JP2000262280A - ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 - Google Patents
ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法Info
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】ウィルス等を含有する培養液または細胞乳化液
等から簡易かつ短時間でウィルス等の活性を損なうこと
なく分離・精製することができるウィルス等の精製する
方法、およびかかる方法を用いたワクチンの製造方法を
提供する。 【解決手段】ウィルスまたはウィルス性抗原を含有する
試料をウィルスまたはウィルス性抗原を吸着可能な固相
担体として４００〜１３００℃で焼成されたハイドロキ
シアパタイトに接触させる工程と、固相担体に吸着した
ウィルスまたはウィルス性抗原を中性領域の溶出液を用
いて溶出する工程とを有することを特徴とする。ハイド
ロキシアパタイトは、球状の二次粒子であることが好ま
しい。また、溶出液としてリン酸系緩衝液を用いること
が好ましい。
等から簡易かつ短時間でウィルス等の活性を損なうこと
なく分離・精製することができるウィルス等の精製する
方法、およびかかる方法を用いたワクチンの製造方法を
提供する。 【解決手段】ウィルスまたはウィルス性抗原を含有する
試料をウィルスまたはウィルス性抗原を吸着可能な固相
担体として４００〜１３００℃で焼成されたハイドロキ
シアパタイトに接触させる工程と、固相担体に吸着した
ウィルスまたはウィルス性抗原を中性領域の溶出液を用
いて溶出する工程とを有することを特徴とする。ハイド
ロキシアパタイトは、球状の二次粒子であることが好ま
しい。また、溶出液としてリン酸系緩衝液を用いること
が好ましい。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、ウィルスまたはウ
ィルス性抗原を含有する培養液等から、ウィルスまたは
ウィルス性抗原を簡便に分離・精製する方法およびかか
る精製方法を用いたワクチンの製造方法に関するもので
ある。
ィルス性抗原を含有する培養液等から、ウィルスまたは
ウィルス性抗原を簡便に分離・精製する方法およびかか
る精製方法を用いたワクチンの製造方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】ウィルスまたはウィルス性抗原（以下
「ウィルス等」という）を含有する培養液、培地、宿主
細胞等からウィルス等の分離・精製は、遺伝子工学や臨
床診断およびワクチン製造の分野では重要なステップで
ある。一般に、培養液等に含まれるウィルス等は、それ
単独で存在するものではなく、培養細胞、夾雑タンパク
質等とともに存在しているため、培養液等からウィルス
等を分離・精製する必要がある。ウィルス等の分離・精
製は、超遠心分離法、密度勾配遠心法等により行われて
いたが、これらの方法は、高価で大がかりな装置を使用
し、また複雑な操作を要するため作業が非常に煩雑であ
った。
「ウィルス等」という）を含有する培養液、培地、宿主
細胞等からウィルス等の分離・精製は、遺伝子工学や臨
床診断およびワクチン製造の分野では重要なステップで
ある。一般に、培養液等に含まれるウィルス等は、それ
単独で存在するものではなく、培養細胞、夾雑タンパク
質等とともに存在しているため、培養液等からウィルス
等を分離・精製する必要がある。ウィルス等の分離・精
製は、超遠心分離法、密度勾配遠心法等により行われて
いたが、これらの方法は、高価で大がかりな装置を使用
し、また複雑な操作を要するため作業が非常に煩雑であ
った。
【０００３】一方、簡便にウィルスを抽出し得る方法と
してハイドロキシアパタイトを用いたカラムクロマトグ
ラフィーによる方法（Sumiaki Tsuru et.al.Bio-Medica
l Materials and Engineering Vol 1,pp.1-5 ,1991）が
研究されている。この方法によれば、ｐＨ７付近の溶出
液を用いてサンプル中のウィルス等を高い収率で抽出す
ることが可能であるとされている。
してハイドロキシアパタイトを用いたカラムクロマトグ
ラフィーによる方法（Sumiaki Tsuru et.al.Bio-Medica
l Materials and Engineering Vol 1,pp.1-5 ,1991）が
研究されている。この方法によれば、ｐＨ７付近の溶出
液を用いてサンプル中のウィルス等を高い収率で抽出す
ることが可能であるとされている。
【０００４】しかし、抽出されたウィルス等が夾雑タン
パク質と良好に分離されているとはいい難く、抽出した
ウィルス等をワクチンの製造等に使用する場合にはさら
に超遠心分離等を施すことが必要となり、純度の高いウ
ィルスを得るためにはさらなる精製工程を要するという
問題があった。
パク質と良好に分離されているとはいい難く、抽出した
ウィルス等をワクチンの製造等に使用する場合にはさら
に超遠心分離等を施すことが必要となり、純度の高いウ
ィルスを得るためにはさらなる精製工程を要するという
問題があった。
【０００５】さらに、ウィルスを精製する簡便な手段と
して、シリカを固相担体として使用するカラムクロマト
グラフィーが提案されている。この方法では培養液等の
生物材料から一段階でウィルスを抽出することが可能で
あるが、ｐＨ値の高い溶出液を使用していたため、ウィ
ルスの活性が損なわれ易く、活性を損なわずかつ効率よ
くウィルスを精製することは非常に困難であった。
して、シリカを固相担体として使用するカラムクロマト
グラフィーが提案されている。この方法では培養液等の
生物材料から一段階でウィルスを抽出することが可能で
あるが、ｐＨ値の高い溶出液を使用していたため、ウィ
ルスの活性が損なわれ易く、活性を損なわずかつ効率よ
くウィルスを精製することは非常に困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ウィ
ルス等を含有する培養液または細胞乳化液等から簡易か
つ短時間でウィルス等の活性を損なうことなく分離・精
製することができるウィルスまたはウィルス性抗原の精
製方法、およびかかる方法を用いたワクチンの製造方法
を提供することにある。
ルス等を含有する培養液または細胞乳化液等から簡易か
つ短時間でウィルス等の活性を損なうことなく分離・精
製することができるウィルスまたはウィルス性抗原の精
製方法、およびかかる方法を用いたワクチンの製造方法
