JP2016519076A - マイクロrna及びegfr−tki阻害剤を利用する癌の併用処置 - Google Patents
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Abstract
本開示は、被験体中の癌細胞を含む癌細胞を処置するための方法および組成物を提供し、これにより、二つ以上の治療剤が使用され、一つはEGFR-TKI剤であり、他方はマイクロRNAである。【選択図】図3C
Description
<関連出願>
本出願は、2013年3月15日出願の米国仮特許出願第61/787,558号、及び、2014年1月15日出願の米国仮特許出願第61/927,543号の優先権の利益を請求するものであり、両出願は、全体を参照することで本明細書に組み込まれる。
本出願は、2013年3月15日出願の米国仮特許出願第61/787,558号、及び、2014年1月15日出願の米国仮特許出願第61/927,543号の優先権の利益を請求するものであり、両出願は、全体を参照することで本明細書に組み込まれる。
<配列表>
本出願は配列表を包含しており、これは、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体を参照することで本明細書に組み込まれる。2014年3月11日に作成されたASCIIのコピーは、12172−201_SL.txtと命名され、26,427バイトのサイズである。
本出願は配列表を包含しており、これは、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体を参照することで本明細書に組み込まれる。2014年3月11日に作成されたASCIIのコピーは、12172−201_SL.txtと命名され、26,427バイトのサイズである。
<発明の分野>
本発明は癌治療に関するものであり、より具体的には、マイクロRNAとEGFR−TKI阻害剤を利用する癌の併用療法に関するものである。
本発明は癌治療に関するものであり、より具体的には、マイクロRNAとEGFR−TKI阻害剤を利用する癌の併用療法に関するものである。
肺癌は、男性と女性の両方において最も高い癌に関連する死因である。2012年には肺癌の新しいケースが約220,000までになると予測され、全ての癌診断の約14%を占めている(Cancer Facts & Figures 2012, Society)。肺癌は、2012年に推定160,000の死亡が集計される、癌に関連する死の主要原因であり、これは、全ての癌による死の約28%に等しい。肺癌は2つの主なクラスに分類される。小細胞肺癌(SCLC)は、患者の20%に影響し、非小細胞肺癌(NSCLC)は約80%に影響する。NSCLCは3つの主なタイプから成る:腺癌、扁平上皮癌、及び大細胞癌であり、肺の腺癌及び扁平上皮癌は、全ての肺癌の大部分を占める(例えば、Forgacs et al., Pathol Oncol Res, 2001. 7(1):6−13; Sekido et al., Biochim Biophys Acta, 1998. 1378(1): F21−59を参照)。処置は、手術、放射線、治療、化学療法、及び標的化治療を含む。局所的なNSCLCでは、手術は通常、最適な処置であり、これら患者の大半の生存は、手術後に化学療法を与えることにより改善する。標的治療は、疾患の癌遺伝子型又は段階に依存して使用され、ベバシズマブ(Avastin(商標)、Genentech/Roche)、VEGF−A、エルロチニブ(Tarceva(商標)、Genentech/Roche)、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR−TKI)、及びクリゾチニブ(Xalkori(商標)、Pfizer)、ALKの阻害剤(未分化リンパ腫キナーゼ)、及びROS1(c−ros癌遺伝子、受容体チロシンキナーゼ)を含む。クリゾチニブは、特定の後期段階(局所的に進行した又は転移性の)非小細胞肺癌を処置するためにFDAによって承認されており、変異したALK遺伝子を発現するものに限定される。ベバシズマブは、カルボプラチン/パクリタキセルの化学療法と組み合わせて第一線の非鱗状のNSCLCに使用するために、最初に承認された。それ以来、National Comprehensive Cancer Networkは、任意の白金ベースの化学療法と組み合わせた標準の第一線の処置としてベバシズマブを推奨し、その後、疾患が進行するまでベバシズマブを維持する(Sandler et al., N Engl J Med, 2006. 355(24): 2542−50)。
エルロチニブは、以前の従来の化学療法レジメンの失敗の後、NSCLCを患う患者のために米国食品医薬品局(FDA)からの迅速な承認を受けた(Cohen et al., Oncologist, 2005. 10(7):461−6; Cohen et al., Oncologist, 2003. 8(4):303−6)。エルロチニブは、EGFRキナーゼの可逆的な阻害剤であり、EGFRキナーゼの活性部位にてATP結合の競合的阻害剤として作用するように設計される(Sharma et al. Nat Rev Cancer, 2007. 7(3):169−81)。ゲフィチニブは、米国の外の国々で使用される別のEGFR−TKI薬剤である。ゲフィチニブとエルロチニブを比較した、直接の相対的な有効性試験は存在しないが、データは、それらの間に主な治療上の差異がないことを示唆する(Pao et al., Nat Rev Cancer, 2010. 10(11): 760−74)。EGFR−TKIを使用する初期の臨床試験は、NSCLCを患う処置された患者の約10−20%において観察された部分応答を適度に促進する(Fukuoka et al. J Clin Oncol, 2003. 21(12):2237−46)。薬物応答は、女性、非喫煙者、アジア民族の患者、及び、腺癌又は気管支肺胞上皮癌の履歴を持つと診断された人において、より頻繁に生じる(Fukuoka et al., J Clin Oncol, 2003. 21(12):2237−46; Bell et al., J Clin Oncol, 2005. 23(31):8081−92)。顕著に、両方の薬剤は、ほんの2か月のみまで全体的な患者の延命効果を延ばし、一次の又は獲得の(acquired)二次耐性により、それらは効能を失う(Sharma, supra; Shepherd et al., N Engl J Med, 2005. 353(2):123−32)。
ゲフィチニブとエルロチニブの不満足な応答率は、反応の遺伝的背景vs耐性のある患者人口を評価するために、複数の研究を引き起こした。臨床試験の遡及分析により、EGFR発現レベルはゲフィチニブに対する反応に関連しないことが明らかとなった(上述のBell)。代わりに、薬物に反応する患者は、EGFRキナーゼドメイン(id.)の変異の活性化を頻繁に抱く。しかし、EGFR変異を患う患者の50%未満は、応答を進行させて、EGFR−TKIに対する感受性を判定する付加的因子の存在を示す。一次耐性又は二次耐性は、次のものに関連した:(1)K−RAS及びEGFRの変異が顕著に互いに相容れないように見えるという事実に関わらず、EGFR変異と共存し得る、K−RAS(Gazdar et al., Trends Mol Med, 2004. 10(10):481−6; Pao et al., PLoS Med, 2005. 2(1):e17);(2)PI3K経路に信号を送り、EGFRの不活性と置き換わる、c−Met、受容体チロシンキナーゼの増幅及び過剰発現(Engelman et al., Science, 2007. 316(5827):039−43);(3)EGFR(通常T790M)の触媒ドメインにおける第2の変異の獲得(Pao et al. PLoS Med, 2005. 2(3): e73.;)(4)BRAF変異(Pratilas et al., Cancer Res, 2008. 68(22):9375−83);(5)ALKの移動(Shaw et al., J Clin Oncol, 2009. 27(26):4247−53);(6)肝細胞成長因子(HGF)過剰発現、MET受容体のリガンド(Yano et al., Cancer Res, 2008. 68(22):9479−87);(7)他のEGFR変異の存在(エクソン20における、小さな挿入又は複製: D770_N771、ins NPG、ins SVQ、ins G及びN771T)(Wu et al., Clin Cancer Res, 2008. 14(15): 4877−82);及び、(8)PIK3CA(Engelman et al., J Clin Invest, 2006. 116(10):2695−706; Kawano et al., Lung Cancer, 2006. 54(2):209−15)、PTEN(Sos et al., Cancer Res, 2009. 69(8):3256−61)、IGF1R及びKDM5Aの損失(Gong et al., PLoS One, 2009. 4(10) e7273; Sharma et al., Cell. 141(1):69−80)を含む、EDFRの信号ダウンストリームに影響を及ぼす遺伝的病変。T790M変異は、獲得耐性を備えたEGFR変異体腫瘍の〜50%に見出され;KRAS変異は全てのNSCLCの15−25%に生じ;及び、変異したBRAFとALKの移動は、それぞれNSCLCの2−3%及び5%に見出される(Pao et al., Nat Rev Cancer, 2010. 10(11):760−74)。従って、EGFR−TKI治療に応答すると思われるNSCLC患者のパーセンテージは、比較的小さい。EGFR阻害剤に対する抵抗を媒介する、付加的であるが未確認の分子決定因子が存在し得る。
単一の治療薬剤としてのエルロチニブの適度の効能は、他の治療レジメンによるこれらEGFR−TKIの併用的使用を必要とする。シスプラチン/ゲムシタビン又はカルボプラチン/パクリタキセルと組み合わせたエルロチニブの効果を調べる、第III相臨床試験TRIBUTE/TALENT試験は、従来の化学療法のみに対する薬物の延命効果を実証することは出来なかった(Sharma, supra; Herbst et al., J Clin Oncol, 2005. 23(25):5892−9 and Giaccone et al., J Clin Oncol, 2004. 22(5):777−84 and Herbst et al., J Clin Oncol, 2004. 22(5):785−94)。それ故、エルロチニブは現在、mTOR及びMETに対する阻害剤等の、他の標的化した小分子阻害剤と組み合わせて試験されている(上述のPao)。この戦略がEGFR−TKI耐性を持つ患者において効果的かどうかが、これから確立される。利用可能なデータは、耐性遺伝子における変異を既に抱いている未処置の腫瘍における希少細胞から耐性腫瘍が発生すること、及び、これらの部分母集団がTKI処置(id.)の間に選択されることを示唆する。また、既に未処置の腫瘍がEGFR−TKI耐性細胞の異種特性を表示し、標的治療の単一の薬物の組み合わせが有効な処置に十分ではないことを示唆することも、起こり得る。代わりに、様々な組み合わせの連続的な使用は、前の処置中に正の選択を受ける、耐性腫瘍を排除するのに必要とされ得る。
それ故、肺癌の処置の進歩にもかかわらず、肺癌患者の生存率は非常に低いままである。EGFR−TKIなど最新の標的治療は、相当な約束を持っているが、一次耐性及び二次耐性の存在又は発達により、単独療法における満足な効能を欠いている。EGFR阻害剤の他の標的化した処置との併用的使用は、EGFR阻害剤の効能を支援し、且つ、薬物耐性を克服又は予防するのを支援することもある。
予備的研究は、特定のmiRNAがインビトロで癌細胞を敏感にすることができることを示す(Bommer et al., Curr Biol, 2007. 17(15):1298−307においてレビューされる)。例えば、let−7は、肺癌細胞を、TRAILベースのゲムシタビン又は放射線治療に対して敏感にすることができる(Li et al., Cancer Res, 2009. 69(16): 6704−12; Ovcharenko et al., Cancer Res, 2007. 67(22): 10782−8; Weidhaas et al., Cancer Res, 2007. 67(23):11111−6)。同様に、miR−34は、前立腺、結腸、脳、胃、膀胱、及び膵臓の癌細胞株における従来の治療の効率を向上させる(Fujita et al., Biochem Biophys Res Commun, 2008. 377(1):114−9; Ji et al., PLoS One, 2009. 4(8):e6816; Kojima et al., Prostate. 70(14):1501−12. Akao et al., Cancer Lett. 300(2):197−204; Weeraratne et al., Neuro Oncol. 13(2):165−75; Ji et al., BMC Cancer, 2008. 8:266; and Vinall et al., Int J Cancer, 2011. 130(11): 2526−38)。しかし、肺癌の細胞及び動物モデルにおける任意のエルロチニブ/miRNAの組み合わせのための実証は、存在しないままである。
近年、Zongら(Chemico−Bio Interac. 2010, 184:431−438)は、ゲフィチニブに対してゲフィチニブ耐性細胞株A549及びH460を敏感にする能力に関して、let−7a、miR−126、及びmiR−145を試験した。IC50の最も大きな減少は、H440細胞(〜7倍)におけるmiR−126によって達成されたが、残りの状態は、2−3倍のIC50の減少のみを結果として生じさせた(上述のZhongにおける表2を参照)。
本発明は、特定のマイクロRNAがEGFR−TKI耐性細胞株において一貫してアップレギュレート又はダウンレギュレートされ得、及び、マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤の特異的な組み合わせが、例えば、特定の癌細胞の処置において特に効果的である(例えば、相乗作用を示す、又はより大きな相加効果を持つ)ので、都合のよい及び/又は予期できない結果を有し得るという発見に、部分的に基づく。適宜、本発明は、様々な態様及び実施形態において、細胞、組織、及び/又は生物体を、マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤の特異的な組み合わせに接触させる工程を含む。より具体的に、本発明は、癌細胞、癌組織、及び/又は癌を持つ生物体を、マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤のそのような組み合わせに接触させる工程を含み得る。方法は、実験的、診断的、及び/又は治療的なものであり得る。方法は、組織又は生物体中に細胞を含む、細胞の増殖を阻害又は低減するために使用され得る。例えば、マイクロRNAは、EGFR−TKI耐性細胞株において一貫してダウンレギュレート又はアップレギュレートされる、マイクロRNAの模倣体又は阻害剤であり得る。
適宜、様々な態様及び実施形態において、本発明は、癌を患う被験体を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、被験体にEGFR−TKI薬剤を投与する工程、及び、被験体に、miR−34、miR−126、miR−124、miR−147、及びmiR−215のマイクロRNA模倣体を投与する工程を含む。同様の方法は、細胞又は組織(例えば、癌細胞又は腫瘍などの癌組織)をEGFR−TKI薬剤に接触させる工程、及び、細胞又は組織をmiR−34、miR−126、miR−124、miR−147、及びmiR−215のマイクロRNA模倣体に接触させる工程を含む。
マイクロRNAは、配列番号:1−6及び168−179の少なくとも1つに対して少なくとも80%(又は、85、90、95、100%)同一である配列(miR−34、miR−126、miR−124、miR−147、及びmiR−215、同様にファミリーメンバー、機能的ホモログ、シード配列、及びその共通配列)を含み得る。これら及び他のマイクロRNAは、天然の核酸、その誘導体及び化学的修飾形態、同様に、核酸アナログを含み得る。
マイクロRNAは、配列番号:1−6及び168−179の少なくとも1つに対して少なくとも80%(又は、85、90、95、100%)同一である配列(miR−34、miR−126、miR−124、miR−147、及びmiR−215、同様にファミリーメンバー、機能的ホモログ、シード配列、及びその共通配列)を含み得る。これら及び他のマイクロRNAは、天然の核酸、その誘導体及び化学的修飾形態、同様に、核酸アナログを含み得る。
