CN105263523A

CN105263523A - 使用微rna和egfr-tki抑制剂的联合癌症治疗

Info

Publication number: CN105263523A
Application number: CN201480026816.XA
Authority: CN
Inventors: 安德里斯·巴德; 简·赵; K·凯尔纳
Original assignee: Asuragen Inc
Current assignee: Asuragen Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-01-20
Also published as: AU2014228166A1; MX2015013177A; US20140309278A1; WO2014143855A3; US20150272981A1; CA2903882A1; EP2968567A2; EA201591543A1; BR112015023439A2; KR20150131312A; JP2016519076A; WO2014143855A2

Abstract

本公开内容提供了用于处理癌细胞(包括受试者的癌细胞)的方法和组合物，借此使用两种或更多种治疗剂，一种是EGFR-TKI药剂而另一种是微RNA。

Description

使用微RNA和EGFR-TKI抑制剂的联合癌症治疗

相关申请

本申请要求2013年3月15日提交的美国序列号61/787,558和2014年1月15日提交的美国序列号61/927,543申请的优先权，其均通过引用全文并入本文。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子提交并通过引用全文并入于此的序列表。创建于2014年3月11日的所述ASCII拷贝被命名为112172-201_SL.txt并且大小为26,427个字节。

技术领域

本发明涉及癌症治疗，更具体地涉及使用微RNA(microRNA)和EGFR-TKI抑制剂的联合癌症治疗。

背景技术

肺癌在男性和女性癌症相关死亡中均占最多数。预期在2012年估计有约220,000例肺癌新病例，占全部癌症诊断的约14％(CancerFacts&Figures2012,Society)。肺癌是癌症相关死亡的主要原因，2012年总数估计有160,000例死亡，相当于全部癌症死亡的约28％。肺癌分为两个主要类别。小细胞肺癌(SCLC)影响到20％的患者而非小细胞肺癌(NSCLC)影响到约80％。NSCLC包括三个主要类型：腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，其中肺腺癌和鳞状细胞癌占所有肺癌的绝大部分(参见，例如，Forgacs等人,PatholOncolRes,2001.7(1):6-13；Sekido等人,BiochimBiophysActa,1998.1378(1):F21-59)。治疗包括手术、放射治疗、化疗和靶向治疗。对于局部NSCLC，手术通常是所选的治疗，并且通过手术后给予化疗提高了这些患者中大多数的存活率。根据癌症基因型或疾病的阶段使用靶向治疗，靶向治疗包括贝伐珠单抗(Avastin^TM，Genentech/Roche)——一种靶向VEGF-A的人源化单克隆抗体，埃罗替尼(Tarceva^TM，Genentech/Roche)——一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，和克唑替尼(crizotinib)(Xalkori^TM，Pfizer)——ALK(间变性淋巴瘤激酶)和ROS1(c-ros癌基因，受体酪氨酸激酶)的抑制剂。克唑替尼已被FDA批准用于治疗某些晚期(局部晚期或转移性)非小细胞肺癌，并限于表达突变的ALK基因的那些。贝伐珠单抗已被首次批准在一线晚期非鳞状NSCLC中与卡铂/紫杉醇化疗联合使用。此后，美国国家综合癌症网络(NationalComprehensiveCancerNetwork)推荐贝伐珠单抗作为与任何基于铂的化疗相联合的标准一线治疗，随后维持贝伐珠单抗直至疾病进展(Sandler等人,NEnglJMed,2006.355(24):2542-50)。

埃罗替尼获得了美国食品和药物管理局(FDA)的快速通道批准，用于在先前的传统化疗方案失败后的NSCLC患者(Cohen等人,Oncologist,2005.10(7):461-6；Cohen等人,Oncologist,2003.8(4):303-6)。它是EGFR激酶的可逆抑制剂，被设计为充当在EGFR激酶的活性位点处的ATP结合的竞争性抑制剂(Sharma等人.NatRevCancer,2007.7(3):169-81)。吉非替尼是在美国之外的国家中使用的另一种EGFR-TKI药剂。虽然不存在比较吉非替尼与埃罗替尼的直接对比效果试验，但数据表明它们之间没有大的治疗差异(Pao等人,NatRevCancer,2010.10(11):760-74)。使用EGFR-TKI的早期临床试验在一定程度上是令人鼓舞的，其中在约10-20％的接受治疗的NSCLC患者中观察到部分反应(Fukuoka等人.JClinOncol,2003.21(12):2237-46)。药物反应更常发生于女性、从不吸烟者、亚裔患者和诊断为腺癌或具有支气管肺泡组织学的那些人(Fukuoka等人,JClinOncol,2003.21(12):2237-46；Bell等人,JClinOncol,2005.23(31):8081-92)。值得注意的是，这两种药物仅使患者总体存活期延长约2个月，它们由于原发性或获得性的继发性抗性而失去功效(Sharma,同上；Shepherd等人,NEnglJMed,2005.353(2):123-32)。

吉非替尼和埃罗替尼的不够理想的反应率已引发了多项研究来评估反应性与抗性患者人群的遗传背景。临床试验的追溯分析揭示，EGFR表达水平与对吉非替尼的反应不相关(Bell，同上)。相反，对所述药物有反应的患者经常在EGFR激酶结构域中具有激活突变(同上)。然而，少于50％的具有EGFR突变的患者产生反应，表明还存在另外的决定对EGFR-TKI的敏感性的因素。原发性抗性或继发性抗性与以下因素相关：(1)K-RAS突变，它可与EGFR突变共同存在，尽管K-RAS与EGFR突变似乎是显著相互排斥的(Gazdar等人,TrendsMolMed,2004.10(10):481-6；Pao等人,PLoSMed,2005.2(1):e17)；(2)c-Met(一种向PI3K途径发信号的受体酪氨酸激酶)的扩增和超表达，代替EGFR的失活(Engelman等人,Science,2007.316(5827):039-43)；(3)EGFR的催化域中第二突变的获得(通常是T790M)(Pao等人.PLoSMed,2005.2(3):e73)，(4)BRAF突变(Pratilas等人,CancerRes,2008.68(22):9375-83)；(5)ALK易位(Shaw等人,JClinOncol,2009.27(26):4247-53)；(6)肝细胞生长因子(HGF)超表达，其为MET受体的配体(Yano等人,CancerRes,2008.68(22):9479-87)；(7)其他EGFR突变的存在(在外显子20中的小插入或复制：D770_N771、insNPG、insSVQ、insG和N771T)(Wu等人,ClinCancerRes,2008.14(15):4877-82)；以及(8)影响EGFR下游的信号传导的遗传损伤，包括PIK3CA(Engelman等人,JClinInvest,2006.116(10):2695-706；Kawano等人,LungCancer,2006.54(2):209-15)，PTEN(Sos等人,CancerRes,2009.69(8):3256-61)、IGF1R和KDM5A(Gong等人,PLoSOne,2009.4(10)e7273；Sharma等人,Cell.141(1):69-80)的损失。T790M突变发现于约50％的具有获得性抗性的EGFR突变肿瘤中；KRAS突变发生于全部NSCLC的15-25％中；突变的BRAF和ALK易位分别发现于2-3％和5％的NSCLC中(Pao等人,NatRevCancer,2010.10(11):760-74)。因此，有可能对EGFR-TKI治疗有反应的NSCLC患者的百分比相对较小。可能存在介导对EGFR抑制剂的抗性的其他尚未鉴定的分子决定因素。

作为单一治疗剂的埃罗替尼的适度功效要求这些EGFR-TKI与其他治疗方案联合使用。III期临床试验TRIBUTE/TALENT试验(其研究埃罗替尼与顺铂/吉西他滨或卡铂/紫杉醇组合的效果)未能证明该药物相对于单独的传统化疗的存活益处(Sharma,同上；Herbst等人,JClinOncol,2005.23(25):5892-9；以及Giaccone等人,JClinOncol,2004.22(5):777-84；以及Herbst等人,JClinOncol,2004.22(5):785-94)。因此，目前正在将埃罗替尼与在临床前研究中显示有前景的结果的其他靶向小分子抑制剂组合进行测试，这样的抑制剂抗mTOR和MET(Pao，同上)。该策略在具有EGFR-TKI抗性的患者中是否有效仍有待确定。可获得的数据表明抗性肿瘤由在已经携带抗性基因的突变的未经处理的肿瘤中的稀有细胞引起，而这些亚群被选择用于TKI治疗的整个过程(同上)。也有可能未经处理的肿瘤已经显示出EGFR-TKI抗性细胞的异基因谱，表明靶向治疗的单一药物组合将不足以用于有效治疗。相反，若干组合的顺序使用对于消除在先前治疗过程中经历阳性选择的抗性肿瘤可能是必要的。

因此，尽管在肺癌的治疗中已取得进展，但肺癌患者的存活率仍然极低。目前的靶向治疗诸如EGFR-TKI前景可观，但由于原发性和继发性抗性的存在或发展而在单一治疗中缺乏满意的功效。EGFR抑制剂与其他靶向治疗的联合使用可有助于EGFR抑制剂的功效，并且可以帮助克服或阻止抗药性。

初步研究表明，某些miRNA可在体外使癌细胞致敏(在Bommer等人,CurrBiol,2007.17(15):1298-307中评述)。例如，let-7能够使肺癌细胞对基于TRAIL的吉西他滨或放射治疗敏感(Li等人,CancerRes,2009.69(16):6704-12；Ovcharenko等人,CancerRes,2007.67(22):10782-8；Weidhaas等人,CancerRes,2007.67(23):11111-6)。类似地，miR-34提高了传统治疗在前列腺、结肠、脑、胃、膀胱和胰腺的癌细胞系中的功效(Fujita等人,BiochemBiophysResCommun,2008.377(1):114-9；Ji等人,PLoSOne,2009.4(8):e6816；Kojima等人,Prostate.70(14):1501-12.Akao等人,CancerLett.300(2):197-204；Weeraratne等人,NeuroOncol.13(2):165-75；Ji等人,BMCCancer,2008.8:266；以及Vinall等人,IntJCancer,2011.130(11):2526-38)。然而，仍然不存在任何埃罗替尼/miRNA组合在肺癌的细胞和动物模型中的示例。

近来，Zong等人(Chemico-BioInterac.2010,184:431-438)已经测试了let-7a、miR-126和miR-145使吉非替尼抗性细胞系A549和H460对吉非替尼敏感的能力。IC₅₀的最大降低通过H440细胞中的miR-126而实现(约7倍)，而其余的条件仅导致IC₅₀降低2-3倍(参见Zhong(同上)中的表2)。

发明内容

本发明部分地基于以下发现：某些微RNA可在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地上调或下调，以及微RNA和EGFR-TKI药剂的特定组合可具有有利的和/或出乎意料的结果，例如由于它们在处理某些癌细胞中尤其有效(例如，协同作用或具有大于累加效应的效果)。因此，本发明在各个方面和实施方案中包括使细胞、组织和/或生物与微RNA和EGFR-TKI药剂的特定组合相接触。更具体地，本发明可包括使癌细胞、癌组织和/或患有癌症的生物与微RNA和EGFR-TKI药剂的这样的组合相接触。所述方法可以是实验性的、诊断性的和/或治疗性的。所述方法可用于抑制或减少细胞(包括组织或生物中的细胞)的增殖。微RNA可以是例如在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地下调或上调的微RNA的模拟物或抑制剂。