を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このような目的は、下記
（１）〜（１６）の本発明により達成される。
（１）〜（１６）の本発明により達成される。
【０００８】（１） ウィルスまたはウィルス性抗原を
含有する試料を前記ウィルスまたはウィルス性抗原を吸
着可能な固相担体として４００〜１３００℃で焼成され
たハイドロキシアパタイトに接触させる工程と、前記固
相担体に吸着した前記ウィルスまたはウィルス性抗原を
中性領域の溶出液を用いて溶出する工程とを有すること
を特徴とするウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法。
含有する試料を前記ウィルスまたはウィルス性抗原を吸
着可能な固相担体として４００〜１３００℃で焼成され
たハイドロキシアパタイトに接触させる工程と、前記固
相担体に吸着した前記ウィルスまたはウィルス性抗原を
中性領域の溶出液を用いて溶出する工程とを有すること
を特徴とするウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法。
【０００９】（２） 前記ハイドロキシアパタイトは球
状の二次粒子である上記（１）に記載のウィルスまたは
ウィルス性抗原の精製方法。
状の二次粒子である上記（１）に記載のウィルスまたは
ウィルス性抗原の精製方法。
【００１０】（３） 前記ハイドロキシアパタイトは平
均粒径が１０〜１００μｍである上記（１）または
（２）に記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法。
均粒径が１０〜１００μｍである上記（１）または
（２）に記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法。
【００１１】（４） 前記ハイドロキシアパタイトは多
孔質粒子である上記（１）ないし（３）のいずれかに記
載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
孔質粒子である上記（１）ないし（３）のいずれかに記
載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
【００１２】（５） 前記溶出液として緩衝液を用いる
上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のウィルスま
たはウィルス性抗原の精製方法。
上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のウィルスま
たはウィルス性抗原の精製方法。
【００１３】（６） 前記緩衝液はリン酸系緩衝液であ
る上記（５）に記載のウィルスまたはウィルス性抗原の
精製方法。
る上記（５）に記載のウィルスまたはウィルス性抗原の
精製方法。
【００１４】（７） 前記ウィルスまたはウィルス性抗
原はその大きさが１０〜５００nmである上記（１）ない
し（６）のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性
抗原の精製方法。
原はその大きさが１０〜５００nmである上記（１）ない
し（６）のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性
抗原の精製方法。
【００１５】（８） 前記ウィルスまたはウィルス性抗
原は動物または培養細胞から得られるものである上記
（１）ないし（７）のいずれかに記載のウィルスまたは
ウィルス性抗原の精製方法。
原は動物または培養細胞から得られるものである上記
（１）ないし（７）のいずれかに記載のウィルスまたは
ウィルス性抗原の精製方法。
【００１６】（９） 前記ウィルスまたはウィルス性抗
原は哺乳類の脳細胞または神経細胞で増殖させたもので
ある上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のウィル
スまたはウィルス性抗原の精製方法。
原は哺乳類の脳細胞または神経細胞で増殖させたもので
ある上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のウィル
スまたはウィルス性抗原の精製方法。
【００１７】（１０） 前記ウィルスまたはウィルス性
抗原は鶏卵で増殖させたものである上記（１）ないし
（８）のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗
原の精製方法。
抗原は鶏卵で増殖させたものである上記（１）ないし
（８）のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗
原の精製方法。
【００１８】（１１） 前記ウィルスは培養細胞で増殖
させたものである上記（１）ないし（８）のいずれかに
記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
させたものである上記（１）ないし（８）のいずれかに
記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
【００１９】（１２） 前記ウィルスは日本脳炎ウィル
スである上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の
ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
スである上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の
ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
【００２０】（１３） 前記ウィルスはインフルエンザ
ウィルスである上記（１）ないし（１１）のいずれかに
記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
ウィルスである上記（１）ないし（１１）のいずれかに
記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。
【００２１】（１４） 前記ウィルスまたはウィルス性
抗原の精製はカラムクロマトグラフィーによる上記
（１）ないし（１３）のいずれかに記載のウィルスまた
はウィルス性抗原の精製方法。
抗原の精製はカラムクロマトグラフィーによる上記
（１）ないし（１３）のいずれかに記載のウィルスまた
はウィルス性抗原の精製方法。