様々な態様及び実施形態において、本発明は、被験体(例えば癌を患う被験体)にEGFR−TKI薬剤を投与する方法、及び、被験体に配列番号:8−122として付録Aに列挙したマイクロRNAのマイクロRNA模倣体(ダウンレギュレートしたマイクロRNA)を投与する方法を提供する。同様の方法は、細胞又は組織(例えば、腫瘍などの癌細胞又は癌組織をEGFR−TKI薬剤に接触させる工程、及び、細胞又は組織を配列番号:8−122として付録Aに列挙したマイクロRNAのマイクロRNA模倣体(ダウンレギュレートしたマイクロRNA)に接触させる工程を含む。マイクロRNAは、配列番号:8−122の少なくとも1つに対して少なくとも80%(又は85、90、95、100%)同一の配列を含み得る。
様々な態様及び実施形態において、本発明は、被験体(例えば癌を患う被験体)にEGFR−TKI薬剤を投与する方法、及び、配列番号:123−167、好ましくは配列番号:156−167、より好ましくは配列番号:159、164、及び165として付録Aに列挙されるマイクロRNAの阻害剤(アップレギュレートしたマイクロRNA)を投与する方法を提供する。同様の方法は、細胞又は組織(例えば、癌細胞又は腫瘍などの癌組織)をEGFR−TKI薬剤に接触させる工程、及び、細胞又は組織を配列番号:123−167、好ましくは配列番号:156−167、より好ましくは配列番号:159、164、及び165として付録Aに列挙されるマイクロRNAの阻害剤(アップレギュレートしたマイクロRNA)に接触させる工程を含む。阻害剤は、マイクロRNAに少なくとも80%(又は85、90、95、100%)相補的な配列を含むマイクロRNAであり得る。
様々な実施形態において、EGFR−TKI薬剤は、エルロチニブ、又は、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブ、又はセツキシマブなどのアナログのEGFR−TKI薬剤、或いは、ラパチニブ、ペルツズマブ、又はトラスツズマブなどのHER2阻害剤であり得る。幾つかの実施形態において、EGFR阻害剤はエルロチニブであり、マイクロRNAは、配列番号:1−4の1つ(例えば、配列番号:1)に対して少なくとも80%(又は85、90、95、100%)同一である。
様々な実施形態において、癌は、本発明に従うマイクロRNAとEGFR−TKI阻害剤の組み合わせが有効な治療学であるという癌、例えば、肺癌(例えば非小細胞肺、NSCL)及び肝臓癌(例えば肝細胞癌、HCC)であり得る。癌は肝臓に転移性の病変を含み得る。
様々な実施形態において、癌は、EGFR−TKI薬剤単独による処置に耐性がある。耐性は一次又は二次(獲得)であり得る。癌は、EGFR−TKI薬剤単独による処置に対する一次又は二次の耐性を持つ肺(例えばNSCL)の癌であり得る。癌は、EGFR−TKI薬剤単独による処置に対する一次又は二次の耐性を持つ肝臓癌(例えばHCC)であり得る。
様々な実施形態において、EGFR−TKI薬剤は、マイクロRNA投与がない状態で有効であることが必要とされる用量未満(例えば、少なくとも50%未満)である有効量で投与され得る。用量は、マイクロRNAが無い状態で必要な用量の前に、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、又は90%であり得る。
様々な実施形態において、EGFR−TKI薬剤のIC50は、マイクロRNA投与が無い状態でIC50に対して低減される(例えば、少なくとも2倍)。IC50は、少なくとも1.5、2、2.5、3、4、5、又は10倍まで低減され得る。
様々な実施形態において、被験体は、ヒト、ヒト以外の霊長類、又は実験動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ)である。被験体はKRAS変異を有し得る。被験体はEGFR変異を有し得る。幾つかの実施形態において、被験体は、エルロチニブに対する一次又は二次の耐性を持ち、例えば、EGFR−TKI薬剤に対する耐性が発達した、又は発達させる可能性のある患者である。代替的に、被験体の癌は、EGFR−TKI薬剤に対して十分な感受性を持ちうるが、単独療法のその毒性は、低用量のEGFR−TKI薬剤が望ましいことを示し得る。
本発明の様々な態様、実施形態、及び特徴が、以下に更に詳しく提示され且つ記載される。しかし、前述及び後述の記載は単に例示的且つ説明的なものである、請求されるように、本発明に制限されない。
本発明は、特定のマイクロRNAがEGFR−TKI耐性細胞株において一貫してアップレギュレート又はダウンレギュレートされ得、及び、マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤の特異的な組み合わせが、例えば、特定の細胞の処置において特に効果的である(例えば、相乗作用を示す、又はより大きな相加効果を持つ)ので、都合のよい及び/又は予期できない結果を有し得るという発見に、部分的に基づく。適宜、本発明は、様々な態様及び実施形態において、細胞、組織、及び/又は生物体を、マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤の特異的な組み合わせに接触させる工程を含む。より具体的に、本発明は、癌細胞、癌組織、及び/又は癌を持つ生物体を、マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤のそのような組み合わせに接触させる工程を含み得る。方法は、実験的、診断的、及び/又は治療的なものであり得る。方法は、組織又は生物体中に細胞を含む、細胞の増殖を阻害又は低減するために使用され得る。例えば、マイクロRNAは、EGFR−TKI耐性細胞株において一貫してダウンレギュレート又はアップレギュレートされる、マイクロRNAの模倣体又は阻害剤であり得る。
<マイクロRNA>
マイクロRNA(miRNA)は、転写後に遺伝子発現を調節し、且つ、複数の遺伝子産物及び細胞の経路を調製することにより細胞運命を判定する、小さな非コードの、自然に発生するRNA分子である(Bartel, Cell, 2004. 116(2):281−97)。miRNAは、mRNA転写を低下させること、タンパク質翻訳機構を遮断することの何れかにより、遺伝子発現に干渉する(上述のBartel)。miRNAは、mRNAの広範であるが特異的なセットを標的とする能力をこれら調節性のRNAに賦与する、完全に又は単に部分的に相補的な配列を備えたmRNAを標的とする。現在まで、細胞増殖、分化、アポトーシス、幹細胞発達、及び免疫機能と同様に多様であるプロセスにおける役割を持つ、〜1,500のヒトの注釈されたmiRNA遺伝子がある(Costinean et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(18):7024−9)。大抵、miRNAの誤調節は、癌を含むヒト疾患の発現に寄与し得る(Esquela−Kerscher et al., Nat Rev Cancer, 2006. 6(4):259−69; Calin et al., 2006. 6(11):857−66)。癌において規制緩和されたmiRNAは、本物の腫瘍サプレッサ又は癌遺伝子として機能することができる。単一のmiRNAは、複数の癌遺伝子および腫瘍形成性シグナル経路を標的とし(Forgacs et al., Pathol Oncol Res, 2001. 7(1):6−13)、及び、この能力を将来の治療に翻訳することは、腫瘍不均一性に対して有効な治療法を作り出す見込みを持ち得る。故に、miRNAは、癌のための強力な治療薬になる可能性があり(Volinia et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(7):2257−61; Tong et al., Cancer Gene Ther, 2008. 15(6):341−55)、それは、複数の癌経路に介在する場合に上手く処置されるのみである「経路疾患」としての癌に関する我々の現在の理解に従って作用する(Wiggins et al., Cancer Res, 2010. 70(14): 5923−5930.; Jones et al., Science, 2008. 321(5897):1801−6; Parsons et al., Science, 2008. 321(5897):1807−12)。
マイクロRNA(miRNA)は、転写後に遺伝子発現を調節し、且つ、複数の遺伝子産物及び細胞の経路を調製することにより細胞運命を判定する、小さな非コードの、自然に発生するRNA分子である(Bartel, Cell, 2004. 116(2):281−97)。miRNAは、mRNA転写を低下させること、タンパク質翻訳機構を遮断することの何れかにより、遺伝子発現に干渉する(上述のBartel)。miRNAは、mRNAの広範であるが特異的なセットを標的とする能力をこれら調節性のRNAに賦与する、完全に又は単に部分的に相補的な配列を備えたmRNAを標的とする。現在まで、細胞増殖、分化、アポトーシス、幹細胞発達、及び免疫機能と同様に多様であるプロセスにおける役割を持つ、〜1,500のヒトの注釈されたmiRNA遺伝子がある(Costinean et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(18):7024−9)。大抵、miRNAの誤調節は、癌を含むヒト疾患の発現に寄与し得る(Esquela−Kerscher et al., Nat Rev Cancer, 2006. 6(4):259−69; Calin et al., 2006. 6(11):857−66)。癌において規制緩和されたmiRNAは、本物の腫瘍サプレッサ又は癌遺伝子として機能することができる。単一のmiRNAは、複数の癌遺伝子および腫瘍形成性シグナル経路を標的とし(Forgacs et al., Pathol Oncol Res, 2001. 7(1):6−13)、及び、この能力を将来の治療に翻訳することは、腫瘍不均一性に対して有効な治療法を作り出す見込みを持ち得る。故に、miRNAは、癌のための強力な治療薬になる可能性があり(Volinia et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(7):2257−61; Tong et al., Cancer Gene Ther, 2008. 15(6):341−55)、それは、複数の癌経路に介在する場合に上手く処置されるのみである「経路疾患」としての癌に関する我々の現在の理解に従って作用する(Wiggins et al., Cancer Res, 2010. 70(14): 5923−5930.; Jones et al., Science, 2008. 321(5897):1801−6; Parsons et al., Science, 2008. 321(5897):1807−12)。
2013年3月時点で、Mirna Therapeutics(Austin, TX)は、cGMP材料の製造、及び、miR−34をベースとする補足治療(MRX34)のためのINDを可能にする研究の伝導を支持するための臨床前の開発プログラムを完了した。Mirnaは、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類を使用して、非GLP予備的研究においてmiR−34模倣体を包含する製剤の薬物動態学の特性と同様に、毒性も評価した。臨床観察、体重、臨床化学(LFT、RFT、その他を含む)、血液学、肉眼的所見、選択した器官及び補体(CH50)の組織病理学によって測定されるように、これらの実験は、MRX34の予測された治療レベルで有害事象を示さなかった。加えて、脂質ナノ粒子中で処方されたmiRNA模倣体は、完全に免疫適格のマウス、ラット、非ヒト霊長類、同様に、ヒト全血試料において実証されるように、固有の免疫系を誘発しない。以前の臨床データのより詳細な調査は、Bader, Front Genet. 2012; 3:120において提供される。
本発明の方法において、特異的なマイクロRNA(例えば、剛性のマイクロRNA模倣体又は阻害剤)は、EGFR−TKI薬剤との併用療法の一部として被験体に投与される。特異的な実施形態において、そのようなマイクロRNAは、配列番号:1−179から成る群から選択される。これらのマイクロRNAは当該技術分野で周知であり、当業者は、マイクロRNAが、従来の自然に発生する配列(本明細書で提供される)、及びその任意の化学的に修飾したバージョン及び配列同族体を含むことを理解する。
様々な態様及び実施形態において、本発明は、トランスフェクションを介して細胞に送達されない、マイクロRNA模倣体又は阻害剤を利用する。むしろ、様々な実施形態において、マイクロRNAは、注入又は輸液などの方法によって投与され得る。幾つかの実施形態において、分離された細胞、組織、又はその培養物ではなく、被験体は、哺乳動物(例えば、ヒト、又は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、非ヒト霊長類などの実験動物)であり得る。
本発明に関連して使用されるマイクロRNAは、7−130のヌクレオチド長の、2本鎖RNA分子であり得、これは、2つの別個の鎖又はヘアピン構造の何れかを持つ。例えば、マイクロRNAは、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、7−30、7−25、15−30、15−25、17−30、又は17−25のヌクレオチド長であり得る。「ガイド鎖」と称される2つの鎖の1つは、下記の表に示される親マイクロRNA配列のシード配列(ヌクレオチド位置2−9)と同一、又はほぼ同一である配列を包含する。本明細書で使用されるように、「ほぼ同一」は、多くとも1又は2の置換及び/又は削除が可能であることを意味する。幾つかの実施形態において、ガイド鎖は、本明細書に提供される完全長の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%同一である配列を含む。「パッセンジャー鎖」と称される2つの鎖のもう一方は、対応する与えられたマイクロRNAのシード配列に相補的、又はほぼ相補的である配列を包含する。本明細書で使用されるように「ほぼ相補的である」は、多くとも1又は2の不一致及び/又は削除が可能であることを意味する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、本明細書に提供されるそれぞれの完全長の補体に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%同一である配列を含む。幾つかの実施形態において、マイクロRNAは、miR−34a、miR−34b、miR−34c、miR−449a、miR−449b、miR−449c、miR−192、miR−215、miR−126、miR−124、miR−147の模倣体、又は、それのアナログ或いは同族体である。幾つかの実施形態において、マイクロRNAは、これらマイクロRNAの1つのシード配列を含む。
マイクロRNA(例えば、マイクロRNA模倣体)は、例えば、米国特許第7,858,117号及び第7,371,404;米国特許出願公開第2009−0306194号及び第2011−0009641号に記載されるものなどのリポソームにおいて処方され得る。他の送達技術は当該技術分野で既知であり且つ利用可能であり、発現ベクター、脂質、又は様々なリガンド接合体を含む。
特定の実施形態において、本発明の方法は、配列番号:123−167、好ましくは配列番号:156−167、より好ましくは配列番号:159、164、及び165として付録Aに列挙されるマイクロRNAから選択されたマイクロRNAの阻害剤を投与する工程を含む。マイクロRNAの阻害剤は当該技術分野で周知であり、典型的には標的マイクロRNAに相補的であるアンチセンスの分子であるが、他のタイプの阻害剤も使用され得る。マイクロRNAの阻害剤は、例えば米国特許第8,110,558号に記載される。特定の実施形態において、マイクロRNAの阻害剤は、配列番号:123−167、好ましくは配列番号:156−167、より好ましくは配列番号:159、164、及び165として付録Aに列挙される、対応するアップレギュレートしたマイクロRNAに相補的又はほぼ相補的である、9−20、10−18、又は12−17のヌクレオチド長の配列を包含する。
マイクロRNA及びその阻害剤はまた、化学的に修飾され得、例えば、マイクロRNAは、パッセンジャー鎖(例えば、NH2−(CH2)6−O−)の上に5’キャップを持ち、及び/又は、同じ鎖の第1及び/又は第2のヌクレオチドにおいて不一致を有し得る。他の可能な化学修飾は、骨格修飾(例えばホスホロチオエート、モルホリノ)、リボース修飾(例えば2’−OMe、2’−Me、2’−F)、2’−4’−ロック(locked)/架橋糖(例えばLNA、ENA、UNA)、同様に、核酸塩基を含み得る(例えば、Peacock et al, 2011. J Am Chem Soc. , 133(24):9200−9203を参照)。特定の実施形態において、マイクロRNA、特にmiR−34及びmiR−124は、米国特許第7,960,359号、米国特許出願公開第2012−0276627号及び第2012−0288933号に記載されるような修飾を有する。
マイクロRNAは、用量当たり0.001−10.0mg/kgの範囲の用量(例えば、必王に応じて2、4、6、8週、又はそれ以上の期間につき、1、2、3、又はそれ以上の用量で、用量当たり0.01−3.0、0.025−1.0、又は0.25−0.5mg/kg)での遅いボーラス注入として静脈内に投与され得る。
<EGFR−TKI薬剤>