因此，在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法。在某些实施方案中，该方法包括：向所述受试者施用EGFR-TKI药剂，以及向所述受试者施用miR-34、miR-126、miR-124、miR-147和miR-215的微RNA模拟物。类似的方法包括：使细胞或组织(例如，癌细胞或癌组织如肿瘤)与EGFR-TKI药剂相接触(例如，处理)，以及使所述细胞或组织与miR-34、miR-126、miR-124、miR-147和miR-215的微RNA模拟物相接触。所述微RNA可包含与SEQIDNO:1-6和168-179(miR-34、miR-126、miR-124、miR-147和miR-215，及其家族成员、功能同源物、种子序列或共有序列)中的至少一个至少80％(或85％、90％、95％、100％)相同的序列。这些以及其他微RNA可包含天然核酸、其衍生物和化学修饰形式以及核酸类似物。

在各个方面和实施方案中，本发明提供了向受试者(例如，患有癌症的受试者)施用EGFR-TKI药剂以及向所述受试者施用在附录A中以SEQIDNO:8-122列出的微RNA(下调的微RNA)的微RNA模拟物的方法。类似的方法包括使细胞或组织(例如，癌细胞或癌组织如肿瘤)与EGFR-TKI药剂相接触，以及使所述细胞或组织与在附录A中以SEQIDNO:8-122列出的微RNA(下调的微RNA)的微RNA模拟物相接触。该微RNA可包含与SEQIDNO:8-122中的至少一个至少80％(或85％、90％、95％、100％)相同的序列。

在各个方面和实施方案中，本发明提供了向受试者(例如，患有癌症的受试者)施用EGFR-TKI药剂以及施用在附录A中以SEQIDNO:123-167，优选SEQIDNO:156-167，更优选SEQIDNO:159、164和165列出的微RNA(上调的微RNA)的抑制剂的方法。类似的方法包括使细胞或组织(例如，癌细胞或癌组织如肿瘤)与EGFR-TKI药剂相接触，以及使所述细胞或组织与在附录A中以SEQIDNO:123-167，优选SEQIDNO:156-167，更优选SEQIDNO:159、164和165列出的微RNA(上调的微RNA)的抑制剂相接触。该抑制剂可以是包含与微RNA至少80％(或85％、90％、95％、100％)互补的序列的微RNA。

在各个实施方案中，所述EGFR-TKI药剂可以是埃罗替尼或类似的EGFR-TKI药剂如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗或西妥昔单抗，或HER2抑制剂如拉帕替尼、培妥珠单抗或曲妥珠单抗。在一些实施方案中，所述EGFR抑制剂是埃罗替尼，并且所述微RNA与SEQIDNO:1-4中的一个，例如SEQIDNO:1至少80％(或85％、90％、95％、100％)相同。

在各个实施方案中，所述癌症可以是其中根据本发明的微RNA和EGFR-TKI抑制剂的组合是对其有效的治疗的癌症，例如肺癌(例如，非小细胞肺癌，NSCL)和肝癌(例如，肝细胞癌，HCC)。所述癌症可包括肝的转移性病变。

在各个实施方案中，所述癌症可以对单独采用EGFR-TKI药剂的治疗具有抗性。所述抗性可以是原发性或继发性的(获得性的)。所述癌症可以是对单独采用EGFR-TKI药剂的治疗具有原发性或继发性抗性的肺(例如，NSCL)癌。所述癌症可以是对单独采用EGFR-TKI药剂的治疗具有原发性或继发性抗性的肝癌(例如，HCC)。

在各个实施方案中，所述EGFR-TKI药剂可以以有效剂量施用，该有效剂量比在不存在微RNA施用的情况下有效所需的剂量低(例如，低至少50％)。所述剂量可以是在不存在微RNA的情况下所必需的剂量以下5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％。

在各个实施方案中，所述EGFR-TKI药剂的IC₅₀相对于在不存在微RNA施用的情况下的IC₅₀降低(例如，至少2倍)。所述IC₅₀可降低至少1.5、2、2.5、3、4、5或10倍。

在各个实施方案中，所述受试者是人、非人灵长类动物或实验动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪)。所述受试者可具有KRAS突变。所述受试者可具有EGFR突变。在一些实施方案中，所述受试者对埃罗替尼具有原发性或继发性抗性，例如，已发展或有可能发展对EGFR-TKI药剂的抗性的患者。或者，所述受试者的癌症可对EGFR-TKI药剂足够敏感，然而，单一治疗的这种毒性可表明较低剂量的EGFR-TKI药剂是理想的。

本发明的各个方面、实施方案和特征在下文中进行了更详细的说明和描述。然而，如所声称的，前文和以下描述仅是说明和解释性的，并非对本发明的限制。

附图说明

图1示出了具有继发性(获得性)抗性的细胞系的产生。通过在低浓度的埃罗替尼(IC₁₀)下处理亲代细胞并继续将浓度经2-3个月提高至IC₉₀来产生HCC827抗性细胞。

图2A-2C示出了控制埃罗替尼抗性的新型miRNA候选物的鉴定。从埃罗替尼抗性HCC827细胞中分离RNA，并在Agilent/Sanger12_0miRNA阵列上对该RNA进行测试以鉴定在HCC埃罗替尼抗性细胞与亲代埃罗替尼敏感性细胞系中差异表达的miRNA。在浅色框(box)和深色框中的miRNA分别在同一基因簇上编码。CP，顺铂；VC，长春新碱；DA，柔红霉素；TZ，替莫唑胺(temozolodime)；DR，多柔比星；PT；紫杉醇；IFN，干扰素；MDR，多药；A，凋亡；C，西妥昔单抗；G，吉西他滨；T，他莫昔芬；M，甲氨蝶呤；5-FU，5-氟尿嘧啶；AM，阿霉素。

图3A-3C显示了埃罗替尼和特定miRNA的组合效果。图3A：单独埃罗替尼的IC₅₀值的确定。图3B：单独miRNA的IC₅₀(或IC₂₀或IC₂₅)值的确定。图3C：miR-34a与埃罗替尼的组合效果的确定。将miR-34在固定的低浓度(～IC₂₅)下反向转染。然后，用系列稀释的埃罗替尼处理细胞。通过目测剂量响应曲线和IC₅₀值的位移来评价组合效果。

图4A-D示出了恢复癌细胞中的EGFR-TKI敏感性的微RNA模拟物的示例。图4A：埃罗替尼在亲代HCC827细胞中的剂量依赖性效应。用系列稀释的埃罗替尼处理细胞3天，并通过AlarmaBlue来测定细胞增殖。图4B：通过经10周的过程将细胞与浓度增加的埃罗替尼一起温育来发展对埃罗替尼具有抗性的HCC827细胞(HCC827^res)，直到细胞在等于亲代HCC827中的IC₉₀的浓度下正常生长。图4C和4D：将HCC827^res和H1299细胞用0.3nMmiR-34a或miR-NC(阴性对照)反向转染，并在补充有系列稀释的埃罗替尼的培养基中温育。3天后，测定细胞增殖。图中示出了单独的或与miRNA组合的埃罗替尼的IC₅₀值。

图5A-C示出了在癌细胞中微RNA模拟物与EGFR-TKI药剂之间，特别是在NSCLC细胞中miR-34a模拟物与埃罗替尼之间的协同效应的示例。图5A：组合指数(CI)分析。CI值通过线性回归和非线性回归方法产生。趋势线指示在任何给定效果下的CI值(Fa，受影响的分数，％抑制)，并且符号表示源自实际数据点的CI值。CI＝1，加和性；CI>1，拮抗作用；CI<1，协同作用。图5B：等效线图分析。虚线对角线指示加和性，并且正方形符号显示了分别达到50％和80％(A549、H1299、H460)或30％和50％(H226)癌细胞抑制的剂量要求。加和性线下面的数据点表示协同作用，以上的数据点表示拮抗作用。图5C：曲线位移分析。将源自非线性回归趋势线的数据对单一药剂的IC₅₀值进行归一化(IC₅₀等效)并绘制在同一幅图中。组合的剂量响应曲线(虚线)相对于单一药剂的剂量响应曲线的向左和向右的位移(灰、黑)分别表示协同或拮抗作用。示出了实际的实验数据点。

图6A-D示出了在癌细胞中微RNA模拟物与EGFR-TKI之间的协同效应的示例，特别是埃罗替尼与miR-34a的某些比例如何在A549细胞中协同配合。图6A：汇总表，显示了以各种浓度和比例组合的埃罗替尼和miR-34a的效能(Fa)、CI和DRI值。示出了miR-34-埃罗替尼摩尔比1:533、1:1333、1:3333(IC₅₀:IC₅₀比)、1:8333和1:20833。图6B：各种药物比例的组合指数图。来自实际数据点的CI值用符号表示。图6C：在80％癌细胞抑制下的等效线图。正方形符号表示各种比例的80％等效线。虚线表示源自产生80％(±2％)抑制的实际埃罗替尼-miR-34a组合的等效线。图6D：各种药物比例的曲线位移分析。

图7A-C示出了在癌细胞中微RNA模拟物与EGFR-TKI之间的协同效应的示例，特别是埃罗替尼与miR-34a如何在HCC细胞中协同作用。图7A：组合指数分析。图7B：等效线图分析。图7C：曲线位移分析。对该图的解释参见图5。

图8A-C示出了控制NSCLC细胞中埃罗替尼抗性的基因的内源miR-34和mRNA水平。在一式三份的qRT-PCR中使用总RNA来测量参与埃罗替尼抗性的基因的miR-34a/b/c和mRNA水平。将数据分别对管家miRNA和mRNA进行归一化，并表示为相比于HCC827细胞中的水平的变化百分比。u，未检测的。

图9A-B示出了单一药剂在对埃罗替尼具有抗性的NSCLC细胞中的剂量-响应曲线。单独采用埃罗替尼或miR-34a在所指示的浓度下一式三份处理细胞。分别在埃罗替尼处理或miR-34a反向转染后3天或4天测定细胞增殖。使用Graphpad产生非线性回归趋势线，并计算IC₅₀和IC₂₅值。用R²值表示非线性回归趋势线的拟合优度。星号表示由剂量-响应曲线(H226)的外推得到的理论IC₅₀值。

图10A-D示出了汇总表，其显示在NSCLC细胞中以各种浓度和比例组合的埃罗替尼和miR-34a的效能、CI和DRI值。产生Fa>65％、CI<0.6、DRI>2的组合以灰色突出显示并被认为是相关的。Fa，受影响的分数(细胞增殖的％抑制)；CI，组合指数；DRI，剂量降低指数。

图11示出了控制HCC细胞中埃罗替尼抗性的基因的miR-34和mRNA的内源性表达。在一式三份的qRT-PCR中使用总RNA来测量参与埃罗替尼抗性的基因的miR-34a/b/c和mRNA水平。分别将数据对管家miRNA和mRNA进行归一化，并表示为相比于在HCC827细胞中的水平的变化百分比。u，未检测的。

图12A-B示出了单一药剂在对埃罗替尼具有抗性的HCC细胞中的剂量-响应曲线。单独采用埃罗替尼或miR-34a在所指示的浓度下一式三份处理细胞。分别在埃罗替尼处理或miR-34a反向转染后3天或6天测定细胞增殖。使用Graphpad产生非线性回归趋势线，并计算IC₅₀和IC₂₅值。用R²值表示非线性回归趋势线的拟合优度。星号表示由剂量-响应曲线(Hep3B、C3A、HepG2)的外推得到的埃罗替尼的理论IC₅₀值。

