DE10013017A1 - Verfahren zum Läutern eines viralen Antigens und zum Erzeugen eines Impfstoffes - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Läutern eines Virus oder viralen Antigens, das leicht und schnell aus einer Kulturlösung oder einer zellularen Emulsion sperariert und geläutert werden kann, ohne seine Aktivierung zu verringern. Das Läuterungsverfahren zeichnet sich dadurch aus, daß eine Probe, die das Virus oder virale Antigen enthält, mit Hydroxylapatit als festem Träger kontaktiert wird, das bei 400 bis 1300 DEG C gesintert wurde und das Virus oder virale Antigen absorbieren kann. Es wird dann durch Verwenden eines Eluats im Neutralbereich ausgewaschen. Hierbei besteht das Hydroxylapatit vorzugsweise aus kugeligen porösen Teilchen. Außerdem wird als Eluat vorzugsweise eine Pufferlösung auf Phosphorbasis verwendet. Es ist ferner ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs unter Anwenden des Läuterungsverfahrens beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Läutern eines Virus oder viralen Antigens und zum Herstellen eines Impfstoffs, insbesondere ein Verfahren zum leichten Separieren und Läutern eines Virus oder viralen Antigens aus einer Kulturlösung, sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs unter Anwendung des Läute­ rungsverfahrens.

Das Separieren und Läutern eines Virus oder eines viralen Antigens (im folgen­ den auch als Virus o. ä. bezeichnet) aus einer Kulturlösung, einem Kulturmedium und Wirtszellen sind wichtige Schritte auf dem Gebiet der Gentechnologie, der klinischen Diagnose und der Herstellung von Impfstoffen.

Allgemein existiert in der Kulturlösung o. ä. ein virales Antigen nicht allein, son­ dern zusammen mit Kulturzellen und unreinen Proteinen. Deshalb muß das Anti­ gen aus der Kulturlösung o. ä. separiert und geläutert werden.

Bisher wurden das Separieren und Läutern eines Virus oder eines viralen Anti­ gens durch Ultrazentrifugalabscheidung oder durch Dichtegradient-Zentrifugal­ verfahren o. ä. durchgeführt. Da diese Verfahren aber kostspielige und große Ein­ richtungen sowie komplizierte Operationen erfordern, sind sie sehr umständlich durchzuführen.

Andererseits wurde bereits zum leichten Extrahieren eines Virus ein Verfahren vorgeschlagen, das die Säulenchromatografie unter Verwendung von Hydroxyl­ apatit anwendet (Sumiaki Tsuru et al., Bio-Medical Materials and Engineering Vol. 1, pp. 1-5, 1991).

Bei diesem Verfahren wird ein Eluat mit etwa 7 pH verwendet, wodurch ein Virus o. ä. aus der Probe mit hoher Extraktionsrate separiert werden kann.

Es kann jedoch kaum gesagt werden, daß das extrahierte Virus von unreinen Proteinen befriedigend separiert ist. Deshalb muß bei Anwenden des extrahierten Virus zum Herstellen eines Impfstoffs eine Ultrazentrifugalabscheidung ausge­ führt werden. Es besteht daher das Problem, ein weiteres Läuterungsverfahren durchzuführen, um ein Virus hoher Reinheit zu erhalten.

Als weiteres Verfahren zum leichten Läutern eines Virus wurde die Säulenchro­ matografie vorgeschlagen, bei der Siliciumdioxid als fester Träger verwendet wird. Bei diesem Verfahren besteht der Vorteil, daß ein Virus mit nur einem Schritt aus einem biologischen Material wie einer Kulturlösung extrahiert werden kann. Da aber ein Eluat mit hohem pH-Wert verwendet wird, ist die Aktivierung des Virus leicht verringert. Deshalb ist es bei diesem Verfahren sehr schwierig, das Virus ohne Verringerung der Aktivierung wirksam zu läutern.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Läuterungsverfahren anzugeben, bei dem ein Virus oder ein virales Antigen leicht und schnell aus einer Kulturlö­ sung oder Zellenemulsion o. ä. separiert und geläutert werden kann, ohne die Ak­ tivierung zu verringern, sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs unter Anwendung dieses Läuterungsverfahrens anzugeben.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 bzw. 17. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand von Unteransprüchen.

