JP2020530014A - がんを治療するための組み合わせ - Google Patents
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Abstract
本出願は、がん、例えば、BRAF及び/またはRAS変異を有する及び有しないがんを治療するのに使用することができる化合物、組成物及びそれらの組み合わせを記載する。【選択図】図1A
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2017年8月7日に出願された米国特許仮出願第62/541,911号及び2017年12月20日に出願された米国特許仮出願第62/608,265号に対して優先権を主張し、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願は、2016年2月5日に出願された米国特許仮出願第62/291,931号、2016年6月2日に出願された米国特許仮出願第62/344,612号及び2016年11月21日に出願された米国特許仮出願第62/424,792号ならびに、2017年2月3日に出願された国際出願第PCT/US2017/01653号と関連しており、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2017年8月7日に出願された米国特許仮出願第62/541,911号及び2017年12月20日に出願された米国特許仮出願第62/608,265号に対して優先権を主張し、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願は、2016年2月5日に出願された米国特許仮出願第62/291,931号、2016年6月2日に出願された米国特許仮出願第62/344,612号及び2016年11月21日に出願された米国特許仮出願第62/424,792号ならびに、2017年2月3日に出願された国際出願第PCT/US2017/01653号と関連しており、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、一般に、がん、例えば、野生型または変異型RafまたはRasをともなうがんを治療するための化合物の組み合わせに関する。
BRAF阻害剤は、末期黒色腫、例えば、転移性黒色腫または切除不能な黒色腫を治療するために承認されている。しかし、これらは、BRAF変異、例えば、V600EまたはV600Kを有する黒色腫で承認されているだけである。さらに、これらの化合物が野生型BRAFを有する患者の腫瘍を実際は悪化させ得ることが、広く認められている。さらに、これらの化合物の効力は永続的ではなく、変異BRAFを有する腫瘍は、そのような治療に耐性になることが多い。変異RAS(KRAS、NRAS及び/またはHRAS)を有する腫瘍は、これらの化合物で治療した場合にさらに速く進行することも分かった。したがって、野生型及び変異BRAFを有する腫瘍において、さらには黒色腫の範囲を超えて、これらの化合物の効力を増大させる必要性がある。本明細書に記載の実施形態は、これらの必要性及び他のものを満たす。
本明細書で提供される実施形態は、対象において腫瘍を治療する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、対象において腫瘍の状態を維持する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF V600E変異もV600K変異も有しない腫瘍を有する対象を治療する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性な)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤をBRAF V600E変異もV600K変異も有しない対象に投与することを含む方法を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、対象において転移性腫瘍を治療する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性な)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を投与することを含む方法を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、薬物耐性腫瘍を治療する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性な)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を投与することを含む方法を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性な)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む医薬組成物を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む固定単位剤形を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性な)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む注射可能な医薬組成物を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性な)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む注射可能な医薬組成物を調製する方法であって、阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩とDNA損傷剤を混合して、注射可能な医薬組成物を形成することを含む方法を提供する。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性な)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含むキットを提供する。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を含む医薬調製物ならびに処方情報を含む容器であって、処方情報が、野生型RAFと特徴づけられる腫瘍を有する対象にDNA損傷剤とともに阻害剤を投与するための指示を含む、容器を提供する。
本出願は、化合物の組み合わせ及びその使用方法を記載する。化合物及び組み合わせは、単位剤形で、または異なる剤形で投与することができる医薬組成物として調製することもできる。
本明細書全体を通してBRAF阻害剤が言及される。例としては、限定されないが、ベムラフェニブ、ダブラフェニブまたはエンコラフェニブ及びそれらの医薬的に許容可能な塩が挙げられる。ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480またはXP102などの他のBRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤を代わりに用いることもできる。したがって、誤解を避けるために、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480またはXP102が言及される場合は、BRAF阻害剤を広く使用することができること、または他の特定のタイプのBRAF阻害剤も使用することができることが開示される。この言及はまた、本明細書に記載の化合物の医薬的に許容可能な塩を含むと解釈されるべきである。ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはそれらの医薬的に許容可能な塩は、がんを治療する様々な治療剤、例えば、限定されないが、DNA損傷剤と(同時に、または順次)組み合わせることができる。そのようなDNA損傷剤の例としては、限定されないが、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤はヌクレオシド類似体である。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド類似体は、シトシンアラビノシド、フルダラビン、クラドリビンまたはゲムシタビンである。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、フルダラビン、クラドリビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンなどである。これらの薬剤は、個々に、または組み合わせて、BRAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤は、ヌクレオシド類似体とともに投与される。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤は、キノリンアルカロイド、例えば、限定されないが、カンプトテシンとともに投与される。投与は本明細書に記載の方法に従って行うことができ、薬剤は、BRAF阻害剤の前に、またはそうでなければ本明細書に記載のように、投与することができる。これらは、MEK阻害剤、例えば、限定されないが、トラメチニブなどと組み合わせることもできる。いくつかの実施形態では、MEK阻害剤はまた、本明細書に記載のように、BRAF阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480またはXP102)及びDNA損傷剤と組み合わせることができ、またはこれらとともに投与することができる。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤はMEK阻害剤と(同時に、または順次)組み合わせて投与されない。
いくつかの実施形態では、組成物または方法は、さらなる治療剤と組み合わされる。いくつかの実施形態では、さらなる治療剤は微小管安定化剤である。微小管安定化剤の非限定例はタキサンである。いくつかの実施形態では、タキサンは、限定されないが、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセルなどである。いくつかの実施形態では、タキサンはタンパク質結合タキサンである。例えば、パクリタキセルはタンパク質結合パクリタキセルであり得、これは、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセルまたはnab−パクリタキセルとも称され得る。タンパク質結合パクリタキセルの非限定的一例はアブラキサン(登録商標)である。ある実施形態では、他のタキサンがタンパク質に結合している。
化合物、組成物及びそれらの組み合わせは、限定されないが、対象において、がんまたは腫瘍、例えば、黒色腫、膵臓癌、肺癌(例えば、NSCLCもしくはSCLC)、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌または乳癌を治療することを含めた、本明細書に記載の方法のいずれかで、使用することができる。
いくつかの実施形態では、組成物、例えば、BRAF阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102)またはその医薬的に許容可能な塩とDNA損傷剤との医薬組成物または固定剤形が提供される。組成物は、本明細書に記載のように、MEK阻害剤、EGFR阻害剤またはさらなる治療剤(例えば、タキサン)を含むこともできる。いくつかの実施形態では、組成物は、MEK阻害剤、EGFR阻害剤またはさらなる治療剤を含まなくてもよい。本明細書で提供される、BRAF阻害剤またはその医薬的に許容可能な塩とDNA損傷剤の組み合わせ及びその組み合わせの使用は、本明細書に記載のように、驚くべき予想外のがん治療能力及び他の予想外の結果を示す。いくつかの実施形態では、組み合わせは腫瘍の進行を遅らせる。いくつかの実施形態では、組み合わせは、腫瘍サイズを低減させる。いくつかの実施形態では、組み合わせは、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤に耐性になった腫瘍を再び感受性にする。いくつかの実施形態では、組み合わせは、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤に耐性がある腫瘍を感受性にする。再び感受性になった腫瘍とは、一次治療、例えば、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480またはXP102)に耐性になっている、または耐性になることが予期される腫瘍を指す。感受性にされた腫瘍とは、ある治療に耐性があった腫瘍であり、且つ現在その治療で治療することができる腫瘍を指す。例えば、BRAF阻害剤に応答しない腫瘍は、BRAF阻害剤とDNA損傷剤の組み合わせで腫瘍が治療される場合に、BRAF阻害剤に感受性にされる。いくつかの実施形態では、感受性化は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤とともにDNA損傷剤で腫瘍を前治療することによってもたらされる。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤とDNA損傷剤(前治療であるかないかを問わない)との組み合わせは、いずれかの成分単独と比較して相乗的に作用する。いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤は、DNA損傷剤との組み合わせが理由で、以前に使用されていたものよりも低い用量で使用することもできる。そのような用量の非限定例は本明細書に記載されている。DNA損傷剤は、これが、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤と組み合わされるので、典型的なものよりも低い用量で使用することもできる。そのような用量の非限定例は本明細書に記載されている。これらの組み合わせは、MEK阻害剤とともに、またはMEK阻害剤なしで使用することもできる。MEK阻害剤の例は本明細書に記載されているが、他のものを使用することもできる。組み合わせは、EGFR阻害剤とともに投与することもできる。組み合わせは、EGFR阻害剤なしで投与することもできる。EGFR阻害剤の例としては、限定されないが、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ及びエルロチニブが挙げられる。組み合わせは、タキサンとともに、またはタキサンなしで投与することもできる。タキサンの非限定例は本明細書に記載されている。本明細書に記載の組み合わせは、同じ製剤または単位剤形中で組み合わせることができ、または別々に投与することができるが、依然として組み合わされていると考えることができ、なぜなら、これらが、各治療剤でがんを治療する目的で患者に投与されているからである。
いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤とDNA損傷剤との組み合わせは、維持療法及び/または二次療法で使用される。維持療法または二次療法は、がんを有する患者、及び一次治療で既に治療されており、腫瘍が一次治療に応答した患者を二次療法で治療することを指す。維持療法は、完全に除去されない場合には腫瘍の増殖能力を遅延させるために、または腫瘍が完全に除去される場合には腫瘍が再発しないようにするために、使用することができる。維持療法は、腫瘍が安定である場合、または患者が完全奏効(例えば、寛解状態であると考えられる)を有していた場合に、使用されることが多い。しかし、維持療法は、対象が、一次療法に対して部分奏効または単なる奏効を有していた場合に使用することもできる。組み合わせは、本明細書に記載のように、MEK阻害剤、EGFR阻害剤またはタキサンを含むこともできる。
いくつかの実施形態では、がん転移を治療するための方法であって、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480及び/またはXP102)及びDNA損傷剤を対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、MEK阻害剤、EGFR阻害剤またはタキサンを投与することを含み、その非限定例は本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、転移性がんは、転移性黒色腫、膵臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌または乳癌である。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の他の実施形態と同様のまたは同じBRAF阻害剤の前に、DNA損傷剤を投与することを含む。
がん(腫瘍)は、治療自体に由来する選択圧のために、治療に耐性になることが多い。したがって、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤などの治療は、初期に作用するが、次いで、耐性が発生するために、一定期間後に作用を停止する可能性がある。本明細書に記載のBRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤をDNA損傷剤とともに投与することによって、この耐性を克服するまたは減らすことができる。したがって、いくつかの実施形態では、耐性がんを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤及びDNA損傷剤を、治療耐性がんを有する対象に投与することを含む。その例は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、がんは、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480及び/またはXP102に耐性である。いくつかの実施形態では、方法は、MEK阻害剤、EGFR阻害剤及び/またはタキサンあるいはそれらの任意の組み合わせとともに治療剤を投与することを含み、その非限定例は本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の他の実施形態と同様のまたは同じBRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の前に、DNA損傷剤を投与することを含む。
医薬組成物/製剤
医薬組成物は、1種または複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、標準的な技法によって製剤化することができる。製剤は、緩衝剤及び/または防腐剤を含むことができる。化合物及びその生理学的に許容可能な塩及び溶媒和化合物は、吸入を介するもの、局所的、経鼻的、経口的、非経口的(例えば、静脈内、腹腔内、膀胱内もしくは髄腔内)または直腸的なものを含めた任意の適切な経路による投与のために、1種または複数の医薬的に許容可能な担体を含むビヒクル中に製剤化することができ、それらの比率は、化合物の溶解度及び化学的性質、選択される投与経路ならびに標準的な生物学的実施によって決定される。
医薬組成物は、1種または複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、標準的な技法によって製剤化することができる。製剤は、緩衝剤及び/または防腐剤を含むことができる。化合物及びその生理学的に許容可能な塩及び溶媒和化合物は、吸入を介するもの、局所的、経鼻的、経口的、非経口的(例えば、静脈内、腹腔内、膀胱内もしくは髄腔内)または直腸的なものを含めた任意の適切な経路による投与のために、1種または複数の医薬的に許容可能な担体を含むビヒクル中に製剤化することができ、それらの比率は、化合物の溶解度及び化学的性質、選択される投与経路ならびに標準的な生物学的実施によって決定される。
医薬組成物は、本明細書に記載の有効量の1種または複数の化合物(複数可)を、例えば、医薬的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び/または他の担体とともに含むことができる。そのような組成物は、様々な緩衝内容物(例えば、TRISまたは他のアミン、カルボネート、リン酸、アミノ酸、例えば、グリシンアミド塩酸塩(特に生理的pH範囲内のもの)、N−グリシルグリシン、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム(二塩基性、三塩基性)など、またはTRIS−HClもしくは酢酸)、pH及びイオン強度の希釈剤;添加剤、例えば、界面活性剤及び可溶化剤(例えば、表面活性剤、例えば、プルロニック、Tween20、Tween80(ポリソルベート80)、クレモフォール、ポリオール、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、防腐剤(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベンなど)、ならびに増量物質(例えば、糖、例えば、スクロース、ラクトース、マンニトール、ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンまたはデキストランなど);及び/またはポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子性調製物中への、またはリポソーム中への材料の組み込みを含むことができる。ヒアルロン酸を使用することもできる。そのような組成物は、物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランスの速度に影響を与えるために用いることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042)pages 1435−1712を参照されたい。組成物は、例えば、液体形態で調製してもよく、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末の状態でもよい。そのような組成物を投与する特定の方法は以下に記載される。
緩衝剤が本明細書に記載の製剤に含まれることになる場合、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタンまたはそれらの混合物から選択することができる。緩衝剤はまた、グリシルグリシン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸ナトリウムまたはそれらの混合物でもよい。
本明細書に記載の化合物のうちの1つの製剤に医薬的に許容可能な防腐剤が含まれることになる場合、防腐剤は、フェノール、m−クレゾール、メチルp−ヒドロキシベンゾエート、プロピルp−ヒドロキシベンゾエート、2−フェノキシエタノール、ブチルp−ヒドロキシベンゾエート、2−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチオメルサールまたはそれらの混合物から選択することができる。
防腐剤は、約0.1mg/ml〜約50mg/mlの濃度で、約0.1mg/ml〜約25mg/mlの濃度で、または約0.1mg/ml〜約10mg/mlの濃度で存在する。
医薬組成物における防腐剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995を参照する。
製剤はキレート剤をさらに含むことができ、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸及びアスパラギン酸の塩ならびにそれらの混合物から選択することができる。
キレート剤は、0.1mg/ml〜5mg/ml、0.1mg/ml〜2mg/mlまたは2mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在し得る。
医薬組成物におけるキレート剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995を参照する。
本明細書に記載の化合物の製剤は、高分子量ポリマー及び低分子化合物から選択される安定化剤をさらに含むことができ、そのような安定化剤としては、限定されないが、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、様々な塩(例えば、塩化ナトリウム)、L−グリシン、L−ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン及びスレオニンまたはそれらの任意の混合物が挙げられる。安定化剤は、L−ヒスチジン、イミダゾールまたはアルギニンでもよい。
高分子量ポリマーは、0.1mg/ml〜50mg/ml、0.1mg/ml〜5mg/ml、5mg/ml〜10mg/ml、10mg/ml〜20mg/ml、20mg/ml〜30mg/mlまたは30mg/ml〜50mg/mlの濃度で存在し得る。
低分子量化合物は、0.1mg/ml〜50mg/ml、0.1mg/ml〜5mg/ml、5mg/ml〜10mg/ml、10mg/ml〜20mg/ml、20mg/ml〜30mg/mlまたは30mg/ml〜50mg/mlの濃度で存在し得る。
