CN104560877B

CN104560877B - 一种快速分离细胞外吐小体的方法

Info

Publication number: CN104560877B
Application number: CN201410794650.8A
Authority: CN
Inventors: 王森; 刘小龙; 刘景丰; 曾永毅
Original assignee: FUZHOU INFECTIOUS DISEASES HOSPITAL
Current assignee: FUZHOU INFECTIOUS DISEASES HOSPITAL
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: CN104560877A

Abstract

本发明涉及一种快速分离细胞外吐小体的方法。所述方法包括：收集活细胞培养上清，离心去除细胞碎片后，收集上清于截留分子量为100KD的超滤管中超滤10～15min，收集上清得到浓缩液，将浓缩液加入至体积为浓缩液体积4～10倍的含有0.1～0.2％(v/v)胎牛血清的pH9～12磷酸盐缓冲液中，在140000～150000g、4℃下超速离心70～90min，取沉淀，重悬于pH9～12的磷酸盐缓冲液中，即得所述外吐小体。本发明的有益效果主要体现在：1、分离时间短。2、得率高。3、纯度高。

Description

一种快速分离细胞外吐小体的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种快速分离细胞外吐小体的方法。

(二)背景技术

外吐小体(Exosome)是晚期核内体(也称为多囊泡体)与胞膜融合后分泌到细胞外的膜性小囊泡，直径在30～100nm之间。上世纪60年代Wolf等人首次在血浆中发现外吐小体，电镜下观察其外观呈特征性的“碟形”或“瘪球形”。外吐小体由活细胞分泌，外吐小体分泌至胞外后，能够通过脂筏(lipid raft)、网格蛋白(clathrin)、小窝蛋白(caveolin)等介导的细胞内吞作用被多种细胞重新吸收入胞内。在对转铁蛋白受体在网状细胞成熟过程中变化的研究中，人们偶然发现外吐小体具有转运蛋白的功能。此后，外吐小体中越来越多的组成分子被陆续报道，截止到2014年底，两个最大的外吐小体数据库，EVpedia和Vesiclepedia构建完成。两大数据库分别收录了通过高通量筛选研究得到的超过172,000和66,000个分子，其中包括蛋白质、mRNA、microRNA、脂质以及代谢分子。

在2007年，研究者首次发现外吐小体中包含具有功能的miRNA和mRNA，也叫做外吐小体穿梭RNA(esRNA)。随后，大量的研究表明外吐小体能够调控一系列的生物过程，包括癌症病理、组织修复以及母体同胎儿间细胞水平的交流。近期研究表明，癌细胞的外吐小体对癌症进程有着重要的调控作用，并且癌旁细胞的外吐小体能够对肿瘤病理进行深度的干预。

目前已知的从细胞上清中分离外吐小体的方法共有四类，分别是超速离心法、密度梯度离心法、ExoQuick-TC TM沉淀法、TEI沉淀法。

超速离心法是将细胞上清收集后在4℃、200g离心10分钟，然后使用0.45μm的滤膜进行过滤，使用 Plus-70(10KD)超滤管(Millipore，MA，USA)超滤20分钟，然后在4℃、100000g超速离心3小时得到外吐小体[Van Deun,J.,et al.,The impact ofdisparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNAprofiling.J Extracell Vesicles,2014.3.]。该方法外吐小体得率相对较高，成本也较低，但外吐小体纯度大约只有20％[Valadi,H.,et al.,Exosome-mediated transfer ofmRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange betweencells.Nat Cell Biol,2007.9(6):p.654-9.]，整个过程需3.5小时左右。

密度梯度离心法首先需要配置不同浓度的工作液(蔗糖/碘克沙醇溶液)，在分离管中分别铺入4ml40％、4ml 20％、4ml 10％、3.5ml 5％工作液，然后将浓缩过后的上清液加入分离管中，在4℃、100000g离心18小时得到外吐小体[Tauro,B.J.,et al.,Comparisonof ultracentrifugation,density gradient separation,and immunoaffinity capturemethods for isolating human colon cancer cell line LIM1863-derivedexosomes.Methods,2012.56(2):p.293-304.]。该方法能够得到较纯的外吐小体(约40％)，但是成本较高，且操作时间长，整个过程需要大约20小时。