本発明の方法は、被験体にEGFR−TKI薬剤を投与する工程を含む。上皮成長因子受容体(EGFR)のファミリーは、上皮成長因子(EGF)ファミリーのメンバーに応じて機能を結合し且つ誘発する、4つの構造上関連する細胞表面受容体チロシンキナーゼを含む。ヒトにおいて、これは、Her−1及びErbB1として知られるEGFR、Neu及びErbB2と称されるHer−2、Her−3(ErbB3)、及びHer−4(ErbB4)を含む。ErbBシグナル伝達の過剰活性化は、広範囲の固形腫瘍の発達に関連する。従って、様々な付加的な実施形態において、本発明は、マイクロRNAとエルロチニブの組み合わせに加えて、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブ、及びセツキシマブなどの他のEGFR阻害剤、更に、ラパチニブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブなどのHER2阻害剤も含む。
本発明の方法は、被験体にEGFR−TKI薬剤を投与する工程を含む。上皮成長因子受容体(EGFR)のファミリーは、上皮成長因子(EGF)ファミリーのメンバーに応じて機能を結合し且つ誘発する、4つの構造上関連する細胞表面受容体チロシンキナーゼを含む。ヒトにおいて、これは、Her−1及びErbB1として知られるEGFR、Neu及びErbB2と称されるHer−2、Her−3(ErbB3)、及びHer−4(ErbB4)を含む。ErbBシグナル伝達の過剰活性化は、広範囲の固形腫瘍の発達に関連する。従って、様々な付加的な実施形態において、本発明は、マイクロRNAとエルロチニブの組み合わせに加えて、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブ、及びセツキシマブなどの他のEGFR阻害剤、更に、ラパチニブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブなどのHER2阻害剤も含む。
特定の実施形態において、EGFR−TKIはエルロチニブであり、薬物の活性成分は現在、商標「TARCEVA(登録商標)」の下で売買されている。他に明白に記述されない限り、本明細書における用語「エルロチニブ」は、式Iの化合物、同様に、その塩又はエステルの何れかを指す。
エルロチニブは、チロシンキナーゼ阻害剤、化学名「N−(3−エチニルフェニル)−6,7−ビス(2−メトキシエトキシ)−4−キナゾリンアミン」を持つキナゾリンアミンである。特定の実施形態において、エルロチニブは塩酸エルロチニブである。経口投与のためのTARCEVA(登録商標)錠剤は、25mg、100mg、及び150mgのエルロチニブと同等な塩酸エルロチニブ(27.3mg、109.3mg、及び163.9mg)及び以下の非活性成分を包含して、3つの投薬強度で利用可能となる:ラクトース一水和物、ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、ナトリウムデンプングリコレート、ラウリル硫酸ナトリウム、及び二酸化チタン。錠剤はまた、製品識別のために、FD&C Yellow #6(25mgのみ)を含む微量の着色料を包含する。更なる情報は、承認された薬物ラベルから利用可能である。
エルロチニブはまた、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,900,221号、及び対応するPCT公報WO01/34574に記載される。
NSCLCのための、TARCEVA(登録商標)の承認され且つ推奨された用量は150mg/日であり、膵臓癌のための承認された用量は100mg/日である。必要な場合、用量は50mgの減衰で低減され得る。
EGFR−TKI薬剤がエルロチニブである特定の実施形態において、マイクロRNAは、miR−126の配列(例えば、ヒトmiR−126の配列又はシード配列との、100、95、90、85、又は80%未満の同一性)を持たない。
特定の実施形態において、EGFR−TKI薬剤はゲフィチニブであり、薬物の活性成分は、商標「IRESSA(登録商標)」の下で売買されている。他に明白に記述されない限り、本明細書における用語「ゲフィチニブ」は、式IIの化合物、同様に、その塩又はエステルの何れかを指す。
ゲフィチニブは、化学名「4−キナゾリンアミン、N−(3−クロロ−4フルオロフェニル)−7−メトキシ−6−[3−4−モルホリン)プロポキシ]」を備えたチロシンキナーゼ阻害剤であり、ZD1839としても知られる。臨床の製剤は、活性成分、ラクトース一水和物、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、ラウリル硫酸ナトリウム、及びステアリン酸マグネシウムを包含する250mgの錠剤として供給される。単一の治療としての推奨された用量は、1日当たり1つ250mgの錠剤である。更なる情報は、承認された薬物ラベルに見出すことができる。
アファチニブ、パニツムマブ、及びセツキシマブなどの他のEGFR阻害剤、同様に、ラパチニブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブなどのHER2阻害剤は当該技術分野で既知であり、故に、当業者は、本発明との使用に要求されるような、それらの構造、製剤、薬注、及び投与(例えば、承認された薬物ラベルなど公表された医用情報に基づく)を容易に理解する。
<癌>
本発明は、被験体における癌細胞及び/又は組織を含む、癌細胞及び/又は組織を処置するための、又は、分離した癌細胞及び/又は組織のインビトロの処置のための方法及び組成物を提供する。被験体における場合、処置される被験体は動物(例えば、ヒト又は実験動物)であり得る。
本発明は、被験体における癌細胞及び/又は組織を含む、癌細胞及び/又は組織を処置するための、又は、分離した癌細胞及び/又は組織のインビトロの処置のための方法及び組成物を提供する。被験体における場合、処置される被験体は動物(例えば、ヒト又は実験動物)であり得る。
処置される被験体は、癌(例えば、肺癌(非小細胞肺癌(NSCLC)、例えば、腺癌、扁平上皮癌、及び大細胞癌)、膵癌、又は肝臓における癌、或いは、乳癌、HCC、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺、脳、胃、又は膀胱の癌を含むEGRF阻害から利益を得る他のタイプの癌)と診断されたかもしれない。幾つかの実施形態において、細胞又は被験体は、EGFR−TKI薬剤に対する一次又は二次の耐性を有している。
被験体は、局所的に進行した、切除不能な、又は転移性の癌を有し得、及び/又は、以前の一次治療に失敗したかもしれない。幾つかの実施形態において、被験体は、少なくとも2、4、6、8、10か月以上続く、EGRR−TKI薬剤による以前の処置を受けている。他の実施形態において、被験体はEGFRにおけるT790M変異を有している(Balak et al. 2006. Clin Cancer Res, 12(1):6494−501)。他の実施形態において、被験体は、EGFR−TKI薬剤に対する1以上のかなりの副作用を経験しており、故に用量の減少を必要とする患者である。処置される被験体はまた、次の1つによって特徴付けられたものであり得る:(1)K−RAS変異;(2)c−Metの増幅と過剰発現;(3)BRAF変異;(4)ALK転位;(5)肝細胞増殖因子(HGF)過剰発現;(6)他のEGFR変異(エクソン20における小さな挿入又は再生:D770_N771、ins NPG、ins SVQ、ins G及びN771T);及び(7)PIK3CA、PTEN、IGF1R及びKDM5Aの損失を含む、EGFRの信号ダウンストリームに影響を及ぼす遺伝子病変。
様々な実施形態において、癌は肝臓癌(例えば、HCC)である。肝臓癌はEGFR−TKI薬剤に耐性がないこともある。代替的に、肝臓癌(例えばHCC)は、EGFR−TKI薬剤に対する一次又は二次の耐性を有し得る。被験体は、マイクロRNAが無い状態のEGFR−TKI薬剤に対するレスポンダになり得る。被験体は、マイクロRNAが無い状態のEGFR−TKIに対するレスポンダになり得ない。幾つかの実施形態において、被験体は、少なくとも2、4、6、8、10か月以上続く、EGFR−TKI薬剤による以前の処置を受けている。他の実施形態において、被験体は、EGFR−TKI薬剤に対する1以上のかなりの副作用を経験しており、故に用量の減少を必要とする患者である。
様々な実施形態において、肝臓癌(例えばHCC)は、中程度、進行している、又は末期であり得る。肝臓癌(例えばHCC)は転移性又は非転移性であり得る。肝臓癌(例えばHCC)は切除可能又は切除不能であり得る。肝臓癌(例えばHCC)は、単一の腫瘍、多発性腫瘍、又は、(門脈又は肝静脈の中への)浸潤性増殖パターンを備えた十分に定められていない腫瘍を含み得る。肝臓癌(例えばHCC)は、繊維層板型、擬腺状(アデノイド)、多形態性(巨大細胞)、又は明細胞パターンを含み得る。肝臓癌(例えばHCC)は、十分に分化された形態、及び、肝細胞に似た腫瘍細胞、小柱の形態、索、及び巣を含み、及び/又は、細胞質中に胆汁色素を含み得る。肝臓癌(例えばHCC)は、十分に分化されていない形態を含み得、悪性上皮細胞は、非凝集性(discohesive)、多形態性、未分化、及び/又は巨大である。幾つかの実施形態において、肝臓癌(例えばHCC)は、B型肝炎、C型肝炎、硬変症、又は2型糖尿病に関連する。
幾つかの実施形態において、EGFR−TKI薬剤の治療上有効な量が減少される。例えば、EGFR−TKI薬剤の毎週又は毎月の用量は、最大推奨投与量又は最大耐用量に対して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上減少される。他の実施形態において、EGFR−TKI薬剤は、マイクロRNA(又はマイクロRNA阻害剤)の投与が無い状態で効果的であるために必要とされる用量の下で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%以上の効果的な用量で投与される。例えば、エルロチニブは、1日当たり50、40、30、25mg以下の用量で投与され得る。幾つかの実施形態において、EGFR−TKI薬剤のIC50は、マイクロRNAの処置(又は、阻害剤が投与される場合のマイクロRNA阻害剤の処置)が無い状態でIC50に対して少なくとも4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、又は100倍にまで減らされる。IC50は、例えば、実施例に示されるように判定され得る。
<併用化学療法>
併用化学療法又は多剤療法は、1より多くの薬又は他の治療(例えば、単独療法とは対照的に、単独で得られる任意の治療である)の使用である。本発明に関して本明細書に使用されるように、この用語は、EGFR−TKI薬剤とマイクロRNAの特異的な組み合わせを使用することを指す。
併用化学療法又は多剤療法は、1より多くの薬又は他の治療(例えば、単独療法とは対照的に、単独で得られる任意の治療である)の使用である。本発明に関して本明細書に使用されるように、この用語は、EGFR−TKI薬剤とマイクロRNAの特異的な組み合わせを使用することを指す。
(例えば比率、用量、時間などの)範囲の説明のために本明細書に使用されるように、用語「約」は、変更を包含する、関連する範囲の誤差内にあり、実質的に同じである(例えば、正常な又はガウスの分布に追従する現象について95%などの、当該技術分野で容認される信頼区間内にある)変形を包含するか、さもなくば、定量化されるものの効果を実質的に変更しない。
EGFR−TKI薬剤の投薬の量及び/又はスケジュールは、臨床的に承認された、又は実験的なガイドラインに従い得る。EGFR−TKI薬剤セクションにおける記載に加えて、様々な実施形態において、EGFR−TKI薬剤の用量は、FDA薬物ラベル、又は、別の機関のラベル/指示書によって処方された用量であり得る。
同様に、マイクロRNAの投薬の量及び/又はスケジュールは、臨床的に承認された、又は実験的なガイドラインに従い得る。様々な実施形態において、マイクロRNAの用量は、1日当たり約10、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、又は250mg/m2である。
様々な実施形態において、マイクロRNAは、1週間(7日)にわたり、1、2、3、4、5、6、又は7日量で被験体に投与される。マイクロRNAは、14日にわたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14日量で被験体に投与され得る。マイクロRNAは、21日にわたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21日量で被験体に投与され得る。マイクロRNAは、28日にわたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日量で被験体に投与され得る。
様々な実施形態において、マイクロRNAは、2週間(合計14日);1週間の休暇付きで1週間(合計14日);3週間連続(合計21日);1週間の休暇付きで2週間(合計21日);2週間の休暇付きで1週間(合計21日);4週間連続(合計28日);1週間の休暇付きで3週間連続(合計28日);2週間の休暇付きで2週間(合計28日);3週間の休暇付きで1週間(合計28日)、で投与される。
様々な実施形態において、マイクロRNAは、7、14、21、又は28日のサイクルの1日目に投与され;21又は28日のサイクルの1及び15日目に投与され;21又は28日のサイクルの1、8、及び15日目に投与され;又は、21又は28日のサイクルの1、2、8、及び15日目に投与される。マイクロRNAは、1、2、3、4、5、6、7、又は8週間ごとに1回投与され得る。
臨床医は、EGFR−TKI薬剤−マイクロRNA治療の経過を処方することができる。併用療法は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12のサイクルの間、投与され得る。
EGFR−TKI薬剤−マイクロRNA治療の経過は、臨床エンドポイントが満たされるまで継続され得る。幾つかの実施形態において、疾患進行又は受け入れがたい毒性が生じるまで、治療が継続される。幾つかの実施形態において、癌の欠如として定められる病理学的な完全寛解(pCR)率を達成するまで、治療が継続される。幾つかの実施形態において、癌の部分的又は完全寛解まで、治療が継続される。癌を患う複数の被験体へのマイクロRNAとEGFR−TKI薬剤の投与は、粗生存率(OS)、無増悪生存率(PFS)、無病生存率(DFS)、反応率(RR)、クオリティオブライフ(QoL)、又はそれらの組み合わせを増加させ得る。
様々な実施形態において、処置は、癌腫瘍の大きさ及び/又は数を減少させ;癌腫瘍がその大きさ及び/又は数を増加させるのを妨げ;及び/又は、癌腫瘍が転移するのを妨げる。
本発明の方法において、投与は、必ずしも任意の特定の送達システムに限定されず、且つ、限定されないが、非経口(皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、又は腹腔内注射を含む)、直腸、局所、経皮、又は経口(例えば、カプセル、懸濁液、又は錠剤で)を含み得る。固体への投与は、単一用量又は繰返しの投与で、及び、様々な生理学的に許容可能な塩の形態の何れかで、及び/又は、医薬組成物の一部として許容可能な医薬担体及/又は添加剤と共に、行われ得る。生理学的に許容可能な塩の形態、及び、標準医薬製剤の技術、投与量、及び賦形剤は、当業者に周知である(例えば、Physicians’ Desk Reference (PDRR) 2005, 59th ed., Medical Economics Company, 2004; and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al. 21th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2005を参照)。
加えて、1匹の動物において達成される効果的な投与量は、当該技術分野で既知の転換比率を使用して、ヒトを含む別の動物における使用のために推測され得る。例えば、Freireich et al., Cancer Chemother Reports 50(4):219−244 (1966)、及び、同等な表面積の投与量因子の表2を参照。Reports 50(4):219−244 (1966)、及び、同等な表面積の投与量因子の表2。
様々な実施形態において、マイクロRNAは、EGFR−TKI薬剤の前、EGFR−TKI薬剤と同時、EGFR−TKI薬剤の後、又はそれらの組み合わせで投与される。マイクロRNAは静脈内に投与され得る。マイクロRNAは、全身で又は局部的に投与され得る。
本発明の併用療法は具体的に、任意の特定の経過又はレジメンに限定されず、且つ、別々に又は他の治療手段(例えば、化学療法又は放射線療法)と共に利用されてもよい。
