CN101715364B - 多糖珠的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备琼脂糖珠的方法，该方法产生了具有相对均匀粒度的珠子的群体。在一种有利的实施方案中，所述珠子的粒度小于10μm，并且所述群体的变异系数C.V.小于15％。本发明的珠子能够有利的用于生物分离方法中，例如用于色谱填料的制造中；用于药物载体中；或者用于任何的生物工程方法中。

Description

多糖珠的制备
技术领域
本发明涉及多糖粒子例如琼脂糖珠的制备，该珠子用于生物分离，例如蛋白质和/或细胞的净化中，用作药物载体或者通常用于生物工程领域中。
发明背景
琼脂糖是一种从藻类中提取的天然多糖，并且它的水溶液在低温时形成水凝胶。从二十世纪六十年代起，琼脂糖已经被用作色谱介质，并且已经具有了许多有利的特性，例如高亲水性、高孔隙率以及可用于官能化的羟基基团。琼脂糖经常被用作例如亲合色谱法、疏水交互色谱法(HIC)、反相色谱法(RPC)和离子交换色谱法中的基质。
例如，Shahab Lahooti等人(Shahab Lahooti和Michael V.Sefton，Effect of an immobilization matrix and capsule permeability on thevariability of encapsulated HEK cells，Biomaterials.21(2000)987-995)描述了被甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物壳所包围的作为核物质的琼脂糖，其被植入到HEK细胞中。一方面，琼脂糖的大孔网状结构甚至能够分散细胞，并且促进营养物质和代谢产物的扩散，另一方面，它还降低了珠隔膜浓度，提高了隔膜的渗透性，并且促进足够的用于细胞生长的营养物质进入珠中。研究显示琼脂糖有利于保持植入的细胞活性和细胞分裂以及增殖。该试验结果显示在14天之后，在琼脂糖存在下所增殖的细胞比没有琼脂糖存在下所增殖的细胞多出了两倍，这主要是因为琼脂糖均匀的分散了细胞，并且为细胞提供了支持性基底。
Hiroyuki Hayashi等人(Hiroyuki Hayashi，Kazutomo Inoue，TunAung等人，Application of a novel B cell line MIN6 to amesh-reinforced polyvinyl alcohol hydrogel tube and three layeragarose microcapsules：An in vitro study，Cell Transplantation5(1996)S65-S69)描述了琼脂糖在制备三层凝胶胶囊中的用途，所述的胶囊被用来植入到B细胞线MIN6中。该研究结果显示植入的B细胞线MIN6具有比未被植入的MIN6高出两倍的胰岛素分泌速度。
Stellan Hjerten(Stellan Hjerten，The preparation of agarosespheres for chromatography of molecules and particles，BiochimiaEt Biophysica Acta，79(1964)393-398)描述了琼脂糖在反悬浮液凝胶化方法中的乳化，其使用搅拌器乳化。
已经提出将使用喷嘴的喷涂方法(A.M.Egorev，A.Kh.Vakhabov和V.Ya.Chernyak，Isolation of agarose and granulation of agar andagarose gel，Journal of chromatography.46(1970)143-148；以及S.Bengtsson和L.Philipsson，Chromatography of animal viruses onpearl-condensed agar，Biochimia Et BiophysicaActa.79(1964)399-406)用于制备作为分离介质或者活细胞载体的琼脂糖珠。
但是，这样的乳液方法已知的缺陷是液滴的粒度不可控制，所制备的乳液具有不均匀的粒度，固化的琼脂糖凝胶珠具有不均匀的粒度。在分离过程中，小的凝胶珠将聚结在凝胶珠之间的间隙中来提高柱背压，甚至由于不均匀的粒度而导致不发生分离。当凝胶珠被用来植入细胞时，由于它们不均匀的粒度，每个珠植入了不同数目的细胞中，并且在细胞生长过程中出现不同的增殖速率。另外，具有均匀粒度的琼脂糖凝胶珠对于研究凝胶性能是非常重要的。不均匀的粒度将导致珠子复杂的特性。另外，在这些传统的制备方法中，控制所制备的珠子的粒度以及制备小尺寸的例如低于大约10μm的珠子是非常困难的。
