增殖和/或表型调节的组合物。所述组合物包含选自表I或II中列出的那些的一种或多种抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、存活、保护、增殖和/或表型调节因子。

另一方面，本公开提供一种诱导细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、保护、存活和/或增殖和/或表型调节的方法。所述方法包括使所述细胞与本公开的组合物接触，从而诱导所述细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、保护、存活和/或增殖和/或表型调节。

又一方面，本公开提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用本公开的组合物，由此治疗所述疾病或病症。

另一方面，本公开提供了一种源自亲本C3A细胞系的合格C3A细胞系，其中所述细胞系的细胞响应于促炎性分子如促炎性细胞因子表达选自表I或II中列出的那些的一种或多种因子。

附图简述

图1是描绘与本发明的实施方案有关的数据的图表。

图2是描绘与本发明的实施方案有关的数据的图表。

图3是说明现有技术的体外过滤和解毒系统的简化框图。

发明详述

本发明是基于出人意料的发现，即某些C3A克隆细胞系的细胞能够产生多种参与肝再生和肝细胞增殖的分泌因子。这些因子通过肝细胞的直接刺激直接或者通过在引入受试者的循环系统中后与其他驻留细胞群体的相互作用间接促进肝再生。所述知识形成提供一种用于诱导细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、保护、存活和/或增殖和/或表型调节以及治疗疾病的组合物和方法的基础。

在进一步描述本发明组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所描述的具体组合物、方法和实验条件，因为此类组合物、方法和条件可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意具有限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。

可参考附图和所附描述更好地理解根据本公开的方法的原理和操作。

如本说明书以及随附权利要求中所用，除非上下文另有清楚定义，否则单数形式的“一(个/种)”和“所述”包括复数提及形式。因此，例如“所述方法”的引用包括一种或多种方法、和/或本文所描述的类型的步骤，在阅读完本公开等之后，这对本领域技术人员而言将变得显而易见。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可使用与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述一些优选的方法和材料。

本文所述的发明涉及一种包含一种或多种抗细胞凋亡、促存活和/或促再生因子的组合物。所述组合物可用于生产用于治疗疾病、病症或其他异常病状(如炎性疾病或病症)的药物组合物。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物受试者。因此，设想治疗哺乳动物目的任何动物。此类动物包括但不限于马、猫、狗、兔、小鼠、山羊、绵羊、非人灵长类动物和人。因此，本公开的方法被考虑用于兽医学应用以及人使用。

本文中的受试者的“治疗”是指治疗性治疗和防治性或预防性措施。需要治疗的那些受试者包括已经患有疾病或病症的那些以及需要预防所述疾病或病症的那些。因此，所述受试者可能已被诊断为患有疾病或病症，或者可能易感或易患疾病或病症。

表述“有效量”是指有效预防、改善或治疗疾病或病症的抗细胞凋亡、促存活和/或促再生因子的量。这种有效量通常将导致疾病或病症的病征、症状或其他指标的改善。例如，在肝病中，有效量使得指示肝功能不良的生物化学标志物减少。

疾病或病症的“症状”是受试者经历的结构、功能或感觉的任何病态现象或偏离正常并指示疾病或病症。

如本文所用，“炎性疾病、病症或其他异常病状”可包括与炎症相关的病症或具有炎症组分，如但不限于：败血症、感染(如病毒、细菌或真菌感染)、寻常痤疮、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、自身免疫性疾病、乳糜泻、慢性(斑块)前列腺炎、肾小球性肾炎、超敏反应、炎性肠病(IBD，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、肉样瘤病、移植排斥、血管炎、间质性膀胱炎、动脉粥样硬化、过敏症(1、2和3型超敏反应、枯草热)、炎性肌病如系统性硬化症，并且包括皮肌炎、多发性肌炎、包涵体肌炎、谢迪亚克-东综合征(Chediak-Higashi syndrome)、慢性肉芽肿病、维生素A缺乏症、癌症(实体肿瘤、胆囊癌)、牙周炎、肉芽肿性炎症(结核病、麻风病、肉样瘤病和梅毒)、纤维素性炎症、化脓性炎症、浆液性炎症、溃疡性炎症和缺血性心脏病、I型糖尿病和糖尿病性肾病。

在某些实施方案中，炎性疾病、病症或其他异常病状包括许多与炎症相关的自身免疫性疾病或病症或具有炎症组分，例如对应于一种或多种类型的超敏反应。对应于一种或多种类型的超敏反应的示例性自身免疫性疾病或病症包括：特应性过敏、特应性皮炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性多内分泌腺综合征、自身免疫性荨麻疹、乳糜泻、冷凝集素病、接触性皮炎、克罗恩氏病、1型糖尿病、盘状红斑狼疮、胎儿成红细胞增多症、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性血小板减少性紫癜、IgA肾病、红斑狼疮、梅尼尔氏病、多发性硬化症、重症肌无力、发作性睡眠症、视神经脊髓炎、德维克病(Devic'sdisease)、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、视性眼阵挛肌阵挛综合征、PANDAS(链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神病症)、副肿瘤性小脑变性、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、风湿热、肉样瘤病、硬皮病、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎”)、血小板减少症、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、荨麻疹性血管炎和血管炎。

肝的炎性疾病、病症或其他异常病状可包括脂肪性肝病、肝硬化、肝癌以及由病毒感染(例如，由甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎)引起的急性或慢性肝炎、酒精性肝炎、药物或化学中毒(如四氯化碳、氨甲蝶呤、四环素、对乙酰氨基酚、非诺洛芬等)、单核细胞增多症、阿米巴痢疾以及由埃-巴二氏病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)或细菌引起的其他全身性感染。

肾的炎性疾病、病症或其他异常病状可与急性或慢性肾炎、间质性肾炎、狼疮肾炎、IgA肾病(伯格氏病)、肾小球性肾炎、膜增生性肾小球性肾炎(MPGN)、与慢性肾病(CKD)和炎症相关的自身免疫性病症、古德帕斯丘综合征、韦格纳氏肉芽肿病、肾盂肾炎、运动性肾炎、肾结石和痛风。

炎性肠病(IBD)是一组结肠和小肠炎性病状。IBD的主要类型是克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。其他形式的IBD(其并不总是分类为典型IBD)包括胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏疾病和未确定型结肠炎。