本発明に係る併用療法は、EGFR−TKI薬剤とマイクロRNAを越えて(beyond)付加療法(例えば製薬、放射線など)を含み得る。同様に、本発明はアジュバント療法(例えば、手術と組み合わせた場合)として使用され得る。様々な実施形態において、被験体はまた、外科的切除、経皮的なエタノール又は酢酸の注射、経カテーテル動脈の化学塞栓術、ラジオ波焼灼療法、レーザアブレーション、冷凍切除、焦点式外部ビーム放射線定位的照射(focused external beam radiation stereotactic radiotherapy)、選択的な内部放射線治療、動脈内のヨウ素−131−リピドール投与、及び/又は高強度焦点式超音波によって、処置される。
マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤の組み合わせは、アジュバント、ネオアジュバント、随伴性、同時的、又は姑息的な治療として使用され得る。マイクロRNAとEGFR−TKI薬剤の組み合わせは、第1線治療、第2線治療、又はクロスオーバー治療として使用され得る。
幾つかの実施形態において、EGFR−TKI薬剤の治療上有効な量は、マイクロRNAとの組み合わせを介して減少される。例えば、EGFR−TKI薬剤の毎日、毎週、又は毎月の用量は、最大推奨投与量又は最大耐用量に対して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上減少され得る。他の実施形態において、EGFR−TKI薬剤は、マイクロRNA(又はマイクロRNA阻害剤)の投与が無い状態で効果的であるために必要とされる用量の下で、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%以上の効果的な用量で投与される。幾つかの実施形態において、EGFR−TKI薬剤のIC50は、マイクロRNA(又はマイクロRNA阻害剤)が無い状態でIC50に対して少なくとも4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、又は100倍にまで減らされる。
併用療法の更なる記載と実施形態は、以下の実施例のセクションで提供される。
以下の実施例に議論され且つ更に示されるように、本発明は、EGFR−TKI薬剤とマイクロRNAが特に効果的である(例えば、相乗的か、添加剤より多い)組み合わせで投与される、癌(例えば、肺癌又は肝臓癌)を処置するための方法と組成物を提供する。相乗効果及び同義語は当該技術分野で共通して使用される一方、特性は必ずしも定められ且つ定量化されるとは限らない(及び、従って、主張される相乗効果は実際に存在しないこともある)。本発明と下記の実施例に関して、組み合わせ指標(CI)値は、EGFR−TKI薬剤とマイクロRNAの様々な組み合わせの効果を定量化するために使用された。
様々な実施形態において、EGFR−TKI薬剤とマイクロRNAの組み合わせは、癌(例えば肺癌又は肝臓癌)においてCI<1を示す。組み合わせは、癌においてCI<0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、又は0.20を示すことができる。
以下の実施例は、本発明の実例となる実施形態を提供する。当業者は、本発明の精神又は範囲を変更することなく実行され得る、多数の改良及び変更を理解する。そのような修飾と変更は本発明の範囲内に包含される。実施例は、任意の方法で本発明を制限しない。
<実施例1:エルロチニブ耐性細胞株の選択>
Engelmanら(前出)に記載されているプロトコルに従って、エルロチニブの獲得耐性を備えるNSCLC株を作成した。簡単に述べると、エルロチニブ(IC50erlo=0.054μM)に対して高感度の親HCC827細胞を、細胞中のIC90に相当する濃度でのエルロチニブを含む培地中で増殖できるようになるまで、10週間にわたってエルロチニブ濃度を増加させながらインキュベートした。選択を経て、個々の細胞クローンから3細胞株(HCC827クローン 5、6、7)を得た。加えて、我々は、おそらく複数のクローン(HCC827res pool図1参照)に由来する異種の大量培養物を得た。
Engelmanら(前出)に記載されているプロトコルに従って、エルロチニブの獲得耐性を備えるNSCLC株を作成した。簡単に述べると、エルロチニブ(IC50erlo=0.054μM)に対して高感度の親HCC827細胞を、細胞中のIC90に相当する濃度でのエルロチニブを含む培地中で増殖できるようになるまで、10週間にわたってエルロチニブ濃度を増加させながらインキュベートした。選択を経て、個々の細胞クローンから3細胞株(HCC827クローン 5、6、7)を得た。加えて、我々は、おそらく複数のクローン(HCC827res pool図1参照)に由来する異種の大量培養物を得た。
表3は、miRNAとEGFR−TKIの組み合わせの効果を評価するために使用される4つのNSCLC細胞のリストを提供する。特定の細胞株を、これらの細胞におけるEGFR−TKIのIC50値、発ガン特性、およびmiRNAに対する感受性に基づいて選択した。このリストは、エルロチニブに耐性がある細胞株、および感受性である細胞を含む。科学文献に報告されているように、これらの細胞株の各々に対するエルロチニブのIC50値を示す。これらの例では、>1μΜのIC50値を有する細胞株は耐性であるとみなされる。
<実施例2:エルロチニブ耐性を制御し示差的に発現するマイクロRNA候補の同定>
すべての4つの細胞株ならびに親HCC827株をRNA抽出のために使用し、mRNA(Affymetrix HG−U133 Plus 2.0)およびmiRNA(Agilent/Sangerl2_0)アレイ解析に供した。予想外に、比較的少数のmRNAのみが、抵抗性株と親株との間で異なって発現していた(データは示さず)。照的に、miRNAの発現レベルは有意に変化した。耐性細胞と親株との間のmiRNA発現の比較は、クローン#7がHCC827に最も密接に関連する(R2= 0.9347)ことを示し、耐性プールは最も関連していない(R2= 0.8308)株である。これは、プールが複数のクローンから生じたという仮説と一致する。親株と比較した場合、miRNAの監修なしのクラスタリングは、すべての耐性HCC827細胞にわたって、15のアップレギュレートされたmiRNA及び23のダウンレギュレートされたmiRNAを同定した(図2A)。遺伝子クラスター中にコード化され、ポリシストニックな転写産物として発現するmiRNA、つまりmiR−106B〜93〜25及びmiR−24〜27B〜23Bはすべて、それぞれアップレギュレート又はダウンレギュレートされていることがわかった。これは、遺伝的メカニズムがエルロチニブ耐性細胞におけるmiRNAの発現差異に寄与することを示唆している。示差的に発現するmiRNAの多くは、以前に他の化学療法に対する抵抗性と関連付けられており−例えば、エルロチニブ耐性HCC827細胞でアップレギュレートされるmiRNAは、従来の抵抗性に寄与し、ダウンレギュレートされるmiRNAは、化学療法抵抗性を抑制する。2つのmiRNA(LET−7bのmiR−486)は、セツキシマブ、つまり抗EGFRモノクローナル抗体に対する抵抗性に関連付けられてきた。エルロチニブ耐性への関与は、すべてのmiRNAについて新規である。これらのmiRNAにより抑制されることが予想される遺伝子産物を検索すると、エルロチニブ耐性細胞においてダウンレギュレートされるmiRNAはRAS、EGFR、METおよびHGFを含む既知のエルロチニブ耐性遺伝子を抑制する傾向が強いことが明らかとなった。定量的逆転写酵素PCR(qRT−PCR)は、METおよびHGFの両方が、すべてのエルロチニブ耐性細胞株で強く過剰発現されたことを示した。このことは、獲得されたエルロチニブ耐性におけるHGF/MET軸の役割を示す以前の報告と一致している。METとHGFの過剰発現は、以前に報告されているように遺伝子増幅の結果である可能性があり、またはその代わりに、我々のデータセット(さらなる調査の対象)によって示唆されるように、これらの遺伝子を抑制するmiRNA発現の喪失の結果であるかもしれない。付録Aは、図2Aの基礎となる定量的なデータを提供する。
すべての4つの細胞株ならびに親HCC827株をRNA抽出のために使用し、mRNA(Affymetrix HG−U133 Plus 2.0)およびmiRNA(Agilent/Sangerl2_0)アレイ解析に供した。予想外に、比較的少数のmRNAのみが、抵抗性株と親株との間で異なって発現していた(データは示さず)。照的に、miRNAの発現レベルは有意に変化した。耐性細胞と親株との間のmiRNA発現の比較は、クローン#7がHCC827に最も密接に関連する(R2= 0.9347)ことを示し、耐性プールは最も関連していない(R2= 0.8308)株である。これは、プールが複数のクローンから生じたという仮説と一致する。親株と比較した場合、miRNAの監修なしのクラスタリングは、すべての耐性HCC827細胞にわたって、15のアップレギュレートされたmiRNA及び23のダウンレギュレートされたmiRNAを同定した(図2A)。遺伝子クラスター中にコード化され、ポリシストニックな転写産物として発現するmiRNA、つまりmiR−106B〜93〜25及びmiR−24〜27B〜23Bはすべて、それぞれアップレギュレート又はダウンレギュレートされていることがわかった。これは、遺伝的メカニズムがエルロチニブ耐性細胞におけるmiRNAの発現差異に寄与することを示唆している。示差的に発現するmiRNAの多くは、以前に他の化学療法に対する抵抗性と関連付けられており−例えば、エルロチニブ耐性HCC827細胞でアップレギュレートされるmiRNAは、従来の抵抗性に寄与し、ダウンレギュレートされるmiRNAは、化学療法抵抗性を抑制する。2つのmiRNA(LET−7bのmiR−486)は、セツキシマブ、つまり抗EGFRモノクローナル抗体に対する抵抗性に関連付けられてきた。エルロチニブ耐性への関与は、すべてのmiRNAについて新規である。これらのmiRNAにより抑制されることが予想される遺伝子産物を検索すると、エルロチニブ耐性細胞においてダウンレギュレートされるmiRNAはRAS、EGFR、METおよびHGFを含む既知のエルロチニブ耐性遺伝子を抑制する傾向が強いことが明らかとなった。定量的逆転写酵素PCR(qRT−PCR)は、METおよびHGFの両方が、すべてのエルロチニブ耐性細胞株で強く過剰発現されたことを示した。このことは、獲得されたエルロチニブ耐性におけるHGF/MET軸の役割を示す以前の報告と一致している。METとHGFの過剰発現は、以前に報告されているように遺伝子増幅の結果である可能性があり、またはその代わりに、我々のデータセット(さらなる調査の対象)によって示唆されるように、これらの遺伝子を抑制するmiRNA発現の喪失の結果であるかもしれない。付録Aは、図2Aの基礎となる定量的なデータを提供する。
<実施例3:エルロチニブとマイクロRNAの組み合わせの効果>
組み合わせの研究において使用される肺癌細胞株は、エルロチニブに対して耐性の細胞株(H1299、H460、HCC827、すべて耐性)、または感受性の細胞株(HCC827親)を含んでいた。組み合わせの主な目的は、エルロチニブの増強された治療効果(IC50の減少)を達成すること、およびエルロチニブの用量及び毒性を低減することであった。組み合わせの働きの評価を、「固定濃度モデル(Fixed Concentration Model)」(Fiebig、HH、併用試験)に従って実施した。細胞毒性化合物A(エルロチニブ)を7−8の濃度で、および化合物B (miRNA)を弱い濃度で、試験した。細胞増殖に対する薬物またはmiRNAの効果を、AlamarBlueアッセイ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて評価した。エルロチニブの単独の及び組み合わせにおけるIC50値を、GraphPadソフトウェアを用いて計算した。
組み合わせの研究において使用される肺癌細胞株は、エルロチニブに対して耐性の細胞株(H1299、H460、HCC827、すべて耐性)、または感受性の細胞株(HCC827親)を含んでいた。組み合わせの主な目的は、エルロチニブの増強された治療効果(IC50の減少)を達成すること、およびエルロチニブの用量及び毒性を低減することであった。組み合わせの働きの評価を、「固定濃度モデル(Fixed Concentration Model)」(Fiebig、HH、併用試験)に従って実施した。細胞毒性化合物A(エルロチニブ)を7−8の濃度で、および化合物B (miRNA)を弱い濃度で、試験した。細胞増殖に対する薬物またはmiRNAの効果を、AlamarBlueアッセイ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて評価した。エルロチニブの単独の及び組み合わせにおけるIC50値を、GraphPadソフトウェアを用いて計算した。
まず、エルロチニブ単独の、又はmiRNA単独のIC50値を、細胞中で測定した。miRNAは固定の弱い濃度(〜IC25)でリバーストランスフェクトされた。使用されるマイクロRNAの配列を、表1に示した。スクランブル配列を、陰性対照として使用した。その後、細胞を、連続希釈したエルロチニブで処理した。細胞増殖の阻害を、薬物処理後3日で、AlarmaBlueアッセイによって分析した。miRNAと組み合わせたエルロチニブのIC50値を、GraphPadソフトウェアを用いて決定した。組み合わせの効果は、用量反応曲線及びIC50値の変化を目視検査することによって評価した。エルロチニブ単独についての、または6つの試験されたmiRNAそれぞれとの組み合わせのIC50の結果を、それぞれ表4に報告する。
<実施例4:エルロチニブ及びmiRNAについてのインビボでの有効性評価>
インビボでのエルロチニブ/マイクロRNAの組み合わせの効果を試験するために、例えば、安定的にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する同所性の異種移植片に基づく腫瘍マウスモデルが使用される 。典型的な有効性研究は、グループあたり8匹の動物を含む。エルロチニブ/miRNAの組み合わせの次に、他の研究グループは、エルロチニブ単独、miRNA単独、並びにエルロチニブ/miR−NC及び無処置の対照が含まれている。肺の腫瘍病変がIVISイメージングを通じて明らかになると、miRNA処置を開始する。miRNAを、ナノ粒子中に組み合わせ、適度に有効な用量で静脈内に一日おきに投与して、エルロチニブ増強の検出(1−10mg/kg)を可能にした。エルロチニブを、マウスにおいて良好な耐用性が示された/日の用量で、胃管栄養により毎日投与される。治療期間は、2−4週間かまたは対照マウスが瀕死になるか、どちらかが最初に来るまでである。動物は、毒性の徴候を検出するために、厳密にモニターされる。屠殺に際し、肺および肺腫瘍組織を収集し、組織病理学的分析(H&E;Ki67およびCASP3 のIHC、正当化される場合)に供した。RNAを、正常肺、肺腫瘍、脾臓、および全血から抽出して、定量RT−PCRによりmiRNA模倣体の濃度を測定する。さらに、腫瘍サンプルは、直接/検証のmiRNAの標的のノックダウンについて、試験する(QRT−PCR)ために使用される。主要器官への転移のレベルは、H&E及びヒト特異的なIHC染色(STEM121、StemCells社)のいずれかによって、評価することができる。
インビボでのエルロチニブ/マイクロRNAの組み合わせの効果を試験するために、例えば、安定的にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する同所性の異種移植片に基づく腫瘍マウスモデルが使用される 。典型的な有効性研究は、グループあたり8匹の動物を含む。エルロチニブ/miRNAの組み合わせの次に、他の研究グループは、エルロチニブ単独、miRNA単独、並びにエルロチニブ/miR−NC及び無処置の対照が含まれている。肺の腫瘍病変がIVISイメージングを通じて明らかになると、miRNA処置を開始する。miRNAを、ナノ粒子中に組み合わせ、適度に有効な用量で静脈内に一日おきに投与して、エルロチニブ増強の検出(1−10mg/kg)を可能にした。エルロチニブを、マウスにおいて良好な耐用性が示された/日の用量で、胃管栄養により毎日投与される。治療期間は、2−4週間かまたは対照マウスが瀕死になるか、どちらかが最初に来るまでである。動物は、毒性の徴候を検出するために、厳密にモニターされる。屠殺に際し、肺および肺腫瘍組織を収集し、組織病理学的分析(H&E;Ki67およびCASP3 のIHC、正当化される場合)に供した。RNAを、正常肺、肺腫瘍、脾臓、および全血から抽出して、定量RT−PCRによりmiRNA模倣体の濃度を測定する。さらに、腫瘍サンプルは、直接/検証のmiRNAの標的のノックダウンについて、試験する(QRT−PCR)ために使用される。主要器官への転移のレベルは、H&E及びヒト特異的なIHC染色(STEM121、StemCells社)のいずれかによって、評価することができる。
エルロチニブ/ miRNAの組み合わせは、腫瘍組織中の既知のmiRNA標的の同時抑制により、エルロチニブ単独よりも優れたインビボでの有効性を示すことが期待される。また、エルロチニブ/miRNAの組み合わせで処置した動物は、転移を発達させ、および改善された生存を示す可能性が低いことも予想される。
<実施例5:EGFR−TKIおよびmicroRNAについては生体外の効果評価>
導入