CN200410000087.9描述了使用传统多微孔隔膜乳化来制备具有可控的均匀粒度的琼脂糖凝胶珠(下文所示的使用传统的隔膜乳化法来制备琼脂糖凝胶珠)。该传统的隔膜乳化能够产生均匀尺寸的粒子。在这种方法中，选择不同孔径的隔膜来制备粒度范围为3-60μm的珠子。具有更小的粒度例如小于10μm粒度的琼脂糖凝胶珠是用具有相应的小孔径的隔膜来制备的。乳化速率在高氮气压力时是非常缓慢的。增高的压力能够将乳化速率提高到某种程度，但是太高的压力表现出降低了珠子的粒度均匀性。当珠子具有高的琼脂糖含量时，高压力导致了珠子粒度分布显著变宽。这被认为是这种传统方法在某些应用中的基本缺陷，在所述的应用中高琼脂糖含量和小粒度都是重要的。
在色谱分离和生物分子净化过程中，分离介质能够经受住高流速是一个优势。因此，与广泛用于生物分离领域中的琼脂糖介质相关的某些问题是已知的。作为公知的，琼脂糖凝胶结构是通过氢键的相互作用而形成的。在凝胶态，多糖链将通过链间交错的氢键而形成多孔的网状结构。这种通过非共价结构而形成的凝胶具有低的机械强度，并因此不能经受住非常高的流速。使用两种方法提高琼脂糖凝胶珠的强度。
US4665164(
Figure G2008800137454D00031
Pernemalm，Mats Lindgren和
Figure G2008800137454D00032
Lindgren。1984。Polysaccharide crosslinked separation material and itspreparation)涉及将化学交联，即共价键，引入到多糖链的羟基基团之间来提高该凝胶的机械强度。以一种恒定的交联密度，一种可选择的方法是通过提高水相中的琼脂糖溶液浓度，来提高凝胶珠中的琼脂糖含量。但是，随着琼脂糖水溶液浓度的升高，它的粘度也升高了。在使用传统的隔膜乳化方法来制备琼脂糖凝胶珠的情况中，水性粘度的升高导致了乳液制备加工困难。由于水性的高粘度，所形成的液滴非常难以从隔膜表面分离。在这里形成小尺寸液滴的情况中，在长时间的乳化加工之后，这些液滴将堵塞隔膜孔。该试验结果显示当使用传统的多微孔隔膜乳化方法来制备小粒度和高琼脂糖含量的凝胶珠时，水相的高粘度导致了甚至在高压时缓慢的W/O乳液制备加工。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种制备琼脂糖凝胶珠的方法，该方法避免了一种或多种上面所讨论的缺陷。该方法在一个或多个附加的权利要求中进行定义。
本发明的一个特定方面是一种上述的方法，其产生了小粒度的琼脂糖凝胶珠，例如平均粒度小于10μm。在另一方面，本发明涉及一种制备琼脂糖珠的方法，其中琼脂糖含量高达20wt％(基于总珠重量)。
在另外一方面，本发明涉及一种小粒度的琼脂糖凝胶珠。在一种特定的实施方案中，这样的粒子的一个群体将具有低于10μm的平均粒度，和/或均匀粒度。在一方面，本发明提供一个琼脂糖凝胶珠的群体，其具有小于10μm的平均粒度。在一种特定的实施方案中，所述珠的琼脂糖含量高达20wt％(基于总珠重量)。
本发明另外的方面和优势将在下面的详细说明中呈现。
附图说明
图1是一种制备小粒度的琼脂糖凝胶珠的原理示意图；
图2是一种均匀乳液制备装置的示意图；
图3是实施例1所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片；
图4是对比例1所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片；
图5是对比例2所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片；
图6是对比例3所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片；
图7是对比例1、2和3以及实施例1所制备的琼脂糖凝胶珠所测量的粒度分布；
图8是用不同孔径的隔膜所制备的琼脂糖凝胶珠的平均粒度与隔膜孔径之间的关系；
图9是具有不同的琼脂糖含量的珠子的平均粒度与琼脂糖溶液浓度之间的关系；和
图10是具有不同的琼脂糖含量的珠子的变异系数与琼脂糖溶液浓度之间的关系。
具体实施方式
简而言之，本发明使用了一种改进的隔膜乳化方法来制备琼脂糖珠，该珠子可以具有相当小的粒度。除非另有规定，否则在本发明的说明书和权利要求中，本发明中的粒度以μm给出，浓度以wt％给出，温度以℃给出。本发明现在将进行更详细的描述。
本发明的第一方面是一种制备琼脂糖凝胶珠的方法，该方法包含下面的步骤：