医薬組成物における安定化剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995を参照する。
本明細書に記載の化合物の製剤は、表面活性剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、表面活性剤は、界面活性剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコールグリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、例えば、188及び407、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン誘導体、例えば、アルキル化及びアルコキシル化誘導体(Tween、例えば、Tween−20またはTween−80)、モノグリセリドまたはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、グリセロール、コール酸またはその誘導体、レシチン、アルコール及びリン脂質、グリセロリン脂質(レシチン、ケファリン、ホスファチジルセリン)、グリセロ糖脂質(ガラクトピラノシド)、スフィンゴリン脂質(スフィンゴミエリン)及びスフィンゴ糖脂質(セラミド、ガングリオシド)、DSS(ドクサートナトリウム、ドクサートカルシウム、ドクサートカリウム、SDS(ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム)、ジパルミトイルホスファチジン酸、カプリル酸ナトリウム、胆汁酸及びその塩ならびにグリシンまたはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、陰イオン性(アルキル−アリール−スルホネート)一価表面活性剤、パルミトイルリゾホスファチジル−L−セリン、リゾリン脂質(例えば、エタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンの1−アシル−sn−グリセロ−3−リン酸エステル)、リゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ならびに極性頭部基、すなわち、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトールの修飾体、ならびに正電荷を帯びたDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニン、双性イオン性表面活性剤(例えば、N−アルキル−N,N−ジメチルアンモニオ−1−プロパンスルホネート、3−コールアミド−1−プロピルジメチルアンモニオ−1−プロパンスルホネート、ドデシルホスホコリン、ミリストイルリゾホスファチジルコリン、ニワトリ卵リゾレシチン)、陽イオン性表面活性剤(第四級アンモニウム塩基)(例えば、セチル−トリメチルアンモニウムブロミド、塩化セチルピリジニウム)、非イオン性界面活性剤、ポリエチレンオキシド/ポリプロピレン酸化物ブロックコポリマー(プルロニック/テトロニクス、TritonX−100、ドデシルβ−D−グルコピラノシド)またはポリマー性表面活性剤(Tween−40、Tween−80、Brij−35)、フシジン酸誘導体(例えば、タウロ−ジヒドロフシド酸ナトリウムなど)、長鎖脂肪酸及びその塩(C6〜C12)(例えば、オレイン酸及びカプリル酸)、アシルカルニチン及び誘導体、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンのNα−アシル化誘導体またはリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンと中性または酸性アミノ酸との任意の組み合わせを含むジペプチドのNα−アシル化誘導体、中性アミノ酸と2つの荷電アミノ酸との任意の組み合わせを含むトリペプチドのNα−アシル化誘導体から選択することができ、あるいは表面活性剤はイミダゾリン誘導体またはそれらの混合物の群から選択することができる。
医薬組成物における表面活性剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995を参照する。
医薬的に許容可能な甘味剤は、本明細書に記載の化合物の製剤の一部であり得る。医薬的に許容可能な甘味剤としては、少なくとも1つの強い甘味剤、例えば、サッカリン、サッカリンナトリウムまたはサッカリンカルシウム、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、シクラミン酸ナトリウム、アリターム、ジヒドロカルコン甘味剤、モネリン、ステビオシドまたはスクラロース(4,1’,6’−トリクロロ−4,1’,6’−トリデオキシガラクトスクロース)、サッカリン、サッカリンナトリウムまたはサッカリンカルシウム、ならびに場合により、バルク甘味剤、例えば、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、スクロース、マルトース、イソマルト、グルコース、水素化グルコースシロップ、キシリトール、カラメル及びハチミツが挙げられる。
強い甘味剤は、低濃度で都合よく用いられる。例えば、サッカリンナトリウムの場合には、濃度は、最終的な製剤の全体積に基づいて0.04%〜0.1%(w/v)の範囲にわたり得るか、または低投与量製剤で約0.06%であり、高投薬量製剤で約0.08%である。バルク甘味剤は、約10%〜約35%または約10%〜15%(w/v)の範囲にわたる、より多くの量で効果的に使用され得る。
本明細書に記載の化合物の製剤は、従来の技法によって、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,1985、またはRemington:The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995に記載されているように調製することができ、医薬品産業のそのような従来の技法は、所望の最終産物を得るために、適宜、成分を溶解し、混合することを含む。
フレーズ「医薬的に許容可能な」または「治療的に許容可能な」は、ヒトに投与される場合に、生理的に忍容性があり、好ましくは、アレルギー反応または同様の有害な反応、例えば、急性胃蠕動、眩暈などを典型的にはもたらさない、分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、用語「医薬的に許容可能な」は、動物における、より詳細にはヒトにおける使用について、連邦または州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)に列挙されていることを意味する。
本明細書に記載の化合物の投与は、当技術分野で既知の任意の方法を使用して行うことができる。例えば、投与は、経皮投与、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼部投与、心室内投与、関節内投与、髄腔内投与、大槽内投与、腹腔内投与、脳室内投与、髄腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与、坐剤による投与、または経口投与でもよい。本明細書に記載の化合物の医薬組成物は、注射投与用、または経口投与、肺投与、経鼻投与、経皮投与、眼投与用であってもよい。
経口投与については、本明細書に記載の化合物の医薬組成物は、単位剤形、例えば、カプセル剤または錠剤に製剤化することができる。錠剤またはカプセル剤は、結合剤、例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース;フィラー、例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム;潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ;崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム;または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含めた医薬的に許容可能な賦形剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとることができ、またはこれは、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提供することができる。そのような液体調製物は、医薬的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂;乳化剤、例えば、レシチンまたはアラビアゴム;非水性ビヒクル、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油;及び防腐剤、例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸を用いて、従来の手段によって調製することができる。調製物は、適宜、緩衝塩、着香料、着色剤及び/または甘味剤を含むこともできる。所望ならば、経口投与用調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように、適切に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、単位剤形は、BRAF阻害剤と1種または複数のDNA損傷剤の両方を含む組み合わせ生成物として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、単位剤形は、BRAF阻害剤を含む1つの組成物及びDNA損傷剤の1つまたは複数を含む第2の組成物を指す。複数のDNA損傷剤が使用される場合は、同数の単位剤形を調製し、使用することができる。
非経口投与については、本明細書に記載の化合物は、医薬的に許容可能なビヒクルまたは担体を有する組成物に入れられて、静脈内、皮下または筋肉内注射のいずれかによって投与される。化合物は、注射による、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルで、または多回用量容器で、防腐剤を添加して、提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤などの形態をとることができ、製剤用薬剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤及び/または分散剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水で構成するための粉末形態でもよい。
注射による投与については、化合物(複数可)は、滅菌水性ビヒクルの溶液で使用することができ、これは、他の溶質、例えば、緩衝剤または防腐剤及び溶液を等張にするのに十分な量の医薬的に許容可能な塩またはグルコースを含むこともできる。本明細書に記載の化合物の医薬組成物は、注射可能な投与用の滅菌溶液剤または懸濁剤を提供するために、医薬的に許容可能な担体を用いて製剤化することができる。注射液は、液体溶液剤もしくは懸濁剤、注射前の液体の溶液剤もしくは懸濁剤に適した固体形態として、または乳剤としてのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩などである。さらに、所望ならば、注射可能な医薬組成物は、少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤剤、pH緩衝剤などを含むことができる。所望ならば、吸収増強調製物(例えば、リポソーム)を利用することができる。適切な医薬担体は、“Remington’s pharmaceutical Sciences”by E.W.Martinに記載されている。注射製剤は、BRAF阻害剤と1種または複数のDNA損傷剤との組み合わせを含むことができる。注射製剤は、別々の製剤を1つにまとめることによって調製することもできる。製剤は、順次または同時にまたはほぼ同時に投与することもできる。
化合物は、例えば、従来の坐剤基材、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含む、直腸用組成物、例えば、坐剤または停留浣腸に製剤化することもできる。
さらに、化合物はデポー調製物として製剤化することができる。そのような長時間作用型製剤は、埋植(例えば、皮下もしくは筋肉内)によって、または筋肉内注射によって、投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマー性もしくは疎水性材料(例えば、許容可能な油の乳剤として)またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として、製剤化することができる。
組成物は、所望ならば、活性成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサー装置に入れて、提供することができる。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックである。パックまたはディスペンサー装置に、投与のための指示を添付することができる。
本明細書に記載の化合物は、プロドラッグと称される誘導体も含み、これは、慣例的な操作またはインビボのいずれかで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって、調製することができる。
投薬量
本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の1種または複数の疾患、例えば、限定されないが、本明細書に記載のがんを予防する、治療する、または管理するために、治療有効用量で患者に投与することができる。本明細書に記載の化合物の1種または複数を含む医薬組成物は、患者において有効な治療応答を誘発するのに十分な量で患者に投与することができる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効用量」と定義される。用量は、用いられる特定の化合物の有効性及び対象の状態、ならびに体重または治療される領域の表面積によって、決定することができる。用量サイズはまた、特定の対象における、特定の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害作用の存在、性質及び程度によって、決定することができる。
本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の1種または複数の疾患、例えば、限定されないが、本明細書に記載のがんを予防する、治療する、または管理するために、治療有効用量で患者に投与することができる。本明細書に記載の化合物の1種または複数を含む医薬組成物は、患者において有効な治療応答を誘発するのに十分な量で患者に投与することができる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効用量」と定義される。用量は、用いられる特定の化合物の有効性及び対象の状態、ならびに体重または治療される領域の表面積によって、決定することができる。用量サイズはまた、特定の対象における、特定の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害作用の存在、性質及び程度によって、決定することができる。
そのような化合物の毒性及び治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順によって、例えば、LD50(集団の50%を死に至らせる用量)及びED50(集団の50%で治療的有効な用量)を決定することによって、決定することができる。LD50及びED50は、成分単独または組み合わせについて決定することができる。毒性及び治療効果の間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50比で表すことができる。いくつかの実施形態では、より大きな治療指数を示す組み合わせが使用される。毒性副作用を示す化合物を使用することができるが、正常細胞への潜在的な損傷を最小にし、それによって副作用を低減させるようにそのような化合物を罹患組織部位に向ける送達システムを設計するように、注意を払う必要がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、BRAF阻害剤と1種または複数のDNA損傷剤との組み合わせを使用することによって、副作用を回避することができる。より低い用量の1種または複数の治療剤を使用することによって、副作用を回避するまたは低減させることができる。
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するための投薬量範囲を定式化するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、そのような化合物の投薬量は、毒性がほとんどまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形及び投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本明細書に記載される任意の化合物については、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定された通りのIC50(症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて定式化することができる。そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定することができる。一般に、モジュレーターの用量当量は、典型的な対象に対して約1ng/kg〜10mg/kgである。
本明細書に記載の化合物及び/またはそれらの医薬的に許容可能な塩の量及び投与頻度は、患者の年齢、状態及びサイズならびに治療される症状の重症度などの因子を考慮して、担当臨床医の判断に従って調節される。通常の技術を有する医師または獣医師は、状態の進行を予防する、状態の進行に対抗する、または状態の進行を抑止するのに必要とされる、薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。一般に、有効量は、0.001mg/kg〜10mg/kg体重、特に、0.01mg/kg〜1mg/kg体重であろうことが意図される。必要とされる用量を、2つ、3つ、4つまたはそれ以上のサブ用量として1日を通して適切な間隔で投与することが適切である場合がある。該サブ用量は、例えば、単位剤形あたり0.01〜500mg、特に0.1mg〜200mgの活性成分を含む単位剤形として製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、医薬調製物は単位剤形である。そのような形態では、調製物は、活性成分の適切な量、例えば、所望の目的を達成するのに有効な量を含む、適切にサイズ調整された単位用量に細分される。調製物の単位用量中の活性化合物の量は、特定の用途に従って、約0.01mg〜約1000mg、約0.01mg〜約750mg、約0.01mg〜約500mgまたは約0.01mg〜約250mgに変動させるまたは調整することができる。いくつかの実施形態では、対象に投与されるBRAF、CRAFもしくは汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩の量は、960mg、720mg、480mg、240mg、150mg、100mg、50mgもしくは25mg(1日2回)未満、約960mg、720mg、480mg、240mg、150mg、100mg、50mgもしくは25mg(1日2回)、または960mg、720mg、480mg、240mg、150mg、100mg、50mgもしくは25mg(1日2回)である。用いられる実際の投薬量は、患者の要求及び治療される状態の重症度によって変動し得る。特定の状況に対して適切な投薬レジメンの決定は当技術分野の範囲内である。便宜上、必要に応じて、全投薬量は、一日の間で複数に分割し、投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種または複数の化合物は、別の化合物とともに投与される。投与は、順次でもよいし、同時でもよい。組み合わせは、同じ剤形中であってもよく、または別々の用量として投与されてもよい。いくつかの実施形態では、第1の化合物はBRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤であり、他の化合物は1種または複数のDNA損傷剤である。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンなどである。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の少なくともまたは約10、20、30、40、50、60、120、180、240、300または360分前に投与される。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の少なくともまたは約、1、2、3、4または5日前に投与される。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、MEK阻害剤またはタキサンが対象に投与されるより前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、MEK阻害剤またはタキサンの少なくともまたは約10、20、30、40、50、60、120、180、240、300または360分前に投与される。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、MEK阻害剤またはタキサンの少なくともまたは約、1、2、3、4または5日前に投与される。
いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の量は、約1mg〜約100mg、約5mg〜約100mg、約10mg〜約100mg、約25mg〜約100mg、約50mg〜約100mgまたは約75mg〜約100mgであり得る。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤の量は、約1mg〜約80mg、約1mg〜約60mg、約1mg〜約40mg、約1mg〜約20mgまたは約1mg〜約10mgであり得る。いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の量は、約5mg〜約80mgであり得る。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤の量は約5mg〜約240mgである。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、約1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2の用量で、または1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2未満の用量で、あるいはこれらの間の任意の範囲の用量で投与される。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤の用量は、患者または対象に対して亜致死量と考えられる。
本明細書に記載の化合物は、制吐剤とも称され得る抗悪心剤とともに投与することもできる。そのような薬剤の例としては、限定されないが、ドラセトロン、グラニセトロン、オンダンセトロン、トロピセトロン、パロノセトロン、ミルタザピン、アプレピタント、カソピタントなどが挙げられる。
医学的使用
本明細書に記載の組成物は、がんを治療するのに有用であり得る。そのようながんの例としては、限定されないが、黒色腫、膵臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌及び乳癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍は、BRAF変異に対して陰性である。いくつかの実施形態では、腫瘍は野生型BRAFである。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAFに変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600E変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600E変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600K変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600K変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS(例えば、KRAS、NRAS及び/またはHRAS)変異を有する。いくつかの実施形態では、RAS変異はG12C、G12D、G12VまたはG13Dである。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍は野生型RASである。誤解を避けるために、用語「RAS」は、KRAS、NRAS及び/またはHRASを指すことができる。いくつかの実施形態では、RASはKRASである。いくつかの実施形態では、RASはNRASである。いくつかの実施形態では、RASはHRASである。
