WO2022024754A1 - 微小粒子の製造方法 - Google Patents

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fine particles
oil
mbp
aqueous phase
production method
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Inventor
高史 林
晃 小野田
俊介 加藤
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2/00—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic
    • B01J2/02—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops
    • B01J2/06—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops in a liquid medium
    • B01J2/08—Gelation of a colloidal solution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/291—Gel sorbents

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fine particles and the like.
  • Maltose-binding protein is a useful affinity tag that can be used by fusing with the target recombinant protein.
  • MBP Maltose-binding protein
  • the MBP tag is particularly superior to other commonly used purification tags such as His tag, GST tag, and Strep in terms of improving solubility, and is highly useful in the purification of proteins having a large molecular weight.
  • Affinity chromatography with amylose resin is widely used for purification of MBP fusion protein (Patent Document 1).
  • amylose resin is made by chemically modifying an amylose molecule with a bead carrier such as cepharose, and is very expensive. Since a large amount of chromatographic carrier is required for large-scale purification and large-scale screening of recombinant proteins, it has been desired to develop a cheaper chromatographic carrier.
  • An object of the present invention is to provide a simpler method for producing fine particles, which is more useful as a carrier for purifying a substance with an MBP tag, and the fine particles obtained thereby.
  • the present inventor gelled the aqueous phase of the water-in-oil emulsion containing an oil phase and an aqueous phase containing a maltose unit-containing saccharide and a gelling polysaccharide. It has been found that fine particles useful as a carrier for purifying a substance with an MBP tag can be easily produced.
  • the present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A method for producing fine particles, which comprises gelling the aqueous phase of a water droplet type emulsion in oil containing an oil phase and an aqueous phase containing a maltose unit-containing saccharide and a gelling polysaccharide.
  • Item 2. The production method according to Item 1, wherein the maltose unit-containing polysaccharide is at least one selected from the group consisting of starch, amylose, and amylopectin.
  • Item 3 The production method according to Item 1 or 2, wherein the maltose unit-containing polysaccharide is soluble starch.
  • Item 4. The manufacturing method described in Crab.
  • Item 5 The production method according to any one of Items 1 to 4, wherein the gelling polysaccharide is agarose.
  • Item 6. The production method according to any one of Items 1 to 5, wherein the content of the maltose unit-containing saccharide in the aqueous phase is 0.5 to 3 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the solvent constituting the aqueous phase.
  • Item 7. The production method according to any one of Items 1 to 6, wherein the content of the gelling polysaccharide in the aqueous phase is 2 to 6 parts by mass with respect to 100 parts by mass of water.
  • Item 8 The production method according to any one of Items 1 to 7, wherein the gelation method is cooling of the water-in-oil emulsion.
  • Item 9 Fine particles obtained by the production method according to any one of Items 1 to 8.
  • Item 10 The fine particles having a particle diameter of less than 1 mm.
  • Item 11 The fine particles according to Item 9 or 10, which is a carrier for purifying a substance with an MBP tag.
  • Item 12 A method for producing a purified product of an MBP-tagged substance, which comprises competitively eluting the MBP-tagged substance from the fine particles according to any one of Items 9 to 11 to which the MBP-tagged substance is bound.
  • Example 2 An optical micrograph of starch / agarose beads (Example 1) is shown.
  • the relative ratio of the amount of protein binding to beads / resin calculated in Example 2 is shown.
  • the present invention comprises gelling the aqueous phase of a water-in-oil emulsion containing an oil phase and an aqueous phase containing a maltose unit-containing saccharide and a gelling polysaccharide.
  • the present invention relates to a method for producing fine particles (in the present specification, it may be referred to as “the production method 1 of the present invention”). Further, the present invention relates to fine particles (in the present specification, may be referred to as "fine particles of the present invention") obtained by the production method 1 of the present invention in one aspect thereof. These will be described below.
  • the organic solvent constituting the oil phase is not particularly limited as long as it can form a water-drop emulsion in oil with an aqueous solvent and is in a liquid state even when cooled (for example, 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C).
  • the organic solvent include non-polar oils such as hydrocarbon oils and silicone oils; polar oils such as fatty alcohols and esters. Among these, non-polar oil is preferable.
  • hydrocarbon oil examples include lower alkanes having 6 to 16 carbon atoms, which may be linear, branched or cyclic. For example, hexane, undecane, dodecane, tridecane, isoparaffin and the like. Alternatively, it may be a linear or branched hydrocarbon having 17 or more carbon atoms, for example, liquid paraffin, liquid vaseline, polydecene, hydride polyisobutene, olive oil, sesame oil, rice bran oil, safflower oil, large. Examples thereof include soybean oil, corn oil, rapeseed oil, palm oil, palm kernel oil, sunflower oil, almond oil, cottonseed oil, palm oil, peanut oil, fish oil, squalane, and squalane.