(a)提供包含琼脂糖的琼脂糖水相W；
(b)提供水不混溶的油相O，在其中溶解有至少一种乳化剂；
(c)混合该水相W和油相O来获得W/O乳液；
(d)施加压力来使该乳液通过疏水的多微孔隔膜，来获得W/O乳液；和
(e)降低该W/O乳液滴的温度，来形成琼脂糖凝胶珠。
更明确的，在步骤(a)中，提供了一种琼脂糖水溶液，其具有一个预设的浓度。该步骤(a)所提供的溶液将构成本发明方法中的含水相，或者水相，并因此表示为W(用于表示水)。因此，该琼脂糖溶液将在水不混溶相中形成含水的小滴。在一种实施方案中，琼脂糖在这种溶液中的浓度是0.1wt％-20.0wt％，更特别的是4.0-15.0wt％；例如≥6.0或者≥12.0wt％。
在步骤(b)中提供了油相。该相包含油性物质，在其中溶解/分散了至少一种油溶性和/或油分散性乳化剂。这种相与水是不混溶的，并因此表示为O(用于表示油)。
在步骤(c)中，提供了水相W和油相O之间的混合来获得一种乳液。在一种实施方案中，水相与油相的体积比是1∶1到1∶1000，并更特别的是1∶2到1∶10。
在步骤(d)中，通过施加压力来使得所述的乳液，即步骤(c)所提供的乳液，通过疏水的多微孔隔膜。在一种实施方案中，步骤(d)中的压力是0.5-3.0kgf/cm2。在一种实施方案中，使该乳液以相对高的流速通过所述隔膜。在另外一种实施方案中，隔膜是玻璃隔膜。在一种特定的实施方案中，隔膜是玻璃隔膜，其已经根据公知的方法进行化学处理来赋予了疏水性。这样的疏水玻璃隔膜是市售的产品。在另外一种实施方案中，隔膜是由本身疏水性材料制成的。在上下文中，术语“疏水的”被理解为表示隔膜具有足够允许制备此处所公开的凝胶珠的疏水性。该隔膜可以具有任何类型的基本孔结构，例如诸如具有弯孔或者垂直于隔膜表面的直圆柱孔的网状孔结构。隔膜的形状可以是例如管状的、中空纤维的、平板的或者折叠片的。在一种实施方案中，用于驱使乳液通过隔膜的压力被设定在一个预先选择的值。根据本发明，通过使用预定压力值的压力来使得琼脂糖滴的乳液通过隔膜，可以获得具有均匀粒度的W/O乳液。在一种实施方案中，本发明方法中所用的多微孔隔膜的孔径是2-50μm，例如2-40或者2-30或者甚至2-20μm。在另外一种实施方案中，所施加的压力是0.5-3.0kgf/cm2。如同本领域技术人员将认识到的那样，有利的压力值将取决于隔膜孔径、水相中的琼脂糖含量和温度。例如，当使用孔径为10.2μm的隔膜在低于65℃来制备琼脂糖含量为10wt％的珠子时，合适的压力是1.0kgf/cm2；当使用孔径为5.7μm的隔膜在低于65℃来制备琼脂糖含量为10wt％的珠子时，合适的压力是2.5kgf/cm2。在一种实施方案中，乳液将以0.5-1.5m3m-2h-1通过多微孔隔膜。因此有利的速率将取决于隔膜孔径、水相中琼脂糖含量、温度和压力。当使用孔径为10.2μm的隔膜在1.0kgf/cm2来制备琼脂糖含量为10wt％的珠子时，乳液生产速率将是大约0.8m3m-2h-1，这意味着该乳化过程是即刻完成的。
有利的，步骤(c)和(d)是在高于环境温度的温度进行的。在一种特定的实施方案，步骤(c)的操作温度取决于水相中的琼脂糖含量以及用于琼脂糖的原材料。当该原材料与琼脂糖类型相同时，所述的温度取决于水相中的琼脂糖含量，即，含量越高，温度越高。作为一个例子，采用的是高熔点的琼脂糖。当水相中的琼脂糖含量是4wt％时，所述温度是60℃；当水相中的琼脂糖含量是8wt％时，所述温度是65℃；当水相中的琼脂糖含量是12wt％时，所述温度是70℃。在水相中的琼脂糖含量相同的情况中，所述的温度取决于琼脂糖的类型。作为一个例子，采取的是水相中含量为4wt％的琼脂糖。在使用低熔点的琼脂糖的情况中，所述的温度是40℃，而在高熔点琼脂糖的情况中，所述的温度是60℃。
在步骤(e)中，使W/O乳液滴凝固，即凝胶成为琼脂糖珠。在一种实施方案中，步骤(e)中的操作温度是大约15℃。
如同将要在下面更详细讨论的那样，本发明方法可以用来制备小粒度的琼脂糖珠。这样的珠子例如作为色谱填料，例如在凝胶过滤方法中是有用的。
在本发明方法的一种特定的实施方案中，增加了一种另外的步骤，其包含在步骤(e)之后，将官能度加入到凝固的琼脂糖珠中。本领域技术人员充分的知晓加入这样的官能度的方法，该官能度可以是例如带电的基团，用于离子交换色谱法中所用的珠子。