ExoQuick-TC TM沉淀法是由System Biosciences公司提供的商用试剂盒，主要操作过程为将浓缩过后的上清液与等体积的ExoQuick-TCTM试剂混合，在4℃孵育12小时后在1500g转速下分别离心30分钟和5分钟得到外吐小体。该方法操作时间约为13小时，并且花费较贵。

TEI沉淀是Invitrogen公司的商用试剂盒Total Exosome IsolationTM，主要操作步骤为将浓缩过后的细胞上清与0.5体积的TEI试剂混合，在4℃孵育12小时候，10000g离心1小时得到外吐小体。该分离方法同样具有较高的成本，整个分离过程约为13.5小时。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有外吐小体分离方法的上述不足，提供一种既方便快捷、又能获得较高外吐小体纯度的分离细胞外吐小体的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种快速分离细胞外吐小体的方法，所述方法包括：收集活细胞(所述活细胞生物体来源为人或动物，经体外纯培养之后用于分离外吐小体)培养上清，离心去除细胞碎片后，加入终浓度分别为1～2mg/ml的RNA酶、6～8％(v/v)的甘油和6～7mM的山梨醇，之后使用真空离心浓缩仪于16～20℃、1500～2000g离心浓缩10～15min，得到浓缩液，将浓缩液加入至体积为浓缩液体积4～10倍的含有0.1～0.2％(v/v)胎牛血清的pH9～12磷酸盐缓冲液中，在140000～150000g、4℃下超速离心70～90min，取沉淀，重悬于pH9～12的磷酸盐缓冲液中，即得所述外吐小体。

本发明是对超速离心法的改进，通过调整前处理溶剂的成分以及超速离心的转速和时间，取得了意想不到的技术效果：与现有超速离心法相比，不仅仅大大缩短了时间，还提高了外吐小体纯度；与密度梯度离心法、ExoQuick-TC TM沉淀法和TEI沉淀法相比，具有操作时间短、成本低以及得率高等优点。

优选的，所述方法如下：收集活细胞培养上清，400g、4℃离心5min去除细胞碎片，加入终浓度分别为1mg/ml的RNA酶、6.5％的甘油和5.5mM的山梨醇，之后使用真空离心浓缩仪于16℃、1500g离心浓缩15min，得到浓缩液，将浓缩液加入至体积为浓缩液体积5倍的含有0.1％胎牛血清的pH 9磷酸盐缓冲液中，在150000g、4℃下超速离心70min，取沉淀，重悬于pH 9的磷酸盐缓冲液中，即得所述外吐小体。

所述活细胞优选为人癌细胞。

本发明的有益效果主要体现在：

1、分离时间短。本方法的分离时间总共约为1.5小时，而传统的超速离心法分离外吐小体需要3.5小时左右，可节约2小时；

2、得率高。通过电镜结果可以得知该方法分离的外吐小体相比于传统超速离心法有更高的得率；

3、纯度高。通过流式细胞仪检测结果可以看出，该方法分离的外吐小体纯度约为42％，比文献中报道的通过超速离心得到的外吐小体纯度高50％左右(文献中外吐小体纯度约为30％)。

(四)附图说明

图1为电镜下观察分离得到的外吐小体形态，标尺为100nm。A为本发明方法得到的外吐小体，B为文献方法得到的外吐小体。

图2为流式细胞仪检测外吐小体纯度，表面标记检测分子为CD9。A为本发明方法得到的外吐小体，B为文献方法得到的外吐小体。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：细胞外吐小体的分离

以人MHCC97H细胞为例(但本发明方法并不仅限于MHCC97H细胞)：

将5×10⁸MHCC97H细胞(复旦大学上海医学院，樊嘉课题组)接种于含有60ml培养基的T175(Corning，USA)细胞培养瓶中，培养基组成为DMEM(Dulbecco's Modified EagleMedium，Life technologies，USA)加上10％(v/v)的胎牛血清(FBS， LifeTechnologies，USA)。于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养48小时。

收集人肝癌细胞系MHCC97H细胞培养上清40mL，400g、4℃离心5min去除细胞碎片，加入终浓度分别为1mg/ml的RNA酶(Sigma，USA)、6.5％的甘油和5.5mM的山梨醇，之后使用真空离心浓缩仪(CentriVap，USA)于16℃、1500g离心浓缩15min，得到浓缩液(约2mL)，将浓缩液加入含有0.1％胎牛血清的磷酸盐缓(pH9)冲液10ml中，在150000g、4℃下超速离心70min，取沉淀，重悬于500uL碱性磷酸盐缓冲液(pH9)中，即得所述外吐小体。