【００２２】（１５） 前記溶出工程において溶出速度
が０．０５〜２ml/minである上記（１）ないし（１４）
のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精
製方法。
が０．０５〜２ml/minである上記（１）ないし（１４）
のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精
製方法。
【００２３】（１６） 上記（１）ないし（１５）のい
ずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法による精製工程と、前記精製工程により精製されたウ
ィルスまたはウィルス性抗原を不活性化する工程とを含
むことを特徴とするワクチンの製造方法。
ずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法による精製工程と、前記精製工程により精製されたウ
ィルスまたはウィルス性抗原を不活性化する工程とを含
むことを特徴とするワクチンの製造方法。
【００２４】
【発明の実施の形態】本発明は、ウィルスまたはウィル
ス性抗原を含有する試料をウィルスまたはウィルス性抗
原を吸着可能な固相担体として４００〜１３００℃で焼
成されたハイドロキシアパタイトに接触させる工程と、
固相担体に吸着したウィルスまたはウィルス性抗原を中
性領域の溶出液を用いて溶出する工程とを有することを
特徴とする。ここで、「中性領域」とはｐＨが６〜７．
５付近の領域を意味し、中性領域の溶出液を用いること
により、活性が維持されたウィルス等を高い純度で得る
ことができる。
ス性抗原を含有する試料をウィルスまたはウィルス性抗
原を吸着可能な固相担体として４００〜１３００℃で焼
成されたハイドロキシアパタイトに接触させる工程と、
固相担体に吸着したウィルスまたはウィルス性抗原を中
性領域の溶出液を用いて溶出する工程とを有することを
特徴とする。ここで、「中性領域」とはｐＨが６〜７．
５付近の領域を意味し、中性領域の溶出液を用いること
により、活性が維持されたウィルス等を高い純度で得る
ことができる。
【００２５】本発明では、固相担体として焼成温度４０
０〜１３００℃で焼成されたハイドロキシアパタイトが
用いられ、９５０〜１０５０℃で焼成されたハイドロキ
シアパタイトがより好ましい。かかる温度範囲で焼成さ
れたハイドロキシアパタイトは、ウィルス等に対し優れ
た吸着能を発揮し得る細孔径、気孔率等の気孔構造を備
え、試料中にウィルス等と共存する夾雑タンパク質等か
らウィルス等のみを効率よく分離・精製することができ
る。また、焼成によりハイドロキシアパタイトの強度が
向上し、例えばウィルス等を吸着する十分な細孔を有し
ながら崩れることがなく、さらにカラムクロマトグラフ
ィーによる精製過程で付加される圧力にも十分耐え得る
粒子とすることができる。
０〜１３００℃で焼成されたハイドロキシアパタイトが
用いられ、９５０〜１０５０℃で焼成されたハイドロキ
シアパタイトがより好ましい。かかる温度範囲で焼成さ
れたハイドロキシアパタイトは、ウィルス等に対し優れ
た吸着能を発揮し得る細孔径、気孔率等の気孔構造を備
え、試料中にウィルス等と共存する夾雑タンパク質等か
らウィルス等のみを効率よく分離・精製することができ
る。また、焼成によりハイドロキシアパタイトの強度が
向上し、例えばウィルス等を吸着する十分な細孔を有し
ながら崩れることがなく、さらにカラムクロマトグラフ
ィーによる精製過程で付加される圧力にも十分耐え得る
粒子とすることができる。
【００２６】ハイドロキシアパタイトの焼成温度が４０
０℃未満の場合、ハイドロキシアパタイトの有する吸着
能が過剰となり、後述する溶出工程においてウィルス等
の溶出を困難にしたり、夾雑タンパク質をも吸着するお
それがある。一方、焼成温度が１３００℃を超える場
合、ハイドロキシアパタイトが熱分解し、固相担体とし
て使用不可能となる場合がある。とくに、９５０〜１０
５０℃で焼成されたハイドロキシアパタイトは、形成さ
れる細孔の数が抑制され、夾雑タンパク質の吸着を制限
することができる。
０℃未満の場合、ハイドロキシアパタイトの有する吸着
能が過剰となり、後述する溶出工程においてウィルス等
の溶出を困難にしたり、夾雑タンパク質をも吸着するお
それがある。一方、焼成温度が１３００℃を超える場
合、ハイドロキシアパタイトが熱分解し、固相担体とし
て使用不可能となる場合がある。とくに、９５０〜１０
５０℃で焼成されたハイドロキシアパタイトは、形成さ
れる細孔の数が抑制され、夾雑タンパク質の吸着を制限
することができる。
【００２７】また、本発明で用いられるハイドロキシア
パタイトは球状の二次粒子であることが好ましい。球状
とすることにより、ハイドロキシアパタイトの単位体積
あたりの有効表面積を最も大きくすることができ、ウィ
ルスの吸着能の向上を図ることができる。さらに、カラ
ムクロマトグラフィーによる場合、カラム内にハイドキ
シアパタイトを高密度で最も効果的に充填することがで
き、より安定にウィルスの分離能が得られる。一方、高
密度で充填した状態であっても球状粒子とすることによ
って粒子間に間隙が形成され、緩衝液等の溶出液の通液
性を良好に維持することができる。
パタイトは球状の二次粒子であることが好ましい。球状
とすることにより、ハイドロキシアパタイトの単位体積
あたりの有効表面積を最も大きくすることができ、ウィ
ルスの吸着能の向上を図ることができる。さらに、カラ
ムクロマトグラフィーによる場合、カラム内にハイドキ
シアパタイトを高密度で最も効果的に充填することがで
き、より安定にウィルスの分離能が得られる。一方、高
密度で充填した状態であっても球状粒子とすることによ
って粒子間に間隙が形成され、緩衝液等の溶出液の通液
性を良好に維持することができる。
【００２８】ハイドロキシアパタイトは、平均粒径が１
０〜１００μｍであることが好ましく、４０〜８０μｍ
であることがより好ましい。粒径が１０μｍ未満の場
合、ハイドロキシアパタイト粒子の間隙をウィルス等が
通過することが困難となり、ハイドロキシアパタイトに
吸着する確率を低下させるおそれがある。一方、粒径が
１００μｍを超えると、粒子間隙が大きくなり過ぎ、ウ
ィルス等の通過速度が大きくなってハイドロキシアパタ
イトに吸着し難くなるおそれがある。また、粒子が大き
すぎるとハイドロキシアパタイトに対する試料の拡散や
系が平衡状態に達するまでの時間が長くなり、精製効率
が低下する場合がある。
０〜１００μｍであることが好ましく、４０〜８０μｍ