作为一个通用的例子，一种疏水玻璃的化学修饰表面可以用作本发明方法的多微孔隔膜。将油相和水相进行均化和乳化，或者高温混合来获得W/O乳液；使该乳液在高压下快速的通过多微孔隔膜来降低乳液中液滴的尺寸。将它重复乳化来获得具有均匀粒度的乳液。将乳液冷却和凝固来获得具有均匀粒度的琼脂糖珠。本发明新颖的隔膜乳化方法可以用来制备具有均匀尺寸并且粒度小于10μm的琼脂糖珠。当琼脂糖浓度高到20wt％时，所获得的珠子有利的仍然将具有高的粒度均匀性。本发明可以用来制备平均粒度小于10μm的、均匀粒度和高琼脂糖含量的珠子的群体，以及还用来通过选择不同的隔膜孔径来控制所获得的珠子的平均粒度。
在本发明的一种特定的实施方案中，制备方法包括下面的步骤：
(a)将琼脂糖加热和溶解在蒸馏水中，来获得用作水相的溶液。
(b)将至少一种乳化剂溶解在水不混溶的油相中，并优选进行预热。
(c)将水和油相快速混合、均化和乳化，然后机械搅拌来获得W/O乳液。
(d)将该乳液在高温和高压下快速通过疏水的多微孔隔膜来获得具有基本均匀的液滴尺寸的W/O乳液。为了获得甚至更均匀的液滴尺寸，可以将每次所获得的乳液用作乳液来重复的通过隔膜孔；
(e)将该乳液转移到冷却装置中，在慢速搅拌和低于15℃的温度下进行冷却，以使得乳液滴凝固成具有基本均匀尺寸的凝胶的琼脂糖珠。在有利的条件下，将该琼脂糖凝胶珠的粒度分布系数控制在15％以下，并且通过隔膜孔径来将粒度控制在1-10μm(不包括10μm)。
根据本发明，乳化方法可以在高于环境温度进行，因为不同浓度的琼脂糖溶液具有不同的凝固温度和不同的隔膜乳化温度。浓度越高，该温度越高。虽然琼脂糖溶液具有相同的浓度和不同的凝固温度，但是当它用作水相来快速通过隔膜进行乳化时，它仍然需要不同的温度。在相同浓度的水相的情况中，低熔点的琼脂糖需要低的温度，高凝固温度的琼脂糖需要高的温度。
在一种有利的实施方案中，本发明方法中的压力是相对高的。合适的压力将取决于隔膜孔径、水相中的琼脂糖含量和温度。例如，当使用孔径为10.2μm的隔膜在低于65℃来制备琼脂糖含量为10wt％的珠子时，该压力是1.0kgf/cm2；当使用孔径为5.7μm的隔膜在低于65℃来制备琼脂糖含量为10wt％的珠时，该压力是2.5kgf/cm2。
本发明的方法可以用来制备琼脂糖凝胶珠，该凝胶珠用于分离和净化化学活性物质或者用作包封细胞和药物的载体。该珠的尺寸可以小于10μm，和/或琼脂糖含量高到20wt％。因此，本发明方法的一个优点是均匀的粒度是受控的。因此，本发明解决了这样的问题，即，传统的隔膜乳化方法不能获得均匀和可控的粒度以及不能制备小粒度和高琼脂糖含量的珠子的问题，并且本发明的方法能够用来快速制备相当小的珠子，例如粒度小于10μm的珠子，和/或琼脂糖浓度高到20wt％的珠子。
本发明的第二方面是如上所述来制备的至少一种琼脂糖珠。在一种特定的实施方案中，本发明的这个方面是一种小粒度的琼脂糖凝胶珠。在上下文中，术语“小”粒度表示在这样的珠群体中，平均粒度低于10μm。在另外一种实施方案中，本发明的珠群体将具有基本上均匀的粒度。在一种特定的实施方案中，所述珠子的琼脂糖含量高到20wt％(基于总珠重量)。更明确的，根据下式所计算的变异系数不大于15％：
C.V.＝{[∑(di-d)2/N]1/2/d}×100％
其中C.V.是变异系数，di是珠直径，d是数均粒度，N是用于粒度计算的珠子数，并且N≥200。
本发明中所采用的多微孔隔膜的孔径可以是如上所述的例如2-20μm，并且所制备的珠子的平均粒度与所采用的隔膜孔径是线性相关的。因此具有所需粒度的琼脂糖珠可以通过改变隔膜孔径来制备。
本发明的一些优点如下。本发明的制备方法可以用来制备用作生物分离介质的琼脂糖凝胶珠，还可以用来制备用作活细胞或者基因的载体的琼脂糖凝胶珠，所述的载体用来提供有助于细胞增殖的小环境和红细胞浆质处理效应以及有效的避免红细胞浆质淋巴球的识别和免疫排斥。
此外，由于所具有的均匀粒度，本发明的凝胶珠被用作分离介质来有效的提高分离效应和分离不能用通常的介质进行分离的化学活性物质。
另外，本发明可以提供了具有不同琼脂糖含量的凝胶珠。该凝胶珠可以用来有效的研究具有不同孔径和不同尺寸的大分子物质，例如蛋白质，核酸等与它们的分离效应之间的关系，并且寻找最适孔径的凝胶珠来分离不同的物质。本发明的制备方法可以用来容易的制备难以用传统乳化方法制备的高琼脂糖含量的凝胶珠，以获得具有高机械强度的和在高压快速分离化学活性物质的凝胶珠。
本发明的制备方法使用温和的条件。作为活性物质例如活细胞等的载体，所述的珠被期望保持它的化学活性和化学稳定性。作为细胞和药物载体，所述的珠确保了植入物质的均匀分布以及快速和正确的随后分离。本发明需要简单的试验装置，并且不使用泵或者搅拌器来产生连续相的流动，并且具有这样的特征如容易的按比例使用的方法，和简单的制备方法，容易的操作控制和快的乳液形成。
