CN103013932B - 一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的快速纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，特点是具体步骤如下：取患病死亡的三疣梭子蟹置于8-10倍体积的高盐TNE2缓冲液中，匀浆直至完全碎裂；将匀浆后的组织悬液分装离心管中，离心收集上清液，将离心所得沉淀再次匀浆离心，收集上清液；合并两次离心所得上清液经8000g，4℃离心20min，取上清液于4℃，35000g离心1.5h，将离心所得的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层白色沉淀部分重悬于TM2缓冲液中；将浸泡后的下层白色沉淀部分重新完全悬浮起来，4℃下3500g离心5min，取上清液于重复上一步步骤，得到的下层结实的纯白色部分即纯化病毒粒子.优点是高效、快速、简便、低成本。

Description

一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的快速纯化方法

技术领域

本发明涉及病毒的纯化方法，尤其是涉及一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的快速纯化方法。

背景技术

呼肠孤病毒（Reovirus）是一类宿主范围非常广泛的病毒，其宿主可涵盖哺乳动物、禽类、昆虫、水生动物等。水生呼肠孤病毒是感染水生生物的一类呼肠孤病毒。Meyers等于1979年首次从美国牡蛎中分离到了水生呼肠孤病毒。迄今为止分离鉴定出了40余株水生呼肠孤病毒，这种病毒主要通过呼吸、肠道感染宿主，导致出血病和肝脏与胰脏疾病，在全球范围内对水产养殖业造成了严重的威胁。水生呼肠孤病毒是水生动物中普遍存在的病毒，在鱼、虾、蟹中均有报道。

三疣梭子蟹是我国重要的水产养殖品种，在我国的江浙、两广、福建等地已经开始成功的规模化养殖。随着养殖规模的扩大，各种病害频繁爆发，三疣梭子蟹病害的病原有细菌、真菌、病毒和寄生虫等，有报道的能感染三疣梭子蟹的病毒主要是疱疹病毒科的疱疹状病毒（HLV）以及小RNA病毒科的小核糖核酸病毒，另外，还存在着对虾白斑病毒对三疣梭子蟹的感染情况。呼肠孤病毒作为水生动物病毒中宿主较广泛的病毒之一在蟹类中的发现早就已经见诸报道，但还没有在三疣梭子蟹中发现呼肠孤病毒的相关报道。实验室研究人员在对三疣梭子蟹养殖场中患病螃蟹进行病原检测的过程中，从患病的三疣梭子蟹体内检测到了呼肠孤病毒的存在，通过人工感染实验等研究确定其为秋冬季梭子蟹大量死亡的主要病原，该病毒给三疣梭子蟹的养殖带来了巨大的损失。因此对三疣梭子蟹呼肠孤病毒的致病机理及其防治展开及时深入的研究显得非常的紧迫。对三疣梭子蟹呼肠孤病毒展开一系列的研究总是存在着有效率生产病毒的需要，以便分离和纯化病毒蛋白，制备疫苗、或提供实验室研究的感染性病毒。另外，高效率的生产感染性病毒对病毒疾病的治疗的推动具有积极的作用。同时以本发明技术为基础，推广至各类蟹组织中病毒的快速纯化具有一定的应用价值。

目前在病毒纯化技术领域存在的问题主要有仪器设备与技术要求高，操作麻烦等特点。如在授权公告号为CN101098959A公开日期为2008年1月2日，发明名称为改进的病毒纯化方法中所描述的方法，涉及到了离子交换和大小排阻色谱等技术，离子交换需要不同树脂的离子交换柱，而且在过柱之前还要经过提取、过滤和浓缩等步骤，在基于大小差异来纯化病毒的方法中采用的大小排阻色谱柱使用前需要先使用阴离子交换柱，虽然经过这些方法纯化的病毒产率、纯度和规模都能达到良好的效果，但是设备要求很高、成本也不低，而且操作繁琐，不适合于一般实验室中使用。在一般常见的CsCl密度梯度超速离心与蔗糖密度超速离心等方法中对离心机的转速要求上也很严格。因此，现有的蟹类病毒纯化中存在着仪器设备要求高，操作麻烦、成本高等困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效、快速、简便、低成本的三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，采用多次差速离心的纯化方式纯化病毒，具体步骤如下：

(1) 取患病死亡的三疣梭子蟹解剖，取内脏与鳃剪碎后，置于预先冰浴过的8-10倍体积的高盐TNE2缓冲液中，匀浆直至完全碎裂；

(2) 将匀浆后的组织悬液分装于50ml离心管中，4℃ 6000g离心10min，收集上清液，将离心所得沉淀的用高盐TNE2缓冲液重悬，再次匀浆，4℃ 6000g 10min离心，收集上清液；将两次离心所得上清液合并；