胰腺的炎性疾病、病症或其他异常病状包括各种形式的具有各种病因和症状的胰腺炎，包括由酒精、胆结石、药物(例如，使用皮质类固醇如强的松龙、HIV药物如去羟肌苷和喷他脒、利尿剂、抗惊厥剂丙戊酸、化学治疗剂L-天冬酰胺酶和硫唑嘌呤、通过增加血甘油三酯的雌激素、降低胆固醇的他汀类药物和抗高血糖药如二甲双胍、维达列汀、西格列汀和糖尿病药物列汀类(gliptins))、创伤、腮腺炎、自身免疫性疾病、蝎螫伤、高血钙、高血甘油三酯、体温过低、内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)、胰腺分裂、妊娠、2型糖尿病、胰腺癌、胰管结石、血管炎(胰腺中的小血管的炎症)、柯萨奇病毒感染和卟啉症--尤其是急性间歇性卟啉症和红细胞生成性原卟啉症、病毒感染(由柯萨奇病毒、巨细胞病毒、乙型肝炎、单纯疱疹病毒、腮腺炎、水痘-带状疱疹病毒感染)、细菌感染(军团菌、钩端螺旋体属、支原体、沙门氏菌)、真菌感染(曲霉属)或寄生虫感染(蛔虫、隐孢子虫、弓形体)引起的胰腺炎。

本发明提供了一种包含一种或多种抗细胞凋亡、促存活和/或促再生因子(其通常是肽)的组合物。在实施方案中，所述一种或多种因子选自表I或II中列出的那些，任何可包括其任何组合。

表I：本公开的因子(例如，抗细胞凋亡、促存活和/或促再生因子)。

表II：本公开的因子(例如，抗细胞凋亡、促存活和/或促再生因子)。

因子
	双调蛋白(AR)
可溶性Fas(sFAS)受体
	α-1-抗胰蛋白酶(AAT)
血管生成素-2(ANG-2)
	促红细胞生成素(EPO)
凝溶胶蛋白
	肝细胞生长因子(HGF)
肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)
	白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)
胎盘生长因子(PLGF)
	血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)
干细胞因子(SCF)
	转化生长因子α(TGFα)
血管内皮生长因子(VEGF)
	血管内皮生长因子C(VEGF-C)

在各种实施方案中，所述一种或多种因子至少包括AR或sFAS。在一个实施方案中，所述一种或多种因子包括AR和sFAS两者以及任选地来自表I或II的一种或多种另外的因子，如已知的有丝分裂原、抑制非疾病相关细胞的细胞凋亡相关的信号转导的因子、促进疾病相关细胞的细胞凋亡的因子和/或诱导使得细胞功能改善的表型改变的因子。

在一个实施方案中，所述一种或多种因子包括表I中列出的那些的全部。在一个实施方案中，所述一种或多种因子包括表II中列出的那些的全部。

在一个实施方案中，所述一种或多种因子包括AR、sFAS以及以下中的一种或多种：肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α、肝素结合表皮生长因子、血小板源性生长因子BB、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子C、胎盘生长因子、促血管生成素2、促红细胞生成素、干细胞因子或其任何组合。在实施方案中，所述一种或多种因子包括AR、sFAS、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α、肝素结合表皮生长因子、血小板源性生长因子BB、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子C、胎盘生长因子、促血管生成素2、促红细胞生成素以及干细胞因子。

在一个实施方案中，所述一种或多种因子包括AR、sFAS以及以下中的一种或多种：AAT、A2Macro、Apo A-I、Apo A-II、Apo C-I、Apo C-III、Apo H、β2M、癌症抗原125(CA-125)、CD 40抗原(CD40)、肌酸激酶-MB(CK-MB)、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、因子VII、铁蛋白(FRTN)、纤维蛋白原、ICAM-1、IL-1Ra、IL-7、IL-8、IL-17、巨噬细胞源性趋化因子(MDC)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、纤溶酶原活化剂抑制剂1(PAI-1)、血清转铁蛋白(转铁蛋白)、性激素结合球蛋白(SHBG)、甲状腺素结合球蛋白(TBG)、TIMP-1、甲状腺素运载蛋白(TTR)或其任何组合。在一个实施方案中，所述一种或多种因子包括AR、sFAS、AAT、A2Macro、Apo A-I、Apo A-II、Apo C-I、Apo C-III、Apo H、β2M、癌症抗原125(CA-125)、CD 40抗原(CD40)、肌酸激酶-MB(CK-MB)、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、因子VII、铁蛋白(FRTN)、纤维蛋白原、ICAM-1、IL-1Ra、IL-7、IL-8、IL-17、巨噬细胞源性趋化因子(MDC)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、纤溶酶原活化剂抑制剂1(PAI-1)、血清转铁蛋白(转铁蛋白)、性激素结合球蛋白(SHBG)、甲状腺素结合球蛋白(TBG)、TIMP-1以及甲状腺素运载蛋白(TTR)。

在实施方案中，所述一种或多种因子是多肽，如表I中列出的那些。在实施方案中，所述组合物是包含一种或多种因子(如多肽)和药学上可接受的载体的药物组合物。术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用来表示通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列线性氨基酸残基。

在实施方案中，所述组合物包含来自表I的单一类型的因子，如AR或sFAS。在其他实施方案中，所述药物组合物包含来自表I的两种或更多种因子的组合，如AR和sFas。在实施方案中，所述组合物基本上不含在血液中发现的血液蛋白质和/或代谢物。在其他实施方案中，所述组合物包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白)。在实施方案中，所述组合物中存在的任何多肽因子是重组产生的。在实施方案中，所述组合物中存在的任何多肽因子是由C3A细胞响应于来自受试者的血液或其级分产生的。

所述组合物还可包含一种或多种增加表I中列出的一种或多种因子的表达或活性的药剂。适用于本发明的药剂可以是任何类型的分子，例如多核苷酸、肽、肽模拟物、类肽如插烯类肽、化学化合物如有机分子或小有机分子等。在各种实施方案中，与在接触所述药剂之前的表达或活性相比，表达或活性增加了至少2.0倍、5.0倍、10倍、25倍、50倍、100倍、250倍、500倍、1,000倍、5,000倍或更多倍。

在实施方案中，所述药剂是多核苷酸，如反义寡核苷酸或RNA分子，其增加细胞中的表I中列出的因子的表达和/或活性(直接或间接)。在各个方面，所述药剂可以是多核苷酸，如反义寡核苷酸或RNA分子，如微小RNA、dsRNA、siRNA、stRNA和shRNA。

微小RNA(miRNA)是调控基因表达的单链RNA分子。miRNA由转录它们的DNA的基因编码，但是miRNA并未翻译成蛋白质；相反，每个初始转录物(初始-miRNA)均被加工为称作前体-miRNA的短茎-环结构并且最终成为功能性miRNA。成熟miRNA分子与一个或多个信使RNA(mRNA)分子完全或部分互补，并且其主要功能是下调基因表达。微小RNA可由独立基因编码，但也可从各种不同的RNA种类(包括内含子、mRNA的3'UTR、长的非编码RNA、snoRNA和转座子)加工(经由酶Dicer)。如本文所用，微小RNA还包括“模拟”微小RNA，所述微小RNA旨在表示外源引入细胞中的微小RNA，其具有与其内源对应物相同或基本上相同的功能。因此，虽然本领域的技术人员将理解，试剂可以是外源引入的RNA，但试剂还包括增加或减少细胞中的微小RNA的表达的化合物等。