在第三方面，本发明涉及一种色谱柱，其填充有此处所述的琼脂糖珠。该色谱柱可以用于下列物质的分离、离析或者净化方法中：有机和/或生物物质和成分，例如蛋白质，例如抗体或者其碎片或者融合蛋白质，缩氨酸，核酸，例如质体，病毒，细胞，脂质等等。该色谱柱可以用于例如凝胶过滤中，或者离子交换方法，这取决于本发明所制备的琼脂糖珠的实际性能。在一个可选择的方面，官能化来制备用于下面的色谱介质：疏水交互色谱法(HIC)；混合的或者多模式色谱法；或者亲合色谱法。
附图详细说明
图1是一种制备根据本发明的具有小粒度的琼脂糖凝胶珠的原理示意图。更明确的，将琼脂糖的热水溶液与热的油相进行混合，使用搅拌机制备了初始的w/o乳液。然后驱使该乳液通过隔膜来获得具有均匀尺寸滴的乳液。
图2表示了一种均匀乳化制备装置的示意图。在图2中，附图标记表示如下：1-氮气入口；2-压力表；3-排气阀；4-绝热层；5-乳液存储槽；6-排气阀；7-隔膜；8-均匀乳液收集器。
图3表示了一种实施例1所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片。获得了一种5.1微米平均直径的均匀尺寸的珠子。在图3中，1cm对应于50微米。
图4表示了一种对比例1所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片。通过搅拌器乳化来制备大的多分散性珠子。在图4中，1cm对应于50微米。
图5表示了一种对比例2所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片。通过搅拌器乳化来制备大的多分散性珠子。在图5中，1cm对应于50微米。
图6表示了一种对比例3所制备的琼脂糖凝胶珠的光学显微镜照片。获得了通过传统的隔膜乳化制备的平均直径为3.7微米，C.V.为18％的珠子。在图6中，1cm对应于50微米。
图7表示了所测量的对比例1、2和3和实施例1所制备的琼脂糖凝胶珠的粒度分布。X轴表示琼脂糖珠的尺寸/(微米)，Y轴表示体积(％)。在图7，曲线1-对比例3，曲线2-实施例1，曲线3-对比例2，曲线4-对比例1。
图8表示了用不同孔径的隔膜所制备的琼脂糖凝胶珠的平均粒度(琼脂糖珠的平均直径/(微米)表示在Y轴上)与隔膜孔径(隔膜孔尺寸/(微米)表示在X轴上)之间的关系。如该图所示，获得了斜率为0.46的一种线性关联：y＝0.46x+0.5569，R2＝0.9878。
图9表示了不同的琼脂糖含量所制备的珠子的平均粒度与该琼脂糖溶液浓度之间的关系。X轴表示了水相中的琼脂糖浓度，而Y轴表示了琼脂糖珠的数均直径/(微米)。如该图所示，粒度不明显的取决于琼脂糖浓度。
图10表示了不同的琼脂糖含量所制备的珠子的粒度变异系数与该琼脂糖溶液浓度之间的关系。X轴表示了水相中的琼脂糖浓度，而Y轴表示C.V*100。如该图所示，依照本发明，可以获得C.V.为10％，并且具有至少高到20％的琼脂糖浓度的珠子。
试验部分
本发明所提供的琼脂糖珠制备方法将使用实施例来描述。下面的实施例仅仅是作为说明性目的而提供的，并且其不应当被解释为对由附加的权利要求所定义的本发明的限制。
琼脂糖凝胶珠是按照图1所示步骤如下来制备的。
1)W/O乳液制备
将琼脂糖、NaCl和其他添加剂加入到水中，并在加热下充分溶解来形成用作水相的混合物，将一种油溶性乳化剂溶解在油性流体中，并且加热到一定的温度来形成用作油相的混合物。将水和油相快速混合和均化以及乳化或者搅拌来获得W/O乳液，将该乳液在高温和高压下通过疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。所述的方法在图2所示的装置中完成。将该乳液转移到冷却装置中，并在缓慢搅拌下冷却到低于15℃，以使得乳液滴凝固成均匀尺寸的琼脂糖凝胶珠。
琼脂糖溶液可以制备成所需的浓度。不同浓度的琼脂糖溶液需要不同的隔膜乳化温度，因此可以选择所需的浓度。在细胞或者药物载体的制备过程中，将琼脂糖在高温溶解，并冷却到这样的温度，该温度对于细胞或者药物来说是可以忍受的，但是该温度不低到足以产生琼脂糖溶液凝固的温度。将该溶液与细胞或者药物充分混合，并用作水相。水相添加剂可以包括对人体无害的水溶性物质，例如清蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等等。油相在环境温度时是液体，并且是水不溶性油性物质，因此液体石蜡和石油醚、橄榄油、棉花籽油、豆油、向日葵籽油或者其他烷烃，或者它们的混合物可以用作油相。优选的油相通常具有高的沸点和低的挥发性。油性乳化剂必须溶解在该油相中，因此可以使用脱水山梨糖醇倍半油酸酯(Arlace183)，甘油醚聚合物(例如Sakamoto YakuhinKogyo Co Ltd.PO-500，PO-310)，聚乙二醇氢化蓖麻油，脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)，脱水山梨糖醇单油酸酯(Span 80)，脱水山梨糖醇三硬脂酸酯(Span 65)或者亲脂-亲水嵌段聚合物的油性乳化剂。油相中的乳化剂的浓度是0.5-1.0wt％，并且水相与油相的体积比是1∶1-1∶1000。
