DE69325266T2

DE69325266T2 - Superporöse polysaccharidgele

Info

Publication number: DE69325266T2
Application number: DE69325266T
Authority: DE
Inventors: Per Larsson
Original assignee: Amersham Pharmacia Biotech AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1992-03-18
Filing date: 1993-03-16
Publication date: 2000-01-20
Anticipated expiration: 2013-03-17
Also published as: US5723601A; EP0631597A1; SE9200827D0; WO1993019115A1; AU3772693A; EP0631597B1; CA2132344A1; ES2136657T3; JPH07505415A; ATE181087T1; JP3473852B2; CA2132344C; DE69325266D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polysaccharidgele, die neben Poren von molekularer Dimension, zum Beispiel 20-500 Å, auch untereinander verbundene makroskopische Poren, typischerweise mit einem Porendurchmesser von etwa 0,5-500 Mikrometer, enthalten. Bei diesen neuen Materialien stellte sich heraus, daß sie die Anwendungsbereiche für Polysaccharidgele, die zahlreiche vorteilhafte Charakteristika für die Verwendung in Bioverfahrenstechniken, wie chromatographische Trennungen, Membran-Trennungs-Technologie und Träger für Festphasenchemie, insbesondere in biologisch empfindlichen Systemen, aufweisen.
Diese superporösen Polysaccharidgele werden durch Mischen einer wasserhaltigen Lösung des Polysacchharids mit einer im wesentlichen wasserunmischbaren organischen Phase unter kräftigem Rühren gebildet, worauf man die feindispergierte Mischung sich verfestigen läßt und die organische Phase schließlich weggewaschen wird. Die obenstehende organische Phase ist die Superporen bildende Phase. Sie muß daher so zusammengesetzt sein, daß sie als kontinuierliche Phase in Gegenwart einer kontinuierlichen Agarosephase vorliegen kann.
Die neuen Polysaccharidgele können in verschiedenen Phasen gebildet werden, zum Beispiel mehr oder weniger gleichmäßige Kügelchen, wie Sphären, Membrane etc., und können als Basismatrix für die Herstellung chromatographischer Medien und als Trägermatrix allgemein für verschiedene Biomoleküle wie Zellen, Enzyme, Antikörper etc. verwendet werden.
Polysaccharidgele sind dafür bekannt, daß sie eine wichtige Rolle für die Herstellung von Materialien zur Trennung von Mischungen aus Biomolekülen spielen. Unter den Charakteristika, welche diese Gele besonders interessant machen, lassen sich ihre Reaktionsträgheit bei Kontakt mit Proteinen und anderen Biomolekülen und ihre poröse Struktur angeben. Eine weitere wichtige Eigenschaft ist ihre Beständigkeit gegenüber alkalischen Bedingungen, was bei Trennungsverfahren im großen Maßstab, die eine häufige Regeneration/Sterilisation des Gels erfordern, von großer Bedeutung ist. Polysaccharidgele lassen im Gegensatz zu zahlreichen anderen Trennmaterialien eine solche In-situ-Regeneration, beispielsweise mit 1 M NaOH, zu, was ein wirksames Mittel ist, das häufig zur Reinigung und Sterilisation verwendet wird.
Polysaccharidgele werden für verschiedene Typen der Chromatographie verwendet. Ein solches Beispiel ist die Gelfiltration, wobei die Probenbestandteile Größen-fraktioniert werden. Dies ist eine Anwendung, bei der die Reaktionsträgheit von entscheidender Bedeutung ist, da jede Wechselwirkung zwischen dem Gelmaterial als solchem und den Probenmolekülen die Trennung weniger wirksam macht und das Ergebnis sogar völlig unbrauchbar machen könnte. Kommerziell wurden über viele Jahre sehr wichtige Materialien für diesen Trennungstyp aus vernetztem Dextran und nativer oder gegebenenfalls vernetzter Agarose (zum Beispiel Sephadex und Sepharose von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden), hergestellt.
Ein weiteres Beispiel für eine kommerziell wichtige chromatographische Verfahrensweise ist die Ionenaustauschchromatographie. Mehrere Materialien für die Ionenaustauschchromatographie sind von Dextran, Agarose oder Cellulose abgeleitet. Die Wahl von Polysaccharidgelen als Trägermatrix basiert, wie obenstehend, auf ihrer Reaktionsträgheit und einer allgemein anerkannten Derivatisierungschemie für die Einführung von Ionenaustauschgruppen.
Ein weiteres Beispiel ist die Affinitätschromatographie. Wiederum werden Polysaccharidgele in zahlreichen Anwendungen aufgrund der Anzahl an zweckmäßigen Verfahrensweisen, die für die Einführung der Affinitätsliganden und das Mindestmaß an unspezifischer Bindung von Biomolekülen verfügbar sind, bevorzugt.
Die Polysaccharidgele weisen demzufolge mehrere wichtige Charakteristika auf, welche diese für die Wahl als Basismatrix für die Herstellung von Materialien für die chromatographische Trennung nahelegen. Die Gele zeigen aber auch bestimmte Nachteile, wie die beschränkte mechanische Stabilität. Dies ist kein echtes Problem, wenn vergleichsweise große Gelkügelchen (etwa 0,1 mm) bei der herkömmlichen Chromatographie mit den niedrigen Fließraten durch das Gelbett, die aus Diffusionsgründen erforderlich sind, verwendet werden. Die Situation stellt sich aber ganz anders dar, wenn Versuche unternommen werden, die Trennungseffizienz durch die Verwendung kleiner Gelkügelchen (etwa 5-20 Mikrometer) zu erhöhen. Bei Fließraten, die aus Diffusionsgründen optimal sind, ist der Druckabfall in dem Gelbett so hoch, daß die Polysaccharidkügelchen zusammenfallen. Es war möglich, den Einsatz beispielsweise von Agarose in Systemur mit erhöhten Fließraten durch Vernetzung zu erweitern, hingegen wurden in ausgesprochenen Hochdrucksystemen nur Teilchen von mechanischer Stabilität ähnlich derjenigen von Silica und Polystyrol verwendet. Die meisten Materialien in dieser Gruppe sind aber wesentlich weniger mit Proteinen kompatibel, sind nicht so leicht als Polysaccharide zu derivatisieren und können nicht bei hohen pH-Werten regeneriert werden.