本明細書に記載の組成物は、がんを治療するのに有用であり得る。そのようながんの例としては、限定されないが、黒色腫、膵臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌及び乳癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍は、BRAF変異に対して陰性である。いくつかの実施形態では、腫瘍は野生型BRAFである。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAFに変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600E変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600E変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600K変異を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600K変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS(例えば、KRAS、NRAS及び/またはHRAS)変異を有する。いくつかの実施形態では、RAS変異はG12C、G12D、G12VまたはG13Dである。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS変異がない。いくつかの実施形態では、腫瘍は野生型RASである。誤解を避けるために、用語「RAS」は、KRAS、NRAS及び/またはHRASを指すことができる。いくつかの実施形態では、RASはKRASである。いくつかの実施形態では、RASはNRASである。いくつかの実施形態では、RASはHRASである。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、BRAF阻害剤と1種または複数のDNA損傷剤との組み合わせを投与するより前に、変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600E変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はBRAF V600K変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS G12C変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS G12D変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS G12V変異について解析される。いくつかの実施形態では、腫瘍はRAS G13D変異について解析される。いくつかの実施形態では、患者は、BRAF中の変異が見出されない場合、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤とDNA損傷剤との組み合わせでのみ治療される。いくつかの実施形態では、患者は、BRAF中の変異が見出される場合、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤とDNA損傷剤との組み合わせでのみ治療される。いくつかの実施形態では、患者は、RAS中の変異が見出されない場合、BRAF阻害剤とDNA損傷剤の組み合わせでのみ治療される。いくつかの実施形態では、患者は、RAS中の変異が見出される場合、BRAF阻害剤とDNA損傷剤の組み合わせでのみ治療される。
いくつかの実施形態では、がんを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは黒色腫、膵臓癌、肺癌(例えば、NSCLCもしくはSCLC)、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌または乳癌である。いくつかの実施形態では、がんは、本明細書に記載のがんのうちの1つとして発生した転移性がんである。したがって、本明細書に記載のように、転移性がんを治療する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のように、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤と1種または複数のDNA損傷剤との組み合わせを投与することを含む。いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤は、1種もしくは複数のDNA損傷剤と同時に、または1種もしくは複数のDNA損傷剤の(前もしくは後に)順次対象に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、BRAF、CRAFもしくは汎RAF阻害剤を最初に投与し、次いで、阻害剤が完全に投与される前に、1種もしくは複数のDNA損傷剤を投与すること、またはその逆を含む。そのような投与は、治療剤の重複と称され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせはまた、本明細書に記載のように、MEK阻害剤またはEGFR阻害剤とともに投与される。化合物は、任意の順序で投与することができ、これらは単なる例に過ぎず、制限を意図したものではない。いくつかの実施形態では、対象は、BRAF、MEK阻害剤及び/またはタキサンで治療されるより前に、本明細書に記載のDNA損傷剤が投与される。いくつかの実施形態では、対象は、第1ステップで、ゲムシタビン、メトトレキサートもしくはピリメタミン(または本明細書に記載の他のDNA損傷剤)が投与され、次いで、その後に、対象は、BRAF、CRAFもしくは汎RAF阻害剤、MEK阻害剤及び/またはタキサンが投与される。これは前治療とも称され得る。したがって、いくつかの実施形態では、対象は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤が対象に投与される前に、DNA損傷剤で前治療される。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤の投与とBRAF阻害剤及び/またはMEK阻害剤及び/またはタキサンの投与の間の時間は、約または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、18、20または24時間である。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤の投与とBRAF、CRAFもしくは汎RAF及び/またはMEK阻害剤及び/またはタキサンの投与の間の時間は、約または少なくとも1〜24、1〜18、1〜12、1〜8、1〜6、1〜4、4〜12、4〜16、4〜20、4〜24、8〜12、8〜16、8〜20、8〜24、12〜16、12〜18、12〜24、16〜20、16〜24または20〜24時間である。いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFもしくは汎RAF及び/またはMEK阻害剤及び/またはタキサンは、DNA損傷剤が投与されてから1〜10日後に投与される。いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFもしくは汎RAF及び/またはMEK阻害剤及び/またはタキサンは、DNA損傷剤が投与されてから約または少なくとも1〜10日後に投与される。いくつかの実施形態では、BRAF、CRAFもしくは汎RAF及び/またはMEK及び/またはタキサン阻害剤は、約もしくは少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、またはDNA損傷剤が投与された後に投与される。このプロトコールは、必要に応じて、例えば、単に例として、1、2、3、4、5、6、7または8回繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、対象は、MEK阻害剤が投与されない。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤は、MEK阻害剤及び/またはタキサンなしで投与される。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤は、MEK阻害剤及び/またはタキサンを含まずに投与される。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤は、MEK阻害剤及び/またはタキサンの非存在下で投与される。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤を含む医薬組成物は、MEK阻害剤及び/またはタキサンがない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象の腫瘍においてBRAF及び/またはRAS変異を検出すること、ならびにBRAF及び/またはRAS変異を有しない対象において、BRAF阻害剤と1種または複数のDNA損傷剤との組み合わせで対象を治療することを含む。治療方法及び異なる活性成分の投与順序は、本明細書に記載される任意の方法に従って行うことができる。これは、例えば、患者が治療から恩恵を受けることを確実にするために、行うことができる。しかし、患者が、そのような変異について特に試験される必要はない。いくつかの実施形態では、検出されない変異はBRAF V600EまたはV600Kである。いくつかの実施形態では、BRAF及び/またはRAS変異を有する対象は、本明細書に記載の組み合わせで治療される。いくつかの実施形態では、治療される対象は、野生型BRAF及び変異型RASである腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、変異RASは本明細書に記載の変異を含む。いくつかの実施形態では、治療される対象は、変異型BRAF及び変異型RASを有する腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、それぞれの変異は本明細書に記載されるものである。いくつかの実施形態では、治療される対象は、変異型BRAF及び野生型RASを有する腫瘍を有する。変異は任意の変異、例えば本明細書に記載のものであり得る。腫瘍中に存在する変異は、任意の方法、例えば、PCR、RT−PCR、ゲノムシークエンシング、RNAシークエンシング、ノーザンブロット、サザンブロット、ウエスタンブロットあるいはBRAF及び/またはRAS中の変異を検出するのに使用することができる任意の他の分子技法によって、検出することができる。BRAF及び/またはRAS中の変異を検出する特定の方法は、重要ではない。変異は、任意の腫瘍試料において検出することができる。腫瘍試料は、例えば生検を介して、得ることができる。腫瘍の変異状況を特定するために、血液試料を使用することもできる。変異の有無を検出するための試料及び技法は、本明細書に記載の方法にとって重要ではない。
いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、BRAF、CRAFもしくは汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及びDNA損傷剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤からなる治療に耐性である。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は転移性腫瘍である。いくつかの実施形態では、転移性腫瘍は、転移性黒色腫、転移性膵臓腫瘍、転移性肺腫瘍、転移性結腸腫瘍、転移性卵巣腫瘍、転移性前立腺腫瘍、転移性肺腫瘍または転移性乳房腫瘍である。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は、黒色腫、膵臓腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍または乳房腫瘍である。
いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は野生型BRAFとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は変異BRAFとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、変異BRAFはBRAF V600EまたはV600Kである。
いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は野生型RASとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍は変異RASとして特徴づけられる。いくつかの実施形態では、薬物耐性腫瘍を治療する方法は、投与ステップより前に、対象に由来する腫瘍試料においてBRAF V600EまたはV600K変異の有無を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、投与ステップより前に、対象に由来する腫瘍試料においてRAS変異の有無を検出することを含む。BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤は、本明細書に記載される任意のそのような阻害剤であり得る。
いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、本明細書に記載される任意のものである。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、ゲムシタビン、メトトレキサート及び/またはピリメタミンである。
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み合わせは、1種または複数の医薬的に許容可能な担体を含むビヒクル中で、限定されないが、吸入を介するもの、局所的、経鼻的、経口的、非経口的(例えば、静脈内、腹腔内、膀胱内もしくは髄腔内)または直腸的なものを含めた任意の適切な経路によって投与することができ、それらの比率は、化合物の溶解度及び化学的性質、選択される投与経路ならびに標準的な実施によって決定される。
本明細書で提供される実施形態は、キットも提供した。いくつかの実施形態では、キットは、BRAF、CRAFもしくは汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物及びDNA損傷剤を含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、1つの医薬組成物が両方を含む。いくつかの実施形態では、これらは別々の医薬組成物である。いくつかの実施形態では、キットは、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤を含む第1の医薬的に許容可能な容器及びDNA損傷剤を含む第2の医薬的に許容可能な容器を含む。いくつかの実施形態では、容器は滅菌されており、発熱物質を含まない。いくつかの実施形態では、キットは処方情報を含む。いくつかの実施形態では、処方情報は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤及びDNA損傷剤を野生型BRAF及び/または変異BRAFとして特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む。いくつかの実施形態では、処方情報は、BRAF阻害剤及びDNA損傷剤を野生型RASまたは変異RASとして特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む。
本明細書で提供される実施形態は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤を含む医薬組成物及び処方情報を含む容器も提供し、処方情報は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤をDNA損傷剤とともに野生型RAFと特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は黒色腫腫瘍である。いくつかの実施形態では、容器は、BRAF阻害剤を含む、カプセル剤、錠剤または他の経口投与剤形を含む。いくつかの実施形態では、BRAF阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブもしくはソラフェニブまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である。いくつかの実施形態では、DNA損傷剤は、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である。いくつかの実施形態では、指示は、EGFR阻害剤またはMEK阻害剤またはタキサン、例えば、限定されないが、本明細書に記載のものを対象に投与することをさらに提供する。
定義
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等の方法及び材料を本明細書に記載の組成物及び化合物の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、制限を意図したものではない。本明細書に記載の組成物及び化合物の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等の方法及び材料を本明細書に記載の組成物及び化合物の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、制限を意図したものではない。本明細書に記載の組成物及び化合物の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
本明細書で使用する場合、フレーズ「医薬的に許容可能な」は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症をともなわないで、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適しており、合理的な利益/危険比に見合う、化合物、材料、組成物及び/または剤形を指す。
「医薬製剤」は、担体、溶媒、賦形剤及び塩が、製剤の活性成分(例えば、本明細書に記載の化合物)に適合しなければならないことをさらに意味する。用語「医薬製剤」と「医薬組成物」は一般に互換的であり、これらは、本出願において、そのように使用されることが当業者に理解される。
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体であって、親化合物が、それらの酸性塩または塩基塩を作製することにより修飾される誘導体を指す。医薬的に許容可能な塩の例としては、限定されないが、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩;カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。医薬的に許容可能な塩は、例えば、無毒の無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒の塩または第四級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来の無毒の塩としては、限定されないが2−アセトキシ安息香酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバム酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロ酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、亜酢酸(subacetic)、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸及びトルエンスルホン酸から選択される無機酸及び有機酸に由来するものが挙げられる。本開示は、本明細書に記載される任意の化合物(複数可)の医薬的に許容可能な塩を含む。
医薬的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、水中、もしくは有機溶媒中、または2つの混合物(一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどのような非水性媒体)中で、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論的量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。適切な塩のリストは、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,USA,p.1445(1990)に見られる。
プロドラッグは、医薬品の多数の望ましい品質(例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、製造など)を増強することが既知であるので、本明細書に記載の化合物は、疾患の治療のために、プロドラッグ形態で送達することができ、この形態で投与することができる。「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグが哺乳類対象に投与される場合に、本明細書に記載の活性な親薬物をインビボで放出する任意の共有結合した担体を含むことが意図される。プロドラッグは、慣例的な操作またはインビボのいずれかで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって、調製される。プロドラッグは、ヒドロキシ基、アミノ基またはスルフヒドリル基が、プロドラッグが哺乳類対象に投与された場合に、それが開裂して、それぞれ遊離ヒドロキシル基、遊離アミノ基または遊離スルフヒドリル基を形成する任意の基に結合している、本明細書に記載の化合物を含む。プロドラッグの例としては、限定されないが、本明細書に記載の化合物のアルコール及びアミン官能基の酢酸、ギ酸及び安息香酸誘導体が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「治療する」または「治療」は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす、任意の効果、例えば、減らすこと、低減させること、調節すること、または除去することを含む。病態を「治療すること」または病態の「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患状態の治療を意味し、以下を含む:(a)現行の疾患状態を阻害すること、すなわち、その発達もしくはその臨床症状を抑止すること;及び/または(c)疾患状態を軽減すること、すなわち、病態の退行を引き起こすこと。
本明細書で使用する場合、「哺乳動物」または「対象」は、ヒト及び非ヒト患者を指す。いくつかの実施形態では、対象は、それらを必要とする対象である。用語「対象」及び「患者」は、互換的に使用され得る。本明細書で使用する場合、「それらを必要とする」患者は、治療を必要とするとして特定されている、または治療を必要とする疑いがある対象である。例えば、がんと診断されている対象はそれらを必要とする対象とみなすことができる。伝統的に、BRAF変異がない対象は、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤について、それらを必要とする対象とみなされないと思われ、この理由は、これが、そのような治療に対して禁忌であるからである。しかし、BRAF阻害剤及び1種または複数のDNA損傷剤の本明細書に記載の組み合わせは、組み合わせがそのようなBRAF野生型腫瘍をBRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の治療に感受性にする能力により、その同じ対象をそれらを必要とする対象に変えることができる。
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、生物活性、例えば、疼痛軽減を誘発するのに十分な量で受容者中または受容者上に存在する、本明細書に記載の化合物または化合物の組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、化合物の組み合わせは相乗的な組み合わせである。相乗効果は、例えば、Chou and Talalay,Adv.Enzyme Regul.vol.22,pp.27−55(1984)によって記載されるように、組み合わせて投与される場合の化合物の効果が、単一薬剤として単独で投与される場合の化合物の相加効果より大きい場合に生じる。一般に、相乗効果は、化合物の最適以下の濃度で最も明らかに示される。相乗効果は、個々の成分と比較した、組み合わせの低い細胞毒性、疼痛低下の増大、またはいくつかの他の有益効果に関するものであり得る。