2)琼脂糖凝胶珠的制备
将步骤1)中所获得的乳液转移到冷却装置中，并且在缓慢搅拌下冷却到低于15℃，以使得该乳液滴凝固。将所获得的凝胶珠存储在蒸馏水中。
在凝胶的凝固过程中，温度以低于2℃/min的速度缓慢降低，并且缓慢进行搅拌，搅拌速度是50-200rpm。
在乳液滴凝固之后，将所获得的凝胶珠依次用石油醚、乙醇、蒸馏水清洗(在用作细胞载体的情况中，不能使用丙酮或者乙醇来清洗它)，并将所获得的凝胶存储在环境温度或者低温的蒸馏水或者细胞培养流体中。
实施例1
将孔径为10.2μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为10wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约4g的水相和油相在6000rpm进行混合和均化以及乳化30秒，然后将所获得的乳液快速转移到预热到65℃的隔膜乳化装置中，并以1.0kgf/cm2快速通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液作为乳液以1.0kgf/cm2通过疏水隔膜，以使它能够被乳化三次。乳化后，将该乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的搅拌速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为5.11μm，C.V.是9.8％，图3所示的光学显微镜照片中的珠子具有均匀的粒度。
对比例1(机械搅拌方法)
类似于实施例1的程序，将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为10wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到20ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约6g的水相转移到油相，并在1000rpm搅拌30分钟来获得W/O乳液，将其快速转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的搅拌速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser ParticleSizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为15.34μm，C.V.是115.97％，图4所示的光学显微镜照片中的珠子具有不均匀的粒度。
对比例2(均乳化方法)
类似于实施例1的程序，将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为10wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约6g的水相转移到油相，并在6000rpm搅拌60秒来获得W/O乳液，将其快速转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的旋转速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser ParticleSizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为15.48μm，C.V.是84.34％，图5所示的光学显微镜照片中的珠子具有不均匀的粒度。
对比例3(传统隔膜乳化方法)
将孔径为1.4μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为10wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到60ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约6g的水相转移到预热到65℃的隔膜乳化装置中的油相中，并以0.75kgf/cm2缓慢通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜，并进入油相来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的搅拌速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为3.69μm，C.V.是17.97％，图6所示的光学显微镜照片中的珠子具有不均匀的粒度。