Hydroxylapatit, das in dem bei der Erfindung vorgesehenen Temperaturbereich gesintert wird, hat eine poröse Struktur mit kleinen Porendurchmessern und einer Porenzahl, die eine ausgezeichnete Virusabsorption bietet, so daß nur ein Virus oder ein virales Antigen effektiv separiert und von unreinem Protein o. ä. geläutert wird, das mit dem Virus oder viralen Antigen in der Probe vorliegt. Ferner hat das in dem gemäß der Erfindung vorgesehenen Temperaturbereich gesinterte Hy­ droxylapatit eine erhöhte Festigkeit, so daß es trotz der hohen Porenzahl zur Ab­ sorption des Virus oder viralen Antigens nicht kollabiert, und ferner ist ein solches Hydroxylapatit ausreichend stabil gegen den Druck, der bei der Säulenchromato­ grafie im Läuterungsverfahren auftritt.

Durch Verwenden eines Eluats in dem neutralen Bereich ergibt sich ein Virus ho­ her Reinheit, dessen Aktivierung beibehalten wird. Der Neutralbereich liegt bei etwa 6 bis 7,5 pH.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnungen näher erläutert. Darin zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm für das Auswaschen des japanischen Encephalitisvi­ rus bei dem Verfahren nach der Erfindung,

Fig. 2 ein weiteres Diagramm ähnlich Fig. 1,

Fig. 3 ein weiteres Diagramm ähnlich Fig. 1 und 2,

Fig. 4 das Diagramm für das Auswaschen eines Grippevirus-Antigens bei dem Verfahren nach der Erfindung,

Fig. 5 ein Diagramm ähnlich Fig. 4,

Fig. 6 ein Diagramm ähnlich Fig. 4 und 5 und

Fig. 7 ein Diagramm für das Auswaschen des japanischen Encephalitisvi­ rus bei dem Verfahren nach der Erfindung.

Bei der Erfindung wird ein Verfahren durchgeführt, bei dem eine Probe, die ein Vi­ rus oder ein virales Antigen enthält, mit bei etwa 400 bis 1300°C gesintertem Hy­ droxylapatit als fester Träger zur Absorption kontaktiert wird, wobei das Virus oder das virale Antigen dann unter Verwendung eines Eluats im neutralen Bereich ausgewaschen wird.

Der neutrale Bereich liegt bei etwa 6 bis 7,5 pH. Durch Verwenden eines Eluats in diesem neutralen Bereich ergibt sich ein Virus hoher Reinheit, dessen Aktivierung beibehalten wird.

Als fester Träger wird Hydroxylapatit verwendet, das bei einer Temperatur von etwa 400 bis 1300°C gesintert wurde, vorzugsweise Hydroxylapatit, das in einem Bereich von etwa 950 bis 1050°C gesintert wurde.

In einem solchen Temperaturbereich gesintertes Hydroxylapatit hat eine poröse Struktur mit kleinem Porendurchmesser und einer Porenzahl, die eine exzellente Virusabsorption bietet, so daß nur ein Virus oder virales Antigen effizient ausge­ sondert und von unreinem Protein o. ä. geläutert wird, das zusammen mit dem Vi­ rus in der Probe vorliegt. Ferner hat das in diesem Temperaturbereich gesinterte Hydroxylapatit eine erhöhte Festigkeit, so daß es nicht kollabiert, auch wenn es ausreichend viele Poren zur Absorption des Virus oder viralen Antigens hat.

Außerdem ist ein solches Hydroxylapatit ausreichend stabil gegen Druckeinwir­ kung, die bei dem Läuterungsverfahren mit der Säulenchromatografie auftritt.