本明細書で使用されるすべてのパーセンテージ及び比は、別段指示がない限り、重量基準である。
説明全体を通して、組成物が、特定の成分を有する、含む(including)もしくは含む(comprising)として記載されている場合、またはプロセスが、特定のプロセスステップを有する、含む(including)もしくは含む(comprising)として記載されている場合は、本明細書に記載の組成物はまた、記載される成分から本質的になる、または記載される成分からなること、及び本明細書に記載のプロセスはまた、記載されるプロセシングステップから本質的になる、または記載されるプロセシングステップからなることが意図される。さらに、ステップの順序またはある特定の行為を行うための順序は、プロセスが実施可能なままである限り、重要でないことを理解されたい。さらに、2つ以上のステップまたは行為を同時に行うことができる。
本開示全体を通して使用されるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈において別段明記しない限り、複数の意味を含む。したがって、例えば、「1つの組成物」への言及は、単一の組成物だけでなく複数のそのような組成物も含み、「1つの治療剤」への言及は、1つまたは複数の治療剤及び/または医薬品ならびに当業者に既知であるそれらの均等物などへの言及である。したがって、例えば、「1つの宿主細胞」への言及は、複数のそのような宿主細胞を含み、「1つの抗体」への言及は、1つまたは複数の抗体及び当業者に既知であるそれらの均等物などへの言及である。
本明細書に記載の化合物は、既知の方法に従って調製することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される実施形態は、以下を含むが、それらに限定されない。
1.対象において腫瘍を治療する方法であって、DNA損傷剤、ならびにBRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
2.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態1に記載の方法。
3.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態1または2に記載の方法。
4.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態3に記載の方法。
5.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシン及び/またはピリメタミンあるいはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態3に記載の方法。
6.前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記DNA損傷剤が、順次、同時に、または重複して投与される、実施形態1に記載の方法。
7.前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記DNA損傷剤が前記対象に投与される、実施形態1に記載の方法。
8.前記DNA損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも1〜24時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態1に記載の方法。
9.前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記DNA損傷剤で前治療される、実施形態1に記載の方法。
10.前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記DNA損傷剤が経口的に投与される、実施形態1に記載の方法。
11.前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記DNA損傷剤が静脈内に投与される、実施形態1に記載の方法。
12.前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が経口的に投与され、前記DNA損傷剤が静脈内に投与される、実施形態1に記載の方法。
13.前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が静脈内に投与され、前記DNA損傷剤が経口的に投与される、実施形態1に記載の方法。
14.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態3〜13のいずれか1つに記載の方法。
15.前記腫瘍が、膵臓腫瘍、黒色腫腫瘍、肺腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍または乳房腫瘍である、実施形態1に記載の方法。
16.前記腫瘍が膵臓腫瘍である、実施形態1に記載の方法。
17.前記腫瘍が黒色腫腫瘍である、実施形態1に記載の方法。
18.前記腫瘍が転移性腫瘍である、実施形態1に記載の方法。
19.前記腫瘍が野生型BRAFとして特徴づけられる、実施形態1に記載の方法。
20.前記腫瘍が野生型RASとして特徴づけられる、実施形態1に記載の方法。
21.前記腫瘍が変異BRAFとして特徴づけられる、実施形態1に記載の方法。
22.前記腫瘍が変異BRAF V600EまたはV600Kとして特徴づけられる、実施形態1に記載の方法。
23.前記腫瘍が変異RASとして特徴づけられる、実施形態1に記載の方法。
24.前記腫瘍が野生型BRAF及び変異RASとして特徴づけられる、実施形態1に記載の方法。
25.前記腫瘍が変異BRAF及び野生型RASとして特徴づけられる、実施形態1に記載の方法。
26.前記対象が、約960mg、720mg、480mg、240mg、150mg、100mg、50mgもしくは25mg(1日2回)、または960mg、720mg、480mg、240mg、150mg、100mg、50mgもしくは25mg未満(1日2回)である、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩の用量を投与される、実施形態1に記載の方法。
27.前記DNA損傷剤が、約1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2の用量、または1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2未満の用量で投与される、実施形態1に記載の方法。
28.前記DNA損傷剤が、毎日、週2回、週3回、週4回、週5回、毎週、2週毎、3週毎または毎月投与される、実施形態1に記載の方法。
29.前記DNA損傷剤が二本鎖切断DNA損傷剤またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態27または28に記載の方法。
30.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシンもしくはピリメタミンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である、実施形態29に記載の方法。
31.MEK阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、実施形態1に記載の方法。
32.前記DNA損傷剤が前記対象に投与された後に、前記MEK阻害剤または前記タキサンが前記対象に投与される、実施形態31に記載の方法。
33.MEK阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、実施形態2〜30のいずれか1つに記載の方法。
34.前記MEK阻害剤がトラメチニブであるか、前記タキサンがパクリタキセルまたはタンパク質結合パクリタキセルまたは本明細書に記載の他のタキサンである、実施形態31に記載の方法。
35.EGFR阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態1〜27のいずれか1つに記載の方法。
36.前記EGFR阻害剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブまたはエルロチニブである、実施形態28に記載の方法。
37.前記対象において腫瘍サイズが低減される、実施形態1に記載の方法。
38.前記腫瘍サイズが約10、20、30、40、50、60、70、80、90または100%低減される、実施形態37に記載の方法。
39.前記腫瘍が治療後にサイズを増大しない、実施形態1に記載の方法。
40.対象において腫瘍の状態を維持する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
41.前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記DNA損傷剤が前記対象に投与される、実施形態40に記載の方法。
42.前記DNA損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも1〜24時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態40に記載の方法。
43.前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記DNA損傷剤で前治療される、実施形態40に記載の方法。
44.前記対象において前記腫瘍が再発しない、実施形態40に記載の方法。
45.前記対象において前記腫瘍がサイズを増大しない、実施形態40に記載の方法。
46.前記対象が、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記DNA損傷剤が投与されるより前に、黒色腫腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または前立腺腫瘍について治療されている、実施形態40に記載の方法。
47.前記腫瘍を有する前記対象が、DNA損傷剤とともに、またはDNA損傷剤なしで、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩で以前に治療されている、実施形態40に記載の方法。
48.前記腫瘍が野生型BRAFとして特徴づけられる、実施形態40に記載の方法。
49.前記腫瘍が変異BRAFとして特徴づけられる、実施形態40に記載の方法。
50.前記腫瘍が、変異BRAFがV600EまたはV600Kであるとして特徴づけられる、実施形態40に記載の方法。
51.前記腫瘍が野生型RASとして特徴づけられる、実施形態40に記載の方法。
52.前記腫瘍が変異RASとして特徴づけられる、実施形態40に記載の方法。
53.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態40〜52のいずれか1つに記載の方法。
54.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である、実施形態40〜53のいずれか1つに記載の方法。
55.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態54に記載の方法。
56.MEK阻害剤、EGFR阻害剤、タキサンまたはそれらの任意の組み合わせを投与することをさらに含む、実施形態40〜55のいずれか1つに記載の方法。
57.BRAF V600E変異もV600K変異も有しない腫瘍を有する対象を治療する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を前記BRAF V600E変異もV600K変異も有しない前記対象に投与することを含む、前記方法。
58.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態57に記載の方法。
59.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態57に記載の方法。
60.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態59に記載の方法。
61.MEK阻害剤、EGFR阻害剤もしくはタキサンまたはそれらの任意の組み合わせを投与することをさらに含む、実施形態57〜60のいずれか1つに記載の方法。
62.前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてBRAF V600EまたはV600K変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態57〜61のいずれか1つに記載の方法。
63.前記BRAF V600E変異もV600K変異も有しない前記腫瘍がRAS変異を有しない、または前記BRAF V600E変異もV600K変異も有しない前記腫瘍がRAS変異を含む、実施形態57〜62のいずれか1つに記載の方法。
64.前記RAS変異または前記BRAF変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態57〜63のいずれか1つに記載の方法。
65.前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記DNA損傷剤が前記対象に投与される、実施形態57に記載の方法。
66.前記DNA損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも1〜24時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態57に記載の方法。
67.前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記DNA損傷剤で前治療される、実施形態57に記載の方法。
68.前記腫瘍が膵臓腫瘍または黒色腫腫瘍である、実施形態57に記載の方法。
69.対象において転移性腫瘍を治療する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を投与することを含む、前記方法。
70.前記転移性腫瘍が、転移性黒色腫、転移性膵臓腫瘍、転移性肺腫瘍、転移性結腸腫瘍、転移性卵巣腫瘍、転移性前立腺腫瘍または転移性乳房腫瘍である、実施形態69に記載の方法。
71.前記腫瘍が野生型BRAFとして特徴づけられる、実施形態69に記載の方法。
72.前記腫瘍が変異BRAFとして特徴づけられる、実施形態69に記載の方法。
73.前記変異BRAFがBRAF V600EまたはV600Kである、実施形態72に記載の方法。
74.前記腫瘍が野生型RASとして特徴づけられる、実施形態69に記載の方法。
75.前記腫瘍が変異RASとして特徴づけられる、実施形態69に記載の方法。
76.前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてBRAF V600EまたはV600K変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態69〜75のいずれか1つに記載の方法。
77.前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてRAS変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態69〜76のいずれか1つに記載の方法。
78.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態69〜77のいずれか1つに記載の方法。
79.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である、実施形態69〜78のいずれか1つに記載の方法。
80.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態79に記載の方法。
81.EGFR阻害剤、MEK阻害剤もしくはタキサンまたはそれらの任意の組み合わせを前記対象に投与することをさらに含む、実施形態69〜80のいずれか1つに記載の方法。
82.前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記DNA損傷剤が前記対象に投与される、実施形態69に記載の方法。
83.前記DNA損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも1〜24時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態69に記載の方法。
84.前記BRAF阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記DNA損傷剤で前治療される、実施形態69に記載の方法。
85.薬物耐性腫瘍を治療する方法であって、BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を投与することを含む、前記方法。
86.前記薬物耐性腫瘍が前記阻害剤からなる治療に耐性である、実施形態85に記載の方法。
87.前記薬物耐性腫瘍が転移性腫瘍である、実施形態86に記載の方法。
88.前記転移性腫瘍が、転移性黒色腫、転移性膵臓腫瘍、転移性肺腫瘍、転移性結腸腫瘍、転移性卵巣腫瘍、転移性前立腺腫瘍、転移性肺腫瘍または転移性乳房腫瘍である、実施形態87に記載の方法。
89.前記薬物耐性腫瘍が、黒色腫、膵臓腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍または乳房腫瘍である、実施形態85に記載の方法。
90.前記腫瘍が野生型BRAFとして特徴づけられる、実施形態85に記載の方法。
91.前記腫瘍が変異BRAFとして特徴づけられる、実施形態85に記載の方法。
92.前記変異BRAFがBRAF V600EまたはV600Kである、実施形態91に記載の方法。
93.前記腫瘍が野生型RASとして特徴づけられる、実施形態85に記載の方法。
94.前記腫瘍が変異RASとして特徴づけられる、実施形態85に記載の方法。
95.前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてBRAF V600EまたはV600K変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態85に記載の方法。
96.前記投与ステップより前に、前記対象に由来する腫瘍試料においてRAS変異の有無を検出することをさらに含む、実施形態85に記載の方法。
97.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態85に記載の方法。
98.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態85に記載の方法。
99.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態98に記載の方法。
100.阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記DNA損傷剤が前記対象に投与される、実施形態85に記載の方法。
101.前記DNA損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも1〜24時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、実施形態85に記載の方法。
102.前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記DNA損傷剤で前治療される、実施形態85に記載の方法。
103.BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む、医薬組成物。
104.前記DNA損傷剤が二本鎖切断剤である、実施形態103に記載の医薬組成物。
105.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサートもしくはピリメタミンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である、実施形態103に記載の医薬組成物。
106.前記医薬組成物が経口送達に適している、実施形態103に記載の医薬組成物。
107.前記医薬組成物が注射に適している、実施形態103に記載の医薬組成物。
108.MEK阻害剤及び/またはEGFR阻害剤及び/またはタキサンあるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、実施形態103に記載の医薬組成物。
109.BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む、固定単位剤形。
110.150mg、240mg、または150mgもしくは240mg未満、または約150mもしくは240mgの前記阻害剤を含む、実施形態109に記載の固定単位剤形。
111.約5〜約200mgの前記阻害剤を含む、実施形態109に記載の固定単位剤形。
112.阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態109に記載の固定単位剤形。
113.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態109に記載の固定単位剤形。
114.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態113に記載の固定単位剤形。
115.前記DNA損傷剤が、約1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2の量、または1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2未満の量で存在する、実施形態113に記載の固定単位剤形。
116.EGFR阻害剤またはMEK阻害剤またはタキサンを含むか、EGFR阻害剤またはMEK阻害剤またはタキサンを含まない、実施形態109に記載の固定単位剤形。
117.BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む、注射可能な医薬組成物。
118.150mg、240mg、または150mgもしくは240mg未満、または約150mもしくは240mgの前記阻害剤を含む、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
119.前記組成物が約5〜約200mgの前記阻害剤を含む、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
120.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480及び/またはXP102あるいはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
121.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤またはアルキル化剤である、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
122.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
123.前記DNA損傷剤が、約1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2の量、または1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2未満の量で存在する、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
124.EGFR阻害剤またはMEK阻害剤またはタキサンを含むか、EGFR阻害剤またはMEK阻害剤またはタキサンを含まない、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
125.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサートまたはピリメタミンである、実施形態117に記載の注射可能な医薬組成物。
126.BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む注射可能な医薬組成物調製する方法であって、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩とDNA損傷剤を混合して、注射可能な医薬組成物を形成することを含む、前記方法。
127.前記BRAF阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態126に記載の方法。
128.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態126に記載の方法。
129.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態126に記載の方法。