であることがより好ましい。粒径が１０μｍ未満の場
合、ハイドロキシアパタイト粒子の間隙をウィルス等が
通過することが困難となり、ハイドロキシアパタイトに
吸着する確率を低下させるおそれがある。一方、粒径が
１００μｍを超えると、粒子間隙が大きくなり過ぎ、ウ
ィルス等の通過速度が大きくなってハイドロキシアパタ
イトに吸着し難くなるおそれがある。また、粒子が大き
すぎるとハイドロキシアパタイトに対する試料の拡散や
系が平衡状態に達するまでの時間が長くなり、精製効率
が低下する場合がある。
【００２９】さらに、ハイドロキシアパタイトは多孔質
粒子であることが好ましい。ハイドロキシアパタイトに
細孔が殆どない緻密質粒子である場合、単位体積あたり
の表面積が小さく、ウィルスに対する十分な吸着能が得
られない場合がある。ハイドロキシアパタイトの球状二
次粒子は、例えば下記の方法により製造することができ
る。まず、公知の湿式法により得られたハイドロキシア
パタイトスラリーを直接噴霧乾燥することにより造粒
し、球状の二次粒子とすることができる。あるいは、ハ
イドロキシアパタイトスラリーに粘度調整剤、熱分解性
有機化合物粒子または繊維等の添加物を加え噴霧乾燥す
ることにより球状の二次粒子を造粒することができる。
そして、このように造粒された球状二次粒子を４００〜
１３００℃温度で焼成することにより多孔質の球状粒子
を得ることができる。
粒子であることが好ましい。ハイドロキシアパタイトに
細孔が殆どない緻密質粒子である場合、単位体積あたり
の表面積が小さく、ウィルスに対する十分な吸着能が得
られない場合がある。ハイドロキシアパタイトの球状二
次粒子は、例えば下記の方法により製造することができ
る。まず、公知の湿式法により得られたハイドロキシア
パタイトスラリーを直接噴霧乾燥することにより造粒
し、球状の二次粒子とすることができる。あるいは、ハ
イドロキシアパタイトスラリーに粘度調整剤、熱分解性
有機化合物粒子または繊維等の添加物を加え噴霧乾燥す
ることにより球状の二次粒子を造粒することができる。
そして、このように造粒された球状二次粒子を４００〜
１３００℃温度で焼成することにより多孔質の球状粒子
を得ることができる。
【００３０】精製されるウィルス等の大きさについて
は、特に限定されないが１０〜５００nm程度のものが好
ましい。この範囲の大きさのウィルス等は、本発明の方
法により良好に分離・精製することができる。精製され
るウィルスとしては、例えば大きさが約１００〜１２０
nmのインフルエンザウィルス、約４０〜５０nmの日本脳
炎ウィルス等が好ましく挙げられる。また、ウィルス性
抗原としては、例えばインフルエンザウィルス、日本脳
炎ウィルスの構造タンパク質等が挙げられる。
は、特に限定されないが１０〜５００nm程度のものが好
ましい。この範囲の大きさのウィルス等は、本発明の方
法により良好に分離・精製することができる。精製され
るウィルスとしては、例えば大きさが約１００〜１２０
nmのインフルエンザウィルス、約４０〜５０nmの日本脳
炎ウィルス等が好ましく挙げられる。また、ウィルス性
抗原としては、例えばインフルエンザウィルス、日本脳
炎ウィルスの構造タンパク質等が挙げられる。
【００３１】ウィルス等は、動物または培養細胞におい
て増殖させること等により得られるものを使用すること
ができる。より具体的には、例えば、哺乳類の脳細胞ま
たは神経細胞で増殖させたもの、鶏卵で増殖させたもの
および培養細胞で増殖させたもの等が好ましく挙げられ
る。このような系でウィルスを増殖させることにより、
大量かつ安定的にウィルスを得ることができる。さら
に、培養細胞を用いて増殖させた場合、不純物が比較的
少ない状態で培養することができ、ウィルスの精製をよ
り容易に行うことができる。
て増殖させること等により得られるものを使用すること
ができる。より具体的には、例えば、哺乳類の脳細胞ま
たは神経細胞で増殖させたもの、鶏卵で増殖させたもの
および培養細胞で増殖させたもの等が好ましく挙げられ
る。このような系でウィルスを増殖させることにより、
大量かつ安定的にウィルスを得ることができる。さら
に、培養細胞を用いて増殖させた場合、不純物が比較的
少ない状態で培養することができ、ウィルスの精製をよ
り容易に行うことができる。
【００３２】ハイドロキシアパタイトからなる固相担体
とウィルス等とを接触させる工程における具体的な操作
としては、使用する固相担体の形態やサンプルのボリュ
ーム等により適宜選択可能であり、例えば、試料中にハ
イドロキシアパタイト等を投入しウィルスを吸着させる
バッチ法や、試料をハイドロキシアパタイト等が充填さ
れたカラム内に添加する方法等が挙げられる。
とウィルス等とを接触させる工程における具体的な操作
としては、使用する固相担体の形態やサンプルのボリュ
ーム等により適宜選択可能であり、例えば、試料中にハ
イドロキシアパタイト等を投入しウィルスを吸着させる
バッチ法や、試料をハイドロキシアパタイト等が充填さ
れたカラム内に添加する方法等が挙げられる。
【００３３】次に、固相担体としてハイドロキシアパタ
イトに吸着させたウィルスを溶出する。本発明の方法に
おいて、溶出工程は中性領域の溶出液を用いて固相担体
から所望のウィルス等を溶離・回収する。例えば、カラ
ムクロマトグラフィーによる場合は、所望のウィルスを
含む画分（フラクション）を分取する。溶出液として中
性領域のものを使用することにより、ウィルス等を容易
に溶出させることができ、かつウィルス等の活性が損な
われたり、変性することを抑止することができる。
イトに吸着させたウィルスを溶出する。本発明の方法に
おいて、溶出工程は中性領域の溶出液を用いて固相担体
から所望のウィルス等を溶離・回収する。例えば、カラ
ムクロマトグラフィーによる場合は、所望のウィルスを
含む画分（フラクション）を分取する。溶出液として中
性領域のものを使用することにより、ウィルス等を容易
に溶出させることができ、かつウィルス等の活性が損な
われたり、変性することを抑止することができる。
【００３４】中性領域の溶出液としては、例えばｐＨ６
〜７．５の範囲において緩衝能を有する緩衝液が好まし
い。このような緩衝液としては、例えばリン酸系緩衝
液、酢酸ナトリウム−酢酸系緩衝液、酢酸ナトリウム−
塩酸系緩衝液、トリスアミノメタン系緩衝液等が挙げら
れるが、なかでもリン酸系緩衝液が好ましい。リン酸系
緩衝液は、ｐＨ＝７付近で緩衝作用を有する緩衝液とし
て用いることができ、ウィルス等の活性をより安定に保
持しながら分離・精製を行うことができる。
〜７．５の範囲において緩衝能を有する緩衝液が好まし