  • the silicone oil may be, for example, dimethylpolysiloxane, tristrimethylsiloxymethylsilane, caprylylmethicone, phenyltrimethicone, tetraxtrimethylsiloxysilane, methylphenylpolysiloxane, methylhexylpolysiloxane, methylhydrogenpolysiloxane, dimethylsiloxane / methylphenyl.
  • Linear or branched organopolysiloxanes with low to high viscosity such as siloxane copolymers, octamethylcyclotetrasiloxane, decamethylcyclopentasiloxane, dodecamethylcyclohexasiloxane, tetramethyltetrahydrogencyclotetrasiloxane, Cyclic organopolysiloxane such as tetramethyltetraphenylcyclotetrasiloxane, silicone rubber such as gum-like dimethylsiloxane / methylphenylsiloxane copolymer, cyclic organopolysiloxane solution of silicone gum or rubber, alkyl-modified silicone, long-chain alkyl Examples thereof include modified silicones, silicone resins, and lysates of silicone resins.
  • examples thereof include cyclic organopolysiloxanes such as organopolysiloxanes and octamethylcyclotetrasiloxanes.
  • the above silicone oil may be organically modified.
  • the organically modified silicone oil is a silicone oil having one or more organic functional groups in the structure of the silicone oil, and is, for example, an amino-modified silicone oil, an epoxy-modified silicone oil, a polyether-modified silicone oil, or a carboxy-modified silicone. Examples thereof include oils, alcohol-modified silicone oils, alkyl-modified silicone oils, ammonium salt-modified silicone oils, and modified silicone oils such as fluorine-modified silicone oils.
  • Aliphatic alcohols have an R-OH structure, where R is a saturated or unsaturated linear chain with 4-40 carbon atoms, preferably 6-30 carbon atoms, more preferably 12-20 carbon atoms. Alternatively, it is a branched monovalent hydrocarbon group. For example, an alkyl group having 12 to 20 carbon atoms and an alkenyl group can be mentioned. R may be substituted with at least one hydroxyl group.
  • aliphatic alcohol examples include lauryl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol, isostearyl alcohol, behenyl alcohol, undecylenyl alcohol, myristyl alcohol, octyldodecanol, hexyldecanol, and mixtures thereof.
  • Ester oils are saturated or unsaturated linear or branched C1-C26 aliphatic monoacids or polyacids, and saturated or unsaturated linear or branched C1-C26 aliphatic monoalcohols, or It is a liquid ester obtained from a condensation reaction with a polyalcohol, and the total number of carbon atoms in this ester is preferably 10 or more.
  • ester oils are diisobutyl adipate, diethylhexyl succinate, cetyl 2-ethylhexanate, glyceryl tri-2-ethylhexanoate, hexyldecyl ethylhexanate, triethylhexanoin, neopentylglycoldiethylhexanate, and trimethyltrotriethylhexanoate.
  • the organic solvent constituting the oil phase may be one kind alone or a combination of two or more kinds.
  • the solvent (aqueous solvent) constituting the aqueous phase is usually water. It may also contain an organic solvent that is compatible with water, for example having 2 to 20 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, and preferentially 2 to 6 carbon atoms.
  • Organic solvent such as glycerol, propylene glycol, butylene glycol, pentylene glycol, hexylene glycol, dipropylene glycol, or diethylene glycol
  • glycol ethers such as mono, gee or tripropylene glycol alkyl ethers, mono, gee or triethylene glycol alkyl ethers Can be mentioned.
  • the solvent constituting the aqueous phase may be one kind alone or a combination of two or more kinds.
  • the aqueous phase contains maltose unit-containing saccharides and gelling polysaccharides.
  • the maltose unit-containing saccharide is not particularly limited as long as it is a saccharide containing a maltose unit (a disaccharide residue formed by ⁇ -1,4-glycosidic bond of two glucose residues).
  • the maltose unit-containing saccharide is preferably a saccharide containing a large amount of maltose unit, for example, the number of sugar residues constituting the maltose unit is 50% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more with respect to 100% of the constituent sugar residues. , Or 95% or more sugars.
  • Maltose unit-containing saccharides are almost insoluble in cold water (eg, 10 ° C or lower) (for example, 10000 mL or more of water is required to dissolve 1 g), and hot water (eg, 80 ° C or higher, 90 ° C or higher, Alternatively, it is preferably soluble at 95 ° C. or higher (for example, less than 30 mL of water is required to dissolve 1 g).
  • hot water eg, 80 ° C or higher, 90 ° C or higher, Alternatively, it is preferably soluble at 95 ° C. or higher (for example, less than 30 mL of water is required to dissolve 1 g).
  • Specific examples of the maltose unit-containing saccharide include starch, modified starch, amylose, and amylopectin.
  • starch amylose and the like are preferable, and starch is more preferable, from the viewpoint of performance as a carrier for purifying a substance with an MBP tag, manufacturing cost and the like.
  • soluble starch is particularly preferable from the viewpoint of performance as a carrier for purifying substances with MBP tags, production cost and the like.
  • the maltose unit-containing saccharide may be one kind alone or a combination of two or more kinds.