130.BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む、キット。
131.前記阻害剤を含む第1の医薬的に許容可能な容器及び前記DNA損傷剤を含む第2の医薬的に許容可能な容器を含む、実施形態130に記載のキット。
132.前記容器が滅菌されており、発熱物質を含まない、実施形態130に記載のキット。
133.さらに処方情報を含む、実施形態130に記載のキット。
134.前記処方情報が、前記阻害剤及び前記DNA損傷剤を対象に投与するための指示を含む、実施形態133に記載のキット。
135.前記処方情報が、前記阻害剤及び前記DNA損傷剤を野生型RAFと特徴づけられる腫瘍を有する対象に投与するための指示を含む、実施形態133に記載のキット。
136.前記処方情報が、前記阻害剤を投与する前に前記DNA損傷剤を前記対象に投与するための指示を含む、実施形態133に記載のキット。
137.BRAF阻害剤、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を含む医薬調製物ならびに処方情報を含む容器であって、前記処方情報が、野生型RAFと特徴づけられる腫瘍を有する対象にDNA損傷剤とともに前記阻害剤を投与するための指示を含む、前記容器。
138.腫瘍が黒色腫腫瘍である、実施形態137に記載の容器。
139.前記阻害剤を含む、カプセル剤、錠剤または他の経口投与剤形を含む、実施形態137に記載の容器。
140.前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、実施形態137〜139のいずれか1つに記載の容器。
141.前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、実施形態137〜139のいずれか1つに記載の容器。
142.前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらの任意の医薬的に許容可能な塩である、実施形態141に記載の容器。
143.EGFR阻害剤またはMEK阻害剤またはタキサンをさらに含むか、EGFR阻害剤またはMEK阻害剤またはタキサンを含まない、実施形態137に記載の容器。
以下の実施例は本明細書に記載の方法及び組成物の例示であるが、これらを限定するものではない。通常は療法で遭遇し、当業者に明白な、様々な条件及びパラメーターの他の適切な修正及び適合は、本明細書に記載の化合物及び方法の趣旨及び範囲の中である。
実施例1:ゲムシタビンはベムラフェニブの治療効果を増強する
ウェルあたりおよそ250,000個の細胞で細胞をプレーティングした。およそ24時間後、図1A及び1Bに示すように、化合物を、単独でまたは組み合わせて与えた。およそ48時間後、細胞を回収し、計数した。図1A及び1Bは、ベムラフェニブ(薬物A)とゲムシタビン(薬物B)の相乗効果を図示する。驚くべき結果は、化合物の組み合わせが野生型BRAFである細胞型においてでさえ有効であることであった。
ウェルあたりおよそ250,000個の細胞で細胞をプレーティングした。およそ24時間後、図1A及び1Bに示すように、化合物を、単独でまたは組み合わせて与えた。およそ48時間後、細胞を回収し、計数した。図1A及び1Bは、ベムラフェニブ(薬物A)とゲムシタビン(薬物B)の相乗効果を図示する。驚くべき結果は、化合物の組み合わせが野生型BRAFである細胞型においてでさえ有効であることであった。
図2A及び2Bは、ベムラフェニブに対する細胞の感受性をおよそ100倍増大させるベムラフェニブとゲムシタビンの組み合わせを図示する。細胞は野生型BRAFを有する腺癌に由来する。したがって、ベムラフェニブが細胞を死滅させるのに有効であろうことが予想外であったと思われた。しかし、ベムラフェニブ(薬物A)をゲムシタビン(薬物B)と組み合わせると、細胞がベムラフェニブ療法に感受性になり、これに応答することが見出された。図1A、1B、2A及び2Bで分かるように、この結果は、各薬剤を単独で使用した場合ではなく、組み合わせて使用した場合のみ観察された。この組み合わせはまた、各化合物の1つまたは複数のより低い量を使用して、有意な細胞死滅を達成することができた。この組み合わせはまた、いずれかの化合物単独よりも良く、且つ相乗的な量で、コロニー形成を阻害した(データ非表示)。
野生型BRAF及び変異KRAS(G12C)を有する転移性がん細胞株(HD。BxPC3M1としても知られる)ならびに野生型BRAF及び野生型RASを有するがん細胞株(BxPC3)を、様々な条件下で、ゲムシタビン及びベムラフェニブで処理した。細胞は、両方の薬剤で、同時に、または順次(すなわち、最初にゲムシタビン、続いてベムラフェニブ、もしくは最初にベムラフェニブ、続いてゲムシタビンのいずれか)のいずれかで処理した。薬剤を細胞から洗い流してから、細胞をコロニー形成させた。細胞を固定し(高濃度メタノール)及び20%エタノール中の0.4%クリスタルバイオレットで染色し、595nmの吸光度を読み取ることによって、コロニーを定量化した。以下の表に例示する結果は、ゲムシタビン、それに続くベムラフェニブの順次添加は、同時処理、またはゲムシタビン(薬物B)より前にベムラフェニブ(薬物A)を加えた場合と比較して、コロニー形成を低減させたことを示す。
これらの結果は、図3A及び3Bにも図示する。
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、この結果は、細胞をS期で停止させる亜致死量のDNA損傷剤(ゲムシタビン)でWT BRAF/変異KRAS細胞をプライムしたためであると考えられ、またはG2期(ドキソルビシン、エトポシド)もしくはG1期(メトトレキサート)で他のDNA損傷剤が使用され、次いで、ベムラフェニブまたは他のBRAF阻害剤、例えば、本明細書に開示されるものが添加される場合は、続いて、細胞周期停止がMAPK経路を活性化し、停止した細胞が損傷した複製しないDNAで増殖しようとする。次いで、細胞は生存することができずに死ぬ。DNA損傷剤を使用した細胞のプライミングがない場合は、BRAF阻害剤は、通常は、MAPK経路を活性化し、野生型BRAFを有する腫瘍細胞の増殖を増強し、これは、BRAF阻害剤のラベル上に禁忌として示される。
これらの結果は、野生型BRAF腫瘍でそのような阻害剤を使用することが有し得る有害効果が理由で、ベムラフェニブの治療より前に腫瘍検体においてBRAF V600E変異のエビデンスを確認することを臨床医に指示する、ベムラフェニブ及び他のBRAF阻害剤に対するラベルを考慮すると、驚くべきことである。したがって、処理された細胞型でベムラフェニブが有効であろうこと、及びベムラフェニブの効果は、これをDNA損傷剤、例えば、二本鎖切断を引き起こすヌクレオシド類似体であるゲムシタビンと組み合わせることによって、相乗的に増強されないであろうことは、予想外であったと思われる。細胞を死滅させる能力はKRAS変異と関係がなく、これも、ベムラフェニブがKRAS変異型腫瘍で有効でなかったことを示す以前のエビデンスのために、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例2:ベムラフェニブ耐性SK−MEL−28VR1細胞の特定及び特徴づけ。薬物選抜によって、SK−MEL−28ベムラフェニブ耐性細胞株をSK−MEL−28親細胞から単離した。SK−MEL−28VR1の増殖速度も親細胞株よりも速かった(図4A)。SK−MEL−28VR1細胞は16時間の倍加時間を有していたが、親細胞は23.1時間の倍加時間を有していた。コロニー形成アッセイによって、SK−MEL−28VR1細胞は、その親細胞株と比較してベムラフェニブに耐性があることが明らかになった(図4B)。SK−MEL−28VR1細胞は、ベムラフェニブについて約30μMのIC50を有していた(データ非表示)が、親細胞株は約1μMのIC50を有していた(図4B)。マススペクトロメトリー(MS)分析によって、SK−MEL−28VR1は、ベムラフェニブ処理に応答して、親細胞株と比較して異なるプロテオミックプロファイルを有することが明らかになった。FAM129Bは、ベムラフェニブで処理されたSK−MEL−28VR1細胞とビヒクルで処理されたSK−MEL−28VR1細胞の間で、3番目に高い差次的発現を有するとして特定された(表2)。
表2は、バイアスのないマススペクトロメトリーを記載する。SK−MEL−28VR1細胞とSK−MEL−28細胞の間で、ベムラフェニブ処理の後に最大の差次的発現を有するタンパク質。特定されたタンパク質は、SK−MEL−28VR1細胞において薬物治療で存在量が増大しおり、SK−MEL−28細胞において薬物治療で存在量が低下している。倍数差異は、親SK−MEL−28細胞と比較した、SK−MEL−28VR1細胞のベムラフェニブ処理による特定のタンパク質の存在量の増大の定量的尺度である。
細胞質内のFAM129Bの存在量は、ビヒクル処理と比較して、ベムラフェニブ処理で約6倍増大した(図5A)。興味深いことに、親SK−MEL−28細胞において、ベムラフェニブ処理に応答してFAM129Bの存在量は低下した。これらの傾向は、SK−MEL−28VR1細胞において活性なMAPK経路を示したが、SK−MEL−28細胞においては示さなかった。さらに、FAM129Bタンパク質の傾向は、観察された細胞増殖の誘導を支持し、SK−MEL−28細胞と比較して、SK−MEL−28VR1細胞の浸潤能の増大を示唆した。
重要なことに、セリン生合成経路のタンパク質は、耐性細胞とベムラフェニブに応答する感受性細胞の間で、規定された経路内の最も高い差次的発現タンパク質であった。この経路の全3酵素(PHGDH、PSAT1、PSPH)ならびにセリン−tRNAリガーゼのSARS(細胞質)及びSARS2(ミトコンドリア)は、ベムラフェニブに暴露されたSK−MEL−28VR1細胞において、ビヒクル以上の存在量で発現していたが、反対の傾向が親細胞で観察された(データ非表示)。PHGDH抗体を使用するウエスタンブロッティングによって、MS分析を介して観察された傾向が確認された(図5B)。MSデータと一致して、ウエスタンブロットによって、SK−MEL−28VR1細胞が、親細胞と比較して、ベースラインPHGDH発現が増大したことが明らかになった(図5B)。さらに、ウエスタンによって、SK−MEL−28VR1細胞において、ベムラフェニブ処理の後に、PHGDHレベルが増大することが明らかになり(図5B)、これは、MSデータと一致する(非表示)。
PHGDHは、SK−MEL−28VR1細胞のベムラフェニブ耐性に必須である。PHGDHは、セリン合成経路の第1ステップを構成する、3−ホスホヒドロキシピルビン酸への3−ホスホグリセリン酸の変換を触媒する酵素である。セリン合成がベムラフェニブ耐性に重要であったかどうかを直接試験するために、siRNAを使用して、SK−MEL−28VR1株及びSK−MEL−28細胞株においてPHGDHを枯渇させた(図13)。PHGDH siRNAは、ベムラフェニブ処理後のSK−MEL−28VR1細胞死を有意に増強したが、ベムラフェニブによる親SK−MEL−28の細胞死に対していかなる相加効果も有していなかった(図6A及び6B)。対照siRNAの処理によって、各細胞株について、ベムラフェニブ処理後の細胞生存率のベースラインを確立した。PHGDH siRNA+ベムラフェニブ処理は、SK−MEL−28VR1細胞において、ベースラインを下回る細胞生存率の低下を示した(図6B)が、親細胞はそうではなかった(図6A)。
メトトレキサートは、SK−MEL−28VR1細胞をベムラフェニブに対して選択的に感受性にする。セリン生合成タンパク質が、親SK−MEL−28細胞ではなく、SK−MEL−28VR1細胞において選択的に誘導されたので、セリンが葉酸サイクルの直接インプットであるからことから、セリン合成が葉酸サイクルに寄与しているがどうかを調べた。葉酸サイクルは、がん細胞におけるDNAの合成及び修復に重要なチミジル酸の生成につながるテトラヒドロ葉酸(THF)の生成に必要である。さらに、同じ研究が、グリシンへのセリンの変換と葉酸サイクルの両方が、腫瘍由来細胞株のサイトゾルにおけるATP生成の一炭素代謝サイクルへ前駆物質を与えることを示した。葉酸代謝拮抗薬であるメトトレキサートは、ジヒドロ葉酸還元酵素及びチミジル酸合成酵素を阻害し、したがって、ヌクレオチド合成を阻害する。メトトレキサートは、腫瘍由来細胞株においてATPレベルを低減することも示された。葉酸サイクルに対するセリンの重要性と一致して、メトトレキサート(75nM)は、ベムラフェニブ処理後のSK−MEL−28VR1の細胞死滅を有意に増強した(図6D)。対照的に、親SK−MEL−28細胞において、メトトレキサート/ベムラフェニブ処理による有意な死滅は、観察されなかった(図6C)。
セリン枯渇はSK−MEL−28VR1細胞をベムラフェニブに対して感受性にする。セリン合成の下流の葉酸サイクルをメトトレキサートで妨害することが、SK−MEL−28VR1細胞をベムラフェニブに対して感受性にするので、SK−MEL−28VR1のベムラフェニブ耐性に対する細胞外セリン枯渇の効果を調査した。コロニー形成アッセイにおいて、SK−MEL−28VR1細胞の細胞プレーティング及び薬物処理の間、セリン、グルコース及びグリシンが枯渇した培地を使用した。薬物処理後、細胞に完全培地を再供給し、細胞をコロニーに増殖させた。コロニー形成アッセイの定量化によって、セリン枯渇条件下のベムラフェニブ処理後に、SK−MEL−28VR1の細胞死の増加が明らかになった(図6E)。2.5μM及び5μMのベムラフェニブ用量で、SK−MEL−28VR1細胞は、セリン枯渇で>50%の細胞死を示したが、完全培地では示さなかった。SK−MEL−28VR1細胞のベムラフェニブ耐性に対する高細胞外セリンレベルの効果も調査した。大量の細胞外セリンは、SK−MEL−28VR1細胞のベムラフェニブ耐性に影響を及ぼさなかった(データ非表示)。まとめると、このデータは、ベースラインの細胞外セリンレベルが、ベムラフェニブストレス条件下におけるSK−MEL−28VR1細胞の生存に重要であることを示す。
ベムラフェニブに対するSK−MEL−28VR1細胞の増感剤としてのゲムシタビンの特定。葉酸サイクルは、DNA修復の間のヌクレオチド生成に重要であり、PHGDH、PSAT1及びPSPHタンパク質のレベルは、ゲノム不安定性の条件下で増大することが示されている。したがって、ベムラフェニブに対するSK−MEL−28VR1細胞の潜在的な増感剤として、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びヌクレオシド類似体を含めて、いくつかのクラスのDNA損傷剤を試験した。ヌクレオシド類似体のゲムシタビンは、組み合わせて使用した場合に、SK−MEL−28VR1細胞をベムラフェニブに対して有意に感受性にしたが、この組み合わせ処理は、単一のベムラフェニブ処理と比べて、SK−MEL−28細胞を感受性にしなかった(図7A及び7B)。コロニー形成アッセイにおいて、50nM用量のゲムシタビンを可変用量のベムラフェニブに加えた。重要なことに、PHGDH siRNA処理は、ゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせ処理で観察される細胞死を越えて、SK−MEL−28VR1の細胞死を増強したが、ゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせで処理したSK−MEL−28親細胞の細胞死を増強しなかった(図7C及び7D)。さらに、メトトレキサートは、ゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせと一緒に処理した場合に、SK−MEL−28VR1細胞の細胞死を有意に増強したが、SK−MEL−28細胞はそうではなかった(図7E及び7F)。重要なことに、組み合わせ指数(CI)の計算によって、試験したすべての用量で、SK−MEL−28VR1細胞においてゲムシタビンとベムラフェニブの間で相乗効果が示された(図7G、表3(以下)、図14A)。
ベムラフェニブは、膵臓癌細胞及び非小細胞肺癌細胞をゲムシタビンに対して感受性にする。ゲムシタビンは膵臓癌における第一選択療法である。したがって、4種の膵細胞株(BxPC3、Panc1、MiaPaca2及びBxPC3M1)を、ベムラフェニブ処理によるゲムシタビン感受性化について試験した。可変ゲムシタビン用量及び1μMの一定ベムラフェニブ用量を使用して、コロニー形成アッセイによって、ベムラフェニブによってBxPC3M1細胞がゲムシタビンに対して有意に感受性になることが明らかになった(図8A)。重要なことに、組み合わせ指数(CI)の計算によって、BxPC3M1細胞において、特定の用量で、ゲムシタビンとベムラフェニブの間で相乗効果が示された(図8B、表4、図14B)。最高(5000nM)及び最低(5nM及び10nM)ゲムシタビン用量は、ゲムシタビンとベムラフェニブの間で競合性を示した。しかし、25nM〜1000nMのゲムシタビン用量は、2種の薬物の間で相乗効果を示した。さらに、ゲムシタビンはまた、特に高齢患者または不健康な患者の進行した非小細胞肺癌(NSCLC)の治療で有効であった。本発明者らは、ステージ4腺癌NSCLC細胞株NCI−H2122を試験した。1μMのベムラフェニブがNCI−H2122細胞をゲムシタビンに対して感受性にすることが観察された(図8C)。
ベムラフェニブは、膵臓癌細胞においてセリン合成タンパク質を誘導する。次に、膵臓癌細胞の増殖に対するベムラフェニブ処理の効果を試験した。試験した細胞株の4種すべて(BxPC3M1、BxPC3、Panc1及びMiaPaca2)は、WT BRAFを発現する。2010年のNatureの研究に基づいて、期待通りに、ベムラフェニブ処理(10μM)は4種の細胞株すべての増殖を増大させた(図9A、9B、9C及び9D)。セリン合成が腫瘍細胞の増殖の増大と相関することが示されているので、MSによって膵細胞株のプロテオミックプロファイルを比較した。予想通り、PHGDH、PSAT1、PSPH及びSARSタンパク質の存在量は、試験した4種の細胞株すべてで増大した(図9E、9F、9G及び9H)。重要なことに、BxPC3M1細胞は、試験した他の3種の細胞株と比較して、4種のタンパク質すべてについてタンパク質存在量の最大の増大を表した。さらに、ゲムシタビン+ベムラフェニブと組み合わせたメトトレキサート処理は、メトトレキサートをともなわないゲムシタビン+ベムラフェニブ処理と比較して、BxPC3M1細胞及びNCI−H2122細胞の細胞死を増加させた(図10A及び10B)。次に、BxPC3M1のベムラフェニブ耐性に対する細胞外セリン枯渇の効果を調査した。コロニー形成アッセイにおいて、BxPC3M1細胞の細胞プレーティング及び薬物処理の間、セリン、グルコース及びグリシンが枯渇した培地を使用した。薬物処理後、細胞に完全培地を再供給し、細胞をコロニーに増殖させた。コロニー形成アッセイの定量化によって、セリン枯渇条件下のベムラフェニブ処理後に、BxPC3M1の細胞死の有意な増加が明らかになった(図10C)。5μMのベムラフェニブ用量で、BxPC3M1細胞は、セリン枯渇培地で>50%の細胞死を示したが、完全培地では示さなかった。
別のBRAF阻害剤であるダブラフェニブは、がん細胞をゲムシタビンに対して感受性にする。ベムラフェニブと同様に、ダブラフェニブは、転移性黒色腫に対して有効性を有するBRAF V600E阻害剤である。本発明者らは、SK−MEL−28VR1、BxPC3M1細胞及びNCI−H2122細胞を感受性にするダブラフェニブの効力を試験した。各病態の第一選択薬物を可変用量で与えた。ダブラフェニブは、BRAF V600E変異を有する転移性黒色腫の第一選択療法と考えられ、一方で、ゲムシタビンは膵臓癌及びNSCLCの第一選択療法である。SK−MEL−28VR1細胞に対して、ゲムシタビン用量を50nmで一定に保ち、ダブラフェニブを可変用量とした。これに対して、膵臓癌細胞株及びNSCLC細胞株において、ダブラフェニブ用量を1μMで一定に保ち、ゲムシタビンを可変用量とした。興味深いことに、ダブラフェニブ処理は、BxPC3M1細胞及びNCI−H2122細胞をゲムシタビンに対して感受性にし(図11A及び11B)、ゲムシタビンはSK−MEL−28VR1細胞をダブラフェニブに対して感受性にした(図11C)。
考察:本発明者らは、BRAF V600E阻害剤耐性のメカニズムを研究するために、ベムラフェニブ耐性SK−MEL−28細胞(SK−MEL−28VR1)を単離した。本発明者らのプロテオミクスデータは、ベムラフェニブに応答して、親SK−MEL−28細胞由来のSK−MEL−28VR1細胞のタンパク質シグネチャを区別した。セリン生合成経路の酵素のレベル(PHGDH、PSAT1及びPSPHならびにセリンtRNA−リガーゼSARS1/2)は、SK−MEL−28VR1細胞のベムラフェニブ処理に応答して上昇することが観察された。対照的に、言及されるタンパク質の5種すべてが、SK−MEL−28親細胞のベムラフェニブ処理に応答して減少した。引き続くウエスタンブロッティングによって、MSアッセイで観察されたタンパク質傾向が確証された。これらの結果から、本発明者らは、セリン合成はSK−MEL−28VR1細胞のベムラフェニブ耐性に重要であると仮定する。セリン合成は、がん細胞の増殖に重要であることが示されている。これは、がん細胞の増殖の間のヌクレオチド及びアミノ酸の合成にグリシンではなくセリンが重要であったことを示す。実際に、SK−MEL−28VR1細胞は、SK−MEL−28細胞(23.1時間の倍加時間)と比較してより高い増殖速度(16時間の倍加時間)を有していた。SK−MEL−28VR1細胞におけるベムラフェニブに応じたセリン生合成誘導についての本発明者らのプロテオミクスの知見は、セリン合成をがん細胞の生存の増大と正に相関させる発表された報告(Mattaini et al.,2016;Possemato et al.,2011)を支持する。
siRNAによるPHGDHアブレーション後のコロニー形成アッセイによって、ベムラフェニブに対するSK−MEL−28VR1の耐性にとってのPHGDH遺伝子産物の重要性が確証された。メトトレキサート処理後のコロニー形成アッセイとともにこのデータによって、SK−MEL−28VR1細胞の耐性シグネチャの重要な要素としてセリン合成が確証された。PHGDHは、セリン生合成経路の第1ステップを触媒し、3−ホスホグリセリン酸を3−ホスホヒドロキシピルビン酸へ変換する。さらに、PHGDH遺伝子の増幅が乳癌及び黒色腫で報告されている。実際に、ある特定の乳癌細胞型は、より高いPHGDH遺伝子発現によるセリン合成フラックスの増大に依存していることが示されている。さらに、NSCLCでは、PHGDH遺伝子の増幅及び過剰発現は侵攻性疾患と正に相関する。重要なことに、PHGDH遺伝子は転移性黒色腫で増幅されることが多く、そのノックダウンは細胞生存率に負に影響を及ぼす。ベムラフェニブ感受性化により誘導されるPHGDHアブレーションは、乳癌におけるBRCA1アブレーション及び白金ベースの化学療法の話を暗示する。
セリン生合成は上流にあり、ヌクレオチド及びアミノ酸の代謝に関与する複数の経路に流れ込む。特に、葉酸サイクルはヌクレオチド代謝に寄与する。本発明者らは、SK−MEL−28及びSK−MEL−28VR1の細胞生存率に関して、葉酸代謝拮抗薬のメトトレキサートをベムラフェニブと組み合わせて試験した。メトトレキサートは、SK−MEL−28VR1細胞をベムラフェニブに対して選択的に感受性にする。メトトレキサートは、増殖中のがん細胞で活性化されるSOG(セリン−一炭素サイクル−グリシン切断)として知られる代替代謝経路におけるセリン生合成の下流に位置する葉酸サイクルを阻害することが既知である。さらに、セリン枯渇実験によって、SK−MEL−28VR1のベムラフェニブ耐性にとってベースラインレベルの細胞外セリンが必要であることが示された。最近の研究によって、BRAF阻害剤耐性黒色腫細胞が細胞増殖の誘導中に酸化的代謝に切り替わることが必要であることが特定された。実際に、耐性細胞は、増殖のために、グルコースではなくグルタミンに過度に依存していることが報告されている。興味深いことに、グルタミンから触媒されるグルタミン酸は、セリン生合成経路の第2ステップの前駆物質である。PSPH酵素は、3−ホスホヒドロキシピルビン酸からホスホセリンへの変換の間に、グルタミン酸からα−ケトグルタル酸への変換を触媒する。本発明者らは、セリン合成は、潜在的に、増殖の間の酸化的代謝への記載の切り替わりの結果として、本発明者らのSK−MEL−28VR1細胞で活性であると仮定する。SK−MEL−28VR1細胞のグルタミンへの依存を調べるために、さらなる研究が必要とされる。
高信頼度ヒットの中でも特に、FAM129Bは、ベムラフェニブ処理に関して、2種の細胞株の間で最も差次的に発現しているタンパク質のうちの1つとして特定された。FAM129は、Niban様タンパク質1としても知られる接着結合関連タンパク質である。FAM129Bは、BRAF/MAPKK/ERKシグナリングカスケードによって4つセリン残基でリン酸化され、FAM129Bは、MAPK経路が活性な条件下でのみ、黒色腫細胞の細胞質全体にわたって分散していることが既知である。化学的阻害剤UO126によるMAPKカスケードの阻害は、FAM129Bを細胞膜に局在化させた。Smalleyらは、FAM129Bの過剰発現が黒色腫細胞の浸潤能を高めることを示した。FAM129Bは、黒色腫において、MAPKカスケードの下流の複数のシグナリング経路に影響を及ぼす。本発明者らのアッセイでは、細胞質内のFAM129Bタンパク質の存在量は、ベムラフェニブ処理後のSK−MEL−28VR1細胞で増大したが、SK−MEL−28細胞では低下した。したがって、本発明者らのMSアッセイにおけるFAM129Bタンパク質の傾向によって、ベムラフェニブがSK−MEL−28VR1細胞においてMAPK経路の活性化を誘導するが、SK−MEL−28細胞では誘導しないことが示唆された。さらに、MAPKの活性化により、ベムラフェニブが、SK−MEL−28VR1細胞において細胞増殖を誘導することができることが示唆され、これは、セリン合成誘導の知見を支持するものである。本発明者らは、現在、転移性黒色腫細胞におけるベムラフェニブ耐性に対する潜在的なバイオマーカーとしてFAM129Bを調べている。