Liegt die Sintertemperatur des Hydroxylapatits unter 400°C, so ist die Absorpti­ onsfähigkeit zu hoch, was dazu führt, daß das Auswaschen des Virus oder viralen Antigens schwierig ist oder daß unreines Protein gleichfalls absorbiert wird. Wenn andererseits die Sintertemperatur über 1300°C liegt, kann das Hydroxylapatit durch die Wärmeeinwirkung zerfallen, so daß es als Feststoffträger ungeeignet ist.

Besonders in einem Hydroxylapatit, das bei etwa 950 bis 1050°C gesintert wurde, ist die Porenanzahl so begrenzt, daß die Absorption unreinen Proteins einge­ schränkt werden kann.

Das Hydroxylapatit hat vorzugsweise die Form kugeliger poröser Teilchen. Durch die poröse Struktur kann die effektive Fläche pro Volumeneinheit des Hydroxyl­ apatits maximiert werden, wodurch die Absorptionsfähigkeit für das Virus verbes­ sert wird.

Bei der Säulenchromatografie kann Hydroxylapatit sehr effektiv in eine Säule mit hoher Dichte eingefüllt werden, so daß die Separation des Virus stabiler abläuft. Andererseits werden auch beim Einfüllen des Hydroxylapatits in die Säule mit ho­ her Dichte durch die Kugelform Zwischenräume zwischen den Teilchen erzeugt, wodurch die Durchgangsfähigkeit für ein Eluat wie eine Pufferlösung zufrieden­ stellend beibehalten wird.

Vorzugsweise hat das Hydroxylapatit eine mittlere Teilchengröße von etwa 10 bis 100 µm, insbesondere von etwa 40 bis 80 µm. Ist der Teilchendurchmesser klei­ ner als 10 µm, so wird ein Durchgang des Virus oder viralen Antigens durch die Abstände zwischen den Hydroxylapatitteilchen schwierig, so daß die Absorpti­ onsmöglichkeit durch das Hydroxylapatit verringert wird. Wenn andererseits der Teilchendurchmesser 100 µm übersteigt, werden die Teilchenabstände zu groß, so daß die Geschwindigkeit des Durchgangs des Virus durch die Zwischenräume zunimmt, wodurch wiederum das Absorbieren des Virus oder viralen Antigens durch das Hydroxylapatit erschwert wird. Sind die Teilchen zu groß, so wird auch der Abstand zwischen den gepackten Teilchen groß. Der Leerraum zwischen den Teilchen in der Säule kann zu einer Diffusion der getrennten Platten (oder Bän­ der) führen. Dies beeinträchtigt die Auflösung der Säule.

Ferner hat das Hydroxylapatit vorzugsweise die Form poröser Teilchen. Die Poro­ sität ist vorzugweise 50 bis 80%, insbesondere 65 bis 75%. Ist sie hoch, so ist durch die relativ kleine spezifische Oberfläche die Absorptionsfähigkeit zu gering. Ist die Porosität gering, so ist die mechanische Stabilität unzureichend.

Die sphärischen porösen Teilchen des Hydroxylapatits können folgendermaßen hergestellt werden. Zunächst wird eine Hydroxylapatitschlämme, die nach einem bekannten Naßverfahren erhalten wurde, durch direktes Sprühtrocknen in Teil­ chenform gebracht, wodurch sich die sphärischen Teilchen ergeben. Alternativ können solche Teilchen durch Beifügen eines Zusatzes wie eines Viskositätsre­ gulierers, durch Wärme zerfallender organischer Verbundteilchen oder Fasern o. ä. zu der Hydroxylapatitschlämme und anschließende Sprühtrocknung gebildet werden. Dann werden die kugeligen Teilchen bei etwa 400 bis 1300°C gesintert, wodurch sich die porösen Kugelteilchen ergeben.

Die Größe des zu läuternden Virus oder viralen Antigens ist nicht besonders ein­ geschränkt, vorzugsweise beträgt sie jedoch etwa 10 bis 500 nm. Das Virus oder virale Antigen mit solcher Größe kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zufriedenstellend separiert und geläutert werden.