电镜实验观察外吐小体形态和得率：

1.将分离得到的外吐小体加入被碳包裹的网格中；

2.用2％的福尔马林将其固定20分钟；

3.使用磷酸缓冲液清洗三次，每次10分钟；

4.外吐小体在2.5％的戊二醛中进行二次固定15分钟；

5.再次使用磷酸缓冲液清洗10分钟；

6.使用2％的乙酸双氧铀处理5分钟；

7.嵌入航油0.4％乙酸双氧铀处理和0.13％甲基纤维素的混合液中；

8.使用电子显微镜对其进行观察(Carl Zeiss NTS,Oberkochen,Germa ny)。

结果见图1。由图可见，使用本发明得到的外吐小体在100nm标尺电镜下呈现典型的“瘪球状”，且与已报到文献相比较[Valadi,H.,et al.,Exosome-mediated transfer ofmRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange betweencells.Nat Cell Biol,2007.9(6):p.654-9.](图B)，相同视野内(同为100nm标尺)，使用本发明方法分离的外吐小体得率更高。

流式细胞仪检测实验检测外吐小体纯度：

使用Invitrogen的Human CD9Flow Detection试剂盒(Cat No：10620D)对分离的外吐小体进行检测，具体步骤如下：

1.将试剂盒中磁珠放在振荡器上30秒使其混匀；

2.将20μl磁珠悬液加入至1ml分析液中(磷酸盐缓冲液+0.1％胎牛血清)；

3.将含有分析液和磁珠的EP管放在磁力架上1分钟，去除上清；

4.将磁珠重悬于90μl分析液中，并加入10μl经过超速离心富集的外吐小体；

5.4℃孵育12小时；

6.快速离心30秒后将EP管置于磁力架上1分钟，去除上清；

7.加入300μl分析液清洗磁珠后将EP管置于磁力架上1分钟，去除上清；

8.将粘附外吐小体的磁珠重悬于300μl分析液；

9.取出100μl粘附外吐小体的磁珠，分别加入20μlanti-human CD9-RPE抗体(BDCat.no.557352)以及mouse IgG1-RPE对照抗体(BD Cat.no.559320)；

10.37℃孵育1小时；

11.加入300μl分析液清洗磁珠后将EP管置于磁力架上1分钟，去除上清；

12.将粘附外吐小体的磁珠重悬于300μl分析液；

13.使用流式细胞仪进行分析。

结果见图2。CD9为外吐小体表面的特殊表达分子，被用来作为外吐小体的检测标志。本发明流式细胞仪检测分离得到的外吐小体表面分子CD9的表达，进而确定所得外吐小体的纯度为42％。结果显示，相比于文献已报到的分离外吐小体的纯度(图B，约30％)，本发明方法分离所得的外吐小体纯度较高。

Claims

1.一种快速分离细胞外吐小体的方法，所述方法包括：收集活细胞培养上清，离心去除细胞碎片后，加入终浓度分别为1～2mg/ml的RNA酶、6～8％的甘油和6～7mM的山梨醇，之后使用真空离心浓缩仪于16～20℃、1500～2000g离心浓缩10～15min，得到浓缩液，将浓缩液加入至体积为浓缩液体积4～10倍的含有0.1～0.2％胎牛血清的pH9～12磷酸盐缓冲液中，在140000～150000g、4℃下超速离心70～90min，取沉淀，重悬于pH9～12的磷酸盐缓冲液中，即得所述外吐小体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：收集活细胞培养上清，400g、4℃离心5min去除细胞碎片，加入终浓度分别为1mg/ml的RNA酶、6.5％的甘油和5.5mM的山梨醇，之后使用真空离心浓缩仪于16℃、1500g离心浓缩15min，得到浓缩液，将浓缩液加入至体积为浓缩液体积5倍的含有0.1％胎牛血清的pH 9磷酸盐缓冲液中，在150000g、4℃下超速离心70min，取沉淀，重悬于pH 9的磷酸盐缓冲液中，即得所述外吐小体。