术语“小干扰RNA”和“siRNA”在本文中也用于指短干扰RNA或沉默RNA，其是一类发挥多种生物学作用的短双链RNA分子。最值得注意的是，siRNA牵涉于RNA干扰(RNAi)途径中，其中所述siRNA干扰特定基因的表达。除了它们在RNAi途径中的作用之外，siRNA还在RNAi相关途径中起作用(例如，作为抗病毒机制或在成形基因组的染色质结构中起作用)。

术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”在本文中广义地用于指通过磷酸二酯键连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。因此，所述术语包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分、cDNA、合成聚脱氧核糖核酸序列等，并且可以是单链或双链的，以及DNA/RNA杂合体。此外，如本文所用的术语包括可从细胞中分离的天然存在的核酸分子，以及可例如通过化学合成的方法或通过酶促方法如通过聚合酶链式反应(PCR)制备的合成多核苷酸。应认识到，所述不同的术语只是为了便于讨论而使用，以便例如区分组合物的不同组分。

如本文所论述，本公开的组合物可包括表I中列出的单一因子或其组合。所述组合物可基本上不含除表I的那些以外的蛋白质。所述组合物可基本上不含任何促炎性分子。如本文所用，术语“基本上不含除表I的那些以外的蛋白质”是指所述组合物的少于5％的蛋白质含量由未在表I中列出的蛋白质组成。如本文所用，术语“基本上不含促炎性分子”是指所述组合物的少于5％的含量由促炎性分子组成。基本上不含除表I的那些以外的蛋白质的组合物可具有少于4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％、0.0001％或更少(例如，0.0％)的除表I的那些以外的蛋白质。基本上不含促炎性分子的组合物可具有少于4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％、0.0001％或更少的此类分子。因此，所述组合物可基本上不含血液蛋白质，如血清白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原和凝血因子。或者，所述组合物可包含血清白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原和凝血因子中的一种或多种。

在实施方案中，所述组合物的肽因子在人或其他哺乳动物或动物中不是天然存在的。例如，所述因子可以是合成的、重组的等。然而，本发明的组合物可包含天然存在于人或其他哺乳动物或动物中的肽因子。

在实施方案中，所述肽因子可包含非天然存在的氨基酸。“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍的化合物。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但其作用的方式类似于天然存在的氨基酸的化学化合物。氨基酸可在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。

在实施方案中，所述组合物包含表I中列出的因子的一种或多种保守性修饰的变体。在实施方案中，所述保守性修饰的变体在氨基酸水平下与天然存在的多肽具有至少80％序列相似性，通常至少85％序列相似性、90％序列相似性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列相似性。

关于氨基酸序列，本领域的技术人员应认识到，改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或较小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守性修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表是本领域中熟知的。此类保守性修饰的变体是除了本发明的多态变体、种间同系物以及等位基因以外的变体并且不排除本发明的多态变体、种间同系物以及等位基因。

例如，可进行取代，其中脂肪族氨基酸(G、A、I、L或V)被所述基团的另一个成员取代，或诸如一个极性残基取代另一个极性残基如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺的取代。以下八个组各自含有彼此为保守性取代的其他示例性氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。

在两个或更多个多肽序列的背景下，术语“相同”或“同一性”百分比是指如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法与默认参数参数或通过人工比对和目视检查所测量，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基(即，当比较和比对相对于比较窗或指定区的最大对应性时，相对于指定区具有约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。此类序列然后被认为是“基本上相同的”。

在实施方案中，所述组合物基本上不含与本发明的一种或多种因子体内缔合或与所述因子共同纯化的生物分子(如多肽、核酸、脂质、碳水化合物和代谢物)。如本文所用，术语“基本上不含生物分子”是指所述组合物的少于5％的干重由未在表I中列出的生物分子组成。基本上不含此类生物分子的组合物可具有少于4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少的未在表I中列出的生物分子。因此，例如，所述组合物可基本上不含在血液中丰富的生物分子，如脂肪酸、胆固醇、非蛋白质凝血因子、代谢物等。此外，所述组合物可基本上不含细胞，包括红细胞、白细胞、血小板和细胞碎片。

在实施方案中，本发明的组合物包含至少1mg(例如，至少5、10、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000mg或更多)的在表I中列出的一种或多种因子。因此，例如，所述组合物可包含等于约1mg至约1000mg(例如，约5mg至约900mg、约5mg至约800mg、约5mg至约700mg、约5mg至约600mg、约10mg至约500mg、约10mg至约400mg、约10mg至约300mg、约10mg至约250mg、约10mg至约200mg、约10mg至约150mg、约10mg至约100mg、约50mg至约500mg、约50mg至约400mg、约50mg至约300mg、约50mg至约250mg、约50mg至约200mg、约50mg至约150mg、约50mg至约100mg、约75mg至约500mg、约75mg至约400mg、约75mg至约300mg、约75mg至约250mg、约75mg至约200mg、约75mg至约150mg、约75mg至约100mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约250mg、约100mg至约200mg，或包括上述端点中的两个的任何其他范围)的量的一种或多种因子。

在实施方案中，本发明的组合物可包括含有至少1mg/ml(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/ml或更多)的在表I中列出的一种或多种因子的溶液。因此，例如，所述组合物可包括具有约1mg/ml至约1000mg/ml(例如，约5mg/ml至约900mg/ml、约5mg/ml至约800mg/ml、约5mg/ml至约700mg/ml、约5mg/ml至约600mg/ml、约5mg/ml至约500mg/ml、约10mg/ml至约500mg/ml、约10mg/ml至约400mg/ml、约10mg/ml至约300mg/ml、约10mg/ml至约250mg/ml、约10mg/ml至约200mg/ml、约10mg/ml至约150mg/ml、约10mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约500mg/ml、约50mg/ml至约400mg/ml、约50mg/ml至约300mg/ml、约50mg/ml至约250mg/ml、约50mg/ml至约200mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约50mg/ml至约100mg/ml、约75mg/ml至约500mg/ml、约75mg/ml至约400mg/ml、约75mg/ml至约300mg/ml、约75mg/ml至约250mg/ml、约75mg/ml至约200mg/ml、约75mg/ml至约150mg/ml、约75mg/ml至约100mg/ml、约100mg/ml至约500mg/ml、约100mg/ml至约400mg/ml、约100mg/ml至约300mg/ml、约100mg/ml至约250mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约10mg/ml至约150mg/ml，或包括上述端点中的两个的任何其他范围)浓度的在表I中列出的一种或多种因子的溶液。