Vorzugsweise Beispiele des zu läuternden Virus sind ein Grippevirus mit einer Größe von etwa 100 bis 120 nm oder das japanische Encephalitisvirus mit einer Größe von etwa 40 bis 50 nm. Weitere Beispiele für das virale Antigen sind Strukturproteine des Grippevirus oder japanischen Encephalitisvirus o. ä.

Bei der Erfindung ist es möglich, ein Virus zu verwenden, das sich durch Aus­ breitung in tierischen oder Kulturzellen ergibt. Beispielsweise kann ein Virus aus den Gehirnzellen oder Neuronen von Säugetieren, ein Virus aus einem Ei, vor­ zugsweise einem embryonalen Hühnerei, und ein Virus in Kulturzellen usw. ver­ wendet werden. Durch Ausbreitung des Virus in einem solchen System ist es möglich, dauernd eine große Menge des Virus zu erhalten. Ferner kann der Virus bei Kulturzellen in einem Zustand relativ geringer Verunreinigung kultiviert wer­ den, wodurch das Läutern erleichtert wird.

Hinsichtlich des Kontaktierens des festen Trägers aus Hydroxylapatit mit dem Vi­ rus oder dem viralen Antigen können verschiedene Verfahren eingesetzt werden, was von der Ausbildung des festen Trägers und dem Probenvolumen u. ä. ab­ hängt. Beispielsweise kann ein Mengenverfahren angewendet werden, bei dem Hydroxylapatit in eine Probe eingebracht wird, um das Virus zu absorbieren, oder ein Verfahren, bei dem eine Probe in eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule einge­ bracht wird.

Dann wird das durch das Hydroxylapatit absorbierte Virus ausgewaschen. Bei dem Verfahren nach der Erfindung wird zum Separieren und Sammeln des ge­ wünschten Virus aus dem festen Träger in dem Auswaschprozeß ein Eluat im Neutralbereich verwendet. Bei der Säulenchromatografie werden Fraktionen, die das gewünschte Virus enthalten, separat extrahiert.

Durch Anwenden eines Eluats in dem Neutralbereich kann das Virus leicht aus­ gewaschen werden, und ferner wird ein Absenken der Aktivierung oder ein De­ naturieren des Virus unterdrückt.

Als ein Eluat im Neutralbereich kann z. B. eine Pufferlösung mit einer Pufferkapa­ zität im Bereich von 6 bis 7,5 pH verwendet werden. Beispiele einer solchen Puf­ ferlösung sind eine Pufferlösung auf Phosphorsäurebasis, eine Pufferlösung auf Natriumacetat-Essigsäurebasis, eine Pufferlösung auf Natriumacetat-Salzsäure­ basis oder eine Pufferlösung auf Trisaminomethanbasis o. ä. Von diesen Lösun­ gen wird vorzugsweise die Pufferlösung auf Phosphorsäurebasis eingesetzt. Diese kann als Pufferlösung verwendet werden, die bei etwa 7 pH eine Pufferwir­ kung zeigt, so daß ein Separieren und Läutern des Virus bei gleichzeitig stabiler Aktivierung möglich ist.

In diesem Zusammenhang wird vor dem Auswaschen des Virus das Hydroxylapa­ tit vorzugsweise einige Male mit einem Eluat mit geringer Salzkonzentration ge­ waschen, um möglichst viele Verunreinigungen zu entfernen, die in der Probe vor­ handen sind und durch das Hydroxylapatit nicht absorbiert wurden. Beispiele sol­ cher Verunreinigungen sind Rückstände der Kulturzellen, ein Teil der Virusteil­ chen und unreines Protein u. ä., die in der Probe existieren.

Das Auswaschen des Virus kann auch durch Erhöhen der Salzkonzentration in der Pufferlösung erfolgen. Die Salzkonzentration in der Pufferlösung kann ent­ sprechend einem geraden oder einem gekrümmten Verlauf erhöht werden. Bei diesem Verfahren wird aus dem Hydroxylapatit zuerst eine Substanz mit geringer Absorptionsfähigkeit wie Protein ausgewaschen. Dies bedeutet, daß es möglich ist, wahlweise ein gewünschtes Virus aus dem Hydroxylapatit zu separieren, das in dem Hydroxylapatit hochabsorbiert ist.