興味深いことに、葉酸サイクルは細胞増殖の間のヌクレオチドプールの補充に寄与することが既知であり、DNA損傷はヌクレオチドの生成を誘導する。さらに、3種のセリン合成酵素のレベルは、すべて、DNA損傷及びゲノム不安定性の条件下で増大することが示された。本発明者らは、ベムラフェニブに対するSK−MEL−28VR1細胞の増感剤として、いくつかのDNA損傷剤を試験した。ゲムシタビンは、ベムラフェニブの添加前にSK−MEL−28VR1細胞がこの薬物で前処理される場合に、増感剤として特定された。組み合わせ指数の計算によって、SK−MEL−28VR1細胞において、ゲムシタビンとベムラフェニブの間の相乗効果が明らかになった。ゲムシタビンはデオキシシチジン類似体であり、これは、膵臓癌及び肺癌を含めた複数の腫瘍タイプに対する一次化学療法であった。ゲムシタビンは、p53変異型細胞の細胞周期のS期における複製フォークの崩壊の結果としてDNA二本鎖切断(DSB)を引き起こし、またはp53WT細胞のG1におけるPUMA及びBax媒介性細胞死プログラムを介してアポトーシスを誘導する。しかし、膵臓及び肺癌の腫瘍細胞のp53及び他の遺伝子において一般に生じる変異は、ゲムシタビンに対して獲得耐性を推進し、その結果、無病生存率を低くする。p53変異型がん細胞は、nM用量のゲムシタビンによる処理後にS期で停止するようになるが、死にはしない。一方で、p53WT細胞は、同一用量で、G1停止後に死ぬ。p53、BRAF及びKRASのようなゲートキーパー遺伝子中の変異は、天然のがん細胞進行において一般的な事象であり、したがって、がん細胞が転移に向かって進行する場合の、がん細胞が薬物のDNA損傷作用に抵抗する生得的能力は、特に問題となる。それにもかかわらず、ゲムシタビンは、進行した膵臓癌(PCa)に対して第一選択療法のままである。
薬物添加の順序は、SK−MEL−28VR1細胞における本発明者らのゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせの成功にとって重要であった。同時薬物処理またはベムラフェニブもしくはダブラフェニブの前処理に続くゲムシタビン処理を用いる実験は、有意な感受性化を示さなかった(データ非表示)。本発明者らは、SK−MEL−28VR1細胞は、ゲムシタビンによって引き起こされるDNA二本鎖切断により、S期で停止すると仮定する。結果として、停止した細胞をベムラフェニブで処理する場合に、MAPKカスケードが活性化され、セリン生合成及び葉酸サイクルが誘導される。本発明者らは、これら一連の事象は、SK−MEL−28VR1細胞において最終的に細胞死につながると考える。ゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせによるSK−MEL−28VR1の細胞死を十分に特徴づけるために、さらなる実験が是認される。本発明者らは、DNA損傷は、DNA修復のためにSK−MEL28VR1細胞において細胞周期停止を誘導して、葉酸サイクル及びヌクレオチド合成の活性化を開始すると仮定する。細胞が停止している間、BRAF V600E阻害剤処理は、MAPK経路を活性化し、セリン合成及びヌクレオチド合成を誘導する。細胞のヌクレオチドプールを枯渇させる2つの相反する経路が、細胞死を引き起こす。
次に、本発明者らのベムラフェニブ研究を、この薬物に本来応答性でないBRAF WTがん細胞株で反復した。ベムラフェニブは、BRAF WTバックグラウンドを有する細胞の増殖を増大させることが既知であるので、本発明者らは、セリン生合成が、ベムラフェニブ処理条件下での細胞の生存及び増殖にとって重要であり得ると仮定する。本発明者らは、BRAF WTであり、ベムラフェニブに本質的に耐性である、複数のがん細胞株を調査した。膵臓癌細胞、NSCL癌細胞、乳癌細胞及び結腸癌細胞を試験した。実際に、MS研究によって、ベムラフェニブ処理に応答してBRAF WT膵臓癌細胞において大きく誘導されたとして、セリン生合成経路が特定された。BxPC3M1細胞は、薬物処理された膵臓癌細胞株のセリン合成酵素の増大が最も高かった。次いで、可変用量のゲムシタビンを試験し、ベムラフェニブ用量を一定に保った。1種の膵臓癌細胞株(BxPC3M1)及び1種のNSCL(NCI−H2122)癌細胞株がゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせ処理に対して感受性になった。薬物添加の順序は、感受性化にとって重要な役割を果たした。ゲムシタビンの前処理は、BRAF阻害剤と組み合わせた場合に、感受性化に対して相乗効果を示した。組み合わせ指数の計算によって、25nM〜1000nMのゲムシタビン用量で、ゲムシタビンとベムラフェニブの間の相乗効果が明らかになった。2種の薬物は、5nM、10nM及び5000nMのゲムシタビン用量で、競合的な関係を有していた。このデータは、5000nM用量のゲムシタビン単独が細胞死を引き起こし、1μMベムラフェニブの追加によって、ゲムシタビンの毒性が低減することを示した。しかし、より低用量のゲムシタビン(25nM〜1000nM)は、ベムラフェニブと相乗効果を示した。最低用量のゲムシタビン(5nM及び10nM)で、2種の薬物は競合的な関係を有する。これらの用量のゲムシタビンは、低すぎて、本発明者らのCIプロットにいかなる影響も与えることができないように思われる。本発明者らは、細胞周期停止は、BxPC3M1細胞において、ベムラフェニブ誘導性細胞死に必要であると考える。さらに、BxPC3M1細胞の増殖はベムラフェニブ処理によって誘導された。セリン枯渇実験によって、BxPC3M1のベムラフェニブ耐性にとって、ベースラインレベルの細胞外セリンが必要であることが示された。重要なことに、ゲムシタビンは、SK−MEL−28VR1細胞、BxPC3M1細胞及びNCI−H2122細胞を、第2のBRAF V600E阻害剤ダブラフェニブに対して感受性にした。まとめると、本発明者らのデータは、ベムラフェニブまたはダブラフェニブに対する、SK−MEL−28VR1細胞の獲得耐性ならびにBxPC3M1細胞及びNCI−H2122細胞の内因性耐性が、ゲムシタビンの添加によって、反転し得ることを示した。ゲムシタビン及びベムラフェニブは、SK−MEL−28VR1細胞及びBxPC3M1細胞で相乗効果を示した。
本発明者らは、試験したすべての膵臓癌及びNSCLC細胞株全体にわたってゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせによる感受性化を観察したわけではないので、レスポンダー、すなわち、SK−MEL28VR1細胞とBxPC3M1細胞とNCI−H2122細胞の間で、統一的な特性を調べ始めた。以前のRNAシークエンシングデータ(データ非表示)から、BxPC3M1細胞がNCI−H2122細胞株と同一のホモ接合型KRAS G12C変異を有することが分かっている。さらに、KRAS G12V変異はSK−MEL−28VR1細胞において生じた。さらに、NCI−H2122細胞及びBxPC3M1細胞はBRAFについてWTである。しかし、本発明者らがさらに探索している興味深い知見は、SK−MEL−28VR1細胞、BxPC3M1細胞及びNCI−H2122細胞に共通している定性的特徴である。3種すべての細胞株は、遊離した表現型を有する(データ非表示)。この表現型は、間葉系癌細胞の遊離した表現型と一致する。上皮間葉転換(EMT)がベムラフェニブ耐性への経路であることが優先される。本発明者らは、現在、SK−MEL−28VR1細胞、BxPC3M1細胞及びNCI−H2122細胞をEMTスケールで十分に特徴づけることに関して研究しており、ならびに3Dゲル浸潤研究及びゲノムシークエンシングによって、それらの転移能を調べている。本発明者らは、転移能及び変異プロファイルが、ゲムシタビン/ベムラフェニブの組み合わせに対する細胞感受性の重要な決定因子であり、個別化療法の可能性を明らかにすると仮定する。さらに、本発明者らは、メトトレキサート+ベムラフェニブまたはダブラフェニブ処理に対する、さらなる耐性黒色腫細胞株の応答をさらに調べている。
本研究は、がん細胞におけるBRAF阻害剤耐性の新規で重要な決定因子として、セリン生合成を特定した。さらに、本発明者らは、BRAF V600E阻害剤に対する黒色腫細胞の増感剤として、メトトレキサートを示した。さらなる実験によって、SOG経路のさらなる阻害剤が、BRAF阻害剤に対する細胞の増感剤としてのそれらの有効性について調べられるであろう。重要なことに、本発明者らは、BRAF阻害剤であるベムラフェニブまたはダブラフェニブに対するがん細胞の増感法としてのゲムシタビン前処理を示した。最後に、本発明者らの研究は、BRAF阻害剤、すなわちベムラフェニブまたはダブラフェニブに対するBRAF V600E及びBRAF WTがん細胞の耐性を反転させるために破壊することができる新規なタンパク質及び経路標的を特定するための定量的なプロテオミクスプロファイリングの好結果の使用を示す。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、図12A及び12Bは、本明細書に記載のデータ及び経路を図示する。これらの組み合わせは、例えば、膵臓癌及び黒色腫ならびに本明細書に記載の他のタイプのがんを治療するのに使用することができる。
材料及び方法
細胞培養及び化学物質:Panc1、BxPC3、MiaPaca2及びNCI−H2122細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から購入した。SK−MEL−28及び501MEL細胞は、Fox Chase Cancer Center(FCCC)のDr.Alfonso Bellacosaの御厚意により頂いた。細胞株SK−MEL−28VR1は、段階的なベムラフェニブ選抜によって特定した。手短に言えば、100,000個のSK−MEL−28細胞を10μMベムラフェニブに48時間、次いで20μMのベムラフェニブに48時間、次いで30μMのベムラフェニブに48時間暴露した。生存細胞をプールし、SK−MEL−28VR1細胞株として特定した。細胞株BxPC3M1は、BxPC3細胞の受動的選抜によって特定した。単一のBxPC3細胞をプレーティングし、サブクローンに増殖させた。非常に接着性のBxPC3親細胞と質的に異なる遊離した表現型を有するサブクローンを特定し、BxPC3M細胞株として単離した。1つのそのような細胞株はBxPC3M1である。すべての細胞株は、DMEM/10%FBS(GenDepot)または2mMグルタミン(Life Technologies;25030081)を補充したRPMI1640/10%FBS(GenDepot)中で培養し、5%CO2中で37℃で維持した。グルコースもグリシンもセリンもないRPMI1640(Teknova)/10%透析FBS(Life Technologies;26400036)をセリン枯渇研究に使用した。ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、メトトレキサート、カンプトテシン及びゲムシタビンはSelleckchemから入手した。PHGDH siRNAはAmbion(AM16708)から入手し、リポフェクタミンRNAiMaxはInvitrogen(100014472)から入手した。
細胞培養及び化学物質:Panc1、BxPC3、MiaPaca2及びNCI−H2122細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から購入した。SK−MEL−28及び501MEL細胞は、Fox Chase Cancer Center(FCCC)のDr.Alfonso Bellacosaの御厚意により頂いた。細胞株SK−MEL−28VR1は、段階的なベムラフェニブ選抜によって特定した。手短に言えば、100,000個のSK−MEL−28細胞を10μMベムラフェニブに48時間、次いで20μMのベムラフェニブに48時間、次いで30μMのベムラフェニブに48時間暴露した。生存細胞をプールし、SK−MEL−28VR1細胞株として特定した。細胞株BxPC3M1は、BxPC3細胞の受動的選抜によって特定した。単一のBxPC3細胞をプレーティングし、サブクローンに増殖させた。非常に接着性のBxPC3親細胞と質的に異なる遊離した表現型を有するサブクローンを特定し、BxPC3M細胞株として単離した。1つのそのような細胞株はBxPC3M1である。すべての細胞株は、DMEM/10%FBS(GenDepot)または2mMグルタミン(Life Technologies;25030081)を補充したRPMI1640/10%FBS(GenDepot)中で培養し、5%CO2中で37℃で維持した。グルコースもグリシンもセリンもないRPMI1640(Teknova)/10%透析FBS(Life Technologies;26400036)をセリン枯渇研究に使用した。ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、メトトレキサート、カンプトテシン及びゲムシタビンはSelleckchemから入手した。PHGDH siRNAはAmbion(AM16708)から入手し、リポフェクタミンRNAiMaxはInvitrogen(100014472)から入手した。
細胞生存率アッセイ:コロニー形成アッセイのために、0日目に、ウェルあたり400個の細胞を24ウェルプレート中に播種した。1日目に、細胞をDMSOまたは様々な用量のゲムシタビンで24時間処理した。2日目に、ゲムシタビンを洗い落とし、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ及びメトトレキサートを加えた。4日目に、2日目に加えた薬物を洗い落とした。その後7日間細胞を増殖させてから、先に記載されたように定量化するために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。
マススペクトロメトリー:U3000 RSLCnano HPLC装置(Thermo Fisher Scientific)と一体となったQ−Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)で行われる液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析(LC−MS/MS)分析のために、試料を乾燥させ、2.5%ACN/0.1%ギ酸に再溶解した。5μLの試料をC18トラップカラム(PepMap100;300μm i.d.×5mm、5μm粒径、100Å;Thermo Fisher Scientific)に1分あたり10μLの流速でロードした。ペプチド分離は、C18カラム(ACQUITY UPLC M−Class Peptide CSH C18;130Å 1.7μm 75μm×250mm、Waters)で、1分あたり0.26μLの流速及び以下の勾配で行った:0〜3分、2%B定組成;3〜76分、2%〜30%B;76〜90分、30%〜45%B;90〜98分、45%〜98%B。移動相Aは0.1%ギ酸であり、移動相Bは80:20アセトニトリル:水中の0.1%ギ酸であった。この実施は、Progenesis−QI for Proteomics(Nonlinear dynamics)を使用して分析した。Mascot(Matrix Science,London,UK;バージョン2.5.1)を使用して、クロマトグラムを整列させ、ペプチドの特定のためにMS/MSデータを抽出した。Mascotは、消化酵素トリプシンを仮定して、QMCペプチド配列及びSwissProtデータベース(Homo sapiensについて選択)を含むカスタムデータベースであるcRAPデータベースを検索するように設定した。Mascotは、0.06Daのフラグメントイオン質量許容度及び15PPMの親イオン許容度を用いて検索した。アスパラギン及びグルタミンの脱アミド化、メチオニンの酸化、リジンのアセチル、リジンのプロピオニル及びシステインのカルバミドメチル化を可変性修飾としてMascotで指定した。FDR<1%を使用して特定されたペプチドを抽出し、ピークの割り当てのためにProgenesisにインポートし直した。少なくとも2つのユニークなペプチド及び20のMascotスコアを有するタンパク質のみをさらなる分析に使用した。ペプチド及びタンパク質の定量化は、試料全体にわたって、正規化のために合成対照ペプチドを使用した。すべてのMSの実施は、Donald Danforth Plant Science Center for Proteomics and Mass Spectrometry及びUniversity of Nebraska,LincolnのProteomics and Metabolomics facilityで行った。
データプロット及び統計:すべてのプロテオミクス傾向プロットは、Evol Scienceスイート(ES)を使用して構築した。ボルケーノプロットは、発現比と統計的有意性の両方によって、データポイントを2軸で視覚的に分離する働きをする。これによって、所与の比較内で最も重要な差次的発現タンパク質を決定する単純な方法が可能になる。各タンパク質について、比較される各実験から反復値を集めて、値の2つの分布を作成する。値の2つの独立した試料間で、同一平均のスチューデントのt検定を使用して、分布を比較し、統計的有意性のP値を生成する。次いで、P値の−log10を用いて、グラフ表示にY座標を提供する。X座標、すなわち比は、所与の実験について、反復比の値の平均のlog10によって与えられる。組み合わせ指数の計算、Fa−CIプロット及びアイソボログラムは、Chou−Tulalay方法を使用して、Compusynソフトウェアプログラムを使用して構築した。コロニー形成アッセイを表すすべてのプロットは、Prism7ソフトウェア(Graphpad.com)を使用して構築した。二元配置ANOVA検定を使用して、p値を計算した。
ウエスタンブロッティング:細胞を回収し、PBS中で洗浄し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含むNP40溶解バッファー(1%NP40/PBS/10%グリセロール)中で溶解した。Total−Protein−Assay−kit(ITSI Biosciences;K−0014−20)を用いてタンパク質濃度を決定し、次いで、SDSサンプルバッファーを可溶化液に加えた。50ugの煮沸した可溶化液をSDS−PAGEによって分離し、次いで、Immobilon P膜(Millipore;IPVH00010)にトランスファーした。免疫ブロットに使用するPHGDH抗体はAbcam(ab211365)から入手した。免疫ブロットに使用するα−チューブリン抗体はAbcam(ab7291)から入手した。α−チューブリンは、いかなる細胞株または薬物処理においてもその発現が変動しなかったので、ローディングコントロールとして使用した。
実施例3:ゲムシタビンは、膵臓癌患者由来の細胞及びATCC樹立細胞株をベムラフェニブまたはダブラフェニブに対して感受性にする。20,000個の細胞をプレーティングして、3D−スフェロイド増殖アッセイ(Corning4515スフェロイドプレート)中で増殖させた。すべてのスフェロイドが少なくとも500μmの直径がであった2日後に、ゲムシタビンを加えた。翌日ゲムシタビンを洗い落とし、3日目(プレーティング後3日目)にBRAF阻害剤を加えた。CTG3D細胞生存率アッセイをプレーティング後5日目(すなわち、5日目、n=2)に行った。図15のデータが図示するように、DNA損傷剤、例えばゲムシタビンによる細胞の前処理は、膵臓癌細胞をBRAF阻害剤に対して感受性にし、その増殖を阻害するだけでなく、細胞死も導く。これは、これらの細胞をこの組み合わせで死滅させることができるという、驚くべき、予想外の効果であった。
実施例4:カンプトテシンはBRAF阻害剤と相乗効果を示す。一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、SK−MEL−28VR1転移性黒色腫細胞において、カンプトテシンとダブラフェニブまたはベムラフェニブの間で有意な相乗効果が示された(図16)。カンプトテシンはトポイソメラーゼ1阻害剤であり、DNA損傷剤である。コロニー形成アッセイは、Chou Talalayの一定比CI計算に対応するように設定した。単一カンプトテシン処理の開始用量は150nMであり、ベムラフェニブは100μMであり、ダブラフェニブは100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、カンプトテシン対いずれかのBRAF阻害剤の比は1対66.7であり、カンプトテシンの開始用量として150nM及びBRAF阻害剤の開始用量として10μMを用いた。0日目に、24ウェルプレートのウェルあたり400個の細胞をプレーティングした。1日目にカンプトテシンを加え、2日目に洗い落とした。2日目のカンプトテシン洗浄後に、いずれかのBRAF阻害剤、ベムラフェニブ(図16A及び16B)またはダブラフェニブ(図16C及び16D)を加えた。4日目にBRAF阻害剤を洗い落とし、コロニーを7日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。図16Aは、カンプトテシンとベムラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図16Bは、カンプトテシンとベムラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のアイソボログラムである。図16Cは、カンプトテシンとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図16Dは、カンプトテシンとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のアイソボログラムである。全体として、これらの結果は、カンプトテシン+ベムラフェニブとカンプトテシン+ダブラフェニブの両方の組み合わせ処理の転移性黒色腫に対する治療的可能性を明らかに示す。キノリンアルカロイド、例えばカンプトテシンとBRAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例5:メトトレキサートはとエンコラフェニブ相乗効果を示す
3Dスフェロイド増殖アッセイから得られた一定比組み合わせ指数(CI)の計算は、SK−MEL−28VR1転移性黒色腫細胞において、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で有意な相乗効果を示した(図17)。メトトレキサートは葉酸代謝拮抗薬であり、DNA損傷剤である。エンコラフェニブは、BRAF V600E変異黒色腫細胞においてセネッセンス及びオートファジーを誘導することが既知であるBRAF阻害剤である。他のBRAF阻害剤と同様に、エンコラフェニブは、BRAF WTバックグラウンドにおいてMAPK経路を逆説的に活性化する。スフェロイド増殖アッセイは、Chou Talalayの一定比CI計算に対応するように設定した。単一メトトレキサート処理の開始用量は200nMであり、エンコラフェニブは100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対エンコラフェニブの比は1対25であり、メトトレキサートの開始用量として200nMを用い、エンコラフェニブの開始用量として5μMを用いた。96ウェルスフェロイドプレート(Corning4515)のウェルあたり5,000個の細胞をプレーティングした。スフェロイド増殖が少なくとも500μmの直径に一旦達したら、メトトレキサート及びエンコラフェニブを加えた。細胞を96時間インキュベートした。続いて、CTG3Dアッセイを行って、スフェロイド増殖を評価した。図17Aは、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図17Bは、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のアイソボログラムである。全体として、図17は、メトトレキサート+エンコラフェニブの組み合わせ処理の転移性黒色腫に対する治療的可能性を明らかに示す。メトトレキサートとBRAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