Ich fand nun heraus, daß sehr leistungsstarke Polysaccharidgele durch Einführen von Makroporen gebildet werden können, welche untereinander verbunden sind unter Erhalt von Fließpassagen, Kanälen durch das Gel. Neben diesen sogenannten Superporen, die im Größenbereich von 0,5-1000 Mikrometer liegen, wie 0,5-500, und vorzugsweise 5-100 Mikrometer, sind auch Poren von etwa 30-500 Å, was für Polysaccharide typisch ist, vorhanden. Die Materialien besitzen demzufolge zwei eindeutige Gruppen von Poren, welche diese von in dem Fachbereich bekannten Polysaccharidmaterialien unterscheiden. Wenn diese neuen Materialien in eine chromatographische Säule gepackt werden und eine Flüssigkeitsströmung durch die Säule angewandt wird, wird ein Teil der Strömung über die Superporen durch die Teilchen hindurch geleitet. Die zu trennenden Substanzen werden somit auch den inneren Teilen der Kügelchen durch eine Konvektionsströmung zugeführt, was einen viel schnelleren Transportweg darstellt als die Diffusion, die der einzige Transportweg in Materialien des Stands der Technik ist.
Es müssen nur kurze Distanzen durch die Diffusion in den neuen Materialien zurückgelegt werden und die Teilchen sind daher trotz einer viel größeren Teilchengröße so wirksam wie Teilchen des Stands der Technik, und führen dennoch zu einem viel geringeren Druckabfall über dem Gelbett. Die Erfindung beschreibt demzufolge eine Lösung des Problems, wie man Polysaccharidgele auch bei der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nützlich macht. Ein weiterer Vorteil, der sich bei den neuen Materialien zeigte, ist ihr Einsatz bei der Trennung von Zellen, Chromosomen und anderen Makromolekülen, die zu groß sind, um Zugang zu den normalerweise in Polysaccharidgelen vorgefundenen Poren zu haben. Ein weiterer Vorteil ist, daß die neuen Materialien in der Elektrophorese, einschließlich der Kapillarelektrophorese, und als Träger für katalytisch aktive Zellen und Enzyme verwendet werden können. Die Strömung in Makroporen, die bei der chromatographischen Trennung für vorteilhaft befunden wurde, verbessert den Massetransport von Substraten und Produkten, wodurch die katalytische Effizienz verbessert wird.
Die Technik zur Anwendung von Durchgangsporen bei der chromatographischen Trennung ist von Afeyan et al. in der US-5019270 beschrieben. Dort wird der Einsatz bestimmter Polymere, insbesondere von Materialien auf Styrol- und Acrylatbasis, erwähnt, doch es gibt keine Ausführungen darüber, wie man in dem beanspruchten Verfahren nützliche Polysaccharidgele herstellt.
Es ist bekannt, daß Polysaccharide hergestellt werden können, die Makroporen enthalten; siehe zum Beispiel die US-4935365 (Mosbach et al.). Ein Gel, wie in der US-4935365 beschrieben, weist einen wesentlich größeren Oberflächenbereich aufgrund der Makroporen auf, eine Tatsache, die deren Einsatzmöglichkeit bei einigen Anwendungen, wie Zellkulturen und auch bei bestimmten chromatographischen Verfahrensweisen, erhöht. Die Makroporen sind jedoch nicht untereinander verbunden und damit gibt des keinen Durchfluß auf dem Weg über diese Poren, welche einen klaren Unterschied zwischen den Gelen des Stands der Technik und den vorliegenden Materialien machen.
Die Erfindung betrifft demzufolge Polysaccharidgele, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie neben Poren von molekularer Dimension, wie 20 bis 500 Å, die ebenfalls untereinander verbunden sind, kontinuierliche Makroporen mit einem Porendurchmesser vorzugsweise im Bereich von 5 bisi 100 Mikrometer aufweisen, sowie die Herstellung solcher Gele in verschiedenen Formen.
Eine große Gruppe an Polysacchariden kann als Basissubstanz für die Herstellung von Materialien gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und unter diesen können Agar, Agarose, Alginat, Dextran, Karrageenan, Chitosan, Cellulose und Stärke sowie Mischungen von diesen genannt werden. Die tatsächliche Auswahl wird normalerweise durch die gewünschten Eigenschaften des Endprodukts bestimmt, zum Beispiel im Hinblick auf die Porengröße, Charge, Stabilität in verschiedenen Medien, Kosten etc.
Die Menge an Superporen in einem Material gemäß der Erfindung kann beträchtlich schwanken, doch deckt ein Bereich von etwa 15-50% die meisten Anwendungen ab. Die Grundanforderung, daß auch die Polysaccharidphase kontinuierlich sein muß, zeigte, daß ein Bereich von 25-40% bevorzugt ist. Die Anwendung dieses Intervalls erleichtert auch, wie sich herausstellte, daß ein gewünschter Parameter sowie ein gewünschter Abstand zwischen den Superporen erhalten wird.