(3) 将合并后的上清液经8000g，4℃ 离心20min，取上清液；

(4) 将步骤（3）得到上清液于4℃ ，35000g离心1.5h，将离心所得的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层白色沉淀部分重悬于1-3ml的TM2缓冲液中，4℃冰浴过夜；

(5) 将浸泡后的下层白色沉淀部分重新完全悬浮起来，4℃下3500g离心5min，弃去沉淀；取上清液于4℃下，38000g离心1.5h；将离心得到的沉淀上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层结实的纯白色部分即纯化的三疣梭子蟹呼肠孤病毒粒子。

所述的高盐TNE2缓冲液的各组分浓度为：50 mM Tris-HCl，400 mM NaCl，5 mM EDTA，1mM的蛋白酶抑制剂，pH为8.5。

所述的TM2缓冲液各组分浓度为：50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，260mM NaCl，1mM的蛋白酶抑制剂，pH 为7.5。由于梭子蟹是海洋生物，而且具有开放式循环系统，所以它用到的缓冲溶液盐离子浓度需要提高。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的快速纯化方法，采用多次差速离心的纯化方式纯化病毒，纯化的病毒结构完整、纯度高（图1）。 该方法具有操作简单、设备要求低（只需要匀浆器与高速离心机而不需要超速离心机等）、成本低廉、无特殊设备与试剂要求等优点。通过上述方法得到的三疣梭子蟹呼肠孤病毒能够用于病毒的分子生物学实验、抗体制备等实验要求。

附图说明

图1为纯化的三疣梭子蟹呼肠孤病毒的电镜结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

本发明一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，采用多次差速离心的纯化方式纯化病毒，具体步骤如下：

（1）取患病死亡的三疣梭子蟹解剖，取内脏与鳃等组织，用眼科剪剪碎后，置于预先冰浴过的8-10倍体积的高盐TNE2缓冲液中，匀浆直至完全碎裂；

（2）将匀浆后的组织悬液分装于50ml离心管中，4℃ 6000g离心10min，收集上清液；将离心得到的沉淀用高盐TNE2重悬，再次匀浆数分钟，4℃，6000g，10min离心，收集上清液，将两次离心所得上清液合并；

（3）将合并后的上清液经8000g，4℃ 离心20min，取上清液；

（4）将步骤（3）中的上清液于4℃ 38000g，离心1.5h，将离心得到的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层白色沉淀部分重悬于1-3ml的TM2缓冲液中，4℃冰浴过夜；

（5）将浸泡后的沉淀重新完全悬浮起来，4℃下3500g离心5min，将离心得到的上清液于4℃下38000g离心1.5h，将离心得到的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层结实的纯白色部分即纯化的三疣梭子蟹呼肠孤病毒。

取少量纯化后的病毒进行电镜检测（图1 见大量结构完整的病毒粒子，背景干净无杂质）。

在此具体实施例中高盐TNE2缓冲液各组分浓度为：50 mM Tris-HCl，400 mM NaCl，5 mM EDTA，pH为8.5，TM2缓冲液各组分浓度为：50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，260mM NaCl,pH 为7.5，两种缓冲液在使用过程中应及时添加终浓度为1mM的PMSF。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，其特征在于采用多次差速离心的纯化方式纯化病毒，具体步骤如下：

(1)取患病死亡的三疣梭子蟹解剖，取内脏与鳃剪碎后，置于预先冰浴过的8-10倍体积的高盐TNE2缓冲液中，匀浆直至完全碎裂；

(2)将匀浆后的组织悬液分装于50ml离心管中，4℃6000g离心10min，收集上清液，将离心所得沉淀的用高盐TNE2缓冲液重悬，再次匀浆数分钟，4℃6000g10min离心，收集上清液；将两次离心所得上清液合并；所述的高盐TNE2缓冲液的各组分浓度为：50mM Tris-HCl，400mM NaCl，5mM EDTA，1mM的蛋白酶抑制剂，pH为8.5；

(3)将合并后的上清液经8000g，4℃离心20min，取上清液；

(4)将步骤（3）得到上清液于4℃，35000g离心1.5h，将离心所得的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层白色部分重悬于1-3ml的TM2缓冲液中，4℃冰浴过夜；所述的TM2缓冲液各组分浓度为：50mM Tris-HCl，10mMMgCl₂，260mM NaCl,1mM的蛋白酶抑制剂，pH为7.5；

(5)将浸泡后的下层白色沉淀部分重新完全悬浮起来，4℃下3500g离心5min，弃去沉淀；取上清液于4℃下，38000g离心1.5h；将离心得到的沉淀上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层结实的纯白色部分即纯化的三疣梭子蟹呼肠孤病毒粒子。