图13A-D示出了汇总表，其显示在HCC细胞中以各种浓度和比例组合的埃罗替尼和miR-34a的效能、CI和DRI值。产生Fa>65％、CI<0.6、DRI>2的组合以灰色突出显示并被认为是相关的。Fa，受影响的分数(细胞增殖的％抑制)；CI，组合指数；DRI，剂量降低指数。

图14示出了显示在全部四种测试的乳腺癌细胞系(BT-549、MCF-7、MDA-MB-231、T47D)中与拉帕替尼协同作用的miR-34-Mim的数据。符号表示源自实际数据点的CI值。CI，组合指数；Fa，受影响的分数(＝增殖的抑制)；CI＝1，加和性；CI>1，拮抗作用；CI<1，协同作用。

具体实施方式

本发明部分地基于以下发现：某些微RNA可在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地上调或下调，以及微RNA和EGFR-TKI药剂的特定组合可具有有利的和/或出乎意料的结果，例如由于它们在处理某些细胞中尤其有效(例如，协同作用或具有大于累加效应的效果)。因此，本发明在各个方面和实施方案中包括使细胞、组织和/或生物与微RNA和EGFR-TKI药剂的特定组合相接触。更具体地，本发明可包括使癌细胞、癌组织和/或患有癌症的生物与微RNA和EGFR-TKI药剂的这样的组合相接触。所述方法可以是实验性的、诊断性的和/或治疗性的。所述方法可用于抑制或减少细胞(包括组织或生物中的细胞)的增殖。微RNA可以是例如在EGFR-TKI抗性细胞系中一致地下调或上调的微RNA的模拟物或抑制剂。

微RNA

微RNA(miRNA)是天然存在的小的非编码RNA分子，它在转录后调节基因表达并通过调节多种基因产物和细胞途径来决定细胞命运(Bartel,Cell,2004.116(2):281-97)。miRNA通过经由阻断蛋白质翻译机制降解mRNA转录物来干扰基因表达(Bartel，同上)。miRNA靶向至具有这样的序列的mRNA，该序列完全或仅部分互补，赋予这些调节性RNA靶向至范围宽但特异性的一组mRNA的能力。迄今为止，存在在多种过程如细胞增殖、分化、凋亡、干细胞发育和免疫功能中发挥作用的约1,500个人类注释的miRNA基因(Costinean等人,ProcNatlAcadSciUSA,2006.103(18):7024-9)。通常，miRNA的误调节可能导致包括癌症在内的人类疾病的发展(Esquela-Kerscher等人,NatRevCancer,2006.6(4):259-69；Calin等人,2006.6(11):857-66)。在癌症中解除调节的miRNA可用作真正的肿瘤抑制基因或癌基因。单一miRNA可靶向至多个癌基因和致癌信号途径(Forgacs等人,PatholOncolRes,2001.7(1):6-13)，并且将这种能力转化为将来的治疗可能有希望产生对抗肿瘤异质性有效的治疗方法。因此，miRNA具有成为针对癌症的强力治疗剂的潜力(Volinia等人,ProcNatlAcadSciUSA,2006.103(7):2257-61；Tong等人,CancerGeneTher,2008.15(6):341-55)，根据我们目前对癌症的理解，该癌症充当仅在采取多个癌症途径干预时才能被成功治疗的“途径疾病”(Wiggins等人,CancerRes,2010.70(14):5923–5930；Jones等人,Science,2008.321(5897):1801-6；Parsons等人,Science,2008.321(5897):1807-12)。

截至2013年3月，MirnaTherapeutics(Austin，TX)已完成了临床前开发项目，以支持cGMP材料的生产和基于miR-34的补充治疗(MRX34)的IND授权研究(IND-enablingstudies)的进行。Mirna在非GLP初步研究中使用小鼠、大鼠和非人灵长类动物评估了含有miR-34模拟物的制剂的毒性以及药代动力学特性。这些实验在预测的MRX34的治疗水平下没有显示不良事件，如通过临床观察、体重、临床化学(包括LFT、RFT以及其他)、血液学、总体病理学、选择器官的组织病理学和补体(CH₅₀)所测定的。此外，配制成脂质纳米颗粒的miRNA模拟物并不诱导先天免疫系统，如在完全免疫活性的小鼠、大鼠、非人灵长类动物以及人全血样本中所显示的。在Bader,FrontGenet.2012；3120中提供了对临床前数据的更详细的评述。

在本发明的方法中，将特定微RNA(例如，合成的微RNA模拟物或抑制剂)作为与EGFR-TKI药剂的联合治疗的一部分施用于受试者。在具体的实施方案中，这样的微RNA选自SEQIDNO:1-179。这些微RNA是本领域公知的，并且本领域技术人员将会理解它们包括传统的天然存在的序列(本文所提供的)及其任何化学修饰的形式和序列同源物。

在各个方面和实施方案中，本发明采用不通过转染递送至细胞的微RNA模拟物或抑制剂。相反，在各个实施方案中，可以通过诸如注射或输注的方法来施用微RNA。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物(例如，人或实验动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、非人灵长类动物等)，而非分离的细胞、组织或其培养物。

与本发明结合使用的微RNA可以是7-130个核苷酸长的双链RNA分子，其具有两个独立的链或发夹结构。例如，微RNA可以是7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、7-30、7-25、15-30、15-25、17-30或17-25个核苷酸长。两条链中被称作“引导链”的一条链含有与下表中所示的亲本微RNA序列的种子序列(核苷酸位置2-9)相同或基本相同的序列。如本文所用的“基本相同”意指最多允许1或2个置换和/或缺失。在一些实施方案中，所述引导链包含与本文提供的相应全长序列至少80％、85％、90％、95％相同的序列。两条链中被称作“随从链(passengerstrand)”的第二条链含有与相应的给定微RNA的种子序列互补或基本互补的序列。如本文所用的“基本互补”意指最多允许1或2个错配和/或缺失。在一些实施方案中，所述随从链包含与本文提供的相应的全长序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％相同的序列。在一些实施方案中，该微RNA是miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b、miR-449c、miR-192、miR-215、miR-126、miR-124、miR-147或其类似物或同源物的模拟物。在一些实施方案中，该微RNA包括这些微RNA中的一个的种子序列。

表1-微RNA序列和序列标识号

“*”表示缺失或任何核苷酸。种子序列以粗体突出显示。

微RNA(例如微RNA模拟物)可配制在脂质体中，例如在美国专利号7,858,117和7,371,404；美国专利申请公开号2009-0306194和2011-0009641中所述的那些脂质体中。其他的递送技术是本领域已知的并且可获得的，包括表达载体、脂质或各种配体偶联物。

在某些实施方案中，本发明的方法包括施用选自在附录A中以SEQIDNO:123-167，优选SEQIDNO:156-167，更优选SEQIDNO:159、164和165列出的微RNA的微RNA的抑制剂。微RNA的抑制剂是本领域公知的并且通常是与靶微RNA互补的反义分子，然而，也可使用其他类型的抑制剂。例如，在美国专利号8,110,558中描述了微RNA的抑制剂。在某些实施方案中，微RNA的抑制剂含有9-20、10-18或12-17个核苷酸长的序列，该序列与在附录A中以SEQIDNO:123-167，优选SEQIDNO:156-167，更优选SEQIDNO:159、164和165列出的相应上调的微RNA序列互补或基本互补。

也可对微RNA及其抑制剂进行化学修饰，例如，微RNA可具有在随从链上的5'帽(例如，NH₂-(CH₂)₆-O-)和/或在同一条链的第一和/第二核苷酸处的错配。其他可能的化学修饰可包括骨架修饰(例如，硫代磷酸酯、吗啉代)、核糖修饰(例如，2'-OMe、2'-Me、2'-F、2'-4'-锁糖/桥糖(例如，LNA、ENA、UNA)以及核碱基修饰(参见，例如，Peacock等人,2011.JAmChemSoc.,133(24):9200–9203)。在某些实施方案中，微RNA，尤其是miR-34和miR-124，具有如在美国专利号7,960,359和美国专利申请公开号2012-0276627和2012-0288933中所述的修饰。

微RNA可以作为缓慢团注以范围为每剂0.001-10.0mg/kg，例如，每剂0.01-3.0、0.025-1.0或0.25-0.5mg/kg的剂量，每周一、二、三个或更多个剂量地静脉内施用2、4、6、8周或必要时更长的时间。

EGFR-TKI药剂

本发明的方法包括向受试者施用EGFR-TKI药剂。表皮生长因子受体(EGFR)的家族包括四种结构相关的细胞表面受体酪氨酸激酶，这些细胞表面受体酪氨酸激酶响应于表皮生长因子(EGF)家族的成员结合并引发功能。在人类中，这包括EGFR(也称为Her-1和ErbB1)、Her-2(也称为Neu和ErbB2)、Her-3(ErbB3)和Her-4(ErbB4)。ErbB信号传导的超活化与很多种实体瘤的发展有关。因此，在各种其他实施方案中，本发明包括微RNA与埃罗替尼以及其他EGFR抑制剂如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗和西妥昔单抗以及HER2抑制剂如拉帕替尼、培妥珠单抗和曲妥珠单抗的组合。

在某些实施方案中，所述EGFR-TKI是埃罗替尼，即目前以商品名销售的药物的活性成分。除非另有明确说明，本文中的术语“埃罗替尼”指的是式I的化合物，也指其任何盐或酯。

埃罗替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，即一种化学名为N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺的喹唑啉胺。在具体的实施方案中，该埃罗替尼是盐酸埃罗替尼。用于口服给药的片剂可以以三个剂量强度获得，其含有相当于25mg、100mg和150mg埃罗替尼的盐酸埃罗替尼(27.3mg、109.3mg和163.9mg)，以及下列非活性成分：乳糖一水合物、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、羟乙酸淀粉钠、月桂基硫酸钠和二氧化钛。所述片剂还包含痕量的色素添加剂，包括用于产物辨识的FD&CYellow#6(仅25mg)。进一步的信息可从批准的药物标签上获得。

埃罗替尼还描述于美国专利号6,900,221(其通过引用并入本文)以及相应的PCT公开WO01/34574中。

用于NSCLC的的批准推荐剂量是150mg/天；用于胰腺癌的批准剂量为100mg/天。必要时可将剂量以50mg的递减量降低。

在其中EGFR-TKI药剂是埃罗替尼的某些实施方案中，微RNA不具有miR-126的序列(例如，与人类miR-126的序列或其种子序列有小于100％、95％、90％、85％或80％的同一性)。

在其他实施方案中，所述EGFR-TKI药剂是吉非替尼，即以商品名销售的药物的活性成分。除非另有明确说明，术语“吉非替尼”在本文中指的是式II的化合物，也指其任何盐或酯。

吉非替尼是化学名称为4-喹唑啉胺、N-(3-氯-4氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-4-吗啉)丙氧基]以及还称作ZD1839的酪氨酸激酶抑制剂。临床制剂作为250mg的片剂提供，该片剂含有活性成分、乳糖一水合物、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、月桂基硫酸钠和硬脂酸镁。作为单一治疗的推荐的剂量为每天一个250mg的片剂。进一步的信息可在批准的药物标签上找到。