3Dスフェロイド増殖アッセイから得られた一定比組み合わせ指数(CI)の計算は、SK−MEL−28VR1転移性黒色腫細胞において、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で有意な相乗効果を示した(図17)。メトトレキサートは葉酸代謝拮抗薬であり、DNA損傷剤である。エンコラフェニブは、BRAF V600E変異黒色腫細胞においてセネッセンス及びオートファジーを誘導することが既知であるBRAF阻害剤である。他のBRAF阻害剤と同様に、エンコラフェニブは、BRAF WTバックグラウンドにおいてMAPK経路を逆説的に活性化する。スフェロイド増殖アッセイは、Chou Talalayの一定比CI計算に対応するように設定した。単一メトトレキサート処理の開始用量は200nMであり、エンコラフェニブは100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対エンコラフェニブの比は1対25であり、メトトレキサートの開始用量として200nMを用い、エンコラフェニブの開始用量として5μMを用いた。96ウェルスフェロイドプレート(Corning4515)のウェルあたり5,000個の細胞をプレーティングした。スフェロイド増殖が少なくとも500μmの直径に一旦達したら、メトトレキサート及びエンコラフェニブを加えた。細胞を96時間インキュベートした。続いて、CTG3Dアッセイを行って、スフェロイド増殖を評価した。図17Aは、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図17Bは、メトトレキサート及びエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のアイソボログラムである。全体として、図17は、メトトレキサート+エンコラフェニブの組み合わせ処理の転移性黒色腫に対する治療的可能性を明らかに示す。メトトレキサートとBRAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例6:BRAF阻害剤とDNA損傷剤とタキサンの組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる
一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、ヒト膵臓癌細胞株(BxPCM1;図18A)、マウスKPC膵臓癌モデル細胞株(KPC FC1242;図18B)または患者由来の膵臓癌細胞株(PNX001;図18C)において、ゲムシタビンとパクリタキセル/アブラキサンとBRAF阻害剤(ダブラフェニブまたはエンコラフェニブ)の間で有意な相乗効果が示された。タキソールとして販売されているパクリタキセルは、膵臓癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌及び卵巣癌を含めた多発癌治療するのに使用される化学療法剤である。アブラキサンは、アルブミン粒子に結合しているパクリタキセル(nab−パクリタキセル)の商品名である。ゲムシタビン+アブラキサンの組み合わせは、現在、米国において>60%の切除不能な膵臓癌患者に与えられる第一選択治療剤である。コロニー形成アッセイは、Chou Talalayの一定比CI計算に対応するように設定した。
一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、ヒト膵臓癌細胞株(BxPCM1;図18A)、マウスKPC膵臓癌モデル細胞株(KPC FC1242;図18B)または患者由来の膵臓癌細胞株(PNX001;図18C)において、ゲムシタビンとパクリタキセル/アブラキサンとBRAF阻害剤(ダブラフェニブまたはエンコラフェニブ)の間で有意な相乗効果が示された。タキソールとして販売されているパクリタキセルは、膵臓癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌及び卵巣癌を含めた多発癌治療するのに使用される化学療法剤である。アブラキサンは、アルブミン粒子に結合しているパクリタキセル(nab−パクリタキセル)の商品名である。ゲムシタビン+アブラキサンの組み合わせは、現在、米国において>60%の切除不能な膵臓癌患者に与えられる第一選択治療剤である。コロニー形成アッセイは、Chou Talalayの一定比CI計算に対応するように設定した。
BxPC3M1(図18A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、パクリタキセルは40nMであり、エンコラフェニブは100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対エンコラフェニブの比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、エンコラフェニブの開始用量として5μMを用いた。パクリタキセル対エンコラフェニブの比は1対250であり、パクリタキセルの開始用量として20nMを用い、エンコラフェニブの開始用量として5μMを用いた。
KPC FC1242(図18B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は50nMであり、パクリタキセルは100nMであり、ダブラフェニブは100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ダブラフェニブの比は1対400であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、ダブラフェニブの開始用量として10μMを用いた。パクリタキセル対ダブラフェニブの比は1対500であり、パクリタキセルの開始用量として20nMを用い、ダブラフェニブの開始用量として10μMを用いた。
PNX001(図18C)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は10nMであり、アブラキサンは20nMであり、ダブラフェニブは100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ダブラフェニブの比は1対1000であり、ゲムシタビンの開始用量として10nMを用い、ダブラフェニブの開始用量として10μMを用いた。アブラキサン対ダブラフェニブの比は1対4000であり、アブラキサンの開始用量として2.5nMを用い、ダブラフェニブの開始用量として10μMを用いた。ゲムシタビン及びアブラキサンの投与を繰り返して、二重処理曲線を得た(図18C)。0日目に、24ウェルプレートのウェルあたり400個の細胞をプレーティングした。ゲムシタビン及びパクリタキセル/アブラキサンを1日目に加え、これを2日目に洗い落とした。
2日目にゲムシタビン及びパクリタキセル/アブラキサンを洗い落とした後に、BRAF阻害剤のエンコラフェニブ(図18A)またはダブラフェニブ(図18B及び18C)のいずれかを加えた。4日目にBRAF阻害剤を洗い落とし、コロニーを7日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。図18Aは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとパクリタキセルとエンコラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図18Bは、マウスKPC膵臓癌細胞株(KPC FC1242)においてゲムシタビンとパクリタキセルとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図18Cは、ヒト患者由来の膵臓癌細胞株(PNX001)においてゲムシタビンとアブラキサンとダブラフェニブの間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。重要なことに、図18Cは、ゲムシタビン+アブラキサン処理に応答しないが、ゲムシタビン+アブラキサン+ダブラフェニブの組み合わせ処理には応答する患者由来の細胞株を示す。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン+パクリタキセル/アブラキサン+BRAF阻害剤の組み合わせ処理の膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びDNA損傷剤、例えばゲムシタビンとタキサン、例えばパクリタキセル/アブラキサンとBRAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例7:BRAF阻害剤とDNA損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1;図19A及び19B、501mel;図20A及び20B)ならびに膵臓癌細胞株(Panc1;図21A及び21B、BxPC3M1;図22A及び22B)において、ゲムシタビンとBRAF阻害剤GDC0879またはAD80の間で有意な相乗効果が示された。
SK−MEL−28VR1(図19A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、GDC0879は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対GDC0879の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、GDC0879の開始用量として5μMを用いた。
SK−MEL−28VR1(図19B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、AD80は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対AD80の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、AD80の開始用量として5μMを用いた。
501mel(図20A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、GDC0879は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対GDC0879の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、GDC0879の開始用量として5μMを用いた。
501mel(図20B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、AD80は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対AD80の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、AD80の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図21A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、GDC0879は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対GDC0879の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、GDC0879の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図21B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、AD80は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対AD80の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、AD80の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図21A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、GDC0879は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対GDC0879の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、GDC0879の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図21B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、AD80は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対AD80の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、AD80の開始用量として5μMを用いた。
2日目にゲムシタビンを洗い落とした後に、BRAF阻害剤GDC0879(図19A、20A、21A及び22A)またはAD80(図19B、20B、21B及び22B)のいずれかを加えた。4日目にBRAF阻害剤を洗い落とし、コロニーを7日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。図19Aは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとGDC0879の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図19Bは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとAD80の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図20Aは、ヒト転移性黒色腫細胞株(501mel)においてゲムシタビンとGDC0879の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図20Bは、ヒト転移性黒色腫細胞株(501mel)においてゲムシタビンとAD80の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図21Aは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてゲムシタビンとGDC0879の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図21Bは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてゲムシタビンとAD80の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図22Aは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとGDC0879の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図22Bは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとAD80の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン+BRAF阻害剤の組み合わせ処理の転移性黒色腫及び膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びDNA損傷剤、例えばゲムシタビンとBRAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの、増殖性非応答性腫瘍細胞株を阻害できる相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例8:CRAF阻害剤とDNA損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。以下の実施例は、CRAF阻害剤も以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができることを示す。一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1;図23A及び23Bならびに501mel;図24A及び24B)ならびに膵臓癌細胞株(Panc1;図25A及び25B、BxPC3M1;図26A及び26B)において、ゲムシタビンとCRAF阻害剤ZM336372及びNVPBHG712の間で有意な相乗効果が示された。
SK−MEL−28VR1(図23A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、ZM336372は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ZM336372の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、ZM336372の開始用量として5μMを用いた。
SK−MEL−28VR1(図23B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、NVPBHG712は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対NVPBHG712の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、NVPBHG712の開始用量として5μMを用いた。
501mel(図24A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、ZM336372は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ZM336372の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、ZM336372の開始用量として5μMを用いた。
501mel(図24B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、NVPBHG712は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対NVPBHG712の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、NVPBHG712の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図25A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、ZM336372は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ZM336372の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、ZM336372の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図25B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、NVPBHG712は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対NVPBHG712の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、NVPBHG712の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図26A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、ZM336372は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対ZM336372の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、ZM336372の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図26B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、NVPBHG712は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対NVPBHG712の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、NVPBHG712の開始用量として5μMを用いた。
2日目にゲムシタビンを洗い落とした後に、CRAF阻害剤ZM336372(図23A、24A、25A及び26A)またはNVPBHG712(図23、24B、25B及び26B)のいずれかを加えた。4日目にCRAF阻害剤を洗い落とし、コロニーを7日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。図23Aは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとZM336372の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図23Bは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとZM336372の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図24Aは、ヒト転移性黒色腫細胞株(501mel)においてゲムシタビンとZM336372の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図24Bは、ヒト転移性黒色腫細胞株(501mel)においてゲムシタビンとZM336372の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図25Aは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてゲムシタビンとZM336372の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図25Bは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてゲムシタビンとNVPBHG712の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図26Aは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとZM336372の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図26Bは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとZM336372の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン+CRAF阻害剤組み合わせ処理の転移性黒色腫及び膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びDNA損傷剤、例えばゲムシタビンとCRAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例9:汎RAF阻害剤とDNA損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。以下の実施例は、汎RAF阻害剤も以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができることを示す。一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1;図27A及び27Bならびに501mel;図28A及び28B)ならびに膵臓癌細胞株(Panc1;図29A及び29B、BxPC3M1;図30A及び30B)においてゲムシタビンと汎RAF阻害剤RAF265及びTAK632の間で有意な相乗効果が示された。
SK−MEL−28VR1(図27A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、RAF265は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対RAF265の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、RAF265の開始用量として5μMを用いた。
SK−MEL−28VR1(図27B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、TAK632は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対TAK632の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、TAK632の開始用量として5μMを用いた。