い。このような緩衝液としては、例えばリン酸系緩衝
液、酢酸ナトリウム−酢酸系緩衝液、酢酸ナトリウム−
塩酸系緩衝液、トリスアミノメタン系緩衝液等が挙げら
れるが、なかでもリン酸系緩衝液が好ましい。リン酸系
緩衝液は、ｐＨ＝７付近で緩衝作用を有する緩衝液とし
て用いることができ、ウィルス等の活性をより安定に保
持しながら分離・精製を行うことができる。
【００３５】なお、ウィルス等のハイドロキシアパタイ
トへの吸着工程から溶出工程に移行するまえに、試料中
に存在する培養細胞の破砕物、ウィルス粒子の一部、夾
雑タンパク質等であってハイドロキシアパタイトに吸着
しない不純物を可能な限り排除するために、予め塩濃度
の低い溶出液を用いて数回繰り返し洗浄しておくことが
好ましい。ウィルス等の溶出は、例えば緩衝液中の塩濃
度を増加させることにより行うことができる。緩衝液中
の塩濃度は、直線勾配または曲線勾配のいずれをもって
増加させるものであってもよい。これにより、吸着力の
弱いタンパク質類から溶出されるため、ハイドロキシア
パタイトに良好に吸着する所望のウィルス等を選択的に
分離することができる。
トへの吸着工程から溶出工程に移行するまえに、試料中
に存在する培養細胞の破砕物、ウィルス粒子の一部、夾
雑タンパク質等であってハイドロキシアパタイトに吸着
しない不純物を可能な限り排除するために、予め塩濃度
の低い溶出液を用いて数回繰り返し洗浄しておくことが
好ましい。ウィルス等の溶出は、例えば緩衝液中の塩濃
度を増加させることにより行うことができる。緩衝液中
の塩濃度は、直線勾配または曲線勾配のいずれをもって
増加させるものであってもよい。これにより、吸着力の
弱いタンパク質類から溶出されるため、ハイドロキシア
パタイトに良好に吸着する所望のウィルス等を選択的に
分離することができる。
【００３６】本発明のウィルス等の精製方法としては特
に限定されず、バッチ法やカラムクロマトグラフィー等
によることができるが、カラムクロマトグラフィーが好
ましい。カラムクロマトグラフィーによれば、ウィルス
等を高い収率、純度で精製することができ、さらにその
再現性に優れる。
に限定されず、バッチ法やカラムクロマトグラフィー等
によることができるが、カラムクロマトグラフィーが好
ましい。カラムクロマトグラフィーによれば、ウィルス
等を高い収率、純度で精製することができ、さらにその
再現性に優れる。
【００３７】カラムクロマトグラフィーによりウィルス
等の分離を行う場合、溶出工程における流速は、試料の
容量やカラムの容量等により適宜選択されるが、０．０
５〜２ml/min程度とすることが好ましく、０．１〜１ml
/min程度がより好ましい。流速が遅すぎる場合、溶出操
作に時間がかかりウィルスの活性を損なうおそれがあ
る。一方、流速が速すぎる場合、ウィルスの分離効率の
再現性が悪くなるおそれがある。
等の分離を行う場合、溶出工程における流速は、試料の
容量やカラムの容量等により適宜選択されるが、０．０
５〜２ml/min程度とすることが好ましく、０．１〜１ml
/min程度がより好ましい。流速が遅すぎる場合、溶出操
作に時間がかかりウィルスの活性を損なうおそれがあ
る。一方、流速が速すぎる場合、ウィルスの分離効率の
再現性が悪くなるおそれがある。
【００３８】また、本発明のワクチンの製造方法は、本
発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製工程と、該
精製工程により精製されたウィルスまたはウィルス性抗
原をを不活性化する工程とを含むことを特徴とする。本
発明の方法によれば、ウィルス等が高い純度で精製され
るため、他の微生物による汚染の危険性を極めて小さく
することができ、安全性の高いワクチンを製造すること
ができる。本発明の方法で精製されたウィルス等を不活
性化させる工程では、製造されるワクチンの種類に応じ
て種々の方法により不活性化を行うことができる。
発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製工程と、該
精製工程により精製されたウィルスまたはウィルス性抗
原をを不活性化する工程とを含むことを特徴とする。本
発明の方法によれば、ウィルス等が高い純度で精製され
るため、他の微生物による汚染の危険性を極めて小さく
することができ、安全性の高いワクチンを製造すること
ができる。本発明の方法で精製されたウィルス等を不活
性化させる工程では、製造されるワクチンの種類に応じ
て種々の方法により不活性化を行うことができる。
【００３９】以上、本発明のウィルスまたはウィルス性
抗原の精製方法およびワクチンの製造方法について説明
したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、例
えば、ウィルス等の精製においてハイドロキシアパタイ
ト粒子の表面に、目的のウィルスと生物特異的相互作用
を有するリガンドを担持させて固相担体として用いても
よい。
抗原の精製方法およびワクチンの製造方法について説明
したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、例
えば、ウィルス等の精製においてハイドロキシアパタイ
ト粒子の表面に、目的のウィルスと生物特異的相互作用
を有するリガンドを担持させて固相担体として用いても
よい。
【００４０】
【実施例】次に、本発明の具体的実施例について説明す
る。 １．ウィルスまたはウィルス性抗原の精製 （実施例１）各々温度４００℃、７００℃、１０００℃
で焼成して得られた粒径４０μｍのハイドロキシアパタ
イト粒子を固相担体として用いたカラムクロマトグラフ
ィーにより日本脳炎ウィルスを精製した。試料として、
日本脳炎ウィルスをマウス脳で増殖させた後その脳を採
取し、乳化した溶液（日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳
剤）を用いた。内径８mm、高さ２０mmのシリンジ内に設
置されたポアサイズ３５μｍのフィルタの上に、４００
℃および７００℃で焼成して得られたハイドロキシアパ
タイト粒子を各々０．４５ｇ、１０００℃で焼成して得
られたハイドロキシアパタイトを０．９ｇ充填した。こ
のように準備されたカラムに上記日本脳炎ウィルス感染
マウス脳乳剤０．１mlを添加した。
る。 １．ウィルスまたはウィルス性抗原の精製 （実施例１）各々温度４００℃、７００℃、１０００℃
で焼成して得られた粒径４０μｍのハイドロキシアパタ
イト粒子を固相担体として用いたカラムクロマトグラフ
ィーにより日本脳炎ウィルスを精製した。試料として、