在实施方案中，本发明的组合物包含至少1pg(例如，至少5、10、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000pg或更多)的在表I中列出的一种或多种因子。因此，例如，所述组合物可包含等于约1pg至约1000pg(例如，约5pg至约900pg、约5pg至约800pg、约5pg至约700pg、约5pg至约600pg、约10pg至约500pg、约10pg至约400pg、约10pg至约300pg、约10pg至约250pg、约10pg至约200pg、约10pg至约150pg、约10pg至约100pg、约50pg至约500pg、约50pg至约400pg、约50pg至约300pg、约50pg至约250pg、约50pg至约200pg、约50pg至约150pg、约50pg至约100pg、约75pg至约500pg、约75pg至约400pg、约75pg至约300pg、约75pg至约250pg、约75pg至约200pg、约75pg至约150pg、约75pg至约100pg、约100pg至约500pg、约100pg至约400pg、约100pg至约300pg、约100pg至约250pg、约100pg至约200pg，或包括上述端点中的两个的任何其他范围)的量的一种或多种因子。

在实施方案中，本发明的组合物可包括含有至少1pg/ml·(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100pg/ml或更多)的在表I中列出的一种或多种因子的溶液。因此，例如，所述组合物可包括具有约1pg/ml至约1000pg/ml(例如，约5pg/ml至约900pg/ml、约5pg/ml至约800pg/ml、约5pg/ml至约700pg/ml、约5pg/ml至约600pg/ml、约5pg/ml至约500pg/ml、约10pg/ml至约500pg/ml、约10pg/ml至约400pg/ml、约10pg/ml至约300pg/ml、约10pg/ml至约250pg/ml、约10pg/ml至约200pg/ml、约10pg/ml至约150pg/ml、约10pg/ml至约100pg/ml、约50pg/ml至约500pg/ml、约50pg/ml至约400pg/ml、约50pg/ml至约300pg/ml、约50pg/ml至约250pg/ml、约50pg/ml至约200pg/ml、约50pg/ml至约150pg/ml、约50pg/ml至约100pg/ml、约75pg/ml至约500pg/ml、约75pg/ml至约400pg/ml、约75pg/ml至约300pg/ml、约75pg/ml至约250pg/ml、约75pg/ml至约200pg/ml、约75pg/ml至约150pg/ml、约75pg/ml至约100pg/ml、约100pg/ml至约500pg/ml、约100pg/ml至约400pg/ml、约100pg/ml至约300pg/ml、约100pg/ml至约250pg/ml、约100pg/ml至约200pg/ml、约10pg/ml至约150pg/ml，或包括上述端点中的两个的任何其他范围)浓度的在表I中列出的一种或多种因子的溶液。

本发明的组合物通常是药物组合物。这种药物组合物可包含在表I或II中列出的一种或多种因子和药学上可接受的载体。药物组合物还可包含除了如表I或II中列出的因子以外的蛋白质。另一种蛋白质可以是治疗剂，如治疗性多肽。或者，另一种蛋白质可以是载体蛋白。

在实施方案中，本发明的组合物包含抗凝剂，如肝素或柠檬酸盐。如本文所用，“柠檬酸盐”是指任何形式的柠檬酸根阴离子，包括柠檬酸(与三个质子络合的柠檬酸根阴离子)、含有柠檬酸根阴离子的盐和柠檬酸根阴离子的部分转角。柠檬酸根阴离子是有机三羧酸盐。已被指定化学文摘登记号77-92-2的柠檬酸具有分子式HOC(CO₂H)(CH₂CO₂H)₂和192.12g/mol的式量。柠檬酸盐(即，含有柠檬酸根阴离子的盐)由与一种或多种生理学上可接受的阳离子缔合的一种或多种柠檬酸根阴离子组成。示例性的生理学上可接受的阳离子包括但不限于质子、铵阳离子和金属阳离子。合适的金属阳离子包括但不限于钠、钾、钙和镁，其中钠和钾是优选的，并且钠是更优选的。含有柠檬酸根阴离子的组合物可含有生理学上可接受的阳离子的混合物。

在一个实施方案中，所述组合物包含柠檬酸钠。柠檬酸钠可呈干化学粉末、晶体、丸剂或片剂的形式。可使用任何生理学上可耐受形式的柠檬酸或柠檬酸钠。例如，柠檬酸或柠檬酸钠可呈水合物，包括一水合物的形式。

本发明的药物组合物可通过将在表I中列出的具有所需纯度程度的一种或多种因子与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.Ed.(1980))混合来制备。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且可包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐以及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在实施方案中，本发明的组合物可包含活细胞。在一个实施方案中，所述组合物包含肝细胞。在一个实施方案中，所述组合物包含任选重组工程化的HepG2细胞或C3A细胞。

本发明的组合物提供用于诱导靶细胞的抗细胞凋亡、存活和/或增殖和/或治疗诸如炎性疾病的疾病或病症的强有力工具。

因此，本发明提供一种通过使细胞与本公开的组合物接触来诱导所述细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、存活、保护、增殖和/或表型调节的方法。在实施方案中，与未与所述组合物接触的可比较细胞的增殖相比，所接触的细胞的增殖增加了至少1.1倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10倍、25倍、50倍、100倍或更多倍。在一个相关实施方案中，与未与所述组合物接触的可比较细胞的存活相比，所述细胞的存活增加了至少1.1倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10倍、25倍、50倍、100倍或更多倍。

本发明还提供一种治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向受试者或其细胞或组织施用表I或II中列出的一种或多种因子(或例如，包含表I或II中列出的一种或多种因子的药物组合物)。

在本发明的方法中，所述一种或多种因子诱导所接触的细胞或组织中的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、存活、保护、增殖和/或表型调节。在实施方案中，所接触的细胞(也称为靶细胞)是真核细胞，如哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所接触的细胞是肝细胞。在一个实施方案中，所述细胞是肝母细胞瘤源性细胞。在一个实施方案中，所述细胞是HepG2细胞或C3A细胞系的C3A细胞。在一个实施方案中，所述细胞是源自亲本C3A细胞系的克隆衍生物。在一个实施方案中，所述细胞是重组工程化细胞。

术语“C3A细胞系”是指人肝母细胞瘤细胞系HepG2的亚克隆。C3A细胞系是在ATCC号CRL-10741下保藏于美国典型培养物保藏中心的合格细胞系。

可以任何合适的方式进行组合物的施用，所述方式包括例如静脉内、腹膜内、胃肠外、原位、皮下、局部、经鼻、经口、舌下、眼内、借助于可植入储库、使用基于纳米颗粒的递送系统、微针贴片、微球体、珠粒、渗透泵或机械泵和/或其他机械手段。