对实施例1和对比例1、2和3所制备的琼脂糖凝胶珠的粒度分布进行对比，如图7所示，使用快速隔膜乳化方法所获得的珠子具有最均匀的粒度。
实施例2
将孔径为5.7μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为10wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约4g的水相和油相在6000rpm进行混合和均化以及乳化30秒，然后将所获得的乳液快速转移到预热到65℃的隔膜乳化装置中，并以2.5kgf/cm2快速通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液作为乳液以2.5kgf/cm2通过疏水隔膜，以使它能够被乳化三次。乳化后，将该乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的搅拌速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为3.06μm，C.V.是19.18％。
实施例3
将孔径为15μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为10wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约4g的水相和油相在6000rpm进行混合和均化以及乳化30秒，然后将所获得的乳液快速转移到预热到65℃的隔膜乳化装置中，并以0.8kgf/cm2快速通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液作为乳液以0.8kgf/cm2通过疏水隔膜，以使它能够被乳化三次。乳化后，将该乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的旋转速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为7.66μm，C.V.是6.72％。
实施例4
将孔径为19μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为10wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约4g的水相和油相在6000rpm进行混合和均化以及乳化30秒，然后将所获得的乳液快速转移到预热到65℃的隔膜乳化装置中，并以0.6kgf/cm2快速通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液作为乳液以0.6kgf/cm2通过疏水隔膜，以使它能够被乳化三次。乳化后，将该乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的旋转速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为9.02μm，C.V.是14.66％。图8表示了实施例1、2、3和4所制备的珠子的平均粒度与隔膜孔径之间的关系。从图8中可以看到平均粒度与隔膜孔径具有线性关系，并且平均珠尺寸大约是隔膜孔径的0.46倍。
实施例5
将孔径为10.2μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为4wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约4g的水相和油相在6000rpm进行混合和均化以及乳化30秒，然后将所获得的乳液快速转移到预热到65℃的隔膜乳化装置中，并以1.0kgf/cm2快速通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液作为乳液以1.0kgf/cm2通过疏水隔膜，以使它能够被乳化三次。乳化后，将该乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的搅拌速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为5.66μm，C.V.是11.66％。