日本脳炎ウィルスをマウス脳で増殖させた後その脳を採
取し、乳化した溶液（日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳
剤）を用いた。内径８mm、高さ２０mmのシリンジ内に設
置されたポアサイズ３５μｍのフィルタの上に、４００
℃および７００℃で焼成して得られたハイドロキシアパ
タイト粒子を各々０．４５ｇ、１０００℃で焼成して得
られたハイドロキシアパタイトを０．９ｇ充填した。こ
のように準備されたカラムに上記日本脳炎ウィルス感染
マウス脳乳剤０．１mlを添加した。
【００４１】次に、ｐＨ＝７のリン酸緩衝液を溶出液と
して用いて日本脳炎ウィルスの溶出を行った。溶出は、
リン酸緩衝液のリン酸濃度を１０mMから４００mMのリニ
アグラジエント濃度勾配で、流速０．５ml/minでカラム
内に供給することにより行った。カラムを通過した溶出
液を１mlづつのフラクションとして分取し、各フラクシ
ョン中の日本脳炎ウィルスの生物活性をＶｅｒｏ細胞
（アフリカミドリザルの腎臓）におけるPlaque assayに
より求めた。また、各フラクション中のタンパク質含有
量をＵＶ吸収スペクトル（２８０nm）により調べた。こ
れらの結果を図１〜図３に示す。さらに、各フラクショ
ン中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。
して用いて日本脳炎ウィルスの溶出を行った。溶出は、
リン酸緩衝液のリン酸濃度を１０mMから４００mMのリニ
アグラジエント濃度勾配で、流速０．５ml/minでカラム
内に供給することにより行った。カラムを通過した溶出
液を１mlづつのフラクションとして分取し、各フラクシ
ョン中の日本脳炎ウィルスの生物活性をＶｅｒｏ細胞
（アフリカミドリザルの腎臓）におけるPlaque assayに
より求めた。また、各フラクション中のタンパク質含有
量をＵＶ吸収スペクトル（２８０nm）により調べた。こ
れらの結果を図１〜図３に示す。さらに、各フラクショ
ン中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。
【００４２】図１〜図３およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
（図示せず）から明らかなように、いずれの場合も、夾
雑タンパク質のほとんどはハイドロキシアパタイトに吸
着されないか、または低濃度のリン酸緩衝液で流出し
た。一方、日本脳炎ウィルスはハイドロキシアパタイト
に強固に吸着され、高濃度のリン酸緩衝液で流出し夾雑
タンパク質と良好に分離された。また、溶出により日本
脳炎ウィルスは、フラクションＮｏ．８〜１０付近にお
いて感染性を保持したまま高純度・高収率で回収され
た。
（図示せず）から明らかなように、いずれの場合も、夾
雑タンパク質のほとんどはハイドロキシアパタイトに吸
着されないか、または低濃度のリン酸緩衝液で流出し
た。一方、日本脳炎ウィルスはハイドロキシアパタイト
に強固に吸着され、高濃度のリン酸緩衝液で流出し夾雑
タンパク質と良好に分離された。また、溶出により日本
脳炎ウィルスは、フラクションＮｏ．８〜１０付近にお
いて感染性を保持したまま高純度・高収率で回収され
た。
【００４３】（実施例２）実施例１と同様に、各々４０
０℃、７００℃、１０００℃で焼成して得られた粒径４
０μｍのハイドロキシアパタイト粒子を用いたカラムク
ロマトグラフィーにより、インフルエンザウィルス（ウ
ィルス性抗原）を精製した。試料として、インフルエン
ザウィルスを鶏卵で増殖させた後、かかる鶏卵から所定
の前処理を経て調製された溶液を用いた。実施例１と同
じリン酸緩衝液を流速０．１ml/minで供給し、カラムを
通過した溶出液を２mlづつのフラクションとして分取
し、各フラクション中のインフルエンザウィルスの生物
活性をＭＤＣＫ（マディン・ダービーイヌ腎細胞）にお
けるPlaque assayにより求めた。また、各フラクション
中のタンパク質含有量をＵＶ吸収スペクトル（２８０n
m）により調べた。さらに、各フラクションについてhem
agglutination assayを行い、ウィルス性抗原の一つで
あるＨＡタンパクを検出した。これらの結果を図４〜図
６に示す。
０℃、７００℃、１０００℃で焼成して得られた粒径４
０μｍのハイドロキシアパタイト粒子を用いたカラムク
ロマトグラフィーにより、インフルエンザウィルス（ウ
ィルス性抗原）を精製した。試料として、インフルエン
ザウィルスを鶏卵で増殖させた後、かかる鶏卵から所定
の前処理を経て調製された溶液を用いた。実施例１と同
じリン酸緩衝液を流速０．１ml/minで供給し、カラムを
通過した溶出液を２mlづつのフラクションとして分取
し、各フラクション中のインフルエンザウィルスの生物
活性をＭＤＣＫ（マディン・ダービーイヌ腎細胞）にお
けるPlaque assayにより求めた。また、各フラクション
中のタンパク質含有量をＵＶ吸収スペクトル（２８０n
m）により調べた。さらに、各フラクションについてhem
agglutination assayを行い、ウィルス性抗原の一つで
あるＨＡタンパクを検出した。これらの結果を図４〜図
６に示す。
【００４４】図４〜図６から明らかなように、いずれの
場合も夾雑タンパク質のほとんどは、ハイドロキシアパ
タイトに吸着されないか、または低濃度のリン酸緩衝液
で流出した。一方、インフルエンザウィルス（ウィルス
性抗原）はハイドロキシアパタイトに強固に吸着され、
高濃度のリン酸緩衝液で流出し、夾雑タンパク質と良好
に分離された。また、インフルエンザウィルス等はフラ
クションＮｏ．４〜５付近において高純度・高収率で回
収され、かかるインフルエンザウィルスは生物活性を有
していることがわかった。さらに、hemagglutination a
ssayの結果もPlaque assayの結果と一致した。
場合も夾雑タンパク質のほとんどは、ハイドロキシアパ
タイトに吸着されないか、または低濃度のリン酸緩衝液
で流出した。一方、インフルエンザウィルス（ウィルス
性抗原）はハイドロキシアパタイトに強固に吸着され、
高濃度のリン酸緩衝液で流出し、夾雑タンパク質と良好
に分離された。また、インフルエンザウィルス等はフラ
クションＮｏ．４〜５付近において高純度・高収率で回
収され、かかるインフルエンザウィルスは生物活性を有
していることがわかった。さらに、hemagglutination a
ssayの結果もPlaque assayの結果と一致した。