在各种实施方案中，细胞可在体内或体外被所述组合物接触。在一个实施方案中，所述细胞在体内被接触，所接触的细胞在通过体外解毒系统治疗的受试者体内，如在美国专利号8,105,491中所描述的体外解毒系统，所述专利以引用的方式整体并入本文。在此类实施方案中，所述组合物的一种或多种因子可由包括于所述系统的活性筒(生物反应器)内的细胞(如C3A细胞)产生。在各种实施方案中，所述系统可流体联接至受试者或其细胞或器官，例如肝。

如图3中所示，体外解毒系统10通常包括血液回路100，其被配置为联接至患者并且可操作来将来自所述患者的血液传送通过超滤液发生器(UFG)40且返回至所述患者；再循环回路50，其与所述UFG 40联接并且可操作来从所述UFG 40抽吸超滤液并独立于所述血液的细胞组分处理超滤液；以及导管接合部15，其可操作来重新组合所述再循环回路50中的超滤液和所述血液回路100中的细胞组分，然后重新引入至所述患者。还在图3中示出布置在再循环回路50内的活性筒70和氧合器60。活性筒70被用来处理超滤液。

术语“活性筒”是指包括细胞(例如像，C3A细胞系的细胞)且在治疗应用和解毒过程中具有效用的基于中空纤维的筒。

术语“血液回路”是指连接至双腔导管并且可操作来使血液从患者循环至血液控制单元并回至患者的管回路。

术语“C3A细胞系”是指人肝母细胞瘤细胞系HepG2的亚克隆。在实施方案中，C3A细胞被包括于一个或多个活性筒的毛细管外空间中。C3A细胞系一直在ATCC号CRL-10741下保藏于美国典型培养物保藏中心。

术语“解毒装置”是指提供从流体流中除去特异性或非特异性分子的装置的筒、罐或其他装置。实例可以是透析筒、吸附筒或过滤器。

术语“毛细管外空间”(ECS)是指活性筒或超滤液发生器的中空纤维外部的空间。活性筒的ECS通常可容纳C3A细胞。

术语“毛细管内空间”(ICS)是指活性筒或超滤液发生器的中空纤维内部的空间。ICS是全血或超滤液流体的流动路径。

术语“再循环回路”是指通常能够对超滤液流体进行过滤、解毒和处理的回路；在一些实施方式中，再循环回路通常包括储库、氧合器和一个或多个活性筒。

术语“超滤液”(UF)是指跨过超滤液发生器的半透膜过滤的血浆流体和溶解的大分子。

术语“超滤液发生器”(UFG)是指包括或实施为“空白”活性筒(即，不包括治疗活性细胞的中空纤维筒)并且可操作来从细胞血液组分分离血浆流体(超滤液)的装置。所述中空纤维可由半透膜构成，在一些实施方式中，所述半透膜具有例如大约100,000道尔顿的标称分子量截留。在使用UFG期间，血液可通过中空纤维的ICS循环；包含血浆和各种大分子的超滤液穿过膜纤维壁进入再循环回路，其中其循环通过一个或多个活性筒。

术语“超滤”通常是指超滤液从全血抽离跨过UFG的半透膜的过程。在下文描述的一些实施方案中，超滤液泵可控制超滤液产生的速率，而UFG的中空纤维膜的孔径可控制渗透所述膜的超滤液的量。

在临床或治疗性治疗期间，UF可被泵送通过活性筒70内的中空纤维筒的腔(ICS)，从而允许来自UF的毒素、营养物、葡萄糖和溶解氧扩散穿过膜至ECS中，其中活细胞可代谢它们。代谢产物连同由所述细胞产生的白蛋白和其他蛋白质可穿过所述膜扩散回至UF中以返回至患者。

如上所述和本文所考虑，C3A细胞系是人肝母细胞瘤细胞系HepG2的亚克隆。这种亲本细胞系如C3A的一些亚克隆例如显示肝特异性功能能力如高白蛋白产生和α-胎蛋白(AFP)产生以及抗炎介质蛋白α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和IL-1Ra响应于本发明的促炎性分子(包括例如细胞因子IL-6和IL-1β)的表达。此类细胞还能够产生表I或II中列出的一种或多种因子。

在各种实施方案中，所述系统可流体联接至受试者或其细胞或器官，例如肝。本发明的组合物被引入系统10的血液回路中。所述组合物可被引入受试者的循环系统中，或者直接引入所述系统的血液流动路径中。在一个实施方案中，表I或II中列出的一种或多种因子由系统10的活性筒70内的细胞产生。一旦进入系统10的血液回路100中，将包含所述组合物的因子的处理的UF重新引入受试者中，其中所述组合物的因子接触所述受试者的细胞(如肝细胞)，从而有助于治疗疾病或病症。

尽管在本实施方案中活性筒的细胞被示为C3A细胞，但本领域的技术人员将理解，活性筒可包括任何数量的合适的细胞类型，所述细胞类型有益于治疗许多不同的疾病，例如如本文所公开的炎性疾病。在实施方案中，活性筒可包括重组工程化以响应于刺激，例如所治疗的受试者内产生的刺激(如促炎性分子)而产生表I或II中列出的一种或多种因子(如AR和/或sFas)的细胞。

结合前述方法中的任一种，所述组合物可每天(或每隔一天或每周)施用，其中表I或II的一种或多种因子的量介于约1mg与约1000mg之间(例如，约5mg至约900mg、约5mg至约800mg、约5mg至约700mg、约5mg至约600mg、约10mg至约500mg、约10mg至约400mg、约10mg至约300mg、约10mg至约250mg、约10mg至约200mg、约10mg至约150mg、约10mg至约100mg、约50mg至约500mg、约50mg至约400mg、约50mg至约300mg、约50mg至约250mg、约50mg至约200mg、约50mg至约150mg、约50mg至约100mg、约75mg至约500mg、约75mg至约400mg、约75mg至约300mg、约75mg至约250mg、约75mg至约200mg、约75mg至约150mg、约75mg至约100mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约250mg、约100mg至约200mg，或包括上述端点中的两个的任何其他范围)。

结合前述方法中的任一种，所述组合物可每天(或每隔一天或每周)施用，其中表I或II的一种或多种因子的量介于约1pg与约1000pg之间(例如，约5pg至约900pg、约5pg至约800pg、约5pg至约700pg、约5pg至约600pg、约10pg至约500pg、约10pg至约400pg、约10pg至约300pg、约10pg至约250pg、约10pg至约200pg、约10pg至约150pg、约10pg至约100pg、约50pg至约500pg、约50pg至约400pg、约50pg至约300pg、约50pg至约250pg、约50pg至约200pg、约50pg至约150pg、约50pg至约100pg、约75pg至约500pg、约75pg至约400pg、约75pg至约300pg、约75pg至约250pg、约75pg至约200pg、约75pg至约150pg、约75pg至约100pg、约100pg至约500pg、约100pg至约400pg、约100pg至约300pg、约100pg至约250pg、约100pg至约200pg，或包括上述端点中的两个的任何其他范围)。