本実施例は、プライマリの及び獲得されたエルロチニブ耐性を備えるNSCLC細胞において、miR−34aとエルロチニブの関係性、及び組み合わせの治療活性を調べる。薬物の組み合わせをエルロチニブに対して不応性であることが知られている癌の種類である、肝細胞癌細胞(HCC)のパネルにおいて試験した。複数の分析方法を使用して、癌細胞増殖の薬物誘導性抑制を決定して、相加効果、拮抗作用又は相乗効果を明らかにする。データは、試験した全ての癌細胞におけるエルロチニブ及びmiR−34a模倣体との間で強力な相乗効果を示す。相乗効果は、用量レベルおよび薬物の比率の範囲にわたって観察され、エルロチニブ及びmiR−34AについてのIC50用量の要件を、それぞれ46倍および13倍まで減少させる。最大の相乗効果は、単一薬物単独でによって誘導され、それ故臨床的に関連があるものよりも高レベルの癌細胞の阻害のを提供する投与量において検出される。。データは、マイクロRNAベースの治療法と組み合わせて使用される場合、以前にEGFR−TKI治療について研究されていないNSCLCおよびその他の癌の大部分は、薬物に対する感受性であると判明する。
本実施例は、プライマリの及び獲得されたエルロチニブ耐性を備えるNSCLC細胞において、miR−34aとエルロチニブの関係性、及び組み合わせの治療活性を調べる。薬物の組み合わせをエルロチニブに対して不応性であることが知られている癌の種類である、肝細胞癌細胞(HCC)のパネルにおいて試験した。複数の分析方法を使用して、癌細胞増殖の薬物誘導性抑制を決定して、相加効果、拮抗作用又は相乗効果を明らかにする。データは、試験した全ての癌細胞におけるエルロチニブ及びmiR−34a模倣体との間で強力な相乗効果を示す。相乗効果は、用量レベルおよび薬物の比率の範囲にわたって観察され、エルロチニブ及びmiR−34AについてのIC50用量の要件を、それぞれ46倍および13倍まで減少させる。最大の相乗効果は、単一薬物単独でによって誘導され、それ故臨床的に関連があるものよりも高レベルの癌細胞の阻害のを提供する投与量において検出される。。データは、マイクロRNAベースの治療法と組み合わせて使用される場合、以前にEGFR−TKI治療について研究されていないNSCLCおよびその他の癌の大部分は、薬物に対する感受性であると判明する。
材料および法
細胞株:ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株A549、H460、H1299、H226を、HCC827親およびHCC827resは、マイクロRNAおよびEGFR−TKIの組合せの効果を評価するために使用した。特定の細胞株を、これらの細胞におけるEGFR−TKIの高いIC50値、それらの発癌特性、およびmiRNAに対する感受性に基づいて選択した。これら細胞株は、いずれかの耐性(A549、H460、H1299、H226)または感受性(HCC827)細胞に耐性である。さらに、獲得耐性を有する細胞株を、10週間にわたってエルロチニブの増加した選択圧を適用し、IC10の等量で開始し、IC90等量で終わることによって作成した。 細胞増殖はIC90選択下で通常の二倍の速度を示したので、耐性細胞を低希釈(HCC827res)または高希釈で播種して、純粋に近い耐性クローン(HCC827res−#5、6および7)を作成した。肝細胞癌(HCC)細胞における効果を研究するために、Hep3B、Huh7、C3AおよびHepG2を使用した。 Huh7細胞をJapanese Collection of Research Bioresources Cell Bankから取得した。米国培養菌保存施設(ATCC、Manassas、VA)から他のすべての親細胞を購入し、サプライヤーの指示に従って培養した。
細胞株:ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株A549、H460、H1299、H226を、HCC827親およびHCC827resは、マイクロRNAおよびEGFR−TKIの組合せの効果を評価するために使用した。特定の細胞株を、これらの細胞におけるEGFR−TKIの高いIC50値、それらの発癌特性、およびmiRNAに対する感受性に基づいて選択した。これら細胞株は、いずれかの耐性(A549、H460、H1299、H226)または感受性(HCC827)細胞に耐性である。さらに、獲得耐性を有する細胞株を、10週間にわたってエルロチニブの増加した選択圧を適用し、IC10の等量で開始し、IC90等量で終わることによって作成した。 細胞増殖はIC90選択下で通常の二倍の速度を示したので、耐性細胞を低希釈(HCC827res)または高希釈で播種して、純粋に近い耐性クローン(HCC827res−#5、6および7)を作成した。肝細胞癌(HCC)細胞における効果を研究するために、Hep3B、Huh7、C3AおよびHepG2を使用した。 Huh7細胞をJapanese Collection of Research Bioresources Cell Bankから取得した。米国培養菌保存施設(ATCC、Manassas、VA)から他のすべての親細胞を購入し、サプライヤーの指示に従って培養した。
RNA単離およびqRT−PCR:細胞ペレットからの全RNAを、製造業者の指示に従ってmirVANA PARIS RNA単離キット(Ambion、Austin、TX)を用いて単離した。RNA濃度は、Nanodrop ND−1000(Thermo Scientific, Wilmington, DE)の上の吸光度測定(A260)により決定された。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)による、miRNAおよびmRNAの定量化に関しては、我々が市販で入手可能な試薬を使用した。下記条件の下でMMLV−RT(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して、RNAをcDNAに変換した:4℃15分;16℃30分;42℃30分;85℃5分。cDNA合成に続いて、以下のサイクリング条件の下でPlatinum Taqポリメラーゼ(Invitrogen)を使用して、ABI Prism 7900HT SDS(Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA)上の2μLのcDNAでqPCRを実行した:95℃1分間(最初の変性);その後、95℃5秒間、60℃30秒間の50サイクル。TaqMan Gene Expression AssayおよびTaqMan MicroRNA Assayを、すべての肺および肝細胞株中のmRNAおよびmiRNAの発現解析のために使用した。miRNA発現について、メーカーの試薬への付加物は、miRNAアッセイの勾配、直線性、および感度を向上させるために、DMSO(6%の最終濃度)および塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC;RTおよびPCRの両方において50 mMの終濃度)を含む。miRNAおよびmRNAの両方の発現レベルを、HCC827親細胞株に対する相対定量によって決定した。miRNAおよびmRNA標的の生のCt値を、選択されたハウスキーピング遺伝子に対して標準化してデルタCt値を作成し、線形空間に変換してパーセンテージ発現として表した。
miRNAおよびEGFR−TKIによる処理:エルロチニブ塩酸塩は、LC Laboratories (Woburn, MA)から購入した。 合成のmiR−34aおよびmiRのNC模倣体は、Life Technologies (Ambion, Austin, TX)によって製造された。各薬物単独でのIC50値を決定するために、ウェル当たり2000−3000細胞を96ウェルプレートフォーマットに播種し、エルロチニブまたはmiR−34Aのいずれかで次のように処理した。(i)InvitrogenからのRNAiMax lipofectamineを使用して、階段希釈(0.03−30 nM)中に3回繰り返してmiR−34a模倣体をリバーストランスフェクトした。対照として、細胞はまた、RNAiMax単独で、又は陰性対照のmiRNA模倣体(miR−NC)と組み合わせてトランスフェクトされた。細胞は、肺または肝臓癌細胞の細胞増殖をそれぞれ判定するために、トランスフェクションの4日または6日後にAlamarBlue(Invitrogen)と共にインキュベートした。増殖データはモックでトランスフェクトされた細胞に対して標準化した。(ii)ジメチルスルホキシド(DMSO)中の10及び20mMストック溶液として調製されたエルロチニブを、一日0.1から100μM.の範囲の終濃度で播種した後、細胞に添加した。溶媒のみ(H226およびHCC827中において最終0.5%DMSO、他のすべての細胞株において最終1%DMSO)を、対照として別々のウェル中に加えた。三日後、細胞増殖をアラマーブルーで測定し、溶媒対照に標準化した。
退行趨勢線&IC50値:線形および非線形回帰傾向線は、それぞれ、CompuSyn (ComboSyn, Inc, Paramus, NJ)およびGraphpad (Prism) ソフトウェアを使用して作成した。両方のソフトウェアプログラムは類似の値を生成したが、非線形傾向線は、実際のデータのためのより良いフィットを提供し、IC50、IC25および他の薬物濃度(ICx社)を計算するためにされた。
「固定濃度」法で決定された組合せの効果
「固定濃度」法を、獲得された抵抗性を備える細胞株(HCC827res)について使用した。 細胞を、上記のような固定の弱い濃度(〜IC25)にて、miR−34aでリバーストランスフェクトした。翌日、階段希釈(0.01−100μM)のエルロチニブで細胞を処理した。細胞増殖の阻害を、3日後にAlarmaBlueによって分析した。単一薬物の効果を測定するために、および潜在的に、脂質担体またはビヒクルが寄与する効果を補正するために、 細胞はまた、モックトランスフェクションと組み合わせて、溶媒(HCC827resにおいて0.5%DMSO、他のすべての細胞株において1%DMSO)またはエルロチニブとmiR−34Aの組合せで処理した。すべての増殖データは、溶媒(DMSO)で処理したモックトランスフェクト細胞に対して標準化された。組み合わせの効果は、miR−34aの存在下または非存在下での、エルロチニブ用量反応曲線の目視検査およびIC50値の推移によって評価した(Graphpadを使用してグラフ化及び計算した)。
「固定濃度」法を、獲得された抵抗性を備える細胞株(HCC827res)について使用した。 細胞を、上記のような固定の弱い濃度(〜IC25)にて、miR−34aでリバーストランスフェクトした。翌日、階段希釈(0.01−100μM)のエルロチニブで細胞を処理した。細胞増殖の阻害を、3日後にAlarmaBlueによって分析した。単一薬物の効果を測定するために、および潜在的に、脂質担体またはビヒクルが寄与する効果を補正するために、 細胞はまた、モックトランスフェクションと組み合わせて、溶媒(HCC827resにおいて0.5%DMSO、他のすべての細胞株において1%DMSO)またはエルロチニブとmiR−34Aの組合せで処理した。すべての増殖データは、溶媒(DMSO)で処理したモックトランスフェクト細胞に対して標準化された。組み合わせの効果は、miR−34aの存在下または非存在下での、エルロチニブ用量反応曲線の目視検査およびIC50値の推移によって評価した(Graphpadを使用してグラフ化及び計算した)。
「固定の割合」法で決定された組合せの効果
細胞は、miR34aの7濃度と組み合わせたエルロチニブの7濃度のそれぞれで処理された。各薬物は、IC50にほぼ等しい濃度、およびその2.5倍(NSCLC)または2倍(HCC)増加した濃度で、上記または下記にて(above or below)使用される。このマトリックスから、13の異なる比率を表す、合計49の異なる組み合わせが得られた。各薬物はまたこれらの濃度で単独で使用された。miR−34aおよびエルロチニブを上に記載されるように加えて、細胞増殖をAlamarBlueにより判定した。各データポイントを3回繰り返して行った。
細胞は、miR34aの7濃度と組み合わせたエルロチニブの7濃度のそれぞれで処理された。各薬物は、IC50にほぼ等しい濃度、およびその2.5倍(NSCLC)または2倍(HCC)増加した濃度で、上記または下記にて(above or below)使用される。このマトリックスから、13の異なる比率を表す、合計49の異なる組み合わせが得られた。各薬物はまたこれらの濃度で単独で使用された。miR−34aおよびエルロチニブを上に記載されるように加えて、細胞増殖をAlamarBlueにより判定した。各データポイントを3回繰り返して行った。
組み合わせインデックス(CI)値の計算
ロエベの加法モデルに基づくCI値は、薬物−薬物相互作用の性質を評価するために決定され、前記相互作用は様々な薬物−薬物濃度および効果のレベルについて相加性(CI=1)、拮抗的(CI>1)、または相乗的(CI<1)であり得る(Fa、影響さらたフラクション;癌細胞増殖の阻害)。CI値を計算し比較するために、線形回帰および非線形の回帰傾向線の両方を使用した。CI値に基づく線形回帰分析は、CompuSynソフトウェア (ComboSyn Inc., Paramus, NJ) を用いてchouらの方法に従って行われ、それによって双曲線、双曲線とシグモイド用量効果曲線は線形形式に変換された(Chou TC (2010) Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou−Talalay method. Cancer Res 70: 440−6, instructions also available at ComboSyn, Inc., www.combosyn.com)。非線形回帰傾向線に由来するCI値は、式1を用いて計算され、式中CA,xおよびCB,xは効果 X (Fa)を生成するための組合せ中の薬物Aおよび薬物Bの濃度である。ICx,AおよびICx,Bは、同じ効果を生成するための単一の薬物として用いられる薬物Aおよび薬物Bの濃度である。
ロエベの加法モデルに基づくCI値は、薬物−薬物相互作用の性質を評価するために決定され、前記相互作用は様々な薬物−薬物濃度および効果のレベルについて相加性(CI=1)、拮抗的(CI>1)、または相乗的(CI<1)であり得る(Fa、影響さらたフラクション;癌細胞増殖の阻害)。CI値を計算し比較するために、線形回帰および非線形の回帰傾向線の両方を使用した。CI値に基づく線形回帰分析は、CompuSynソフトウェア (ComboSyn Inc., Paramus, NJ) を用いてchouらの方法に従って行われ、それによって双曲線、双曲線とシグモイド用量効果曲線は線形形式に変換された(Chou TC (2010) Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou−Talalay method. Cancer Res 70: 440−6, instructions also available at ComboSyn, Inc., www.combosyn.com)。非線形回帰傾向線に由来するCI値は、式1を用いて計算され、式中CA,xおよびCB,xは効果 X (Fa)を生成するための組合せ中の薬物Aおよび薬物Bの濃度である。ICx,AおよびICx,Bは、同じ効果を生成するための単一の薬物として用いられる薬物Aおよび薬物Bの濃度である。
薬物濃度を決定するために式1で必要なCI値(CA,x,CB,x,ICx,AおよびICx,B)は、線形回帰傾向線に由来するHillの式(式2)、IC50、およびHill勾配(n)を用いて算出する(Graphpad)。
アイソボログラム
エルロチニブおよびmiR−34aの用量依存性の相互作用を記述するために、癌細胞増殖の50%および80%阻害のレベルに影響を及ぼすアイソボログラムを作成する。単一剤−単独または組み合わせ−は通常、50%の癌細胞の阻害に達するので、50%のアイソボログラムは単一の使用対組み合わせの実際の比較を提供した。80%のアイソボログラムは、腫瘍学における実用的な意味を有する高い効果レベルでの組み合わせの有用性を示すために使用された。これらの各々において、相加性は、単一の使用(IC50、IC80)から、組み合わせの各薬物に関する用量要件を推定することによって決定された。相加性の線より上または下のデータポイントは、それぞれ拮抗作用または相乗効果を示す。 49の全組み合わせについて、組み合わせで必要な薬物の濃度は、同じ効果に到達するための単一剤のみのものと比較され、倍率変化(用量減少指数、DRI)として表された。
エルロチニブおよびmiR−34aの用量依存性の相互作用を記述するために、癌細胞増殖の50%および80%阻害のレベルに影響を及ぼすアイソボログラムを作成する。単一剤−単独または組み合わせ−は通常、50%の癌細胞の阻害に達するので、50%のアイソボログラムは単一の使用対組み合わせの実際の比較を提供した。80%のアイソボログラムは、腫瘍学における実用的な意味を有する高い効果レベルでの組み合わせの有用性を示すために使用された。これらの各々において、相加性は、単一の使用(IC50、IC80)から、組み合わせの各薬物に関する用量要件を推定することによって決定された。相加性の線より上または下のデータポイントは、それぞれ拮抗作用または相乗効果を示す。 49の全組み合わせについて、組み合わせで必要な薬物の濃度は、同じ効果に到達するための単一剤のみのものと比較され、倍率変化(用量減少指数、DRI)として表された。