其他EGFR抑制剂，如阿法替尼、帕尼单抗和西妥昔单抗，以及HER2抑制剂如拉帕替尼、培妥珠单抗和曲妥珠单抗是本领域已知的，因此普通技术人员将容易知晓它们在将要与本发明一起使用时所需的结构、配制、剂量和给药等(例如，基于公开的医学信息如批准的药物标签)。

癌症

本发明提供了用于处理癌细胞和/或组织(包括受试者的癌细胞和/或组织)的方法和组合物，或者分离的癌细胞和/或组织的体外处理。如果在受试者体内，则待治疗的受试者可以是动物，例如，人或实验动物。

正在治疗的受试者可被诊断为患有癌症，例如，肺癌(非小细胞肺癌(NSCLC)，例如，腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌)、胰腺癌或肝中的癌症或受益于EGRF抑制的任何其他类型的癌症(包括乳腺癌、HCC、结肠直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌或膀胱癌)。在一些实施方案中，所述细胞或受试者对EGFR-TKI药剂具有原发性或继发性抗性。

所述受试者可能具有局部晚期、不可切除的或转移性癌症，和/或可能先前的一线治疗已经失败。在一些实施方案中，所述受试者已经经历了持续至少2、4、6、8、10个月或更长时间的采用EGFR-TKI药剂的先前治疗。在其他实施方案中，所述受试者具有EGFR中的T790M突变(Balak等人.2006.ClinCancerRes,12(1):6494–501)。在其他实施方案中，所述受试者是已经历对EGFR-TKI药剂的一个或多个显著不良副作用并且因此需要减少剂量的患者。正在治疗的受试者还可以是具有以下之一的特征的受试者：(1)K-RAS突变；(2)c-Met的扩增和超表达；(3)BRAF突变；(4)ALK易位；(5)肝细胞生长因子(HGF)超表达；(6)其他EGFR突变(在外显子20中的小插入或复制：D770_N771、insNPG、insSVQ、insG和N771T)；以及(7)影响EGFR下游的信号传导的遗传损伤，包括PIK3CA，PTEN、IGF1R和KDM5A的损失。

在各个实施方案中，所述癌症是肝癌(例如，HCC)。该肝癌可能对EGFR-TKI药剂不具有抗性。或者，该肝癌(例如，HCC)可能对EGFR-TKI药剂具有原发性或继发性抗性。所述受试者可以是在不存在微RNA的情况下对EGFR-TKI药剂的响应者。该受试者可以是在不存在微RNA的情况下对EGFR-TKI的非响应者。在一些实施方案中，该受试者已经经历了持续至少2、4、6、8、10个月或更长时间的采用EGFR-TKI药剂的先前治疗。在其他实施方案中，该受试者是已经历对EGFR-TKI药剂的一个或多个显著不良副作用并且因此需要减少剂量的患者。

在各个实施方案中，所述肝癌(例如，HCC)可以是中间期、晚期或末期的。该肝癌(例如，HCC)可以是转移性或非转移性的。该肝癌(例如，HCC)可以是可切除的或不可切除的。该肝癌(例如，HCC)可以包含单个肿瘤、多个肿瘤或具有浸润性生长模式(进入门静脉或肝静脉)的非明确定义的肿瘤。该肝癌(例如，HCC)可包括纤维板层样、假腺性(腺样)、多形性(巨细胞)或透明细胞模式。该肝癌(例如，HCC)可以包括良好分化形式，并且肿瘤细胞类似于肝细胞，形成小梁、索带(cord)和巢，和/或在细胞质中含有胆色素。该肝癌(例如，HCC)可以包括不良分化形式，并且恶性上皮细胞是松散的、多形性的、间变性的和/或巨大的。在一些实施方案中，该肝癌(例如，HCC)与乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化或2型糖尿病相关。

在一些实施方案中，减少EGFR-TKI药剂的治疗有效剂量。例如，将EGFR-TKI药剂的每周或每月剂量相对于最大推荐剂量或最大耐受剂量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在其他实施方案中，施用有效剂量的EGFR-TKI药剂，该有效剂量比在不存在微RNA(或微RNA抑制剂)施用的情况下有效所需的剂量低至少50％、60％、70％、80％、90％或更多。例如，埃罗替尼可以以每天50、40、30、25mg或更少的剂量施用。在一些实施方案中，EGFR-TKI药剂的IC₅₀相对于在不存在微RNA治疗(或如果将施用抑制剂情况下的微RNA抑制剂治疗)的情况下的IC₅₀降低了至少4、5、10、20、30、40、50或100倍。例如，可以如实施例中所述确定IC₅₀。

联合化疗

联合化疗或多重疗法使用多于一种药物或其他治疗(例如，不同于单独采用的任何治疗的单一治疗)。如本文针对本发明所使用的，该术语指使用EGFR-TKI药剂和微RNA的特定组合。

如本文在描述例如比例、剂量、时间等的范围时所用的，术语“约”包含了在相关误差界限之内、基本相同(例如，对于遵循正态或高斯分布的现象，在本领域接受的置信区间如95％以内)或另外不会实质改变所定量的事物的效果的变化。

EGFR-TKI药剂的给药量和/或时间表可遵循临床批准的指导或实验指导。在各个实施方案中，关于在EGFR-TKI药剂部分的描述，EGFR-TKI药剂的剂量可以是由FDA药物标签或另一个机构的标签/说明规定的剂量。

同样地，微RNA的给药量和/或时间表可遵循临床批准的指导或实验指导。在各个实施方案中，微RNA的剂量为每天约10、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225或250mg/m²。

在各个实施方案中，将微RNA经单周(7天)以1、2、3、4、5、6或7个日剂量施用于受试者。可将微RNA经14天以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个日剂量施用于受试者。可将微RNA经21天以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个日剂量施用于受试者。可将微RNA经28天以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个日剂量施用于受试者。

在各个实施方案中，微RNA：施用2周(共计14天)；施用1周停药1周(共计14天)；施用连续3周(共计21天)；施用2周停药1周(共计21天)；施用1周停药2周(共计21天)；施用连续4周(共计28天)；施用连续3周停药1周(共计28天)；施用2周停药2周(共计28天)；施用1周停药连续3周(共计28天)。

在各个实施方案中，微RNA：在7、14、21或28天周期的第1天施用；在21或28天周期的第1和15天施用；在21或28天周期的第1、8和15天施用；或在21或28天周期的第1、2、8和15天施用。微RNA可以每1、2、3、4、5、6、7或8周施用一次。

EGFR-TKI药剂-微RNA治疗疗程可由临床医生规定。该联合治疗可施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期。

可继续EGFR-TKI药剂-微RNA治疗的疗程直到满足临床终点。在一些实施方案中，继续治疗直到发生疾病进展或不可接受的毒性。在一些实施方案中，继续治疗直到获得定义为没有癌症的病理完全缓解(pCR)速率。在一些实施方案中，继续治疗直到癌症部分或完全缓解。向多个患有癌症的受试者施用微RNA和EGFR-TKI药剂可提高总生存率(OS)、无进展生存率(PFS)、无病生存率(DFS)、响应率(RR)、生活质量(QoL)或其组合。

在各个实施方案中，所述治疗减小了癌症肿瘤的大小和/或数目；阻止癌症肿瘤的大小和/或数目的增加；和/或阻止癌症肿瘤转移。

在本发明的方法中，施用不一定局限于任何特定的递送系统，并且可包括但不限于肠胃外(包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌肉内或腹膜内注射)、直肠、局部、经皮或口服(例如，以胶囊、悬浮液或片剂)。向个体给药可以以单一剂量或重复给药的方式，以及以多种生理上可接受的盐形式的任何形式，和/或以可接受的药物载体和/或添加剂作为药物组合物的一部分而发生。生理上可接受的盐形式和标准的药物配制技术、剂量和赋形剂是本领域技术人员公知的(参见，例如Physicians’DeskReference2005,第59版.,MedicalEconomicsCompany,2004；以及Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy编著.Gennado等人.第21版.,Lippincott,Williams&Wilkins,2005)。

此外，在一种动物中获得的有效剂量可使用本领域已知的转换因子外推用于另一种动物，包括人类。关于等效表面积剂量因子，参见，例如，Freireich等人,CancerChemotherReports50(4):219-244(1966)以及表2。

表2-等效表面积剂量因子

在各个实施方案中，微RNA在EGFR-TKI药剂之前、与EGFR-TKI药剂同时、在EGFR-TKI药剂之后或以其组合形式施用。微RNA可以静脉内施用。微RNA可以全身或局部施用。

本发明的联合治疗并非特别地局限于任何特定的过程或方案，并且可单独地或与其他治疗方法(例如，化疗或放疗)联合地使用。

除EGFR-TKI药剂和微RNA之外，根据本发明的联合治疗还可包括附加治疗(例如，药物、放射等)。类似地，本发明可用作辅助治疗(例如，当与手术结合时)。在各个实施方案中，受试者还通过手术切除、经皮乙醇或乙酸注射、经导管动脉化学栓塞、射频消融、激光消融、冷冻消融、聚焦外束辐射立体定向放射治疗(focusedexternalbeamradiationstereotacticradiotherapy)、选择性内部放射治疗、动脉内碘-131-碘油施用和/或高强度聚焦超声进行治疗。

微RNA和EGFR-TKI药剂的组合可用作辅助、新辅助、伴随、同时或姑息性治疗。微RNA和EGFR-TKI药剂的组合可用作一线治疗、二线治疗或交叉治疗。

在一些实施方案中，通过与微RNA组合减少了EGFR-TKI药剂的治疗有效剂量。例如，EGFR-TKI药剂的每日、每周或每月剂量可相对于最大推荐剂量或最大耐受剂量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在其他实施方案中，EGFR-TKI药剂以有效剂量施用，该有效剂量比在不存在微RNA(或微RNA抑制剂)施用的情况下有效所需的剂量低至少50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，EGFR-TKI药剂的IC₅₀相对于在不存在微RNA(或微RNA抑制剂)的情况下的IC₅₀降低了至少4、5、10、20、30、40、50或100倍。

在下面的实施例部分提供了联合治疗的进一步描述和实施方案。

如在以下实施例中讨论和进一步说明的，本发明提供了用于治疗癌症(例如，肺癌或肝癌)的方法和组合物，其中EGFR-TKI药剂和微RNA以特别有效(例如，协同或大于加和的)的组合形式施用。尽管协同作用和同义的术语在本领域中常用，但该特性并不总是定义的或量化的(以及，因此，声称的协同作用可能实际上并不存在)。关于本发明和以下实施例，使用组合指数(CI)值来量化EGFR-TKI药剂和微RNA的各种组合的效果。

在各个实施方案中，EGFR-TKI药剂和微RNA的组合在癌症(例如，肺癌或肝癌)中表现出CI<1。该组合在癌症中可表现出CI<0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25或0.20。

以下实施例提供了本发明的说明性实施方案。本领域普通技术人员将认识到可在不改变本发明的精神或范围的情况下进行多种修改和变化。这样的修改和变化包含在本发明的范围内。该实施例不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：埃罗替尼抗性细胞系的选择

我们遵循了描述于Engelman等人(同上)中的方案来产生对埃罗替尼具有获得性抗性的NSCLC系。简言之，将对埃罗替尼高度敏感(IC₅₀ _埃罗替尼＝0.054μM)的亲代HCC827细胞与埃罗替尼一起在增加的浓度下经10周温育直到细胞能够在含有相当于在亲代HCC827细胞中的IC₉₀的浓度的埃罗替尼的培养基中增殖。经过选择过程，获得了来自单独的细胞克隆的3个细胞系(HCC827^{克隆5、6、7})。此外，我们获得了据推测起源于多个克隆的异基因大量培养物(HCC827^抗性池)(参见图1)。