Der Superporendurchmesser kann, wie obenstehend erwähnt, innerhalb eines weiten Bereichs variiert werden und ist größer als 0,5 Mikrometer, vorzugsweise größer als 5 Mikrometer, und kleiner als 1 mm, vorzugsweise kleiner als 0,5, insbesondere kleiner als 0,1 mm. Dies ergibt ein bevorzugtes Intervall um 5-100 Mikrometer, doch sind bei bestimmten Anwendungen Werte außerhalb dieses Bereich nützlich und sogar erwünscht, zum Beispiel 0,5 bis 1000 Mikrometer. Die Wahl des Porendurchmessers hängt hauptsächlich von der beabsichtigten Anwendung und der physikalischen Form des herzustellenden Materials ab. Wenn das Gel als diskrete Teilchen, die in Betten, zum Beispiel in eine Säule, gepackt werden, hergestellt wird, sollte der Durchmesser der Makroporen proportional zu dem Teilchendurchmesser für einen optimalen Durchfluß durch die miteinander verbundenen Poren sein. Das Verhältnis kann gemäß dem folgenden Modell geschätzt werden: Die Superporen sind röhrenänhnlich gemacht und ebenso sind auch die Zwischenräume zwischen den Kügelchen. In einem normalen Bett aus gepackten monodispersen Sphären ist der Durchmesser solcher interstitieller Poren ungefähr 1/4 des Teilchendurchmessers. Um mit der besten Effizienz zu funktionieren, sollte die lineare Strömung durch die Superporen in einem chromatographischen Bett aus superporösen Teilchen dieselbe sein wie die Strömung in den interstitiellen Poren. Dies wird erreicht, wenn der Durchmesser der Superporen etwa derselbe ist wie der Durchmesser der interstitiellen Poren. Wenn man allerdings eine bestimmte Teilchengrößenverteilung berücksichtigt, welche die interstitielle Porengröße vermindert, sollte die ideale Größe einer Superpore etwa 1/6 des Teilchendurchmessers betragen. Kleinere Superporen ergeben eine weniger zufriedenstellende Porenströmung, verbessern aber immer noch sehr stark die chromatographischen Eigenschaften des Betts. Daher sollte die Größe der Superporen vorzugsweise im Bereich von 1/6 bis 1/10 des Teilchendurchmessers liegen.
Einfache geometrische Berechnungen zeigen, daß die durchschnittliche Dicke der Polysaccharidphase ungefähr die gleiche ist wie der Superporendurchmesser, wenn das Teilchen den bevorzugten Gehalt an Superporen, d. h. etwa 33% (v/v), aufweist. Bei einem mit optimal geformten superporösen Teilchen gepackten Bett mit einem Durchmesser d könnte man daher erwarten, daß es eine chromatographische Effizienz, die derjenigen eines mit Teilchen des Stands der Technik gepackten Betts mit einem Durchmesser d/6 nahekommt, zumindest in Diffusionsregulierten Situationen aufweist. Am signifikantesten würde der Druckabfall bei den superporösen Teilchen lediglich etwa 1/36 des Druckabfalls bei den Teilchen des Stands der Technik betragen (der Druckabfall ist umgekehrt proportional zum Quadrat des Teilchendurchmessers).
Wenn die neuen Materialien als ein kontinuierliches Bett an Stelle von diskreten Teilchen hergestellt sind, ist augenscheinlich, daß die gesamte Strömung durch die Superporen passieren muß, wodurch sich etwas unterschiedliche Gesichtspunkte ergeben, die bei der Gestaltung bzw. Planung des System zu berücksichtigen sind. Wenn der Superporendurchmesser klein gemacht wird, liegen solche Poren um so dichter beieinander, mit dem Vorteil, daß nur kleine Abstände durch die Diffusion überbrückt werden müssen. Jedoch nimmt der Rück(stau)druck zu, wenn die Poren kleiner gemacht werden (der Rückstaudruck ist umgekehrt proportional zu dem Quadrat des Superporendurchmessers). Dies bedeutet in der Praxis, daß in einem tiefen Bett der Superporendurchmesser nicht weniger als etwa 20 Mikrometer betragen sollte, wenn das Material eine Volumenfraktion an Superporen von etwa 1/3 aufweist, um noch eine akzeptable Strömung durch das Bett zu erhalten.
In einer dünnen Membran (0,1 bis 3 mm) kann ein sehr kleiner Superporendurchmesser dennoch angewandt werden, und Werte von sogar weniger als 20 Mikrometer sind zulässig. Andererseits ist es durch Bilden größerer Superporen möglich, Membrane mit sehr geringem Rückstaudruck herzustellen.
Die Fraktion an Polysaccharidphase in einem kontinuierlichen Bett wie obenstehend erwähnt kann bis zu mindestens 80% betragen, während die entsprechenden Werte für ein normales gepacktes Bett des Stands der Technik und ein superporöses gepacktes Bett 60-70% bzw. 40% sind.
Bei der Herstellung eines Polysaccharidgels gemäß der Erfindung wird eine Polysaccharidphase auf Wasserbasis unter kräftigem Rühren mit einer im wesentlichen wasserunmischbaren organischen Phase vermischt, die aus einer oder mehreren Komponenten besteht, in der Regel ein organisches Lösungsmittel und ein Detergens des Typs der "Öl-in-Wasser"- stabilisierenden Systeme. Die so gebildete Emulsion, Emulsion 1, muß bestimmte Charakteristika aufweisen, um ein Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung zu bilden, und dies wird in gewisser Ausführlichkeit im Nachstehenden erläutert.
Die Emulsion wird verschiedenen Behandlungen je nach der geometrischen Form des herzustellenden Materials unterworfen:
(a) Herstellung superporöser sphärischer Teilchen: Die Emulsion 1 wird unter Rühren mit einer im wesentlichen wasserunmischbaren organischen Phase, die eine oder mehrere Komponenten umfaßt, in der Regel ein organisches Lösungsmittel und ein Detergens des "Wasser-in-Öl" stabilisierenden Typs, gemischt. Es werden Tropfen der Emulsion 1 gebildet. Die Tropfengröße hängt von der Rührgeschwindigkeit und der Konzentration des Detergens 2 ab. Die Polysaccharidphase in den Tropfen wird verfestigen gelassen, zum Beispiel durch Absenken der Temperatur auf unterhalb die Gelierungstemperatur des Polysaccharids.
In einer alternativen Ausführungsform werden kleine Tropfen von Emulsion 1 durch eine Düse geformt. Die Tropfen, welche die Düse in einem Strom verlassen, verfestigen sich, wenn sie durch die Atmosphäre strömen oder wenn sie in einem Komplexbildner enthaltenden Bad gesammelt werden. Feste Teilchen, die gemäß einem der obenstehend dargelegten Verfahren gebildet wurden, werden gesammelt und zum Beispiel mit Wasser, Wasser-Ethanol, Wasser- Aceton oder irgendeinem anderen wassermischbaren Lösungsmittel gewaschen.
(b) Superporöse Fasern: Die Emulsion 1 wird durch eine oder mehrere Düsen in ein Bad gepumpt, mit einer Temperatur unterhalb der Gelierungstemperatur des Polysaccharids, oder das Komplexbildner enthält. Die so gebildeten Fasern werden beibehalten und wie obenstehend (a) gewaschen.
(c) Superporöse kontinuierliche Betten: Die Betten werden in geeigneten Behältern, zum Beispiel Säulen für die Chromatographie, geformt. Die Emulsion 1 wird in den Behälter gegossen und die Polysaccharidphase wird durch Absenken der Temperatur der Säule auf einen Wert unterhalb der Gelierungstemperatur des Polysaccharids zum Verfestigen gebracht. Die organische Phase in dem superporösen Gelbett wird durch Pumpen von Wasser und eines wassermischbaren Lösungsmittels durch das Bett entfernt.
(d) Superporöse Membrane: Die Emulsion 1 wird als dünne Schicht in einer aus zwei parallelen Glasplatten bestehenden Gerätschaft geformt, die an den Enden versiegelt bzw. abgeschlossen sind. Die Polysaccharidphase wird zum Verfestigen gebracht, zum Beispiel durch Absenken der Temperatur, und die organische Phase wird durch Waschen der Gelschicht mit Wasser und einem wassermischbaren Lösungsmittel entfernt.
(e) Unregelmäßgie superporöse Teichen: Superporöse Fasern (b) oder superporöse Gelbetten (c) werden auf eine geeignete Teilchengröße zermahlen und danach fraktioniert, zum Beispiel durch Naßsieben.
Die Emulsion 1 sollte wie obenstehend erwähnt bestimmte Kriterien erfüllen und solche Charakteristika von Bedeutung sind der Typ der Polysaccharidphase, die Konzentration von Polysaccharid in der Phase, die Volumenfraktion der organischen Phase, die Zusammensetzung der organischen Phase, die Mikrostruktur der organischen Phase, die Rührintensität während der Bildung der Emulsion 1 und das Verhältnis zwischen der Zeit, während welcher diese gebildet und anschließend verfestigt wird. Dies ist eine Reihe voneinander abhängiger Parameter, die ein ziemlich komplexes Reaktionsschema definieren. Zwei Schnelltests sind für die Verifizierung verfügbar, daß eine bestimmte Kombination ein System ergibt, welches für die Herstellung der tatsächlichen Materialien geeignet ist. Der erste Test beinhaltet eine Untersuchung der Emulsion 1 unter einem Mikroskop. Der entscheidende Faktor ist, daß die zwei Phasen leicht ein Netzwerk aus zwei kontinuierlichen Phasen bilden müssen.
Bei der Untersuchung von Emulsionssystemen, die über Raumtemperatur verfestigen, zum Beispiel Agarose, erleichtert der Einsatz eines thermostatierten Objektträgers die Untersuchung erheblich, da es andernfalls zu früh zu einer Gelierung kommen könnte. Die Verwendung von organischen Phasen, die mit wasserunmischbarem Farbstoff gefärbt sind, zum Beispiel Sudan- Gelb, könnte ebenfalls eine gewisse Hilfe sein.
Der zweite Ergänzungstest beinhaltet einen Funktionstest der Porenströmung. Eine kleine Probe der Emulsion 1 wird verfestigt und eine dünne (etwa 1 mm Dicke) Gelscheibe wird gebildet. Die Gelscheibe wird auf ein Trägernetz gelegt und ein Wasserstrahl wird auf die Geloberfläche gerichtet. Sofern geeignete Superporen vorhanden sind, verdrängt der Wasserstrahl leicht die organische Phase in der Gelscheibe. Das Aussehen der Gelscheibe verändert sich bei diesem Vorgang von Weiß zu halbdurchsichtig.
Von spezieller Bedeutung für die Charakteristika der Emulsion 1 ist die Zusammensetzung der organischen Phase und die Rührintensität während der Bildung der Emulsion. Die organische Phase umfaßt in den meisten Fällen eine Mischung eines organischen Lösungsmittels und eines Detergens. Das im wesentlichen wasserunmischbare Lösungsmittel kann beispielsweise aus der Cyclohexan, Heptan und Toluol umfassenden Gruppe gewählt werden. Das Detergens, welches vom Typ der "Öl-in-Wasser"-stabilisierenden Emulsionen sein sollte, ist vorzugsweise der durch Tween 80 (Polyoxyethylensorbitan-monooleat) oder Tween 20 (Polyoxyethylensorbitan-monolaurat) angegebene Typ.
Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Emulsion 1 beinhaltet ein organisches Lösungsmittel und umfaßt die folgenden Schritte: Das Detergens wird in dem organischen Lösungsmittel fein dispergiert, zum Beispiel durch kräftiges Rühren unter Bildung der organischen Phase, die anschließend mit der Polysaccharidphase auf Wasserbasis unter reguliertem Rühren vermischt wird. Wenn die Emulsion 1 sich bei einer Untersuchung unter einem Mikroskop wie obenstehend beschrieben leicht in zwei kontinuierliche Phasen in einem Mosaikmuster auftrennt, zeigte sich ganz klar, daß diese die richtigen Eigenschaften für die Herstellung superporöser Gels besitzt. Eine weitere Untersuchung der kontinuierliche Poren bildenden organischen Phase ergibt wichtige Informationen. Die Phase ist nicht homogen, umfaßt aber diskrete, mikroskopische Tropfen an Lösungsmittel in einer kontinuierlichen Detergensphase. Die Lösungsmitteltropfen können als "füllig machendes" Material in einer kontinuierlichen Detergensphase charakterisiert werden. Wenn die Emulsion 1 andererseits nicht für die Herstellung von superporösen Materialien geeignet ist, erscheinen Tropfen der organischen Phase in der Polysaccharidphase isoliert und zeigen keine Tendenz zu einer Aggregation zu einer kontinuierlichen organischen Phase.
Von besonderer Bedeutung für den Aufbau von Teilchen mit kontinuierlichen, miteinander verbundenen Superporen ist die Beobachtung, daß die auf die bevorzugte Art hergestellte Emulsion 1 eine kontinuierliche Polysaccharidphase und eine kontinuierliche organische Phase umfaßt, welche wiederum aus einer kontinuierlichen Detergensphase und suspendierten Tröpfchen eines organischen Lösungsmittels besteht. Es können einige Anleitungen für den bevorzugten Aufbau der Emulsion 1 gegeben werden: Die Beobachtung, daß die Emulsion 1, wenn sie gemäß der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, eine kontinuierliche Detergensphase mit Tropfen von Lösungsmittel umfaßt, ist von wesentlicher Bedeutung für den Aufbau von Materialien mit untereinander verbundenen Superporen. Es können einige Anleitungen hierzu gegeben werden:
(a) Da das Detergens, und nicht das Lösungsmittel, den kontinuierlichen Teil der die Superporen bildenden organischen Phase bildet, ist es wichtig, daß genügend Detergens vorhanden ist. Wenn die Menge an Detergens zu niedrig ist, wird alles davon für die Stabilisierung der Grenzflächenoberflächen zwischen den Lösungsmitteltropfen und dem Polysaccharid auf Wasserbasis "aufgebraucht". Der Mangel an "freien" Detergensmolekülen verhindert die Bildung kontinuierlicher Superporen.
(b) Die Rührgeschwindigkeit oder, in anderen Worten, die durch einen Rührer erzeugte Energie ist wichtig für die Bildung von Superporen. Eine erhöhte Rührgeschwindigkeit führt zu kleineren Lösungsmitteltropfen mit der Folge, daß mehr Detergens für die Stabilisierung der Grenzflächenoberfläche gegen die Polysaccharidphase auf Wasserbasis erforderlich ist. Dies bedeutet, daß eine bestimmte Zusammensetzung der Emulsion 1, die bei einer niedrigen Rührgeschwindigkeit von beispielsweise 500 U/min hergestellt wurde, zu einem superporösen Produkt führen kann, wohingegen eine höhere Geschwindigkeit, zum Beispiel 2000 U/min. möglicherweise nicht zu einem superporösen Produkt führt.
(c) Die Volumenfraktion von Superporen ist hauptsächlich eine Funktion der Menge an organischer Phase in der Emulsion 1.
(d) Der Durchmesser der Superporen sowie die Menge der Superporen in dem Material wird in erster Linie durch die Detergenskonzentration, die Rührgeschwindigkeit und die Zeitspanne zwischen der Bildung der Emulsion 1 und der Verfestigung des Polysaccharids bestimmt.
Wenn alle anderen Parameter konstant gehalten werden, stellte man fest, daß
(1) eine erhöhte Detergenskonzentration (ausgedrückt in % der gesamten organischen Phase) zu einem größeren Superporendurchmesser, aber einer kleineren Zahl solcher Poren in dem Material führt;
(2) eine erhöhte Rührgeschwindigkeit zu einer höheren Zahl an Superporen mit einem kleineren Durchmesser führt;
(3) eine längere Zeitspanne zwischen der Bildung der Emulsion 1 und der Verfestigung der Polysaccharidphase eine geringere Menge an Superporen ergibt, die jedoch einen größeren Durchmesser aufweisen.
Durch die obenstehend angegebenen Richtlinien wird deutlich, daß die kontinuierliche organische Phase in der Emulsion 1 im wesentlichen ein Detergens mit mikroskopischen Lösungsmitteltropfen als "füllig machende" Substanz umfaßt. Dies zeigt an, daß es möglich wäre, eine funktionierende Emulsion 1 herzustellen, selbst ohne ein organisches Lösungsmittel. Dies stellte sich auch so heraus und es wurden superporöse Membrane aus einer Mischung aus warmer Agaroselösung und dem Detergens Tween 80 hergestellt, welches für eine Verfestigung ausreichend gekühlt wurde. Die obenstehend angegebenen Regeln sind selbstverständlich in dieser Ausführungsform der Erfindung etwas abgewandelt, da keine Lösungsmitteltropfen zu stabilisieren sind.
Poröse Materialien gemäß der Erfindung weisen bei Herstellung in sphärischer Form zur Verwendung bei chromatographischen Trennungen ein Verhältnis zwischen dem Fließporendurchmesser und dem Teilchendurchmesser innerhalb eines Bereichs von 0,01 bis 0,3, vorzugsweise 0,05-0,2, auf.
Die Erfindung wird nunmehr anhand einer Reihe von Beispielen dafür, wie ein Polysaccharidgel gemäß der Erfindung hergestellt wird, erläutert, sowie zu dessen Anwendung in der Chromatographie erläutert.