曲線推移解析
用量反応曲線の直接の比較を可能にするために、および相乗的な薬物 − 薬物相互作用を同定するために、各薬物単独の、又は組み合わせの非線形回帰傾向線(IC50:IC50の比率又は示される他の比率)は、それ自身のIC50値に対して標準化され、IC50等量(IC50 eq)と呼ばれる。組み合わせのIC50等量は、式3を用いて計算され、Zhao L, Au JL Wientjes MG (2010) Comparison of methods for evaluating drug−drug interaction.Front Biosci (Elite Ed) 2: 241−9.中に記載されている。単一剤および組合せのデータは、単一の薬物に対して任意の所定の効果を達成するのに必要な低い薬物濃度を示すために、同じダイアグラム中でグラフ化された。これは、用量反応曲線の左推移を示し、相上Idを示す。
用量反応曲線の直接の比較を可能にするために、および相乗的な薬物 − 薬物相互作用を同定するために、各薬物単独の、又は組み合わせの非線形回帰傾向線(IC50:IC50の比率又は示される他の比率)は、それ自身のIC50値に対して標準化され、IC50等量(IC50 eq)と呼ばれる。組み合わせのIC50等量は、式3を用いて計算され、Zhao L, Au JL Wientjes MG (2010) Comparison of methods for evaluating drug−drug interaction.Front Biosci (Elite Ed) 2: 241−9.中に記載されている。単一剤および組合せのデータは、単一の薬物に対して任意の所定の効果を達成するのに必要な低い薬物濃度を示すために、同じダイアグラム中でグラフ化された。これは、用量反応曲線の左推移を示し、相上Idを示す。
統計的分析
統計分析は、Excel(マイクロソフト)、CompuSyn及びGraphpad ソフトウェアを用いて行った。平均および標準偏差を、三回の実験から計算した。線形および非線形回帰傾向線のフィットの良さは、R(CompuSyn)とR2(Graphpad)の値でそれぞれ記述され、薬物非感受性の制限により、H226およびHepG2を除くほとんどの細胞株について0.9>であった。
統計分析は、Excel(マイクロソフト)、CompuSyn及びGraphpad ソフトウェアを用いて行った。平均および標準偏差を、三回の実験から計算した。線形および非線形回帰傾向線のフィットの良さは、R(CompuSyn)とR2(Graphpad)の値でそれぞれ記述され、薬物非感受性の制限により、H226およびHepG2を除くほとんどの細胞株について0.9>であった。
結果
miR−34aは、非小細胞肺癌細胞におけるエルロチニブに対する感受性を回復する。
miR−34aは、非小細胞肺癌細胞におけるエルロチニブに対する感受性を回復する。
獲得耐性を備える細胞の薬剤耐性を研究するために、我々は、活性化型EGFR変異体(アミノ酸745−750の欠失をもたらすエクソン19の欠失)を発現するHCC827細胞を使用した。HCC827は0.022μM(図4A)のIC50値でエルロチニブに対し高い感受性を示す。親細胞株のIC90に同等の濃度で培養物が増殖抑制の徴候を示さなくなるまで、10週間にわたって増加するエルロチニブ濃度に対して親HCC827細胞を曝露することによって、エルロチニブ耐性の細胞株を発達させた。このプロセスの間に、個々の細胞クローン(HCC827res−#5、#6、#7)並びに耐性細胞(HCC827res)のプールを増殖させた。全RNAを単離し、miR−34ファミリーメンバーおよび抵抗性を誘導することが知られている遺伝子のレベルを定量的PCRにより調べた。エルロチニブに耐性のHCC827細胞は、おそらくEGFRシグナルをバイパスするように機能する、MET及びそのリガンドHGFのmRNAレベルの増加を示した(図8A−C)。対照的に、AXL、GAS6、KRAS、FGFR1、ERBB3、PIK3CAおよびEGFR自体など、抵抗性に関連する他の遺伝子の発現レベルは上昇しなかった。miR−34b/cファミリーメンバーは、いくつかの耐性HCC827細胞中で減少した(図8A−C)。興味深いことに、miR−34aエルロチニブ耐性HCC827細胞では減少せず、このことは、MET遺伝子の増幅によってmiR−34が独立して起こり得る、これらの細胞中の耐性の開始において、miR−34aが因果的役割を果たしてはいないことを示唆している。
METとAXL両方がmiR−34によって直接抑制され、AXLの阻害がエルロチニブ耐性と拮抗することができるので、合成のmiR−34模倣体の導入は、エルロチニブ感受性を回復し得る。この可能性を探るために、HCC827res細胞を、固定の弱い濃度(0.3 nM)で使用されるmiR−34aの非存在下または存在下のどちらかで、0.03〜100μMの範囲で増加するエルロチニブ濃度に暴露した。エルロチニブの効果は、miR−34Aと組み合わせたエルロチニブがエルロチニブ単独に対して低いIC50値を生成するように、濃度依存性であることが予想された。図4Cに示されるように、エルロチニブはHCC827res細胞(IC 50=25.2μM)中ではさほど強力ではなかった。しかし、miR−34Aと組み合わせて使用される場合、 エルロチニブのIC50値は0.094μMまで減少した。この結果は、miR−34aの少量の添加が、親HCC827細胞のものと同様のエルロチニブ感受性を回復させ得ることを示している。 負の陰性対照のmiRNA(miR−NC)の添加はエルロチニブの効力を向上させなかったので、効果はmiR−34A配列に特異的であった(図4C)。したがって、HCC827res細胞において生成されたデータは、miR−34aがエルロチニブの獲得耐性を備える癌細胞を感作させ得ることを示している。
miRNAが一次性の耐性機構に対抗できるかどうかを判定するために、我々はNRASとTP53遺伝子の変異を有するH1299細胞を使用した。 ここれらの細胞において、エルロチニブは11.0μMのIC50値を生成しました(図4D)。0.3 nMでのmiR−34Aとの組み合わせで、エルロチニブ用量反応曲線はx軸に沿って推移し、これは約4倍低いIC50値(3.0μM)を示した。 この結果は、エルロチニブの効力を変化させなかったmiR−NCとは対照的であり、miR−34aが獲得抵抗ならびに一次性の抵抗の両方を備える非小細胞肺癌細胞を感作させ得ることを示唆している。
miR−34aおよびエルロチニブは、非小細胞肺癌細胞において協働する。
エルロチニブのIC50値の推移は、固定のmiR−34a濃度がエルロチニブの有効性を向上させるかどうか示した。 しかし、「固定された濃度モデル」としても知られるこのモデルは、相乗効果を評価することはできない。 両方の薬物が互いに増強できるかどうかを調べるために、我々は、加法のLoeweのコンセプトに基づく「固定比率−モデル」を採用した (Chou TC (2010) Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou−Talalay method. Cancer Res 70: 440−6. Tallarida RJ (2001) Drug synergism: its detection and applications. J Pharmacol Exp Ther 298: 865−72. Tallarida RJ (2006) An overview of drug combination analysis with isobolograms. J Pharmacol Exp Ther 319: 1−7.)。このモデルでは、組合せ指数(CI)値は、各用量反応曲線(薬物単独で、または組み合わせで)の傾斜およびIC50値に基づいて計算され、薬物−薬物相互作用は相加性(CI=1)、拮抗性(CI>1)、または相乗性(CI<1)であるかどうかを定義する。CI値の精度が用量反応曲線傾向線のフィットに依存するので、CI値は、線形または非線形回帰傾向線(材料および方法を参照)の2つの方法 のいずれかを使用して、により算出した。4つのエルロチニブ耐性の細胞株を使用し、それらの全ては遺伝的構成が異なっていた:A549(KRAS、STK11、CDKN2Aの中の変異)、H460(KRAS、STK11、CDKN2A、PIK3CAの中の変異)、H1299(NRAS、TP53の中の変異)およびH226(CDKN2Aの中の変異)[37]。定量RT−PCR分析は、これらの細胞において、エルロチニブ感受性のHCC827細胞と比較して、AXL、GAS6およびFGFR1のmRNAレベルの顕著な増加を示し、エルロチニブ耐性についての説明をさらに提供した(図8A−C)。miR−34のレベルはH1299およびH460細胞で有意に減少した。 最初のステップにおいて、エルロチニブ又はmiR34aを連続希釈で細胞に添加さして、各薬物単独のIC50値を決定した。エルロチニブについては、これらは、4.2および>50μMの範囲であった(図9A−B)。miR34aのIC50値は0.4乃至15.6nMの範囲であった。どちらの薬物も100%の癌細胞を阻害することできず、いずれの薬物の最大活性も75%を超えなかった。エルロチニブ及びmiR−34aはH226細胞において最も有効でなく、用量−応答曲線の外挿の結果として理論上のIC50値を得た。第2のステップでは、各薬物を、それ自身のおおよそのIC50値に等しく、ならびにそれらの上記および下記(固定比率)の倍数での濃度で、混合した。対照として、各薬物単独をこれらの濃度で単独で使用した。両方の線形および非線形回帰モデルは、試験されたすべての細胞株において1.0をよく下回るCI値を生じ、強い相乗効果を示した(図5A)。我々が適切であると考えたCI値は0.6を下回るものである。ほとんどの細胞系統において、相乗効果は、より高い用量レベルおよび癌細胞抑制のより高い大きさで、観察された。薬物の組み合わせの実用化には最大の癌細胞阻害(75%阻害またはそれ以上)での相乗効果が求められるので、これは重要ある。両方のモデルが同様の結果を生成したが、一般的には、非線形回帰傾向線は、実際のデータについてより良いフィットを提供した。
次に我々は、アイソボログラムを生成し、相乗効果のための読み出しとして、50%および80%の癌細胞の阻害における各薬物の用量要件を決定した。薬の効能が頻繁にそのIC50で評価され、我々の研究では各薬物単独が50%のほとんどの癌細胞を阻害することが可能であって、それにより各薬物単独と組み合わせとの比較が実際のデータの範囲内で可能となったので、50%の効果のレベルが選択された。腫瘍学の適用のための高阻害活性で相乗効果を示すことが重要であるため、80%の効果のレベルが選択された。80%の阻害を達成するような各薬物単独の濃度は、用量−反応曲線の外挿に基づいており、 自然の中では理論的であるが、miR−34A−エルロチニブの組合せは、容易に80%阻害以上を達成し、実際のデータの範囲内である。二つの薬物は、H226細胞中ではあまり有効はなかったので、30%および50%の阻害でのアイソボログラムが、H226データ用に作成された。図5Bに示されるように、組み合わせのイソボール(isobole)は、すべての細胞株について相乗的イソロ−ブをよく下回り、効果レベルは強い相乗効果を示した。エルロチニブ用量の要件は、50%阻害を達成するために、ほとんどの細胞株において2μMまたはそれ以下にまで減少し。4から46倍だけ投与量を減少させた。同様に、miR−34aの必要な濃度も、miR−34a単独に比べて、組み合わせにおいて実質的に少なく、7から13倍だけその量を減少させた。減少指標(DRI)とも呼ばれるこの用量レベルの減少は、80%阻害で著しく明白であり、用量の要件は28倍(エルロチニブ)および33倍(miR−34a)まで減少したれる
第三に、我々は曲線推移解析を行い、それにより各薬物の濃度がそれ自身のIC50値に対して正規化された(Zhao L, Au JL Wientjes MG (2010) Comparison of methods for evaluating drug−drug interaction. Front Biosci (Elite Ed) 2: 241−9.)。この薬物濃度のIC50当量(IC50 eq)への変換により、単一の薬物および組み合わせから、各用量反応曲線を直接比較することが可能となる。傾向線が生成され、0から100%の阻害の効果レベルに及ぶ。趨勢線の傾斜は薬物潜在能力を示し、実際のデータポイントから最大の活性をguagedすることができる。組み合わせのIC50当量が単一剤Idと比較して任意の効果を達成するには低い場合、相乗効果が同定される。これは、組み合わせ趨勢線の左の変更で視覚的に示される。図8A−Cに見られるように、組相乗効果を示す単一剤から十分に分離されている。H460およびH226細胞において、組み合わせのIC50当量は、単一剤のものと比較して、低い効果レベル(0−25%)でより大きくなり、30%以上の効果レベルでより低くなっている。この観察は、これらの細胞における25%を下回る阻害での拮抗作用と、25%を上回る阻害での相乗効果を示す、CIプロットからのデータと一致している(図4A)。従って、分析は、癌細胞阻害の高いレベルを誘導する薬物濃度について相乗効果を明らかにする。組み合わせの利点は、抑制の実際のレベルが、組み合わせについて単一剤に対して大きく− 単一の薬物の最大活性が75%よりも大きくなく、組み合わせて使用した場合90%を超えて拡張され得る、という事実によってさらに明らかにされる。
エルロチニブ及びmiR−34aの様々な割合は、相乗的に協働する。
我々の分析では、エルロチニブとmiR−34は、2つの薬物がそれらのIC50値に由来する比率で組み合わされる場合に協同することを示唆している。薬物 − 薬物相互作用が相対的な量に応じて変化し得るので、我々は、エルロチニブを0.41乃至100μMの濃度で、miR−34aを0.12乃至30nMの濃度で組み合わせることにより、複数のエルロチニブ−miR−34Aの比率の影響を検討した。薬物の用量は、2.5倍増加し、各薬物はまた対照として単独で使用された。このマトリックスから、13の異なる薬物の比を表す49の薬物の組み合わせが得た(図6A)。癌細胞の阻害のレベル、CIおよびDRI値は、各組み合わせについて同定され、CIプロット、アイソボログラムおよび曲線推移図にグラフ化された。本実施例で我々は、miR−34aとエルロチニブがIC50:IC50の比(モル比1:3333)および次のモルベースの比(1:533、1:1333、1:8333および1:208333)で加えられる組み合わせに焦点を当てた。
算出されたCI値は、これらの比率の全てで組み合わされるエルロチニブ及びmiR−34aが強い相乗効果を提供すると予測している(図6B)。75%阻害よりも大きな効果レベルにて、CI値は0.2未満であった。より多くの量のエルロチニブを含む比率は、−75%未満の効果レベルで低い相乗効果を提供し、75%を上回る阻害効果レベルでわずかに優れていた。同様に、アイソボログラムは、様々なエルロチニブ−miR−34Aの比率について、強力な相乗効果を示している(図6C)。実際のデータ点は、単一剤として用いる場合、−80%の癌細胞の抑制を誘導するために30 nMのmiR−34A又は100μΜのエルロチニブが必要とされることを示している。 対照的に、組み合わせにおいて必要とされるエルロチニブの用量レベルは、miR−34aの量が増加するにつれて実質的に減少した。例えば、12nMのmiR−34aが使用される場合、2.56μΜのエルロチニブは単に−80%の阻害を誘導するのに必要とされ、これにより、−40倍だけエルロチニブの用量の要件を減少させる。これらの比率の相乗効果に関するさらなる証拠は、曲線推移解析から来ており、該解析は、単一剤単独のIC50値と比較してはるかに低い、組み合わせのIC50当量を明らかにする(図6D)。ICso eqデータは、様々な比率間での相乗効果の用量依存度を示すCIデータと相関しており: 低い比率は低効果レベルで低い相乗効果を示し、これは癌細胞の阻害の高レベルでは反転する。
49の組合せの完全な範囲はH1299、H460およびH226細胞においても試験され、A549細胞で得られた結果を確認た。(図10A−D)複数の比率は良好な相乗効果を提供し、より高い効力を有するものがより高い薬物濃度のものにクラスター化された。これらの中では、我々のカットオフを満たし、>75%の癌細胞の抑制を生成し、各薬物についてCI<0.6およびDRI>2であった。
エルロチニブおよびmiR−34aは、肝細胞癌の細胞において相乗的に同時に協働する。