Als Läuterungsverfahren kann ein Mengenverfahren oder eine Säulenchromato­ grafie o. ä. eingesetzt werden. Die Säulenchromatografie wird vorzugsweise an­ gewendet, da hierbei das Virus oder virale Antigen mit hoher Extraktionsrate und hoher Reinheit erhalten wird und die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet ist.

Wird das Virus oder virale Antigen durch Säulenchromatografie separiert, so ist die Strömungsgeschwindigkeit beim Auswaschen abhängig von der Probenkapa­ zität und der Säulenkapazität zu wählen. In diesem Fall soll die Strömungsge­ schwindigkeit etwa 0,05 bis 2 ml/min und vorzugsweise etwa 0,1 bis 1 ml/min be­ tragen.

Ist die Strömungsgeschwindigkeit zu gering, so dauert das Auswaschen des Virus zu lange, wodurch seine Aktivität gesenkt wird. Andererseits kann sich bei zu ho­ her Strömungsgeschwindigkeit die Reproduktionsfähigkeit der Separationswir­ kung verschlechtern.

Das Impfstoffherstellungsverfahren nach der Erfindung zeichnet sich durch eine erfindungsgemäße Läuterung des Virus oder viralen Antigens aus, wobei das Vi­ rus oder virale Antigen inaktiviert wird. Da bei dem Verfahren zum Herstellen ei­ nes Impfstoffs das Virus oder virale Antigen mit hoher Reinheit geläutert wird, ist die Gefahr der Verschmutzung durch andere Mikroben gering, wodurch ein sehr sicherer Impfstoff erzielt wird.

Bei dem Verfahren zum Inaktivieren des Virus oder viralen Antigens nach dem Läutern gemäß der Erfindung kann die Inaktivierung abhängig von dem Typ des herzustellenden Impfstoffs unterschiedlich durchgeführt werden.

Vorstehend wurden das Läutern des Virus oder viralen Antigens sowie ein Verfah­ ren zum Herstellen eines Impfstoffs beschrieben. Darauf ist die Erfindung jedoch nicht beschränkt. Beispielsweise ist es beim Läutern des Virus oder viralen Anti­ gens möglich, einen festen Träger zu verwenden, in dem ein Ligand mit biolo­ gisch spezifischer Wechselwirkung mit einem Zielvirus an der Oberfläche der Hy­ droxylapatitteilchen vorgesehen ist.

Beispiele

Im folgenden werden Beispiele für die Durchführung der Erfindung erläutert.

Beispiel 1

Nach einem Naßverfahren (molares Verhältnis Ca/P von 1,67) erhaltene Hy­ droxylapatitschlämme wurde durch direktes Sprühtrocknen zu Teilchen verarbei­ tet, wodurch sich kugelige Hydroxylapatitteilchen ergaben. Dann wurden diese Teilchen bei 400°C, 700°C und 1000°C gesintert und poröse Teilchen eines Durchmessers von 40 µm klassiert. Durch Verwenden dieser Teilchen als fester Träger wurde das japanische Encephalitisvirus mit der Säulenchromatografie ge­ läutert.

Als Probe wurde das japanische Encephalitisvirus in einem Mausgehirn vermehrt und dann das Gehirn extrahiert. Es wurde dann eine Lösung des emulsifizierten Gehirns (mit dem japanischen Encephalitisvirus infiziert) verwendet.

Auf einem Filter mit Poren einer Größe von 35 µm, das in eine Spritze mit einem Innendurchmesser von 8 mm und einer Höhe von 20 mm eingesetzt war, wurden 0,45 g Hydroxylapatitteilchen nach Sintern bei 400°C, 0,45 g Hydroxylapatitteil­ chen nach Sintern bei 700°C und 0,9 g Hydroxylapatitteilchen nach Sintern bei 1000°C aufgebracht. In eine so vorbereitete Säule wurden 0,1 ml der Mausgehirn- Emulsion eingegeben.