501mel(図28A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、RAF265は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対RAF265の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、RAF265の開始用量として5μMを用いた。
501mel(図28B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、TAK632は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対TAK632の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、TAK632の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図29A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、RAF265は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対RAF265の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、RAF265の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図29B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、TAK632は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対TAK632の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、TAK632の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図30A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、RAF265は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対RAF265の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、RAF265の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図30B)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、TAK632は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対TAK632の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、TAK632の開始用量として5μMを用いた。
2日目にゲムシタビンを洗い落とした後に、汎RAF阻害剤RAF265(図27A、28A、29A及び30A)またはTAK632(図27B、28B、29B及び30B)のいずれを加えた。4日目に汎RAF阻害剤を洗い落とし、コロニーを7日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。図27Aは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとRAF265の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図27Bは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとTAK632の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図28Aは、ヒト転移性黒色腫細胞株(501mel)においてゲムシタビンとRAF265の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図28Bは、ヒト転移性黒色腫細胞株(501mel)においてゲムシタビンとTAK632の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図29Aは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてゲムシタビンとRAF265の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図29Bは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてゲムシタビンとTAK632の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図30Aは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとRAF265の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図30Bは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとTAK632の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビン+汎RAF阻害剤の組み合わせ処理の転移性黒色腫及び膵臓癌に対する治療的可能性を明らかに示す。ヌクレオシド類似体及びDNA損傷剤、例えばゲムシタビンと汎RAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例10:BRAFキナーゼのDFG−out(不活性)コンフォメーションに結合する選択的BRAF阻害剤(第2世代BRAF阻害剤)とDNA損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1;図31A及び31B)、膵臓癌細胞株(Panc1;図32A及び32B、BxPC3M1;図33A及び33B)、結腸癌細胞株(SW620;図34A及び34B)ならびに肺癌細胞株(A549;図35A及び35B)において、ゲムシタビンまたはメトトレキサートとBRAF阻害剤XP102(BI882370として以前に知られている)の間で有意な相乗効果が示された。
SK−MEL−28VR1(図31A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対XP102の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
SK−MEL−28VR1(図31B)については、単一メトトレキサート処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対XP102の比は1対200であり、メトトレキサートの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図32A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対XP102の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
Panc1(図32B)については、単一メトトレキサート処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対XP102の比は1対200であり、メトトレキサートの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図33A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対XP102の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
BxPC3M1(図33B)については、単一メトトレキサート処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対XP102の比は1対200であり、メトトレキサートの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
SW620(図34A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対XP102の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
SW620(図34B)については、単一メトトレキサート処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対XP102の比は1対200であり、メトトレキサートの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
A549(図35A)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対XP102の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
A549(図35B)については、単一メトトレキサート処理の開始用量は150nMであり、XP102は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、メトトレキサート対XP102の比は1対200であり、メトトレキサートの開始用量として25nMを用い、XP102の開始用量として5μMを用いた。
2日目にゲムシタビン(図31A、32A、33A、34A及び35A)またはメトトレキサート(図31B、32B、33B、34B及び35B)を洗い落とした後に、XP102を加えた。4日目にXP102を洗い落とし、コロニーを7日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。図31Aは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図31Bは、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)において、メトトレキサートとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図32Aは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてゲムシタビン及びXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図32Bは、ヒト膵臓癌細胞株(Panc1)においてメトトレキサートとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図33Aは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてゲムシタビンとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図33Bは、ヒト膵臓癌細胞株(BxPC3M1)においてメトトレキサートとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図34Aは、ヒト結腸癌細胞株(SW620)においてゲムシタビンとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図34Bは、ヒト結腸癌細胞株(SW620)においてメトトレキサートとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図35Aは、ヒト肺癌細胞株(A549)においてゲムシタビンとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。図35Bは、ヒト肺癌細胞株(A549)においてメトトレキサートとXP102の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。全体として、これらの結果は、ゲムシタビンまたはメトトレキサート+XP102の組み合わせ処理の転移性黒色腫、膵臓癌、結腸癌及び肺癌に対する治療的可能性を明らかに示す。がん、例えば非応答性腫瘍に由来する細胞株の治療における、DNA損傷剤、例えばゲムシタビンまたはメトトレキサートと選択的第2世代BRAF阻害剤、例えば本明細書に記載のものとの組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
実施例11:MEK阻害剤とDNA損傷剤の組み合わせは、以前に治療に非応答性であったがんを治療するのに使用することができる。一定比組み合わせ指数(CI)の計算によって、転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1;図36)において、ゲムシタビンとMEK阻害剤E6201の間で有意な相乗効果が示された。
SK−MEL−28VR1(図36)については、単一ゲムシタビン処理の開始用量は150nMであり、E6201は100μMであった。用量は、3連で、連続したウェル中で、一定比で1/2、1/4、1/8、1/16及び1/32に累進的に低減させた。組み合わせ処理については、ゲムシタビン対E6201の比は1対200であり、ゲムシタビンの開始用量として25nMを用い、E6201の開始用量として5μMを用いた。
2日目にゲムシタビン(図36)を洗い落とした後に、E6201を加えた。4日目にE6201を洗い落とし、コロニーを7日間させてから、以前に記載された定量化のために、これを固定し(10%メタノール+10%酢酸)、クリスタルバイオレット(20%エタノール中に0.4%)で染色した。図36は、ヒト転移性黒色腫細胞株(SK−MEL−28VR1)においてゲムシタビンとE6201の間で相乗効果を示す、一定比のFaCIプロットである。この結果は、ゲムシタビン+E6201の組み合わせ処理の転移性黒色腫に対する治療的可能性を明らかに示す。DNA損傷剤、例えばゲムシタビンとMEK阻害剤、例えばE6201の組み合わせの相乗効果は、驚くべきことであり、予想外であった。
結論として、本明細書で提供される阻害剤の組み合わせ、例えば、DNA損傷剤、例えば、限定されないが、ゲムシタビン、メトトレキサートまたはカンプトテシンなどと組み合わせた、異なるタイプのBRAF、CRAF、汎RAF、MEK阻害剤及びBRAFキナーゼのDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、エンコラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480またはXP102は、これらのクラスの化合物に非感受性であると以前に思われていた耐性がん細胞株をこれらの阻害剤に対して感受性にすることが分かった。これらの組み合わせを、他のタイプの阻害剤、例えば、タキサン、MEK阻害剤またはEGFR阻害剤を加えて増強させることもできる。結果は、これらの組み合わせが、BRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤のいずれにも特異的でなく、本明細書で記載され、例示されるような様々なBRAF、CRAFまたは汎RAF阻害剤の全体にわたって使用することができるも示す。これらの結果は、驚くべきことであり、予想外であり、治療の選択肢がほとんどなかったがんに対して新しい治療を可能にする。
本明細書に記載の実施形態を実施例を参照して説明してきたが、それらの趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることを当業者は認識する。
本明細書で参照される及び/または出願データシート中に列挙される、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Claims (44)
- 対象において腫瘍を治療する方法であって、DNA損傷剤、ならびにBRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記阻害剤が、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が、二本鎖切断(DSB)を引き起こす薬剤、一本鎖切断を引き起こす薬剤、代謝拮抗剤、DNA架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体またはアルキル化剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、5−FU、シタラビン、メトトレキサート、ピリメタミン、ブレオマイシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ビノレルビン、ミトキサントロン、ポドフィロトキシン、アフィディコリン、フォテムスチン、カルムスチン、S−23906、S39、SN−38、トポテカン、カンプトテシン、レベッカマイシンまたはそれらのいずれかの医薬的に許容可能な塩である、請求項3に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシン及び/またはピリメタミンあるいはその医薬的に許容可能な塩である、請求項3に記載の方法。
- 前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記DNA損傷剤が、順次、同時に、または重複して投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤が前記対象に投与されるより前に、前記DNA損傷剤が前記対象に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が前記対象に投与されてから少なくとも1〜24時間後に、前記阻害剤が前記対象に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤が前記対象に投与される前に、前記対象が前記DNA損傷剤で前治療される、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記DNA損傷剤が経口的に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩及び前記DNA損傷剤が静脈内に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が経口的に投与され、前記DNA損傷剤が静脈内に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩が静脈内に投与され、前記DNA損傷剤が経口的に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、RAF265、AD80、GDC0879、AZ628、ZM336372、NVPBHG712、LY3009120、TAK632、MLN2480もしくはXP102またはその医薬的に許容可能な塩である、請求項3〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腫瘍が、膵臓腫瘍、黒色腫腫瘍、肺腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍または乳房腫瘍である、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が膵臓腫瘍である、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が黒色腫腫瘍である、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が転移性腫瘍である、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が野生型BRAFとして特徴づけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が野生型RASとして特徴づけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が変異BRAFとして特徴づけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が変異BRAF V600EまたはV600Kとして特徴づけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が変異RASとして特徴づけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が野生型BRAF及び変異RASとして特徴づけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が変異BRAF及び野生型RASとして特徴づけられる、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、約960mg、720mg、480mg、240mg、150mg、100mg、50mgもしくは25mg(1日2回)、または960mg、720mg、480mg、240mg、150mg、100mg、50mgもしくは25mg未満(1日2回)である、前記阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩の用量を投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が、約1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2の用量、または1250mg/m2、1000mg/m2、800mg/m2、600mg/m2、400mg/m2、200mg/m2、100mg/m2もしくは50mg/m2、25mg/m2、10mg/m2もしくは5mg/m2未満の用量で投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が、毎日、週2回、週3回、週4回、週5回、毎週、2週毎、3週毎または毎月投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が二本鎖切断DNA損傷剤またはその医薬的に許容可能な塩である、請求項27に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が、ゲムシタビン、メトトレキサート、カンプトテシンもしくはピリメタミンまたはそれらの医薬的に許容可能な塩である、請求項29に記載の方法。
- MEK阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA損傷剤が前記対象に投与された後に、前記MEK阻害剤または前記タキサンが前記対象に投与される、請求項31に記載の方法。
- MEK阻害剤またはタキサンを投与することをさらに含む、請求項2〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MEK阻害剤がトラメチニブであるか、前記タキサンがパクリタキセルまたはタンパク質結合パクリタキセルまたは本明細書に記載の他のタキサンである、請求項31に記載の方法。
- EGFR阻害剤を投与することをさらに含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記EGFR阻害剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブまたはエルロチニブである、請求項28に記載の方法。
- 前記対象において腫瘍サイズが低減される、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍サイズが約10、20、30、40、50、60、70、80、90または100%低減される、請求項37に記載の方法。
- 前記腫瘍が治療後にサイズを増大しない、請求項1に記載の方法。
- BRAF V600E変異もV600K変異も有しない腫瘍を有する対象を治療する方法であって、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を前記BRAF V600E変異もV600K変異も有しない前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 対象において転移性腫瘍を治療する方法であって、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を投与することを含む、前記方法。
- 薬物耐性腫瘍を治療する方法であって、BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を投与することを含む、前記方法。
- BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む、医薬組成物。
- BRAF阻害剤のDFG−out(不活性)コンフォメーションに対して特異的なBRAF阻害剤、CRAF阻害剤及び汎RAF阻害剤またはそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群から選択される阻害剤ならびにDNA損傷剤を含む、固定単位剤形。
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