エルロチニブ及びmiR−34aの協働の活性について他の癌の適応症において有用性があるかどうかを調べるために、我々は、肝細胞癌の細胞モデルにおいてこの組み合わせを調査した。エルロチニブが単一剤としての進行型の肝臓の患者で適度に有効であり、ソラフェニブとの組み合わせにおいて全生存期間および増悪までの時間を延長するのに失敗したため、肝臓癌を試験プラットフォームとして選んだ。(Philip PA, Mahoney MR, Allmer C, Thomas J, Pitot HC, et al. (2005) Phase II study of Erlotinib (OSI−774) in patients with advanced hepatocellular cancer.J Clin Oncol 23: 6657−63. Thomas MB, Chadha R, Glover K, Wang X, Morris J, et al. (2007) Phase 2 study of erlotinib in patients with unresectable hepatocellular carcinoma. Cancer 110: 1059−67. Zhu AX, Rosmorduc O, Evans J, Ross P, Santoro A, et al. (2012) SEARCH: A phase III, randomized, double−blind, placebo−controlled trial of sorafenib plus erlotinib in patients with hepatocellular carcinoma (HCC). 37th Annual European Society for Medical Oncology Congress, Vienna, Austria, September 28−October 2 (abstr 917)).
さらに、現在臨床試験中のMRX34、miR−34aのリポソームは、前臨床動物実験で効果的に肝臓腫瘍を除去し、したがってエルロチニブとの組み合わせで魅力的な薬物であり得る。使用された細胞モデルは、Hep3B、C3A、HepG2、およびHuh7を含み、そのうちのいくつかは、エルロチニブ感受性の肺癌株と比較して、エルロチニブ耐性遺伝子AXL、HGF、FGFR1、およびERBB3のアップレギュレーションを示す(図11)。まとめると、miR−34ファミリーメンバーのレベルは、肝臓癌細胞において低いか又は検出不能であった。我々の予想と一致して、エルロチニブのIC50値は、これらの4つの細胞株で、25μM以上であった(図12A−B)。miR−34aのIC50値は、0.3乃至2.3 nMの範囲であって、ゆえに、肺癌細胞のそれと同様であった。これらの値は、IC50:IC50の固定比率でエルロチニブとmiR−34aとを組み合わせるために、およびCI、イソボール、及びIC50eqの値を生成するために、ガイドとして使用される(図7)。さらに、各組み合わせは、複数の比率にわたって組み合わせの効果を評価するために、異なる濃度のマトリックスで試験された(図13A−D)。我々のデータは、試験した全ての細胞株においてエルロチニブとmiR−34aとの間の強力な相乗効果を予測する。相乗効果は癌細胞の阻害の高レベルで観察され、従って、活性の望ましい範囲内で生じた(図7A)。この結果は、より高い用量および効果レベルでの相乗効果を示す、IC50eqの曲線推移解析によって確認された。分析はまた、組み合わせの最大の阻害活性が、単一剤のものと比較して実質的に拡大されることを示している(図7C)。 50%より大きな阻害、例えば80%を誘導するためにmiR34aで使用される場合、アイソボログラムは、エルロチニブ用量の明確な減少を示す(図7B)。組み合わせにおいて、エルロチニブは、50%の癌細胞を阻害するために、2μMという低濃度で使用され得、それによって、その単独での使用(HepGを参照)と比較して75倍投与量を低下させる。相乗効果は特定の比率に限定されないが、試験されたほとんどの比率にわたって明らかである (図13A−D)。したがって、データは、肺癌細胞において生成されたものと類似しており、エルロチニブ単独では不十分な癌におけるエルロチニブmiR−34aの組み合わせに関して、増強された有効性を予測する。
議論
成果は薬物の比率、薬物濃度および所望の効力に依存するので、薬物−薬物相互作用の正確な評価は複雑である(Chou TC (2010) Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou−Talalay method. Cancer Res 70: 440−6)。miR−34a模倣体とエルロチニブとの間の薬理学的関係を調べるために、我々は複数の分析アプローチを使用して、薬物の強化を明らかにし(「固定濃度」モデル)、相加効果、拮抗作用、および相乗効果を区別した(「固定比率」モデル)。我々は、線形または非線形データ回帰に由来する、CI値、アイソボログラムおよびIC50当量を調べた。miR−34aが、一次性又は二次性/獲得耐性に関連するかどうかについて試験された全ての癌細胞におけるエルロチニブに対する感受性を増強する、ということを我々のデータは示す。もっともらしい説明は、腫瘍抑制miRNAが多数の癌経路を阻害するという事実によって提供される。この仮説を支持して、エルロチニブ耐性に特異的にリンクされる遺伝子産物であるAXLおよびMETは、miR−34Aによって直接抑制される(Kaller M, Liffers ST, Oeljeklaus S, Kuhlmann K, Roh S, et al. (2011) Genome−wide characterization of miR−34a induced changes in protein and mRNA expression by a combined pulsed SILAC and microarray analysis.Mol Cell Proteomics 10: M111 010462. Mudduluru G, Ceppi P, Kumarswamy R, Scagliotti GV, Papotti M, et al. (2011) Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR−34a and miR−199a/b in solid cancer. Oncogene 30: 2888−99. He L, He X, Lim LP, de Stanchina E, Xuan Z, et al. (2007) A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature 447: 1130−4.)。
成果は薬物の比率、薬物濃度および所望の効力に依存するので、薬物−薬物相互作用の正確な評価は複雑である(Chou TC (2010) Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou−Talalay method. Cancer Res 70: 440−6)。miR−34a模倣体とエルロチニブとの間の薬理学的関係を調べるために、我々は複数の分析アプローチを使用して、薬物の強化を明らかにし(「固定濃度」モデル)、相加効果、拮抗作用、および相乗効果を区別した(「固定比率」モデル)。我々は、線形または非線形データ回帰に由来する、CI値、アイソボログラムおよびIC50当量を調べた。miR−34aが、一次性又は二次性/獲得耐性に関連するかどうかについて試験された全ての癌細胞におけるエルロチニブに対する感受性を増強する、ということを我々のデータは示す。もっともらしい説明は、腫瘍抑制miRNAが多数の癌経路を阻害するという事実によって提供される。この仮説を支持して、エルロチニブ耐性に特異的にリンクされる遺伝子産物であるAXLおよびMETは、miR−34Aによって直接抑制される(Kaller M, Liffers ST, Oeljeklaus S, Kuhlmann K, Roh S, et al. (2011) Genome−wide characterization of miR−34a induced changes in protein and mRNA expression by a combined pulsed SILAC and microarray analysis.Mol Cell Proteomics 10: M111 010462. Mudduluru G, Ceppi P, Kumarswamy R, Scagliotti GV, Papotti M, et al. (2011) Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR−34a and miR−199a/b in solid cancer. Oncogene 30: 2888−99. He L, He X, Lim LP, de Stanchina E, Xuan Z, et al. (2007) A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature 447: 1130−4.)。
意外なことに、EGFR経路を含む複数の発癌性シグナル伝達経路の制御におけるmiR−34aの関与の証拠があるにもかかわらず、エルロチニブはまたmiR−34a模倣体の治療効を増強した (Lal A, Thomas MP, Altschuler G, Navarro F, O’Day E, et al. (2011) Capture of microRNA−bound mRNAs identifies the tumor suppressor miR−34a as a regulator of growth factor signaling. PLoS Genet 7: e1002363.)。 したがって、この結果は、miRNA模倣体が単一の遺伝子指向性療法(gene−directed therapy)と協働できることを示し、他の組み合わせの探索を誘っている。従って、様々な追加の実施形態において、本発明は、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブおよびセツキシマブなどの他のEGFR阻害剤、ならびにラパチニブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブなどのHER2阻害剤と、miR−34aとの組み合わせを含む。
獲得耐性を備える肺癌細胞(HCC827res)では、少量のmiR−34aを添加によって、エルロチニブIC50値を0.1μMより下まで低減することができた。 これは注目すべき結果であり、miR34aが、親HCC827細胞と比較して同等のエルロチニブ感受性を、この細胞株に付与できることを示唆している。一次性の耐性を伴う肺癌細胞では、エルロチニブのIC50用量要件は4から46倍減少し、約2μMであった。 これは、臨床的有用性を有する濃度の範囲内で有り得る(Sharma SV, Bell DW, Settleman J Haber DA (2007) Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer 7: 169−81.)。エルロチニブは、最大150mgの経口投与量として毎日与えらる。MRX34の臨床用量レベルは未だ確立されていないが、臨床で使用されるmiR−34aとエルロチニブとのモル比は、我々の細胞研究で相乗効果を示した比率の範囲内であり得る。
エルロチニブは現在、活性EGFR変異を備えるNSCLC患者のための一次治療として使用されている。 少なくとも1つの先の化学療法レジメンで失敗した、局所的に進行したか又は転移したNSCLCについて、化学療法および2次および3次の治療の後の維持療法としても使用される。臨床試験は、従来の化学療法単独と比べて、シスプラチン/ゲムシタビンまたはカルボプラチン/パクリタキセルとの組み合わせでは、エルロチニブの生存利益を示すのを失敗した(Id. Herbst RS, Prager D, Hermann R, Fehrenbacher L, Johnson BE, et al. (2005) TRIBUTE: a phase III trial of erlotinib hydrochloride (OSI−774) combined with carboplatin and paclitaxel chemotherapy in advanced non−small−cell lung cancer. J Clin Oncol 23: 5892−9.)。HCCにおけるエルロチニブ・プラス・ソラフェニブを調査し、最近の第III相試験も、そのエンドポイントを満たさなかった(Zhu AX, Rosmorduc O, Evans J, Ross P, Santoro A, et al. (2012) SEARCH: A phase III, randomized, double−blind, placebo−controlled trial of sorafenib plus erlotinib in patients with hepatocellular carcinoma (HCC). 37th Annual European Society for Medical Oncology Congress, Vienna, Austria,September 28−October 2(abstr 917))。したがって、併用療法の他のアプローチが望まれる。我々のデータは、エルロチニブとmiR−34aとの組み合わせが特に有効であり、エルロチニブで治療できるNSCLC患者集団を実質的に広げ得ることを示す。組み合わせはHCC細胞においても同様に相乗的であり、このことは、相乗的相互作用がそれらの作用分子機構の結果であり、NSCLC以外の癌にも適用可能であることを示唆した。
<実施例6:ラパチニブおよびmiR−34模倣体(MIR−Rx34)は乳癌細胞において協働する>
ヒト乳癌細胞株BT−549、T47D、MDA−MD−231、およびMCF−7(ATCCから)は、miR−Rx34及びラパチニブの組み合わせの効果を評価するために使用された。ラパチニブは、LC Laboratories(マサチューセッツ州)から購入した。 合成のmiR−34aおよびmiR−NCの模倣体は、Life Technologies(Ambion, Austin, TX)によって製造された。各薬物単独のIC50値を決定するために、ウェル当たり2,000−3,500細胞を96ウェルプレートフォーマットに播種し、ラパチニブまたはmiR−34aのいずれかで次のように処理した。(i)miR−34Aの模倣体は、公開されたプロトコルに従って、InvitrogenからのRNAiMAXリポフェクタミンを用いて、連続希釈(0.03−30 nM)中で3組でリバーストランスフェクトした。対照として、細胞はRNAiMAXトランス単独(モック)でトランスフェクトされた。細胞は、細胞増殖を決定するために、トランスフェクションの6日後にAlamarBlue (Invitrogen)でインキュベートした。増殖データは、モックでトランスフェクトされた細胞に対して正規化された。(ii)ラパチニブは、ジメチルスルホキシド(DMSO)中の10mMストック溶液として調製され、0.1から100μMの範囲の最終濃度で播種した一日後、細胞に添加した。溶媒のみ(全細胞株中で1%の最終DMSO)を対照として別々のウェル中の細胞に添加した。三日後、細胞増殖をアラマーブルーで測定し、溶媒対照に対して正規化した。
ヒト乳癌細胞株BT−549、T47D、MDA−MD−231、およびMCF−7(ATCCから)は、miR−Rx34及びラパチニブの組み合わせの効果を評価するために使用された。ラパチニブは、LC Laboratories(マサチューセッツ州)から購入した。 合成のmiR−34aおよびmiR−NCの模倣体は、Life Technologies(Ambion, Austin, TX)によって製造された。各薬物単独のIC50値を決定するために、ウェル当たり2,000−3,500細胞を96ウェルプレートフォーマットに播種し、ラパチニブまたはmiR−34aのいずれかで次のように処理した。(i)miR−34Aの模倣体は、公開されたプロトコルに従って、InvitrogenからのRNAiMAXリポフェクタミンを用いて、連続希釈(0.03−30 nM)中で3組でリバーストランスフェクトした。対照として、細胞はRNAiMAXトランス単独(モック)でトランスフェクトされた。細胞は、細胞増殖を決定するために、トランスフェクションの6日後にAlamarBlue (Invitrogen)でインキュベートした。増殖データは、モックでトランスフェクトされた細胞に対して正規化された。(ii)ラパチニブは、ジメチルスルホキシド(DMSO)中の10mMストック溶液として調製され、0.1から100μMの範囲の最終濃度で播種した一日後、細胞に添加した。溶媒のみ(全細胞株中で1%の最終DMSO)を対照として別々のウェル中の細胞に添加した。三日後、細胞増殖をアラマーブルーで測定し、溶媒対照に対して正規化した。
併用の研究を、ラパチニブの〜IC50比率及びmiR−Rx34(比率= IC50ラパチニブ/ IC50miR−Rx34)で行った。 細胞は、上記または下記の2倍の増加内の、対応するIC50および濃度にほぼ等しい濃度で、miR−Rx34aと組み合わせたラパチニブで処理された。 ラパチニブ/miR−Rx34aの比率はBT−549で4000、MDA−MD−231で3333.3、MCF−7で5000、およびT47Dで6000である。細胞をmiR−Rx34aでリバーストランスフェクトし、ラパチニブをトランスフェクションの3日間後に添加し、細胞増殖をAlamarBlueによってラパチニブ添加の3日後に測定した。
CI値は、単一剤の用量反応曲線の非線形回帰に基づいて計算され、および、組み合わせで使用される場合、0(阻害なし)から1(100%阻害)までの軸上ので、癌細胞の阻害のレベルに対して示される。相乗的と考えられ、臨床的価値を有する組み合わせは、最大の癌細胞阻害における低いCI値(<0.6)を有するものである。図14に示されるようにmiR−Rx34は、すべての4つの乳癌細胞株(BT−549、MCF−7、MDA−MB−231、T47D)にわたってラパチニブと相乗作用する。記号は、実際のデータポイントに由来するCI値を表わす。CI(組み合わせインデックス);Fa、影響された画分、(=増殖の抑制);CI=1、相加性;CI〉1、拮抗性;CI〈1、相乗性。