表3提供了用于评估miRNA和EGFR-TKI的组合效果的4种NSCLC细胞的列表。根据EGFR-TKI在这些细胞中的IC₅₀值、它们的致癌特性和它们对miRNA的敏感性来选择特定的细胞系。该列表包含对埃罗替尼具有抗性的细胞系和敏感的细胞。示出了如在科学文献中报道的埃罗替尼对这些细胞系中的每一个的IC₅₀值。在这些实施例中，IC₅₀值>1μM的细胞系被认为是抗性的。

表3

*N/R＝在科学文献中没有报道

实施例2：控制埃罗替尼抗性的差异表达的微RNA候选物的鉴定

全部四种细胞系以及亲代HCC827系用于RNA提取并经历mRNA(AffymetrixHG-U133Plus2.0)和miRNA(Agilent/Sanger12_0)阵列分析。出乎意料地，相对较少的mRNA在抗性系与亲本系之间差异性表达(数据未示出)。相比之下，miRNA的表达水平显著改变。抗性细胞与亲本系之间miRNA表达的比较显示克隆#7与HCC827关系最为密切(R²＝0.9347)，并且抗性池是最小相关的系(R²＝0.8308)。这与该池由多个克隆所产生的假设一致。当与亲本系相比时，miRNA的无监督聚类鉴定了在全部抗性HCC827细胞中的15种上调和23种下调的miRNA(图2A)。发现在基因簇中编码并表达为多顺反子转录物miR-106b～93～25和miR-24～27b～23b的miRNA均分别上调或下调。这表明遗传机制导致miRNA在埃罗替尼抗性细胞中的差异表达。许多差异表达的miRNA先前已与对其他化疗的抗性相关—例如，在埃罗替尼抗性HCC827细胞中上调的miRNA有助于对传统治疗的抗性，并且下调的miRNA抑制化学抗性。两种miRNA(let-7b、miR-486)已经参与对西妥昔单抗(一种抗EGFR的单克隆抗体)的抗性。参与埃罗替尼抗性对于全部miRNA是新型的。对预期被这些miRNA抑制的基因产物的研究揭示，埃罗替尼抗性细胞中下调的miRNA具有较高的倾向抑制已知的埃罗替尼抗性基因，包括RAS、EGFR、MET和HGF。定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)显示，MET和HGF在全部埃罗替尼抗性细胞系中均高度超表达。这与显示HGF/MET轴在获得性埃罗替尼抗性中的作用的先前报告一致。MET和HGF超表达可能是如先前报道的基因扩增的结果，或者可替代地，如我们的数据集所表明的抑制这些基因的miRNA表达的损失的结果(进一步研究的主题)。附录A提供了图2A下面的定量数据。

实施例3：埃罗替尼和微RNA的组合效果

在组合研究中使用的肺癌细胞系包括对埃罗替尼具有抗性(H1299、H460、HCC827，全部具有抗性)或敏感的(HCC827亲代)细胞系。组合的主要目的是获得埃罗替尼的强化治疗效果(降低的IC₅₀)并降低埃罗替尼的剂量和毒性。按照“固定浓度模型(FixedConcentrationModel)”(Fiebig,H.H.,CombinationStudies)进行组合工作的评估。在7-8个浓度下测试细胞毒性化合物A(埃罗替尼)，并在一个低浓度下测试化合物B(miRNA)。使用AlamarBlue测定(Invitrogen,Carlsbad,CA)来评估药物或miRNA对细胞增殖的影响。使用GraphPad软件计算单独的及组合的埃罗替尼的IC₅₀值。

首先，在细胞中测定单独埃罗替尼或单独miRNA的IC₅₀值。将miRNA在固定的、低浓度(～IC₂₅)下反向转染。所用的微RNA序列示于表1中。错义序列用作阴性对照。然后，采用系列稀释的埃罗替尼处理细胞。在药物处理后3天通过AlarmaBlue测定分析细胞增殖抑制。使用GraphPad软件确定与miRNA组合的埃罗替尼的IC₅₀值。通过目测剂量响应曲线和IC₅₀值的位移对组合效果进行评价。单独的或与六个测试的miRNA中的每一个相组合的埃罗替尼的IC₅₀结果分别记录在表4中。

实施例4：埃罗替尼和miRNA的体内功效评估

为了在体内测试埃罗替尼/微RNA组合的效果，使用例如基于稳定表达萤光素酶报道基因的原位异种移植的肿瘤小鼠模型。典型的功效研究包括每组8只动物。埃罗替尼/miRNA组合之后，其他的研究组包括单独的埃罗替尼、单独的miRNA以及埃罗替尼/miR-NC和非治疗对照。当肺中的肿瘤病变通过IVIS成像变得明显时，开始miRNA治疗。每隔一天以允许检测埃罗替尼增强的适度有效剂量(1-10mg/kg)静脉内施用在纳米颗粒中复合的miRNA。通过管饲法以在小鼠中显示良好耐受的每日剂量每日给予埃罗替尼。治疗持续时间为2-4周，或直至对照小鼠变得垂死，以先到者为准。严密监测动物以检测毒性体征。处死后，收集肺和肺肿瘤组织并对其进行组织病理学分析(H&E；ki67和casp3IHC，如果合理)。从正常的肺、肺肿瘤、脾和全血中提取RNA以通过qRT-PCR测量miRNA模拟物的浓度。此外，使用肿瘤样品来测试直接/经验证的miRNA靶标的敲减(qRT-PCR)。可通过H&E或人特异性IHC染色(STEM121,StemCells,Inc.)来评估在主要器官中的转移水平。

预期埃罗替尼/miRNA组合将显示比单独埃罗替尼更好的体内功效，并同时抑制肿瘤组织中的已知miRNA靶标。还预期用埃罗替尼/miRNA组合物治疗的动物不太可能产生转移并显示提高的存活率。

实施例5：EGFR-TKI和微RNA的体外功效的评估

简介

本实施例研究了miR34a与埃罗替尼的关系以及该组合在具有原发性和获得性埃罗替尼抗性的NSCLC细胞中的治疗活性。还将该药物组合在一组肝细胞癌细胞(HCC)——一种已知对埃罗替尼为难治性的癌症类型中进行测试。通过使用多种分析方法，测定癌细胞增殖的药物诱导抑制，以揭示加和、拮抗或协同效应。该数据显示了在所测试的全部癌细胞中埃罗替尼与miR-34a模拟物之间强的协同相互作用。在整个剂量水平和药物比例范围观察到协同作用，将对埃罗替尼和miR-34a的IC₅₀剂量需求分别降低了高达46倍和13倍。在提供超出由单独药剂诱导并因此具有临床相关性的癌细胞抑制的高水平癌细胞抑制的剂量下检测到最大协同作用。该数据表明，大多数NSCLC，以及先前不适合EGFR-TKI治疗的其他癌症，在与基于微RNA的治疗联合使用时证明了对该药物是敏感的。

材料与方法

细胞系：人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549、H460、H1299、H226、HCC827亲代和HCC827^res用于评估微RNA和EGFR-TKI的组合效果。根据EGFR-TKI在这些细胞中的高IC₅₀值、它们的致癌特性和对miRNA的敏感性来选择特定的细胞系。这些细胞系是抗性的(A549、H460、H1299、H226)或敏感的(HCC827)。此外，具有获得性抗性的细胞系通过经十周施加增加的埃罗替尼的选择性压力而产生，以IC₁₀的等效量开始并以IC₉₀等效量结束。由于细胞增殖在IC₉₀选择下显示正常的倍增速率，在低稀释度(HCC827^res)或高稀释度下接种抗性细胞以产生几乎纯的抗性克隆(HCC827^res-#5、6和7)。为了研究在肝细胞癌(HCC)细胞中的效果，使用了Hep3B、Huh7、C3A和HepG2。Huh7细胞从日本研究生物资源细胞库(JapaneseCollectionofResearchBioresourcesCellBank)获得。所有其他亲代细胞从美国模式培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA)购买并按照提供者的说明进行培养。

RNA分离和qRT-PCR：根据制造商的说明使用mirVANAPARISRNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX)从细胞团(cellpellet)中分离总RNA。通过在NanodropND-1000(ThermoScientific,Wilmington,DE)上的吸光度测量(A260)来确定RNA浓度。为了通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)来量化miRNA和mRNA，我们使用了商购可得的试剂。使用MMLV-RT(Invitrogen,Carlsbad,CA)在以下条件下将RNA转化为cDNA：在4℃下15min；在16℃下30min；在42℃下30min；在85℃下5min。cDNA合成后，使用PlatinumTaq聚合酶(Invitrogen)在以下循环条件下在ABIPrism7900HTSDS(AppliedBiosystems,LifeTechnologies,FosterCity,CA)上对2μL的cDNA进行qPCR：在95℃下1min(初始变性)；然后是在95℃下5秒、在60℃下30秒的50次循环。使用TaqMan基因表达测定和TaqMan微RNA测定进行在所有肺和肝细胞系中mRNA和miRNA的表达分析。对于miRNA表达，添加至制造商的试剂的试剂包括DMSO(6％的最终浓度)和四甲基氯化铵(TMAC；在RT和PCR中均为50mM的最终浓度)，以改善miRNA测定的斜率、线性度和灵敏度。通过对HCC827亲代细胞系的相对定量来确定miRNA和mRNA两者的表达水平。将miRNA和mRNA靶标的原始Ct值对选择的管家基因进行归一化以产生Δ-Ct值，转化为线性空间，并随后表示为表达百分比。

miRNA和EGFR-TKI治疗：从LCLaboratories(Woburn,MA)购买盐酸埃罗替尼。由LifeTechnologies(Ambion,Austin,TX)制备合成的miR-34a和miR-NC模拟物。为了测定单独的每种药物的IC₅₀值，采用96孔板形式每孔接种2,000-3,000个细胞，并如下用埃罗替尼或miR-34a进行处理。(i)使用来自Invitrogen的RNAiMax脂转染胺将miR-34a模拟物在系列稀释液(0.03-30nM)中一式三份进行反向转染。作为对照，还采用单独的RNAiMax(模拟的)或与阴性对照miRNA模拟物(miR-NC)复合的RNAiMax对细胞进行转染。在转染后4天或6天将细胞与AlamarBlue(Invitrogen)一起温育以分别确定肺癌或肝癌细胞的细胞增殖。将增殖数据对模拟转染的细胞进行归一化。(ii)在接种后一天，以0.1至100μM的最终浓度，向细胞中加入在二甲基亚砜(DMSO)中制备为10和20mM储备液的埃罗替尼。向在单独的孔中的细胞中添加单独的溶剂(在H226和HCC827中0.5％的最终DMSO，在全部其他细胞系中1％的最终DMSO)作为对照。此后三天，通过AlamarBlue测定细胞增殖并将其对溶剂对照进行归一化。

回归趋势线和IC₅₀值：使用CompuSyn(ComboSyn,Inc,Paramus,NJ)和Graphpad(Prism)软件分别产生线性和非线性回归趋势线。非线性趋势线提供了对于实际数据更好的拟合并用于计算IC₅₀、IC₂₅和其他药物浓度(IC_x)，尽管这两个软件程序产生了相似的值。