结合前述方法中的任一种，所述组合物可与适用于治疗所述疾病或病症的药物组合施用。在一个实施方案中，所述组合物与抗生素一起施用。适用于与本发明的组合物协同治疗的具体类别的抗生素的实例包括氨基糖苷类(例如，妥布霉素)、青霉素类(例如，哌拉西林)、头孢菌素类(例如，头孢他啶)、氟喹诺酮类(例如，环丙沙星)、碳青霉烯类(例如，亚胺培南)、四环素类和大环内酯类(例如，红霉素和克拉霉素)。除了以上列出的抗生素，典型的抗生素包括氨基糖苷类(阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、链霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、依托红霉素/琥乙红霉素/葡庚糖酸红霉素/乳糖酸红霉素/硬脂酸红霉素)、β-内酰胺如青霉素类(例如，青霉素G、青霉素V、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、羧苄青霉素、美洛西林、阿洛西林和哌拉西林)或头孢菌素类(例如，头孢噻吩、头孢唑啉、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢呋辛、头孢尼西、头孢美唑、头孢替坦、头孢丙烯、氯碳头孢、头孢他美、头孢哌酮、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢克肟、头孢泊肟和头孢磺啶)。其他类别的抗生素包括碳青霉烯类(例如，亚胺培南)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南)、喹诺酮类(例如，氟罗沙星、萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、洛美沙星和西诺沙星)、四环素类(例如，多西环素、米诺环素、四环素)和糖肽类(例如，万古霉素，替考拉宁)。其他抗生素包括氯霉素、克林霉素、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲噁唑、呋喃妥因、利福平、莫匹罗星和阳离子肽。

本发明的任何前述方法还包括评估治疗性治疗的功效的步骤。因为本发明的因子具有诱导靶细胞的抗细胞凋亡、存活和/或增殖的可证明的能力，所以可通过测量相应生物途径的方面来评估治疗性治疗的功效，包括测量与此类途径相关的因子(例如，在血清中)的水平。

提供以下实施例来进一步说明本发明的实施方案，但并不意图限制本发明的范围。虽然它们是可使用的实施例中的典型实施例，但可替代地使用本领域的技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实施例1

肝再生因子的分泌

目的

本研究的目的是评估存在于本公开的系统的活性筒中的C3A细胞分泌在文献中报道为对肝细胞复制和/或肝再生具有有益作用的因子的能力。

材料和方法

使用化学发光多重阵列检测(Aushon)和/或签约的免疫测定多重服务(MyriadRules Based Medicine)针对已知的有丝分裂原、血管生成因子或文献中展示为参与肝再生的其他蛋白质测定C3A细胞盒废弃培养基。通过将灌注流速和时间相乘来将系统稳态浓度转换成“剂量”，然后与正常健康个体的文献值进行比较，并且确定剂量可预期增加到那些水平以上的质量。

结果

表III：分泌的因子

¹实验确定的稳态增长系统浓度x每个筒的流速x时间。

²正常血清水平x 3L平均身体血浆体积。

³剂量x 3L平均身体血浆体积。

讨论

这些数据证明，C3A细胞分泌据报道参与肝再生的多种蛋白质，包括生长因子、血管生成因子和造血因子。

大多数生长因子、细胞因子和激素通过细胞表面上的受体酪氨酸激酶起作用以触发细胞内信号传导级联。对于肝细胞，这些包括MET和EGFR。作用于Fas受体的配体可为细胞凋亡途径传导信号。这些多个信号传导途径的整合导致细胞是被针对增殖、存活还是细胞凋亡诱导。

HGF是最广泛已知的肝细胞有丝分裂原，但其他有丝分裂原包括转化生长因子α(TGFα)、双调蛋白、肝素结合EGF(HB-EGF)和血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)。所有这些生长因子都由C3A细胞以可测量的量分泌。

除了肝细胞有丝分裂原之外，再生肝需要增加的血管供应来支持增加的组织质量。血管内皮生长因子(VEGF)是最广泛认可的血管生成因子。它刺激窦状腺内皮细胞分泌HGF。VEGF和其他血管生成因子、VEGF-C、胎盘生长因子(PLGF)和血管生成素2(ANG2)由C3A细胞产生。

干细胞因子(SCF)和促红细胞生成素(EPO)也由C3A细胞分泌。SCF刺激骨髓细胞的造血功能，与GM-CSF协同作用以诱导胆管细胞和肝细胞的增殖和响应于IL-1β暴露的C3A细胞增加。EPO改善大鼠肝切除术模型中的存活，其中肝脏重量增加并且有丝分裂指数较高。

这些蛋白质可直接作用于肝细胞群体，或通过刺激其他驻留细胞群体(如内皮细胞、星状细胞或免疫细胞)而间接作用于肝细胞以产生肝细胞有益因子。

此外，已经显示，当C3A细胞暴露于促炎性细胞因子时，许多这些组成型分泌因子被上调，如可存在于肝炎患者中。因此在患者治疗期间蛋白质分泌的水平可进一步增加。

这些数据表明C3A细胞通过提供促肝细胞介质的环境作为治疗益处的多重机制的一部分来促进肝再生。

结论

C3A细胞能够产生已知参与肝再生的各种分泌因子。这可通过肝细胞的直接刺激直接地、通过与用本公开的系统治疗肝衰竭患者期间的其他驻留细胞群体相互作用间接地促进肝再生。

实施例2

促进肝细胞的抗细胞凋亡、存活和/或增殖能力

本研究证明C3A细胞分泌因子在肝再生的后续阶段中的潜在作用，即促进各种肝细胞类型的细胞存活和增殖能力的潜在作用。

目的

本研究的目的是评估C3A细胞分泌在文献中报道为对肝细胞存活、复制和/或肝再生具有有益作用的因子的能力。然后，发现此类因子以评估选定因子对各种肝细胞类型的作用。

材料和方法

本公开的系统是具有辅助装置部件和支持电路的由四种具有代谢活性的细胞盒(C3A细胞)组成的基于人肝细胞的肝治疗，其意图连续治疗继发于急性肝细胞损伤和酒精使用的肝功能衰竭受试者。使用签约的ELISA多重(Myriad)或化学发光多重阵列检测(Aushon Ciraplex)测定针对已知的促有丝分裂因子、血管生成因子和其他再生因子来测定C3A细胞盒废气培养基。

原代人肝细胞(PHH)细胞凋亡模型改编自Berasain等人(J Biol Chem.280(19):19012-20(2005))。在与Williams E培养基(w/补充剂，w/o地塞米松，[Gibco])或通过在成熟的C3A细胞盒中静态孵育Williams E培养基而制备的系统条件培养基(CM)一起孵育3小时后使用抗-CD95(Fas)抗体(EOS9.1，eBioscience)在PHH(Gibco)中诱导细胞凋亡。通过半胱天冬酶-Glo 3/7测定(Promega)、膜联蛋白V(Roche)和蛋白质免疫印迹(第一抗体，细胞信号传导)测量细胞凋亡。