Beispiel 1

Herstellung der Emulsion 1 auf Agarose-Basis (bevorzugte Ausführungsform)

Lösung A: 6,0 g Agarosepulver wurden in 94 ml Wasser suspendiert, das auf 92ºC erwärmt wurde und auf dieser Temperatur 1 Minute lang zur Auflösung der Agarose gehalten wurde. Die Agaroselösung wurde danach auf 60ºC gekühlt.
Lösung B: 3,0 ml des Detergens Polyoxyethylensorbitan-monooleat (Tween 80) wurden in Cyclohexan suspendiert und das Volumen der Mischung wurde auf 50 ml eingestellt und auf 60ºC unter Rühren erwärmt. Unmittelbar vor einer weiteren Verwendung wurde es kräftig umgerührt.
Die Lösung B wurde danach mit der Lösung A in einem thermostatierten Behälter (60ºC), welcher mit einem Rührer ausgerüstet war, vermischt, der zwei Minuten bei 1200 U/min gehalten wurde. Es bildete sich eine weiße viskose Emulsion (Emulsion 1).

Beispiel 2

Herstellung der Emulsion 1 auf Agarosebasis (alternative Ausführungsformen)

Die Lösungen A und B wurden analog zu Beispiel 1 hergestellt; siehe die Tabelle 1 zu Einzelheiten bezüglich der Zusammensetzungen und Resultate. Ob eine bestimmte Mischung zur Herstellung superporöser Materialien geeignet war oder nicht, wurde durch den folgenden Test ermittelt: Eine 5-10-ml-Probe von Emulsion 1 wurde in einem Teströhrchen durch Absenken der Temperatur verfestigen gelassen. Das so gebildete Gel wurde in dünne Scheiben geschnitten, die mit Wasser oder 50%igem Ethanol gewaschen wurden. Die Scheiben wurden danach durch das Mikroskop untersucht und das Vorhandensein oder das Fehlen von untereinander verbundenen Superporen war leicht festzustellen.

Tabelle 1

A ist die Menge von Agarose in %. B ist das gewählte organische Lösungsmittel. C ist die Menge an Detergens Tween 80 in %.
c. h. = Cyclohexan; h. = Heptan
Tw. 20 = Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat)
s. o. = Sojabohnenöl

Beispiel 3

Herstellung von superporösen Sphären - Standardverfahren

100 ml der Emulsion 1, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde unter Rühren bei 600 U/min hergestellt, in 200 ml Cyclohexan (mit Thermostat auf 60ºC eingestellt) gefüllt, das 4 (v/v) Span 85 (Sorbitan-trioleat) enthielt. Nach 0,5 Minuten wurde die Mischung auf 20ºC gekühlt und es bildeten sich sphärische, superporöse Teilchen. Die Teilchen wurden abfiltriert, mit Wasser, 50%igem Ethanol und schließlich mit Wasser gewaschen. In einem alternativen Experiment wurde die Agaroselösung bei 600 U/min bei 60ºC umgerührt, und die organische Phase (umfassend Cyclohexan und Span 85) wurde hinzugegeben. Nach 0,5 Minuten wurde die Mischung auf Raumtemperatur gekühlt. Die superporösen Teilchen wurden wie obenstehend behandelt.
Das Experiment wurde unter Verwendung einer gemäß Beispiel 2 hergestellten Emulsion bei verschiedenen Rührgeschwindigkeiten wiederholt, was in superporösen Teilchen resultierte, die einen ganzen Bereich an Porendurchmessern und Teilchendurchmessern umfassen. Ein Produkt mit einer gewünschten Teilchengrößenverteilung konnte in jedem Fall leicht durch Naßsieben erhalten werden.

Beispiel 4

Herstellung an superporösen Membranen

Die Membrane wurden in einem durch zwei Glasplatten (20 · 20 cm) gebildeten Behälter geformt, und parallel in einem Abstand von 0,5 bis 5 mm gehalten. Die Emulsion 1 aus Beispiel 1 oder Beispiel 2 wurde in den Behälter gegossen, welcher thermostatisch auf 60ºC eingestellt wurde. Nach 0,5 Minuten wurde der Behälter auf Raumtemperatur gekühlt und die Emulsion wurde verfestigen gelassen. Die so gebildete superporöse Membranplatte wurde herausgenommen und mit Wasser, 50%igem Ethanol und Wasser gewaschen. Runde Membranen wurden aus der Platte gestanzt und in herkömmlichen Membranfilterhaltern eingesetzt.

Beispiel 5

Herstellung eines kontinuierlichen, superporösen Agarosebetts

Eine Emulsion gemäß Beispiel 1 wurde in eine mit einem Thermostat eingestellte (60ºC) Säule für die Chromatographie (ein Glasrohr mit einem Durchmesser von 1,6 und einer Höhe von 20 cm) gefüllt und an einem Ende mit einem Silikonpfropfen verschlossen. Das Rohr wurde auf Raumtemperatur gekühlt und es bildete sich ein Agarosegel. Der zylindrisch geformte Gelpfropfen wurden aus dem Rohr gedrückt und die zwei Endoberflächen wurden senkrecht zu der Zylinderachse geschnitten. Der Gelpfropfen wurde danach in das chromatographische Rohr eingeführt, welches mit einer Peristaltikpumpe des in der Chromatographie eingesetzten Typs verbunden war. Die das Detergens enthaltende organische Phase wurde durch Waschen des Gels mit Wasser, 50%igem Ethanol und schließlich mit einer weiteren Portion Wasser entfernt.

Beispiel 6

Vernetzung mit Divinylsulfon

10 g superporöse Teilchen, die gemäß Beispiel 3 hergestellt wurden, wurden in 10 ml Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 12,3) suspendiert und 100 mg Natriumborhydrid wurden hinzugegeben. Nach der Zugabe von 0,5 ml Divinylsulfon (DVS) wurde die Vernetzung 4 Stunden lang auf einem Schüttelherd voranschreiten gelassen. Das Produkt wurde danach wiederholt mit Wasser auf einem Glasfilter gewaschen. Diese Behandlung erhöhte die mechanische Stabilität der Teilchen mit einem Faktor von etwa 4.

Beispiel 7

Herstellung superporöser Anionenaustauscherteilchen

Superporöse Agaroseteilchen, die gemäß Beispiel 3 hergestellt wurden, wurden mit DVS analog zu Beispiel 6 umgesetzt. Nach dem letzten Waschen wurden die Teilchen sofort in 50 ml 10%iger Polyethyleniminlösung (Molekulargewicht von etwa 60 000) auf einen pH-Wert von 9,5 durch HCl eingestellt. Die Teilchensuspension wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur umge rührt und danach auf einem Glasfilter mit Wasser, 0,1 M Natriumchlorid und Wasser gewaschen.