<実施例7:NSCLCにおけるエルロチニブ+ MRX34療法>
非小細胞肺癌を有する患者を治療するために、MRX34+エルロチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日150、100、または50mgの経口用量のエルロチニブ、および、50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は、50、70、93、124、または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
非小細胞肺癌を有する患者を治療するために、MRX34+エルロチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日150、100、または50mgの経口用量のエルロチニブ、および、50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は、50、70、93、124、または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例では、エルロチニブは毎日150、100、または50mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴の間、1週間に2回(three twice)(例えば月曜日と火曜日)、与えられる。特定の状況では、50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルでMRX34を与える。
別の例において、エルロチニブは毎日150、100、または50mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴によって毎日与えられるが、ただし1週間につき5日間連続で行われ、2日間の休みを設ける。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
<実施例8:膵臓癌におけるエルロチニブ+MRX34療法>
膵臓癌、例えば膵管腺癌を有する患者を治療するために、MRX34+エルロチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日100、または50mgの経口用量のエルロチニブ、および、50mg/m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
膵臓癌、例えば膵管腺癌を有する患者を治療するために、MRX34+エルロチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日100、または50mgの経口用量のエルロチニブ、および、50mg/m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例では、エルロチニブは毎日100、または50mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴の間、1週間に2回((例えば月曜日と火曜日)、与えられる。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例において、エルロチニブは毎日100、または50mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴によって毎日、ただし1週間あたり5日間連続と2日間のオフで与えられる。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
<実施例9:乳癌におけるラパチニブ+MRX34療法>
乳癌、例えば、ホルモン受容体陽性、HER2陽性転移性乳癌を備える患者を試験するために、MRX34+ラパチニブの組み合わせを次のように使用することができる。患者は毎日1500、1250、1000、または750mgの経口用量のラパチニブ、および、50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
乳癌、例えば、ホルモン受容体陽性、HER2陽性転移性乳癌を備える患者を試験するために、MRX34+ラパチニブの組み合わせを次のように使用することができる。患者は毎日1500、1250、1000、または750mgの経口用量のラパチニブ、および、50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例では、ラパチニブは毎日1500、1250、1000、または750mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴の間、1週間に2回(例えば月曜日と火曜日)、与えられる。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例において、ラパチニブは毎日1500、1250、1000、または750mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴によって毎日、ただし1週間あたり5日間連続と2日間のオフで与えられる。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例において、ラパチニブおよびMRX34は上記のように、及び、21日周期の1−14日目でカペシタビン2000mg/m2/日(約12時間おきに2つの用量で経口投与される)と組み合わされて、投与される。
別の例において、ラパチニブおよびMRX34は、上記のように、および一日一回2.5mgのレトロゾールと組み合われて、投与される。
<実施例10:NSCLCにおけるアファチニブ+MRX34療法>
非小細胞肺癌を有する患者を治療するために、MRX34+アファチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日40、30、または20mgの経口用量のアファチニブ、および、50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
非小細胞肺癌を有する患者を治療するために、MRX34+アファチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日40、30、または20mgの経口用量のアファチニブ、および、50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、MRX34の30分乃至3時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例では、アファチニブは毎日40、30、または20mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴の間、1週間に2回(例えば月曜日と火曜日)与えられる。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
別の例において、アファチニブは毎日40、30、または20mgの経口用量として与えられ、および、MRX34は50mg/ m2乃至165mg/m2の範囲の用量レベルで、30分乃至3時間の点滴によって毎日、ただし1週間あたり5日間連続と2日間のオフで与えられる。特定の状況では、MRX34は50、70、93、124または165mg/m2の用量レベルで与えられる。
明細書は、明細中で引用される引用の教えに照らして最も徹底的に理解される。明細書内の実施形態は、発明の実施形態の実例を提供し、発明の範囲を限定するようには解釈されるべきでない。当業者は、他の多くの実施形態が本発明により包含されることを容易に認識する。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または、ただ日常的な実験のみを用いて確認できよう。こうした等価物は以下の請求項で包含されるように意図される。
Claims (35)
- 癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は:
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFR−TKI)薬剤を投与する工程;及び
miR−34、miR−124、miR−126、miR−147、miR−215から選択されるマイクロRNA、及び、配列番号:8−122として付録Aに列挙されるマイクロRNAを、被験体に投与する工程
を含み、
ここで、EGFR−TKI薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロRNAはmiR−126ではない
ことを特徴とする方法。 - EGFR−TKI薬剤はエルロチニブである、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 癌は肺癌である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 肺癌は非小細胞肺(NSCL)癌である、ことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 癌は、EGFR−TKI薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 耐性は一次である、ことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 耐性は二次(獲得)である、ことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤は、マイクロRNA投与がない状態で有効であることが必要とされる用量の下で少なくとも50%である有効量で投与される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤のIC50は、マイクロRNA投与が無い状態でIC50に対して少なくとも2倍低減される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 癌は肝臓癌である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 肝臓癌は肝細胞癌である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 被験体はKRAS変異を有する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 被験体はEGFR変異を有する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 癌は肝臓に転移性病巣を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤は、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブ、又はセツキシマブを含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- NSCLは、EGFR−TKI薬剤単独による処置に対する二次耐性を有する、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- HCCは、EGFR−TKI薬剤単独による処置に対する二次耐性を有する、ことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤はエルロチニブであり、マイクロRNAは配列番号:1に少なくとも80%同一の配列を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤はHER2阻害剤である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- HER2阻害剤は、ラパチニブ、ペルツズマブ、又はトラスツズマブである、ことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤はエルロチニブであり、マイクロRNAは、配列番号:1、配列番号:168、又は配列番号:169に少なくとも80%同一の配列を含み、癌は非小細胞肺(NSCL)である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤はエルロチニブであり、マイクロRNAは、配列番号:1、配列番号:168、又は配列番号:169に少なくとも80%同一の配列を含み、癌は膵癌である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤はラパチニブであり、マイクロRNAは、配列番号:1、配列番号:168、又は配列番号:169に少なくとも80%同一の配列を含み、癌は乳癌である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤はアファチニブであり、microRNAは、配列番号:1、配列番号:168、又は配列番号:169に少なくとも80%同一の配列を含み、癌は非小細胞肺(NSCL)である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は:
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFR−TKI)薬剤を投与する工程;及び
配列番号:1−6、8−122、又は168−179に少なくとも80%同一の配列を含むマイクロRNAを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、EGFR−TKI薬剤がゲフィチニブである場合、配列は配列番号:3と同一ではない
ことを特徴とする方法 - マイクロRNAはmiR−34である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 肺癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は:
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFR−TKI)薬剤を投与する工程;及び
miR−34a、miR−34b、又はmiR−34cから選択されるマイクロRNAを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、EGFR−TKI薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロRNAはmiR−126ではない
ことを特徴とする方法。 - 肺癌は非小細胞肺(NSCL)癌である、ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- NSCLは、EGFR−TKI薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 肝臓癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は:
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFR−TKI)薬剤を投与する工程;及び
miR−34a、miR−34b、又はmiR−34cから選択されるマイクロRNAを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、EGFR−TKI薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロRNAはmiR−126ではない
ことを特徴とする方法。 - 肝臓癌は肝細胞癌である、ことを特徴とする請求項30に記載の方法。
- HCCは、EGFR−TKI薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 乳癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は:
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFR−TKI)薬剤を投与する工程;及び
miR−34a、miR−34b、又はmiR−34cから選択されるマイクロRNAを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、EGFR−TKI薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロRNAはmiR−126ではない
ことを特徴とする方法。 - NSCLは、EGFR−TKI薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項33に記載の方法。
- EGFR−TKI薬剤はラパチニブである、ことを特徴とする請求項33に記載の方法。
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