人主动脉内皮细胞(HAEC)血管生成因子模型被开发为通过与C3A细胞在Transwell中共培养的肝窦EC(LSEC)的替代物或用通过在成熟盒中静态孵育EGM-2培养基(Lonza)制备的CM处理。通过Aushon Ciraplex在24、48和72小时时在上清液中测量选定血管生成因子的累积表达。

结果

C3A细胞盒废气培养基。

系统废弃培养基(从成熟盒收集的培养基，在稳态条件下保持流动)的评估显示C3A细胞产生许多公认的生长和血管生成因子(实施例1的表III)。

为了评估这些因子对肝的各种细胞的潜在作用，开发了一系列基于细胞的模型。

PHH细胞凋亡模型。

在用Fas-激动剂抗体激发PHH培养物之前3小时施用的CM显著减少Fas介导的细胞凋亡，如通过半胱天冬酶活性所测量(图1)。CM还减少了未处理的肝细胞的自发性细胞凋亡。与Fas-激动剂处理的PHH相比，CM处理的PHH维持更正常的大小和鹅卵石形态，如通过膜联蛋白V染色可视化(数据未示出)。

蛋白质免疫印迹显示来自用CM或CM加Fas-激动剂处理的细胞的溶解产物中与EGFR(AKT、ERK1/2和STAT3)相关的信号传导蛋白质的磷酸化。然而，这些相同的信号传导蛋白质的磷酸化也存在于未处理的对照中并且在不同程度上存在于Fas处理的细胞中(数据未示出)。

HAEC血管生成因子模型。

在72小时内每日施用的CM以时间依赖性方式显著增加HAEC的PLGF分泌(图2)。

图例

图1：CM减少PHH中的细胞凋亡，在CM存在下在未处理的培养物和Fas激动剂处理的PHH培养物两者中半胱天冬酶活性均降低。误差是96孔格式的n＝8个孔的SD(除了两个CM-处理的对比彼此，对于所有比较，***p<0.001。单向ANOVA与Tukey事后检验)。

图2：CM增加HAEC的PLGF分泌。与EGM-2培养基相比，在CM存在下HAEC培养物分泌显著更多的PLGF。误差线是24孔格式的n＝2个重复的SD。

讨论

肝再生是涉及多种途径和细胞类型的高度协调事件。代谢活性的C3A细胞通过以基于非细胞的疗法不可能实现的方式影响这些多种细胞类型和途径来提供促进肝再生的潜力。

本研究突出显示了由C3A细胞分泌的在细胞生长、存活、再生和造血中具有公认作用的11种因子。将在制造过程中由四个活性筒产生的每种因子的稳态量在表III中与正常血清值进行比较。在此不提供治疗的受试者中的预期血浆浓度的药代动力学建模。

为了开始评估这些因子对肝细胞的潜在作用并更好地理解所述系统的作用机制，将CM施用于培养的PHH。据发现CM在未处理的细胞和通过Fas-激动剂抗体针对细胞凋亡诱导的那些细胞两者中均促进存活(图1)。

类似的模型显示依赖于AR，所述AR是在部分肝切除术后用于肝再生的最必要的EGFR配体。然而，在模型中在20nM下AR没有保护性(数据未示出)。为了确定CM的促存活作用是否通过EGFR活化介导，通过蛋白质免疫印迹在有或无CM的情况下从未处理的和用Fas-激动剂处理的C3A细胞评估细胞溶解产物。发现AKT、ERK1/2和STAT3的磷酸化，从而表明EGFR的活化。C3A细胞分泌许多EGFR配体(TGFα、AR、HB-EGF)。CM的促PHH存活作用与显示来自HepG2细胞(C3A细胞的亲本细胞系)的CM含有支持培养物中的人胎儿肝细胞生长的必需因子的数据一致。

已经显示LSEC和LSEC的骨髓祖细胞(BMSPC)通过响应于肝VEGF的增加的HGF产生而参与肝再生。在LSEC的HAEC共培养替代模型中评估了C3A细胞分泌的VEGF的作用(由于HAEC的更大可用性)。尽管HGF未显著增加(DNS)，但在施用CM后24小时，PLGF的分泌相对于未处理的HAEC增加5倍。在CM存在下HAEC持续产生增加的PLGF持续所述模型的72小时长度(图2)。据称PLGF从骨髓募集VEGFR1+干细胞用于器官发生。

SCF和EPO两者均与G-CSF协同作用；SCF诱导胆管细胞和肝细胞的增殖，并且EPO增加失代偿期肝硬化患者的存活率。响应于IL-1β和IL-6，C3A细胞中的G-CSF分泌增加(数据未示出)。

结论

本公开的C3A细胞产生多种在细胞生长、存活、再生和血细胞生成中具有确认作用的分泌因子。基于细胞的模型阻止PHH细胞凋亡并增强HAEC PLGF分泌。这可通过刺激肝细胞直接地或通过与治疗期间的其他驻留细胞群体相互作用间接地促进肝再生。

实施例3

C3A细胞经由表皮生长因子受体(EGFR)活化和可溶性FAS(SFAS)分泌抑制原代人肝细胞中Fas诱导的细胞凋亡。

酒精性肝炎(AH)的特征是肝细胞死亡增加，肝功能障碍增加以及进一步在死亡细胞无效清除情况下的炎症反应。本发明人在临床上在重度急性AH(sAAH)的治疗中评估了使用本公开的C3A细胞的本公开的系统。本发明人先前表明(实施例2)，来自在三维生物反应器中生长的C3A细胞的条件培养基(CM)含有肝细胞有丝分裂原(双调蛋白、TGFα、HGF、HB-EGF和PDGF-BB)，并且可抑制原代人肝细胞(PHH)培养物中的Fas诱导的细胞凋亡，如通过半胱天冬酶3/7活性和膜联蛋白V染色所测量；然而，所述机制先前是未知的。

据推测，由CM中的配体进行的表皮生长因子受体(EGFR)活化可能是所观察到的肝保护作用的原因。本研究的目的是确定CM促进Fas诱导的细胞凋亡模型中的肝细胞存活的机制。

通过抗Fas激动剂抗体在PHH中体外诱导细胞凋亡。CM的添加显著抑制细胞凋亡，如通过半胱天冬酶-3/7活性和膜联蛋白V染色所测量，从而证实了先前报道的结果。使用蛋白质免疫印迹检测半胱天冬酶-8裂解产物的新数据(作为细胞凋亡的量度)显示与CM活化EGFR一致的模式。Fas激动剂处理的PHH溶解产物显示增加的裂解产物，而来自在CM存在下用Fas激动剂处理的PHH的溶解产物与对照相比显示裂解产物减少。此外，向Fas激动剂/CM处理的PHH添加EGFR抑制剂卡奈替尼产生类似于单独Fas激动剂的裂解产物水平。