【００４５】（実施例３）試料として、日本脳炎ウィル
スをＣ６／３６（蚊の細胞）に接種し増殖させて得られ
た培養上清を用いた以外は、実施例１と同様にして日本
脳炎ウィルスを精製した。これらの結果を図７（焼成温
度１０００℃のハイドロキシアパタイトの場合）に示
す。なお、焼成温度４００℃および７００℃についても
図７とほぼ同様の結果が得られた。
スをＣ６／３６（蚊の細胞）に接種し増殖させて得られ
た培養上清を用いた以外は、実施例１と同様にして日本
脳炎ウィルスを精製した。これらの結果を図７（焼成温
度１０００℃のハイドロキシアパタイトの場合）に示
す。なお、焼成温度４００℃および７００℃についても
図７とほぼ同様の結果が得られた。
【００４６】図７およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図示せず）
の結果から明らかなように、いずれの場合も夾雑タンパ
ク質のほとんどは、ハイドロキシアパタイトに吸着され
ないか、または低濃度のリン酸緩衝液で流出した。一
方、日本脳炎ウィルスはハイドロキシアパタイトに強固
に吸着され、高濃度のリン酸緩衝液で流出し、夾雑タン
パク質と良好に分離された。日本脳炎ウィルス等は、フ
ラクションＮｏ．９付近において高純度・高収率で回収
され、かかる日本脳炎ウィルスは生物活性を有している
ことがわかった。さらに、実施例１の結果と比較する
と、ウィルスの溶出パターンがシャープであり、分離能
により優れていることがわかった。なお、各焼成温度で
得られるハイドロキシアパタイトの粒径を８０μｍとし
て実施例１〜３と同様にウィルス等の精製を行ったとこ
ろ、それぞれ実施例１〜３とほぼ同様の結果が得られ
た。
の結果から明らかなように、いずれの場合も夾雑タンパ
ク質のほとんどは、ハイドロキシアパタイトに吸着され
ないか、または低濃度のリン酸緩衝液で流出した。一
方、日本脳炎ウィルスはハイドロキシアパタイトに強固
に吸着され、高濃度のリン酸緩衝液で流出し、夾雑タン
パク質と良好に分離された。日本脳炎ウィルス等は、フ
ラクションＮｏ．９付近において高純度・高収率で回収
され、かかる日本脳炎ウィルスは生物活性を有している
ことがわかった。さらに、実施例１の結果と比較する
と、ウィルスの溶出パターンがシャープであり、分離能
により優れていることがわかった。なお、各焼成温度で
得られるハイドロキシアパタイトの粒径を８０μｍとし
て実施例１〜３と同様にウィルス等の精製を行ったとこ
ろ、それぞれ実施例１〜３とほぼ同様の結果が得られ
た。
【００４７】
【発明の効果】以上述べたように、本発明のウィルスま
たはウィルス性抗原の精製方法によれば、簡単な操作で
純度の高いウィルスまたはウィルス性抗原が効率よく得
られる。さらに、本発明の方法により分離・精製された
ウィルスまたはウィルス性抗原は良好に生物活性を維持
しているため、安全性、有効性に優れたワクチンの製造
等に利用することができる。
たはウィルス性抗原の精製方法によれば、簡単な操作で
純度の高いウィルスまたはウィルス性抗原が効率よく得
られる。さらに、本発明の方法により分離・精製された
ウィルスまたはウィルス性抗原は良好に生物活性を維持
しているため、安全性、有効性に優れたワクチンの製造
等に利用することができる。
【図１】本発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
【図２】本発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
【図３】本発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
【図４】本発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製
方法によるインフルエンザウィルスまたはウィルス性抗
原の溶出パターンを示す図である。
方法によるインフルエンザウィルスまたはウィルス性抗
原の溶出パターンを示す図である。
【図５】本発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製
方法によるインフルエンザウィルスまたはウィルス性抗
原の溶出パターンを示す図である。
方法によるインフルエンザウィルスまたはウィルス性抗
原の溶出パターンを示す図である。
【図６】本発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製
方法によるインフルエンザウィルスまたはウィルス性抗
原の溶出パターンを示す図である。
方法によるインフルエンザウィルスまたはウィルス性抗
原の溶出パターンを示す図である。
【図７】本発明のウィルスまたはウィルス性抗原の精製
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
方法による日本脳炎ウィルスの溶出パターンを示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/84 Ｇ０１Ｎ 30/84 Ｊ 30/88 30/88 Ｅ Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA91X AA95X BC42 BD16 BD22 CA45 4H045 AA11 BA10 CA01 DA86 EA31 FA71 GA24
Claims (16)
- 【請求項１】 ウィルスまたはウィルス性抗原を含有す
る試料を前記ウィルスまたはウィルス性抗原を吸着可能
な固相担体として４００〜１３００℃で焼成されたハイ
ドロキシアパタイトに接触させる工程と、 前記固相担体に吸着した前記ウィルスまたはウィルス性
抗原を中性領域の溶出液を用いて溶出する工程とを有す
ることを特徴とするウィルスまたはウィルス性抗原の精
製方法。 - 【請求項２】 前記ハイドロキシアパタイトは球状の二
次粒子である請求項１に記載のウィルスまたはウィルス
性抗原の精製方法。 - 【請求項３】 前記ハイドロキシアパタイトは平均粒径
が１０〜１００μｍである請求項１または２に記載のウ
ィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。 - 【請求項４】 前記ハイドロキシアパタイトは多孔質粒
子である請求項１ないし３のいずれかに記載のウィルス
またはウィルス性抗原の精製方法。 - 【請求項５】 前記溶出液として緩衝液を用いる請求項
１ないし４のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス
性抗原の精製方法。 - 【請求項６】 前記緩衝液はリン酸系緩衝液である請求
項５に記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法。 - 【請求項７】 前記ウィルスまたはウィルス性抗原はそ
の大きさが１０〜５００nmである請求項１ないし６のい
ずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方
法。 - 【請求項８】 前記ウィルスまたはウィルス性抗原は動
物または培養細胞から得られるものである請求項１ない
し７のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗原
の精製方法。 - 【請求項９】 前記ウィルスまたはウィルス性抗原は哺
乳類の脳細胞または神経細胞で増殖させたものである請
求項１ないし８のいずれかに記載のウィルスまたはウィ
ルス性抗原の精製方法。 - 【請求項１０】 前記ウィルスまたはウィルス性抗原は
鶏卵で増殖させたものである請求項１ないし８のいずれ
かに記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。 - 【請求項１１】 前記ウィルスは培養細胞で増殖させた
ものである請求項１ないし８のいずれかに記載のウィル
スまたはウィルス性抗原の精製方法。 - 【請求項１２】 前記ウィルスは日本脳炎ウィルスであ
る請求項１ないし１１のいずれかに記載のウィルスまた
はウィルス性抗原の精製方法。 - 【請求項１３】 前記ウィルスはインフルエンザウィル
スである請求項１ないし１１のいずれかに記載のウィル
スまたはウィルス性抗原の精製方法。 - 【請求項１４】 前記ウィルスまたはウィルス性抗原の
精製はカラムクロマトグラフィーによる請求項１ないし
１３のいずれかに記載のウィルスまたはウィルス性抗原
の精製方法。 - 【請求項１５】 前記溶出工程において溶出速度が０．
０５〜２ml/minである請求項１ないし１４のいずれかに
記載のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法。 - 【請求項１６】 請求項１ないし１５のいずれかに記載
のウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法による精製
工程と、 前記精製工程により精製されたウィルスまたはウィルス
性抗原を不活性化する工程とを含むことを特徴とするワ
クチンの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11073915A JP2000262280A (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 |
| DE10013017A DE10013017A1 (de) | 1999-03-18 | 2000-03-17 | Verfahren zum Läutern eines viralen Antigens und zum Erzeugen eines Impfstoffes |
| FR0003558A FR2791698A1 (fr) | 1999-03-18 | 2000-03-20 | Procede pour la purification d'un virus ou antigene viral, et procede pour la production d'un vaccin |
| GB0006716A GB2348886A (en) | 1999-03-18 | 2000-03-20 | Virus or viral antigen purification method and vaccine producing method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11073915A JP2000262280A (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000262280A true JP2000262280A (ja) | 2000-09-26 |
Family
ID=13531951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11073915A Pending JP2000262280A (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000262280A (ja) |
| DE (1) | DE10013017A1 (ja) |
| FR (1) | FR2791698A1 (ja) |
| GB (1) | GB2348886A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010038719A1 (ja) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | デンカ生研株式会社 | 精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法 |
| DE102010038034A1 (de) | 2009-10-07 | 2011-05-19 | Hoya Corp. | Reinigungsverfahren und Verfahren zum Herstellen von Impfstoff |
| WO2021002257A1 (ja) * | 2019-07-04 | 2021-01-07 | 株式会社カネカ | ウイルスまたはウイルス様粒子の精製方法 |
| JP6898535B1 (ja) * | 2020-06-16 | 2021-07-07 | ＨＯＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｓｕｒｇｉｃａｌ株式会社 | アパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法 |
| WO2022044727A1 (ja) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | 株式会社カネカ | 有用物質の精製方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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