Dann wurde eine Pufferlösung aus Phosphorsäure mit 7 pH als Mittel zum Aus­ waschen des japanischen Encephalitisvirus angewendet. Die Pufferlösung mit ei­ nem linearen Gradienten der Phosphorsäurekonzentration von 10 mM bis 400 mM wurde in die Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min zum Auswaschen eingeführt.

Die durch die Säule geführte Lösung wurde durch jede Fraktion von 1 ml extra­ hiert, und die biologische Aktivität des Virus in jeder Fraktion wurde nach einem Plaque-Test in den Vero-Zellen (erhalten von der Niere des afrikanischen Grün­ affen) berechnet. Ferner wurde der Proteinanteil in jeder Fraktion mit dem UV- Absorptionsspektrum (280 nm) geprüft. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 bis Fig. 3 dargestellt.

Ferner wurde in jedem Anteil Protein durch SDS-PAGE erfaßt.

Wie Fig. 1 bis 3 sowie die Ergebnisse von SDS-PAGE (nicht dargestellt) zeigen, wurde in allen Fällen der größte Teil des unreinen Proteins durch das Hydroxyl­ apatit nicht absorbiert oder aus der Pufferlösung der Phosphorsäure geringer Konzentration ausgegeben. Andererseits wurde das japanische Encephalitisvirus durch das Hydroxylapatit sicher absorbiert und durch die Pufferlösung der Phos­ phorsäure geringer Konzentration ausgegeben, wodurch es zufriedenstellend von dem unreinen Protein separiert wurde.

Ferner wurde das japanische Encephalitisvirus nahe den Fraktionen 8 bis 10 ge­ sammelt, während die Infektionsfähigkeit bei hoher Reinheit und hoher Sammel­ rate beibehalten wurde.

Beispiel 2

Es wurde ein Influenzavirus (virales Antigen) durch Säulenchromatografie mit Hydroxylapatitteilchen eines Durchmessers von 40 µm, die bei 400°C, 700°C und 1000°C gesintert waren, wie in Beispiel 1 angegeben geläutert.

Als Probe wurde eine Lösung verwendet, die nach vorbestimmtem Verfahren aus einem Ei hergestellt war, in dem ein Grippevirus vermehrt wurde.

Dieselbe Pufferlösung wie in Beispiel 1 wurde mit einer Strömungsgeschwindig­ keit von 0,1 ml/min durch die Säule geführt und in jeder Fraktion von 2 ml separat extrahiert. Dann wurde die biologische Aktivität des Grippevirus in jeder Fraktion nach dem Plaque-Test in MDCK (Madin-Darby-Kaninchennierenzellen) berech­ net.

Ferner wurde der Proteinanteil in jeder Fraktion mit einem UV-Absorptionsspek­ trum (280 nm) geprüft.

Außerdem wurde ein Hemagglutinationstest für jede Fraktion durchgeführt, und es wurde HA-Protein erfaßt, das eines der viralen Antigene war.

Die Ergebnisse sind in Fig. 4 bis Fig. 6 dargestellt.

Wie sich aus diesen Darstellungen ergibt, wurde in allen Fällen der größte Teil des unreinen Proteins durch das Hydroxylapatit nicht absorbiert oder aus der Pufferlösung ausgegeben. Andererseits wurde das Grippevirus (virales Antigen) sicher von dem Hydroxylapatit absorbiert und von der Pufferlösung bei hoher Konzentration ausgegeben, wodurch das Virus zufriedenstellend von dem unrei­ nen Protein separiert wurde.

Ferner wurde das Grippevirus nahe den Fraktionen 4 bis 5 bei hoher Reinheit und hoher Sammelrate gesammelt, und es zeigte sich, daß es hohe biologische Akti­ vität hatte.