通过“固定浓度”法测定的组合效果。

该“固定浓度”法用于具有获得性抗性的细胞系(HCC827^res)。如上所述使用在固定的、低浓度(～IC₂₅)下的miRNA，用miR-34a对细胞进行反向转染。第二天，用系列稀释(0.01-100μM)的埃罗替尼处理细胞。通过AlamarBlue在3天后分析细胞增殖抑制。为了测量单一药剂的效果并校正由脂质载体或媒介物潜在导致的效果，还用与溶剂(在HCC827^res中的0.5％DMSO，在全部其他细胞系中的1％DMSO)组合的miR-34a或与模拟转染组合的埃罗替尼来处理细胞。将全部增殖数据对用溶剂(DMSO)处理的模拟转染的细胞进行归一化。通过目测埃罗替尼剂量-响应曲线和在存在或不存在miR-34a的情况下的IC₅₀值的位移(使用Graphpad绘图并计算)来评价组合效果。

通过“固定比例”法确定的组合效果

用各自与7个浓度的miR34a组合的7个浓度的埃罗替尼处理细胞。每一种药物在约等于其IC₅₀的浓度下以及在以上或以下2.5倍(NSCLC)或2倍(HCC)增量之内的浓度下使用。该基质产生了代表13个不同比例的总计49个不同组合。还在这些浓度下单独使用每种药物。如上所述添加miR-34a和埃罗替尼，并且通过AlamarBlue来测定细胞增殖。一式三份完成每一个数据点。

组合指数(CI)值的计算

确定基于Loewe加和性模型的CI值以评估药物-药物相互作用的性质，该性质针对各种药物-药物浓度和有效水平(Fa，受影响的分数；癌细胞增殖的抑制)可以是加和性的(CI＝1)、拮抗性的(CI>1)或协同性的(CI<1)。使用线性回归和非线性回归趋势线两者来计算和比较CI值。使用CompuSyn软件(ComboSynInc.,Paramus,NJ)按照Chou等人的方法来完成基于线性回归分析的CI值，借此将双曲线和S形剂量-效应曲线转化为线性形式(ChouTC(2010)DrugcombinationstudiesandtheirsynergyquantificationusingtheChou-Talalaymethod.CancerRes70:440-6，还可在ComboSyn,Inc.,www.combosyn.com上获得说明)。使用等式1计算源自非线性回归趋势线的CI值，其中C_A,x和C_B,x是产生效果X(Fa)的组合中药物A和药物B的浓度。IC_x,A和IC_x,B是作为单一药剂用来产生同样效应的药物A和药物B的浓度。

方程式1：

C I = \frac{C_{A, x}}{{IC}_{x, A}} + \frac{C_{B, x}}{{IC}_{x, B}}

使用Hill方程(方程式2)、IC₅₀和由非线性回归趋势线(Graphpad)产生的Hill斜率值(n)来计算方程式1中确定CI值所需的药物浓度(C_A,x、C_B,x、IC_x,A和IC_x,B)。

方程式2：

E = E_{m a x} \times \frac{C^{n}}{{IC}_{50}^{n} + C^{n}}

等效线图

为了描述埃罗替尼与miR-34a的剂量依赖的相互作用，生成了在对癌细胞增殖的50％和80％抑制的有效水平下的等效线图。由于单一药剂—单独的或组合的—通常达到50％的癌细胞抑制，因此50％等效线图提供了单一使用相对于所述组合的实际比较。使用80％等效线图来说明在肿瘤学中具有实际意义的高效应水平下所述组合的效用。在这些中的每一个中，通过从它的单一使用(IC₅₀、IC₈₀)外推组合形式中每一种药物的剂量需求来确定加和性。加和性线以上或以下的数据点分别表示拮抗作用或协同作用。对于全部49个组合，将组合中所需的药物浓度与达到相同效应的单独的单一药剂的浓度进行比较并表示为倍数变化(剂量降低指数，DRI)。

曲线位移分析

为了允许剂量-响应曲线的直接比较以及鉴定协同药物-药物相互作用，将单独或组合(IC50:IC50比值或其中所指示的其他比值)的每一种药物的非线性回归趋势线对它自己的IC₅₀值进行归一化并称作IC₅₀等效值(IC₅₀等效)。该组合的IC₅₀等效值使用方程式3进行计算，并描述于ZhaoL,AuJLWientjesMG(2010)Comparisonofmethodsforevaluatingdrug-druginteraction.FrontBiosci(Elite编著)2:241-9中。单一药剂和组合的数据被绘制在同一幅图中以说明相对于单一药剂需要达到任何给定效果的较低的药物浓度。这在剂量-响应曲线的左向位移中示出并指示协同作用。见上。

方程式3：

{IC}_{50 e q} = \frac{C_{A, x}}{{IC}_{50, A}} + \frac{C_{B, x}}{{IC}_{50, B}}

统计分析

使用Excel(Microsoft)、CompuSyn和Graphpad软件进行统计分析。由三个重复实验计算平均值和标准差。线性和非线性回归趋势线的拟合优度分别用R(CompuSyn)和R²(Graphpad)值来描述，并且由于限制药物不敏感性而对于除H226和HepG2细胞外的大多数细胞系为大于0.9。

结果

miR-34a恢复了在非小细胞肺癌细胞中对埃罗替尼的敏感性

为了研究具有获得性抗性的细胞中的抗药性，我们使用了表达激活EGFR突变(导致氨基酸745-750缺失的外显子19的缺失)的HCC827细胞。HCC827对埃罗替尼高度敏感，IC₅₀值为0.022μM(图4A)。通过在整个10周的过程中将亲代HCC827细胞暴露于增加的埃罗替尼浓度直至培养物在相当于在亲代细胞系中的IC₉₀的浓度下不显示生长抑制的迹象来发展埃罗替尼抗性细胞系(图4B)。在这个过程中，使单独的细胞克隆(HCC827^res-#5、#6、#7)以及抗性细胞池(HCC827^res)进行繁殖。分离总RNA，并通过定量PCR探测其miR-34家族成员和已知诱导抗性的基因的水平。埃罗替尼抗性HCC827细胞显示了MET及其推测起到绕过EGFR信号传导作用的配体HGF的增加的mRNA水平(图8A-C)。相比之下，还与抗性相关的其他基因如AXL、GAS6、KRAS、FGFR1、ERBB3、PIK3CA和EGFR本身的表达水平均未提高。miR-34b/c家族成员的水平在若干抗性HCC827细胞中降低(图8A-C)。有趣的是，miR-34a在埃罗替尼抗性HCC827细胞中并未降低，表明miR-34a在这些细胞的抗性引发中并没有起到因果作用，该抗性可通过MET基因的扩增独立于miR-34而发生。

由于MET和AXL两者直接受miR-34抑制，并且由于对AXL的抑制可能拮抗埃罗替尼抗性，因此引入合成的miR-34模拟物可以恢复埃罗替尼的敏感性。为了探索这种可能性，在存在或不存在以固定的低浓度(0.3nM)使用的miR-34a的情况下，将HCC827^res细胞暴露于范围为0.03-100μM的增加的埃罗替尼浓度。预期埃罗替尼的效果是浓度依赖性的，使得与miR-34a组合的埃罗替尼产生了相对于单独埃罗替尼更低的IC₅₀值。如图4C所示，埃罗替尼在HCC827^res细胞中并不是非常强力的(IC₅₀＝25.2μM)。然而，当与miR-34a联合使用时，埃罗替尼IC₅₀值降低至0.094μM。该结果表明，添加少量的miR-34a能够恢复类似于亲代HCC827细胞的埃罗替尼敏感性。该效果对于miR-34a序列是特异性的，因为阴性对照miRNA(miR-NC)的加入并没有改善埃罗替尼的效能(图4C)。因此，在HCC827^res细胞中产生的数据表明，miR-34a可以使具有获得性埃罗替尼抗性的癌细胞致敏。

为了确定所述miRNA是否还能抵消原发性抗性机制，我们使用在NRAS和TP53基因中具有突变的H1299细胞。在这些细胞中，埃罗替尼产生了11.0μM的IC₅₀值(图4D)。通过与0.3nMmiR-34a组合，埃罗替尼的剂量-响应曲线沿x轴移动，表明约低4倍的IC₅₀值(3.0μM)。该结果与未改变埃罗替尼的效能的miR-NC相反，并表明miR-34a使具有获得性以及原发性抗性的非小肺癌细胞致敏。

miR-34a和埃罗替尼在非小细胞肺癌细胞中协同作用

埃罗替尼IC₅₀值的位移表明固定的miR-34a浓度如何能提高埃罗替尼的效能。然而，这种模型，也被称为“固定浓度模型”，不允许对协同作用的评估。为了研究这两种药物是否可以彼此强化，我们采用了基于Loewe的加和性概念的“固定比例模型”(ChouTC(2010)DrugcombinationstudiesandtheirsynergyquantificationusingtheChou-Talalaymethod.CancerRes70:440-6.TallaridaRJ(2001)Drugsynergism:itsdetectionandapplications.JPharmacolExpTher298:865-72.TallaridaRJ(2006)Anoverviewofdrugcombinationanalysiswithisobolograms.JPharmacolExpTher319:1-7)。在该模型中，根据各剂量-响应曲线(单独或组合的药物)的斜率和IC₅₀值来计算组合指数(CI)值，并确定药物-药物相互作用是否是协同性的(CI<1)、加和性的(CI＝1)或拮抗性的(CI>1)。由于CI值的准确度依赖于剂量-响应曲线趋势线的拟合，因此通过使用线性或非线性回归趋势线的两种方法来计算CI值(参见材料与方法部分)。使用四种埃罗替尼抗性细胞系，所有这些细胞系在它们的遗传组成上不同：A549(在KRAS、STK11、CDKN2A中突变)、H460(在KRAS、STK11、CDKN2A、PIK3CA中突变)、H1299(在NRAS、TP53中突变)和H226(在CDKN2A中突变)[37]。qRT-PCR分析显示了AXL、GAS6和FGFR1mRNA水平在这些细胞中相对于在对埃罗替尼敏感的HCC827细胞中的显著增加，从而进一步提供了对埃罗替尼抗性的解释(图8A-C)。miR-34的水平在H1299和H460细胞中显著降低。在第一步中，将埃罗替尼或miR34a以系列稀释添加至细胞中，以确定每种药物单独的IC₅₀值。对于埃罗替尼，其范围为4.2至>50μM(图9A-B)。miR34a的IC₅₀值的范围为0.4至15.6nM。没有药物能够达到100％癌细胞抑制，而且任何药物的最大活性也不超过75％。埃罗替尼和miR-34a在H226细胞中效果最差，产生了作为剂量-响应曲线的外推结果的理论IC₅₀值。在第二步中，每种药物以等于它自己的近似IC₅₀值以及在其以上及以下的倍数(固定比例)的浓度进行组合。作为对照，每种药物在这些浓度下单独使用。线性和非线性回归模型均产生了在所有测试的细胞系中远低于1.0的CI值，显示了强协同作用(图5A)。我们认为相关的CI值是那些低于0.6的值。在大多数细胞系中，在较高的剂量水平和较高的癌细胞抑制量级下观察到协同作用。由于药物组合的实际应用需要在最大癌细胞抑制(75％或更高的抑制)下协同作用，因此这是至关重要的。通常，非线性回归趋势线提供了对实际数据的更好的拟合，尽管这两个模型均产成了相似的结果。