Beispiel 8

Herstellung von CNBr-aktivierten superporösen Agaroseteilchen

25 g superporöse Agaroseteilchen, die gemäß Beispiel 3 hergestellt wurden, wurden in 50 ml vereistem 1 M Natriumcarbonat, pH-Wert 12,1, suspendiert. Die Suspension wurde umgerührt und eine CNBr-Lösung (0,75 g CNBr + 1,5 ml Acetonitril) wurde hinzugegeben. Nach 1,5 Minuten wurde eine gleiche Menge an CNBr-Lösung hinzugegeben und die Aktivierung wurde nach 4 Minuten durch Waschen der Teilchen auf einem Glasfilter mit 0,5 Liter Eiswasser, 100 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH-Wert 8,5) und schließlich 0,5 Liter Eiswasser abgeschlossen. Das so aktivierte Gel wurde zum Kuppeln verschiedener Liganden verwendet.

Beispiel 9

Herstellung eines CNBr-aktivierten kontinuierlichen superporösen Gelbetts

Ein zylindrisches, kontinuierliches, superporöses Agarosebett mit der Abmessung 1,6 · 6 cm wurde analog zu Beispiel 5 hergestellt und in eine Säule mit einem Fließadapter eingeführt. Die Säulen waren mit einem Wärmetauscher (ein 50 cm · 1/16" großes Rohr aus nichtrostendem Stahl) und einer Peristaltikpumpe verbunden. Die Säule sowie der Wärmetauscher wurden in ein Eisbad gestellt und 50 ml vereistes 1 M Natriumcarbonat wurde durch die Säule gepumpt. 50 ml Aktivierungslösung (2,5 g CNBr gelöst in 1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 12,1) wurden 5 Minuten durch die Säule gepumpt, worauf das aktivierte Gel mit 100 ml Eiswasser, 50 ml vereistem 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 8,5) und 50 ml Wasser gewaschen wurde. Das Gel wurde unmittelbar danach für das Kuppeln verschiedener Liganden verwendet.

Beispiel 10

Herstellung superporöser NAD-Agarose-Teilchen

20 g superporöse CNBr-aktivierte Teilchen, hergestellt gemäß Beispiel 8, wurden mit 10 ml vereistem 0,2 M Phosphatpuffer, pH-Wert 8,5, und 5 ml vereister NAD-Analog-Lösung (10 mg N&sup6;-[(6-Aminohexyl)kabamoylmethyl)]-NAD] vermischt. Nach dem Einstellen des pH- Wertes auf 8,5 wurde die Suspension 16 Stunden bei Raumtemperatur umgerührt. Die superporösen Teilchen wurden abfiltriert und in 0,2 M Glycin-NaOH-Puffer, pH-Wert 8,7, 15 Minuten lang suspendiert, um etwaige verbleibende aktive Gruppe zu entfernen. Die superporösen NAD- Teilchen wurden mit 0,5 Liter Wasser und 0,5 Liter 1 mM Acetatpuffer, pH-Wert 5,0, gewaschen. Die Teilchen wurden in einem Kühlraum gelagert.

Beispiel 11

Herstellung eines superporösen kontinuierlichen NAD-Agarose-Betts

Ein CNBr-aktiviertes superporöses kontinuierliches Gelbett (1,6 · 6 cm), hergestellt gemäß Beispiel 9, wurde in eine Säule mit Fließadaptern gepackt. Eine 10-ml-Eislösung, enthaltend 200 mg NAD-Analog (10 mg N&sup6;-[(6-Aminohexyl)kabamoylmethyl)]-NAD] in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 8,5, wurde in der Säule zirkulieren gelassen. Nach 1 h wurde die Temperatur in dem Zirkulationssystem auf Raumtemperatur angehoben. 16 Stunden später war die Kupplungsreaktion beendet und ein 0,2 M Glycin-NaOH-Puffer, pH-Wert 8,7, wurde 15 Minuten lang durch die Säule gepumpt, um etwaige verbleibende aktive Gruppe zu inaktivieren. Die superporöse kontinuierliche NAD-Agarose wurde mit 100 ml Wasser und 100 ml Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5, gewaschen. Das Gelbett wurde schließlich in einem Kühlraum gelagert.

Beispiel 12

Herstellung superporöser, kontinuierlicher, mit biologisch nachgeahmten Farbstoffen derivatisierter Gelbetten

Ein superporöses Gelben mit der Abmessung 1,0 · 5 cm wurde analog zu dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren hergestellt. Eine Lösung, enthaltend 12,5 ml Wasser, 125 mg Farbstoff, 3 ml 20%iges Natriumchlorid und 3 ml 2,5 M Natriumcarbonat wurde in dem Bett 16 Stunden lang zirkulieren gelassen, worauf das Gel mit 100 ml 1 M Natriumcarbonat und 500 ml Wasser gewaschen wurde.
Es wurden die folgenden reaktiven Triazinfarbstoffe verwendet: Procion Blau H-Erd, Procion Orange, Procion Grün, Procion Gelb, Procion Rot und Cibacron Blau 3 GA.