Außerdem waren die Ergebnisse des Hämagglutinationstests dieselben wie die des Plaque-Tests.

Beispiel 3

Das japanische Encephalitisvirus wurde wie in Beispiel 1 geläutert mit dem Unter­ schied, daß eine obere klare Kulturzellenschicht verwendet wurde, die sich durch Impfen von C6/36 (Moskitozellen) mit dem japanischen Encephalitisvirus ergab, um dieses zu vermehren.

Die Ergebnisse zeigt Fig. 7 (für bei 1000°C gesintertes Hydroxylapatit). Auch für Sintertemperaturen von 400°C und 700°C zeigten sich dieselben Ergebnisse wie in Fig. 7 dargestellt.

Wie Fig. 7 und die Ergebnisse von SDS-PAGE (nicht dargestellt) zeigen, wurde in allen Fällen der größte Teil des unreinen Proteins von dem Hydroxylapatit nicht absorbiert oder von der Pufferlösung der Phosphorsäure geringer Konzentration ausgegeben. Andererseits wurde das japanische Encephalitisvirus sicher von dem Hydroxylapatit absorbiert und von der Pufferlösung von Phosphorsäure ho­ her Konzentration ausgegeben, wodurch es von dem unreinen Protein zufrieden­ stellend separiert wurde.

Das japanische Encephalitisvirus sammelte sich nahe der Fraktion 9 bei hoher Reinheit und hoher Sammelrate, wodurch sich zeigte, daß es eine hohe biologi­ sche Aktivität hatte.

Ferner war im Vergleich mit den Ergebnissen des Beispiels 1 das Elutionsmuster des Virus scharf, was zeigte, daß die Separationskapazität ausgezeichnet war.

Auch beim Läutern des Virus in der in Beispiel 1 bis 3 angegebenen Weise mit einem Teilchendurchmesser des Hydroxylapatits von 80 µm, gesintert bei den angegebenen Temperaturen, zeigten sich dieselben Ergebnisse wie in Beispiel 1 bis 3.

Wie vorstehend beschrieben, ergibt sich durch die Erfindung ein sehr reines Virus oder virales Antigen durch einfache Operationen.

Da das so erhaltene Virus oder virale Antigen die biologische Aktivität zufrieden­ stellend beibehält, kann ein effizienter und sicherer Impfstoff hergestellt werden.

Claims (17)

1. Läuterungsverfahren für ein Virus oder virales Antigen, mit den Schritten:
Kontaktieren einer ein Virus oder virales Antigen enthaltenden Probe mit Hydroxylapatit als festem Träger, das bei etwa 400 bis 1300°C gesintert und für das Virus oder virale Antigen absorptionsfähig ist, und
Auswaschen des absorbierten Virus oder viralen Antigens mit einem Eluat im neutralen Bereich.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydroxyl­ apatit aus sphärischen porösen Teilchen besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Teilchendurchmesser des Hydroxylapatits etwa 10 bis 100 µm be­ trägt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Hydroxylapatit in Form poröser Teilchen verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Eluat eine Pufferlösung verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Pufferlösung eine Phosphorsäurelösung verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Größe des Virus oder viralen Antigens etwa 10 bis 500 nm beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Virus oder virale Antigen aus tierischen oder Kulturzellen erhalten wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Virus oder virale Antigen in Gehirnzellen oder Neuronen von Säugetieren vermehrt wurde.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Virus oder virale Antigen in einem Ei vermehrt wurde.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus in Kulturzellen vermehrt wurde.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Virus das japanische Encephalitisvirus ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Grippevirus ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Virus oder virale Antigen mittels der Säulenchromatogra­ fie geläutert wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Strömungsgeschwindigkeit in dem Waschprozeß etwa 0,05 bis 2 ml/min beträgt.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Neutralbereich zwischen etwa 6 pH und 7,5 pH liegt.

17. Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffes, gekennzeichnet durch ein Läuterungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, und einen Prozeß zum Inaktivieren des Virus oder viralen Antigens aus dem Läuterungsverfah­ ren.