接着，我们生成了等效线图并确定了作为协同作用的读出的每种药物在50％和80％癌细胞抑制下的剂量需要。选择50％的效应水平是因为经常在药物的IC₅₀下评估药物的效能以及因为在我们的研究中每种药物单独均能够将大多数癌细胞抑制50％，从而允许每种单独的药物与组合在实际数据范围内比较。选择80％效应水平是因为对于肿瘤学应用证明在高抑制活性下的协同作用是重要的。虽然每种药物单独达到80％抑制时的浓度是基于剂量-响应曲线的外推并且在本质上是理论性的，但miR-34a-埃罗替尼组合容易达到80％或更高的抑制并在实际数据的范围内。由于两种药物本身在H226细胞中并不十分有效，因此针对H226数据生成在30％和50％抑制下的等效线图。如图5B所示，组合的等效线远低于每个细胞系的加和等效线和效应水平，表明强协同作用。在大多数细胞系中埃罗替尼的剂量要求降低至2μM或更低以达到50％抑制，从而将剂量减少了4至46倍。同样地，相对于单独的miR-34a，在组合中所需miR-34a的浓度也大幅较少，其剂量降低了7至13倍。这种剂量水平的减少(也被称为剂量减少指数(DRI))在80％抑制下是明显的，在80％抑制下剂量需求降低了高达28倍(埃罗替尼)和33倍(miR-34a)。

第三，我们进行了曲线位移分析，由此将每种药物的浓度对它自己的IC₅₀值进行归一化(ZhaoL,AuJLWientjesMG(2010)Comparisonofmethodsforevaluatingdrug-druginteraction.FrontBiosci(Elite编著)2:241-9.)。药物浓度到IC₅₀等效量(IC₅₀等效)的这种转化允许直接比较来自单一药剂和组合的每个剂量-响应曲线。生成了趋势线并且其跨越了0-100％抑制的效应水平。趋势线的斜率表示药物效能，而最大活性可由实际数据点来度量。当组合的IC₅₀等效量较低时确定协同作用以达到相对于单一药剂的任何给定效应(见上)。这在视觉上通过组合趋势线的左移来指示。如图8A-C中所见，所述组合与单一药剂良好分离，显示了协同作用。在H460和H226细胞中，与单一试剂的IC₅₀等效量相比，该组合的IC₅₀等效量在低效应水平(0-25％)下较大而在30％以上效应水平下较低。这一观察结果与来自CI曲线的数据一致，该曲线显示在这些细胞中在25％抑制以下为拮抗作用而25％抑制以上为协同作用(图4A)。因此，所述分析揭示了诱导高水平的癌细胞抑制的药物浓度的协同效应。通过以下事实进一步证明了组合的益处：相对于单一药剂，组合的实际抑制水平更大——单一药物的最大活性不超过75％，并且在联合使用时可以扩展至超过90％。

各种比例的埃罗替尼和miR-34a协同配合

我们的分析表明埃罗替尼和miR-34a在以由它们的IC₅₀值获得的比例组合时，这两种药物协同作用。因为药物-药物相互作用可以根据相对量而改变，因此我们通过将浓度为0.41-100μM的埃罗替尼与浓度为0.12-30nM的miR-34a组合起来而探索了多个埃罗替尼-miR-34a比例的效果。药物剂量以2.5倍的增量提高，并且每种药物还作为对照单独使用。该矩阵产生了表示13种不同的药物比例的49种药物组合(图6A)。测定每个组合的癌细胞抑制水平、CI和DRI值并绘制在CI图、等效线图和曲线位移图中。在该实施例中，我们关注其中miR-34a和埃罗替尼以IC₅₀：IC₅₀比值(摩尔比1:3333)以及下面的基于摩尔的比值添加的组合：1:533、1:1333、1:8333和1:208333。

计算的CI值预测，以全部这些比例组合的埃罗替尼与miR-34a提供了强协同作用(图6B)。效应水平大于75％抑制时，CI值低于0.2。含有较多量的埃罗替尼的比例提供了在低于约75％的效应水平下的较低的协同作用，并在75％抑制以上的效应水平下略微较优。类似地，等效线图显示了各种埃罗替尼-miR-34a比例的强协同作用(图6C)。实际数据点表明，当用作单一药剂时需要30nM的miR-34a或100μM的埃罗替尼来诱导约80％的癌细胞抑制。相比之下，随着miR-34a的量增加，组合中所需的埃罗替尼的剂量水平大幅降低。例如，当与12nMmiR34a一起使用时仅需要2.56μM的埃罗替尼来诱导约80％的抑制，从而将埃罗替尼的剂量需求降低了约40倍。针对这些比例的协同作用的进一步证据来自曲线位移分析，该分析揭示了与单独的单一药剂的IC₅₀值相比低得多的组合的IC₅₀等效量(图6D)。IC₅₀等效量数据与CI数据相关，CI数据显示了各种比例之间协同作用的剂量依赖度：低比例显示了在低效应水平下较低的协同作用，这与在高水平的癌细胞抑制下的情形相反。

全部范围的49种组合还在H1299、H460和H226细胞中进行测试并确认了采用A549细胞获得的结果(图10A-D)。多个比例提供了良好的协同作用，并且具有更高效能的那些比例聚类到具有更高药物浓度的那些比例。这些比例中很多满足我们的截断值(cut-off)，并针对每种药物产生了>75％的癌细胞抑制、CI<0.6和DRI>2。

埃罗替尼和miR-34a在肝细胞癌细胞中协同配合

为了研究埃罗替尼和miR-34a的协作活性是否在其他癌症适应证中有用，我们在肝细胞癌的细胞模型中对这一组合进行了探测。选择肝癌作为测试平台，这是因为埃罗替尼作为单一药剂剂在晚期肝癌患者中适度有效，并且与索拉非尼组合时没有延长总存活率和疾病进展时间(time-to-progression)(PhilipPA,MahoneyMR,AllmerC,ThomasJ,PitotHC等人(2005)PhaseIIstudyofErlotinib(OSI-774)inpatientswithadvancedhepatocellularcancer.JClinOncol23:6657-63.ThomasMB,ChadhaR,GloverK,WangX,MorrisJ等人(2007)Phase2studyoferlotinibinpatientswithunresectablehepatocellularcarcinoma.Cancer110:1059-67.ZhuAX,RosmorducO,EvansJ,RossP,SantoroA等人(2012)SEARCH:AphaseIII,randomized,double-blind,placebo-controlledtrialofsorafenibpluserlotinibinpatientswithhepatocellularcarcinoma(HCC).第37届欧洲肿瘤医学学会年会(37thAnnualEuropeanSocietyforMedicalOncologyCongress),Vienna,Austria,9月28日-10月2日(abstr917))。

此外，MRX34——目前处于临床试验中的miR-34a脂质体，在临床前动物研究中有效地消除了肝肿瘤并因此可能是与埃罗替尼组合的具有吸引力的药剂。使用的细胞模型包括Hep3B、C3A、HepG2和Huh7，其中几个与埃罗替尼敏感性肺癌系相比表现出埃罗替尼抗性基因AXL、HGF、FGFR1和ERBB3的上调(图11)。总体上，miR-34家族成员的水平在肝癌细胞中是低的或不可检测的。与我们的预期一致，在这四种细胞系中埃罗替尼的IC₅₀值为25μM或更大(图12A-B)。miR-34a的IC₅₀值的范围为0.3至2.3nM，并因此类似于肺癌细胞中的那些值。使用这些值作为指导来以固定的IC₅₀：IC₅₀比例组合埃罗替尼与miR-34a以及用于产生CI、等效线和IC₅₀等效值(图7)。此外，每个组合还在不同浓度的矩阵中进行测试以评估在多个比例上的组合效果(图13A-D)。我们的数据预测在全部测试的细胞系中埃罗替尼与miR-34a之间具有强协同作用。在高水平的癌细胞抑制下观察到协同作用，因此协同作用在所希望的活性范围内发生(图7A)。该结果通过IC₅₀等效曲线位移分析得到确认，表明在较高剂量和效应水平下的协同作用。该分析还表明该组合的最大抑制活性与单一药剂的最大抑制活性相比大幅增加(图7C)。等效线图表明，当与miR34a一起用于诱导50％或更高的抑制如80％时，埃罗替尼剂量明显减少(图7B)。在组合中，可使用浓度低至2μM的埃罗替尼来将癌细胞抑制50％，从而使它的剂量与单独使用相比降低75倍(参见HepG2)。协同作用不限于特定的比例，但是在大多数所测试的比例中是明显的(图13A-D)。因此，该数据类似于在肺癌细胞中生成的数据，并预测在单独的埃罗替尼没有足够效果的癌症中，埃罗替尼-miR34a组合的增强的功效。

讨论

药物-药物相互作用的准确评价是复杂的，因为结果取决于药物比例、药物浓度和所需效能(ChouTC(2010)DrugcombinationstudiesandtheirsynergyquantificationusingtheChou-Talalaymethod.CancerRes70:440-6)。为了研究miR-34a模拟物与埃罗替尼之间的药理关系，我们使用多种分析方法来揭示药物增强作用(“固定浓度”模型)以及区分加和性、拮抗作用和协同作用(“固定比例”模型)。我们考察了CI值、等效线图和来自线性和非线性数据回归的IC₅₀等效量。我们的数据显示，miR-34a增强了在测试的所有癌细胞中对埃罗替尼的敏感性——无论它们是否与原发性或继发性/后天性抗药性有关。一个看似合理的解释由肿瘤抑制基因miRNA抑制许多癌症途径的事实提供。以下事实支持了这一假设，AXL和MET(与埃罗替尼抗性特异性关联的基因产物)直接被miR-34a抑制(KallerM,LiffersST,OeljeklausS,KuhlmannK,RohS等人(2011)Genome-widecharacterizationofmiR-34ainducedchangesinproteinandmRNAexpressionbyacombinedpulsedSILACandmicroarrayanalysis.MolCellProteomics10:M111010462.MudduluruG,CeppiP,KumarswamyR,ScagliottiGV,PapottiM等人(2011)RegulationofAxlreceptortyrosinekinaseexpressionbymiR-34aandmiR-199a/binsolidcancer.Oncogene30:2888-99.HeL,HeX,LimLP,deStanchinaE,XuanZ等人(2007)AmicroRNAcomponentofthep53tumoursuppressornetwork.Nature447:1130-4)。

出乎意料地，埃罗替尼还增强了miR-34a模拟物的治疗效果，尽管现有的证据暗示miR-34a控制多种致癌信号途径，包括EGFR途径(LalA,ThomasMP,AltschulerG,NavarroF,O'DayE等人(2011)CaptureofmicroRNA-boundmRNAsidentifiesthetumorsuppressormiR-34aasaregulatorofgrowthfactorsignaling.PLoSGenet7:e1002363)。因此，该结果表明，miRNA模拟物可与单一基因定向治疗协同作用，并引起对于其他组合的搜索。因此，在各种另外的实施方案中，本发明包括miR-34a与其他EGFR抑制剂如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗和西妥昔单抗以及HER2抑制剂如拉帕替尼、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的组合。