已知与EGFR活化相关的蛋白质(例如MEK 1/2、ERK 1/2和STAT3)的磷酸化在CM处理的PHH的溶解产物中增加并且在用卡奈替尼处理的样品中减少。

用重组人双调蛋白处理减少PHH细胞凋亡，其是在卡奈替尼被添加至处理时阻断的作用。然而，双调蛋白的肝保护作用低于CM的肝保护作用，从而表明可能涉及额外的机制和/或EGFR配体。

据发现C3A细胞产生可溶性Fas(sFas)。重组人sFas有效减少PHH中的细胞凋亡，从而支持C3A细胞分泌sFas作为在这种Fas诱导的细胞凋亡模型中有助于PHH存活的另外的和新颖的因子。

这些结果证明，C3A细胞通过多种机制促进肝细胞存活，并且提出用本系统治疗可为sAAH受试者提供益处的潜在手段。

虽然已参考上述实例描述了本发明，但应当理解修改和变型涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以下权利要求限制。

Claims (55)

1.一种用于诱导靶细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、保护、存活和/或增殖和/或表型调节的组合物，所述组合物包含一种或多种抗细胞凋亡、促存活和/或促再生因子，其中所述一种或多种因子选自在表I、II或III中列出的那些因子。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述因子从源细胞分泌。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述源细胞是真核细胞。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述源细胞是哺乳动物细胞。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述源细胞是人细胞。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述源细胞是肝细胞。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述源细胞是重组工程化细胞。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述源细胞是肝母细胞瘤源性细胞。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述源细胞是HepG2细胞或C3A细胞。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述源细胞是来自亲本C3A细胞系的克隆衍生物。

11.如权利要求1所述的组合物，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述靶细胞是人细胞。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述靶细胞是肝源性细胞。

14.如权利要求1所述的组合物，其中所述靶细胞是肝母细胞瘤源性细胞。

15.如权利要求1所述的组合物，其中所述靶细胞是患病肝脏的细胞。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述疾病是肝硬化、肝炎或脂肪性肝病。

17.如权利要求1所述的组合物，其中所述因子至少包含双调蛋白(AR)或可溶性Fas受体。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述因子至少包含双调蛋白(AR)和可溶性Fas(sFas)。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述因子还包含选自表I中列出的这些因子的一种或多种另外的因子。

20.如权利要求1所述的组合物，其中所述因子包含选自表I中列出的那些的一种或多种有丝分裂原。

21.如权利要求1所述的组合物，其中所述因子包含选自表I中列出的那些的一种或多种因子，所述一种或多种因子抑制非疾病相关细胞的细胞凋亡相关的信号转导。

22.如权利要求1所述的组合物，其中所述因子包含选自表I中列出的那些的一种或多种因子，所述一种或多种因子促进疾病相关细胞的细胞凋亡。

23.如权利要求1所述的组合物，其中所述因子包含选自表I中列出的那些的一种或多种因子，所述一种或多种因子诱导使得细胞功能改善的表型改变。

24.如权利要求1所述的组合物，其中所述多种因子中的每种以至少1、10、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000pg/ml或更大的浓度存在。

25.如权利要求1所述的组合物，其中所述因子诱导活化星状细胞的细胞凋亡，但不诱导非活化星状细胞的细胞凋亡。

26.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含真核细胞。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述真核细胞是肝细胞或肝母细胞瘤源性细胞。

28.如权利要求26所述的组合物，其中所述真核细胞是重组工程化细胞。

29.如权利要求26所述的组合物，其中所述真核细胞是来自亲本C3A细胞系的HepG2细胞、C3A细胞或克隆衍生物。

30.一种诱导靶细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、保护、存活和/或增殖和/或表型调节的方法，所述方法包括使所述靶细胞与根据权利要求1-29中任一项所述的组合物接触，从而诱导所述靶细胞的抗细胞凋亡、抗细胞焦亡、抗坏死性凋亡、保护、存活和/或增殖和/或表型调节。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述靶细胞是真核细胞。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述靶细胞是人细胞。

34.如权利要求30所述的方法，其中所述靶细胞是肝细胞。

35.如权利要求30所述的方法，其中所述细胞是肝母细胞瘤源性细胞。

36.如权利要求30所述的方法，其中所述细胞是患病肝脏的细胞。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述疾病是肝硬化、肝炎或脂肪性肝病。

38.如权利要求30所述的方法，其中在体外接触所述靶细胞。

39.如权利要求38所述的方法，其中将所述靶细胞粘附至固体基质。

40.如权利要求38所述的方法，其中将所述靶细胞包埋在半固体基质中。

41.如权利要求30所述的方法，其中在体内接触所述靶细胞。

42.如权利要求41所述的方法，其中在与含有所述靶细胞的受试者联接的体外血液解毒系统的活性筒中产生所述多种因子。

43.如权利要求30所述的方法，其还包括检测所述多种因子。

44.如权利要求30所述的方法，其中持续地接触所述靶细胞超过1小时、6小时、24小时、48小时、60小时、72小时或84小时。

45.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-29中任一项所述的组合物，从而治疗所述疾病或病症。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述疾病或病症是炎性疾病。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病或自身炎性疾病。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述疾病是选自由以下各项组成的组的肝病：肝硬化、肝炎和脂肪性肝病。

49.如权利要求45所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者的循环系统。

50.如权利要求49所述的方法，其中经由与所述受试者联接的体外血液解毒系统施用所述组合物。

51.如权利要求50所述的方法，其中由所述血液解毒系统的活性筒中的细胞产生所述组合物。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述血液解毒系统包括：

a)血液回路，其联接至所述受试者的所述循环系统并且可操作来将来自所述受试者的血液传送通过超滤液发生器并且返回至所述受试者；

b)再循环回路，其与所述超滤液发生器联接并且可操作来从所述超滤液发生器抽吸超滤液并独立于所述血液的细胞组分处理超滤液，其中处理包括：使所述超滤液通过包括所述细胞的活性筒，所述细胞产生包含所述多种因子的所述组合物；以及将所述因子引入所述超滤液中；以及

c)导管接合部，其可操作来重新组合所述再循环回路中的所述超滤液和所述血液回路中的所述细胞组分，然后重新引入至所述受试者。

53.如权利要求52所述的方法，其还包括检测所述多种因子。

54.如权利要求49所述的方法，其中持续施用所述组合物超过1小时、6小时、24小时、48小时、60小时、72小时或84小时。

55.一种源自亲本C3A细胞系的合格C3A细胞系，其中所述细胞系的细胞表达如在表I中列出的多种因子。