Beispiel 13

Vergleich zwischen Teilchen des Stands der Technik und superporösen Teilchen als Trägermatrices für die Gelfiltration

Die superporösen Agaroseteilchen wurden gemäß Beispiel 3 hergestellt. Die Teilchen des Stands der Technik wurden durch Dispergieren einer 6%igen Agaroselösung in Cyclohexan (60%) im wesentlichen wie für die Emulsion 1 in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Teilchen der zwei Typen mit einem Durchmesser von 0,4 mm wurden in Chromatographiesäulen (1,6 · 16,5 cm) gepackt, die mit einem HPLC-System, umfassend eine Pumpe, einen Probeninjektor, UV-Detektor und Plotter, verbunden waren, gepackt. Die Probe bestand aus einer niedermolekularen Substanz (Natriumazid) und einer hochmolekularen Substanz (Rinderserumalbumin - BSA). Die Proben wurden injiziert und die Elutionsprofile wurden für Berechnungen der effektiven theoretischen Plattenhöhe bzw. Bodenzahl (HETP) aufgezeichnet. Die in den Experimenten mit superporösen Teilchen erhaltenen niedrigeren HETP-Werte zeigen klar an, daß diese überlegen sind im Vergleich zu den Teilchen des Stands der Technik. Dies trifft besonders bei Experimenten mit hohen Strömungsraten und hochmolekularen Substanzen, zum Beispiel Experiment 8, zu. Tabelle 2

Beispiel 14

Vergleich zwischen Affinitäts-Chromatographiematerialien, hergestellt aus Teilchen des Stands der Technik und superporösen Teilchen

Superporöse NAD-Agarose-Teilchen, hergestellt gemäß Beispiel 10, wurden in eine Chromatographiesäule (1,6 · 5 cm) gepackt. Die NAD-Agarose-Teilchen hatten einen Durchmesser von 0,4 mm und ein statisches Bindungsvermögen für Lactatdehydrogenase von 10 mg/g Gel in Gegenwart von 25 mM Oxalat. Eine weitere Säule mit denselben Dimensionen wurde mit Agaroseteilchen des Stands der Technik (Beispiel 13) mit derselben Konzentration an NAD- Analog gepackt (die Substitution wurde wie in Beispiel 10 durchgeführt). Beide Säulen hatten denselben Teilchendurchmesser und das gleiche Bindungsvermögen. Die Säulen wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Adsorption von Lactatdehydrogenase aus einem Rohextrakt in Gegenwart von 25 mM Natriumoxalat verglichen. 50 ml des Rohextrakts wurden durch jede der Säulen mit einer Geschwindigkeit von 3 oder 9,9 ml/min gepumpt. Der Abfluß aus den Säulen wurde hinsichtlich der Proteinkonzentration und der Lactatdehydrogenaseaktivität analysiert. Die Säulen wurden danach gewaschen und das adsorbierte Enzym wurde mit 1 mM NADH eluiert. Es wurden folgende Resultate erhalten:
Die Resultate zeigen klar, daß, wenn die Strömungsrate von 3,0 auf 9,9 ml/min erhöht wird, das Agarosematerial des Stands der Technik erheblich weniger wirksam wird, während das superporöse Gel ungefähr dasselbe Verhalten zeigt. Dies zeigt an, daß die operative Kapazität des superporösen Gels etwa das Dreifache des entsprechenden Wertes eins Agarosegels des Stands der Technik ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung poröser Materialien aus einem Polysaccharid, umfassend die Schritte:

a. Mischen einer Lösung des Polysaccharids auf Wasserbasis mit einer wasserunmischbaren organischen Phase unter reguliertem Rühren zur Bildung einer Emulsion,

b. Verfestigen der Mischung zur Bildung des porösen Materials,

dadurch gekennzeichnet, daß Verfahrensparameter gewählt werden, welche in einem Testlauf verifiziert worden sind, um eine Emulsion vorzusehen, welche kurz vor oder während des Verfestigungsverfahrens ein Netzwerk bildet, wie, beispielsweise durch mikroskopische Untersuchungen, anhand einer kontinuierlichen wäßrigen Polysaccharidphase und einer kontinuierlichen, Durchflußporen bildenden organischen Phase verifiziert, so daß das Verfestigungsverfahren in einer Polysaccharidmatrix resultiert, welche Durchflußporen aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserunmischbare Phase ein "Öl-in-Wasser"-Detergens und ein organisches Lösungsmittel umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet; daß das organische Lösungsmittel aus der Cyclohexan, Heptan und Toluol umfassenden Gruppe gewählt wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid ein oder mehrere Polysaccharide aus der Agarose, Alginat, Dextran und Cellulose umfassenden Gruppe umfaßt.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Agarose ist und daß die Emulsion vor dem Verfestigungsverfahren mit einem wasserunmischbaren, organischen Lösungsmittel, enthaltend ein "Wasser-in-Öl"-stabilisierendes Detergens, bei einer regulierten Rührgeschwindigkeit und über einen regulierten Zeitraum vermischt wird, wonach das Verfestigungsverfahren voranschreiten gelassen wird durch Verringerung der Temperatur unterhalb der Gelierungstemperatur von Agarose.

6. Poröses Polysaccharidmaterial in Form sphärischer Teilchen, Fasern, eines kontinuierlichen Bettes oder einer Membran, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen, Fasern, das kontinuierliche Bett und die Membran Durchflußporen aufweisen.

7. Poröses Polysaccharidmaterial nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußporen einen Durchmesser von größer als 0,5 um aufweisen.

8. Poröses Polysaccharidmaterial nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußporen einen Durchmesser von größer als 5 um aufweisen.

9. Poröses Polysaccharidmaterial nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußporen eine Durchmesser von weniger als 1 mm aufweisen.

10. Poröses Polysaccharidmaterial nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußporen einen Durchmesser von weniger als 0,1 mm aufweisen.

11. Poröses Polysaccharidmaterial nach mindestens einem der Ansprüche 6- 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Material in Form von Teilchen vorliegt, und daß das Verhältnis zwischen dem Durchflußporen-Durchmesser und dem Teilchendurchmesser innerhalb des Bereichs von 0,01-0,3 liegt.

12. Poröses Polysaccharidmaterial nach mindestens einem der Ansprüche 6- 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Material in Form von Teilchen vorliegt, und daß das Verhältnis zwischen dem Durchflußporen-Durchmesser und dem Teilchendurchmesser innerhalb des Bereichs von 0,05-0,2 liegt.