在具有获得性抗药性的肺癌细胞(HCC827^res)中，添加少量的miR-34a能够将埃罗替尼IC₅₀值降低至低于0.1μM。这是一个值得注意的结果，并且表明miR-34a可使该细胞系与亲代HCC827细胞相比同样地对埃罗替尼敏感。在具有原发抗性的肺癌细胞中，埃罗替尼的IC₅₀剂量需求降低了4至46倍，并且约为2μM。这可能在具有临床效用的浓度范围之内(SharmaSV,BellDW,SettlemanJHaberDA(2007)Epidermalgrowthfactorreceptormutationsinlungcancer.NatRevCancer7:169-81)。埃罗替尼每日给药，口服剂量最高达150mg。虽然MRX34的临床剂量水平还没有被确定，但在临床使用的miR-34a与埃罗替尼之间的摩尔比很可能在已在我们的细胞研究中显示协同作用的比例范围之内。

埃罗替尼目前用作具有激活EGFR突变的NSCLC患者的一线治疗。它也用作化疗后的维持治疗，以及对于至少一种先前化疗方案失败的局部晚期或转移性NSCLC的二线和三线治疗。临床试验未能证实与顺铂/吉西他滨或卡铂/紫杉醇组合的埃罗替尼相比于传统的单独化疗的存活益处(同上.HerbstRS,PragerD,HermannR,FehrenbacherL,JohnsonBE等人(2005)TRIBUTE:aphaseIIItrialoferlotinibhydrochloride(OSI-774)combinedwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyinadvancednon-small-celllungcancer.JClinOncol23:5892-9)。在HCC中研究埃罗替尼加索拉非尼的最近的III期试验也没有达到它的终点(ZhuAX,RosmorducO,EvansJ,RossP,SantoroA等人(2012)SEARCH:AphaseIII,randomized,double-blind,placebo-controlledtrialofsorafenibpluserlotinibinpatientswithhepatocellularcarcinoma(HCC).第37届欧洲肿瘤医学学会年会,Vienna,Austria,9月28日-10月2日(abstr917))。因此，需要其他联合治疗方法。我们的数据表明，埃罗替尼加miR-34a组合尤其有效，并且可以大幅扩大可用埃罗替尼治疗的NSCLC患者群体。该组合在HCC细胞中类似地具有协同作用，表明协同相互作用是它们的分子作用机制的结果，并且也可以应用于除了NSCLC之外的癌症。

实施例6：拉帕替尼和miR-34模拟物(miR-Rx34)在乳腺癌细胞中协同作用

使用人类乳腺癌细胞系BT-549、T47D、MDA-MD-231和MCF-7(来自ATCC)来评估mir-Rx34和拉帕替尼的组合效果。拉帕替尼从LCLaboratories(Woburn,MA)购买。合成的miR-34a和miR-NC模拟物由LifeTechnologies(Ambion，Austin，TX)制造。为了确定单独每种药物的IC₅₀值，以96孔板形式每孔接种2,000-3,500个细胞并用拉帕替尼或miR-34a如下处理细胞。(i)按照公开的方案将miR-34a模拟物使用来自Invitrogen的RNAiMax脂转染胺在系列稀释(0.03-30nM)下一式三份进行反向转染。作为对照，还用单独的RNAiMax(模拟的)转染细胞。转染后6天将细胞与AlamarBlue(Invitrogen)一起温育以测定细胞增殖。将增殖数据对模拟转染的细胞进行归一化。(ii)在接种后一天，以0.1至100μM的最终浓度，向细胞中添加在二甲基亚砜(DMSO)中制备为10mM储备液的拉帕替尼。向作为对照的在单独的孔中的细胞中添加单独溶剂(在全部细胞系中1％的最终DMSO)。此后三天，通过AlamarBlue测定细胞增殖并将其对溶剂对照进行归一化。

在拉帕替尼与miR-Rx34的～IC50比例(比例＝IC₅₀拉帕替尼/IC₅₀miR-Rx34)下进行组合研究。以约等于其相应的IC₅₀的浓度和以上或以下2倍增量内的浓度，用拉帕替尼与miR-Rx34a组合来处理细胞。拉帕替尼/miR-Rx34a的比例是BT-549中的4000，MDA-MD-231中的3333.3，MCF-7中的5000以及T47D中的6000。用miR-Rx34a对细胞进行反向转染，转染后3天添加拉帕替尼，并在拉帕替尼添加3天后通过AlamarBlue测定细胞增殖。

CI值基于单一药剂的剂量-响应曲线的非线性回归并在联合使用时进行计算，并相对于癌细胞抑制的水平显示在0(没有抑制)至1(100％抑制)的轴上。被认为是协同的并具有临床价值的组合是在最大癌细胞抑制下具有低CI值(<0.6)的那些组合。如图14所示，在全部四种乳腺癌细胞系(BT-549、MCF-7、MDA-MB-231、T47D)中miR-Rx34与拉帕替尼协同作用。符号表示源自实际数据点的CI值。CI，组合指数；Fa，受影响的分数(＝增殖的抑制)；CI＝1，加和性；CI>1，拮抗作用；CI<1，协同作用。

实施例7：在NSCLC中的埃罗替尼+MRX34治疗

为了治疗非小细胞肺癌患者，可如下使用MRX34+埃罗替尼组合。给予患者150、100或50mg埃罗替尼的每日口服剂量以及范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平的MRX34静脉内30min至3hr输注。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一个实例中，按150、100或50mg的每日口服剂量给予埃罗替尼，并在30min至3hr输注期间以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平每周三或两次(例如星期一和星期四)给予MRX34。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一实例中，按150、100或50mg的每日口服剂量给予埃罗替尼，并且在每周连续五天给药接下来两天不给药的情况下以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平通过静脉内30min至3hr输注来每天给予MRX34。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

实施例8：在胰腺癌中的埃罗替尼+MRX34治疗

为了治疗胰腺癌患者，例如胰腺导管腺癌患者，可如下使用MRX34+埃罗替尼组合。给予患者100或50mg埃罗替尼的每日口服剂量，以及范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平的MRX34静脉内30min至3hr输注。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一个实例中，按100或50mg的每日口服剂量给予埃罗替尼，并在30min至3hr的输注期间以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平每周两次(例如星期一和星期四)给予MRX34三次。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一实例中，按100或50mg的每日口服剂量给予埃罗替尼，并且在每周连续五天给药接下来两天不给药的情况下以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平通过静脉内30min至3hr输注来每天给予MRX34。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

实施例9：在乳腺癌中的拉帕替尼+MRX34治疗

为了治疗乳腺癌患者，例如激素受体阳性、HER2-阳性转移性乳腺癌患者，可如下使用MRX34+拉帕替尼组合。给予患者1500、1250、1000或750mg拉帕替尼的每日口服剂量，以及范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平的MRX34静脉内30min至3hr输注。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一个实例中，按1500、1250或750mg的每日口服剂量给予拉帕替尼，以及在30min至3hr输注期间以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平每周三或两次(例如星期一和星期四)给予MRX34。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一实例中，按1500、1250或750mg的每日口服剂量给予拉帕替尼，并且在每周连续五天给药接下来两天不给药的情况下以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平通过静脉内30min至3hr输注每日给予MRX34。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一个实例中，如上所述并与2,000mg/m²/天(间隔约12小时口服施用2个剂量)的卡培他滨组合在重复21天的周期中的第1-14天给予拉帕替尼和MRX34。

在另一个实例中，如上所述并与2.5mg来曲唑组合每日一次给予拉帕替尼和MRX34。

实施例10：在NSCLC中的阿法替尼+MRX34治疗

为了治疗非小细胞肺癌患者，可如下使用MRX34+阿法替尼组合。给予患者40、30或20mg阿法替尼的每日口服剂量，以及范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平的MRX34静脉内30min至3hr输注。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一个实例中，按40、30或20mg的每日口服剂量给予阿法替尼，并在30min至3小时输注期间以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平每周三或两次(例如星期一和星期四)给予MRX34。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

在另一个实例中，按40、30或20mg的每日口服剂量给予阿法替尼，并且在每周连续五天给药接下来两天不给药的情况下以范围为50mg/m²至165mg/m²的剂量水平通过静脉内30min至3hr输注每日给予MRX34。在特定情况下，以50、70、93、124或165mg/m²的剂量水平给予MRX34。

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本说明书根据在说明书内引用的参考文献的教导得到最彻底的理解。本说明书内的实施方案提供了对本发明的实施方案的说明，并且不应被解释为限制本发明的范围。本领域技术人员容易认识到，本发明涵盖许多其他实施方案。本领域技术人员将会认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。旨在由以下权利要求涵盖这样的等同方案。

Claims

1.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：

向所述受试者施用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)药剂；以及

向所述受试者施用选自miR-34、miR-124、miR-126、miR-147、miR-215以及在附录A中以SEQIDNO:8-122列出的微RNA的微RNA，

其中如果所述EGFR-TKI药剂是吉非替尼，则所述微RNA不是miR-126。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是埃罗替尼。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺(NSCL)癌。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症对单独采用所述EGFR-TKI药剂的治疗具有抗性。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗性是原发性的。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗性是继发性的(获得性的)。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂以有效剂量施用，该有效剂量比在不存在微RNA施用的情况下有效所需的剂量低至少50％。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂的IC₅₀相对于在不存在微RNA施用的情况下的IC₅₀降低了至少2倍。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是肝癌。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌(HCC)。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有KRAS突变。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有EGFR突变。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症包括肝的转移性病变。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂包括吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗或西妥昔单抗。

16.根据权利要求4所述的方法，其中所述NSCL对单独采用所述EGFR-TKI药剂的治疗具有继发性抗性。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述HCC对单独采用所述EGFR-TKI药剂的治疗具有继发性抗性。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是埃罗替尼，并且所述微RNA包含与SEQIDNO:1至少80％相同的序列。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是HER2抑制剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述HER2抑制剂是拉帕替尼、培妥珠单抗或曲妥珠单抗。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是埃罗替尼，所述微RNA包含与SEQIDNO:1、SEQIDNO:168或SEQIDNO:169至少80％相同的序列，并且所述癌症是非小细胞肺(NSCL)癌。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是埃罗替尼，所述微RNA包含与SEQIDNO:1、SEQIDNO:168或SEQIDNO:169至少80％相同的序列，并且所述癌症是胰腺癌。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是拉帕替尼，所述微RNA包含与SEQIDNO:1、SEQIDNO:168或SEQIDNO:169至少80％相同的序列，并且所述癌症是乳腺癌。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是阿法替尼，所述微RNA包含与SEQIDNO:1、SEQIDNO:168或SEQIDNO:169至少80％相同的序列，并且所述癌症是非小细胞肺(NSCL)癌。

25.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：

向所述受试者施用包含与SEQIDNO:1-6、8-122或168-179至少80％相同的序列的微RNA，

其中如果所述EGFR-TKI药剂是吉非替尼，则所述序列与SEQIDNO:3不相同。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是miR-34。

27.一种用于治疗患有肺癌的受试者的方法，该方法包括：

向所述受试者施用选自miR-34a、miR-34b或miR-34c的微RNA，

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺(NSCL)癌。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述NSCL对单独采用所述EGFR-TKI药剂的治疗具有抗性。

30.一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括：

向所述受试者施用选自miR-34a、miR-34b或miR-34c的微RNA，

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌(HCC)。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述HCC对单独采用所述EGFR-TKI药剂的治疗具有抗性。

33.一种用于治疗患有乳腺癌的受试者的方法，该方法包括：

向所述受试者施用选自miR-34a、miR-34b或miR-34c的微RNA，

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述NSCL对单独采用所述EGFR-TKI药剂的治疗具有抗性。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述EGFR-TKI药剂是拉帕替尼。