实施例6
将孔径为10.2μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为8wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约4g的水相和油相在6000rpm进行混合和均化以及乳化30秒，然后将所获得的乳液快速转移到预热到65℃的隔膜乳化装置中，并以1.0kgf/cm2快速通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液作为乳液以1.0kgf/cm2通过疏水隔膜，以使它能够被乳化三次。乳化后，将该乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的搅拌速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为5.09μm，C.V.是12.06％。
实施例7
将孔径为10.2μm的疏水隔膜浸泡到亲脂性物质中来完全润湿多孔隔膜，并在该隔膜上彻底铺展疏水链。将琼脂糖和NaCl正确的称量到水中来确保琼脂糖浓度为20wt％，NaCl浓度为0.9wt％。将它们加热和完全溶解在水中来形成溶液，将该溶液保持在低于65℃。将油溶性乳化剂PO-500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7∶5)中来确保浓度为4wt％，搅拌直到它们彻底溶解来形成用作油相的混合物，并加热到65℃。在加热下，将大约4g的水相和油相在6000rpm进行混合和均化以及乳化30秒，然后将所获得的乳液快速转移到预热到80℃的隔膜乳化装置中，并以1.4kgf/cm2快速通过具有均匀孔径的疏水多微孔隔膜来获得具有均匀粒度的W/O乳液。使所获得的乳液作为乳液以1.4kgf/cm2通过疏水隔膜，以使它能够被乳化三次。乳化后，将该乳液转移到冷却装置，并且在空气中在50rpm的搅拌速度搅拌下缓慢冷却到室温，然后加入少量的冰到水浴中来持续的将乳液冷却到低于15℃，以使琼脂糖乳液滴凝固。过滤所获得的凝胶珠，用石油醚、乙醇和蒸馏水依次清洗，并存储在蒸馏水中。在Laser Particle Sizer Mastersizer 2000E中测量所述珠子的平均粒度分布。在水中的珠子的平均直径为5.70μm，C.V.是10.22％。图9和10表示了不同浓度的琼脂糖凝胶珠的平均粒度和粒度分布系数与浓度之间的关系。当琼脂糖浓度高到20wt％时，琼脂糖能够用来获得具有均匀粒度的琼脂糖凝胶珠。

Claims (13)

1.一种制备琼脂糖凝胶珠的方法，该方法包含下面的步骤：
(a)提供包含琼脂糖的琼脂糖水相W；
(b)提供水不混溶的油相O，在其中溶解有至少一种乳化剂；
(c)混合该水相W和油相O来获得W/O乳液；
(d)施加压力来使该乳液通过疏水的多微孔隔膜，来获得W/O乳液；和
(e)降低该W/O乳液滴的温度，直到形成琼脂糖凝胶珠。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)中的压力是0.5-3.0kgf/cm2。
3.根据权利要求1或者2的方法，其中在步骤(d)中，乳液通过多微孔隔膜的流速是0.5-1.5m3m-2h-1。
4.根据权利要求1或者2的方法，其中多微孔隔膜的孔径是2-20μm。
5.根据权利要求1或者2的方法，其中在步骤(a)中，琼脂糖的浓度是0.1wt％-20.0wt％。
6.根据权利要求1或者2的方法，其中步骤(a)、(c)和(d)是在加热下进行的。
7.根据权利要求1或者2的方法，其中步骤(d)产生了粒度基本上均匀的琼脂糖凝胶珠。
8.根据权利要求1或者2的方法，其包括步骤：将官能度加入到获自步骤(e)的琼脂糖凝胶珠中。
9.根据权利要求8的方法，其中加入官能度的步骤包括加入带电基团。
10.根据权利要求1-7中任何一个所制备的琼脂糖凝胶珠，其的平均粒度小于10μm。
11.根据权利要求10的琼脂糖凝胶珠，其中粒度分布的变异系数小于15％，该变异系数如下式计算：
C.V.＝{[∑(d1-d)2/N]1/2/d}×100％
其中C.V.是变异系数，
di是珠直径，
d是数均粒度，
N是用于粒度计算的珠子数，并且N≥200。
12.一种色谱柱，其包含根据权利要求10-11中任意一个的琼脂糖凝胶珠。
13.权利要求12的色谱柱在凝胶过滤中的用途。
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