  • the content of the maltose unit-containing saccharide in the aqueous phase is such that the obtained fine particles function as a carrier for purifying the substance with the MBP tag, and the amount does not significantly inhibit gelation by the gelling polysaccharide.
  • the content is, for example, 0.1 to 15 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the solvent constituting the aqueous phase.
  • the content is preferably 0.2 to 10 parts by mass, more preferably 0.5 to 5 parts by mass, still more preferably 0.5 to 3 parts by mass, from the viewpoint of the performance of the MBP-tagged substance as a carrier for purification, the production cost, and the like. Even more preferably, it is 1 to 2 parts by mass.
  • the gelling polysaccharide is not particularly limited as long as it is a polysaccharide that gels by cooling and / or ionizing after dissolving in water.
  • a polysaccharide known ones can be widely used.
  • the dissolution temperature of the gelling polysaccharide in water is, for example, 65 to 95 ° C, preferably 75 to 95 ° C, and more preferably 85 to 95 ° C.
  • the gelling temperature of the gelling polysaccharide is, for example, 20 to 80 ° C, preferably 25 to 60 ° C, more preferably 25 to 50 ° C, still more preferably 30 to 45 ° C.
  • the dissolution temperature and gelation temperature of each polysaccharide are known, and for example, a website related to polysaccharides (for example, https://www.tatourui.com/about/03_outcome.html) can be referred to.
  • Specific examples of the gelling polysaccharide include agarose, carrageenan, pectin, gellan gum, sodium alginate, xanthan gum, locust bean gum, tamarind seed gum, curdlan and the like.
  • agarose is particularly preferable from the viewpoint of performance as a carrier for purifying a substance with an MBP tag, manufacturing cost, and the like.
  • the gelling polysaccharide may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the gelling polysaccharide in the aqueous phase is not particularly limited as long as the aqueous phase gels by cooling and / or ion addition.
  • the content is, for example, 0.5 to 10 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the solvent constituting the aqueous phase.
  • the content is preferably 1 to 8 parts by mass, more preferably 2 to 6 parts by mass, and further preferably 3 to 5 parts by mass from the viewpoint of the performance of the MBP-tagged substance as a carrier for purification, the production cost, and the like. be.
  • the aqueous phase may further contain other components.
  • an inorganic salt is preferable.
  • Inorganic salts facilitate the formation of fine particles suitable as carriers for the purification of MBP-tagged substances.
  • the inorganic salt is not particularly limited, and examples thereof include sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, magnesium sulfate and the like, and preferably sodium chloride and the like.
  • the inorganic salt may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the inorganic salt in the aqueous phase is, for example, 0.1 to 2 parts by mass, preferably 0.5 to 1.5 parts by mass, more preferably with respect to 100 parts by mass of the solvent constituting the aqueous phase. Is 0.8 to 1.1 parts by mass.
  • the water-in-oil emulsion preferably contains a surfactant from the viewpoint of forming and maintaining the water-in-oil emulsion.
  • the surfactant may be any of a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, and an amphoteric surfactant.
  • Preferred examples of the surfactant include nonionic surfactants.
  • nonionic surfactant examples include, but are not limited to, fatty acid esters, fatty alcohol ethoxylates, polyoxyethylene alkyl phenyl ethers, alkyl glycosides and fatty acid alkanolamides, and polyoxyethylene castor oil and hardened castor oil. ..
  • the fatty acid ester is not particularly limited, but a sugar fatty acid ester is preferable. Specific examples thereof include esters of fatty acids such as erucic acid, oleic acid, lauric acid, stearic acid and behenic acid with sugar (preferably sucrose).
  • the other fatty acid ester is not particularly limited, and examples thereof include an ester of at least one of glycerin, polyglycerin, polyoxyethylene glycerin, sorbitan, and polyoxyethylene sorbit and a fatty acid.
  • anionic surfactant examples include alkyl sulfate ester salts, polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salts, alkylbenzene sulfonates, fatty acid salts and phosphoric acid ester salts.
  • cationic surfactant examples include alkyltrimethylammonium salts, dialkyldimethylammonium salts, alkyldimethylbenzylammonium salts, amine salts and the like.
  • amphoteric tenside examples include alkylamino fatty acid salts, alkyl betaines, and alkyl amine oxides.
  • the surfactant may be one type alone or a combination of two or more types.
  • the content thereof is, for example, 0.3 to 10 parts by mass, preferably 1 to 6 parts by mass, more preferably 1 part by mass, based on 100 parts by mass of the organic solvent constituting the oil phase. It is 2.5 to 4.5 parts by mass.
  • the volume ratio of the organic solvent constituting the oil phase and the solvent constituting the aqueous phase in the water-in-oil emulsion is not particularly limited as long as the volume ratio is such that the water-in-oil emulsion can be formed and maintained.
  • the volume of the organic solvent constituting the oil phase is, for example, 100 to 500 volumes, preferably 130 to 300 volumes, from the viewpoint of the performance as a carrier for purifying the substance with the MBP tag, with respect to 100 volumes of the organic solvent constituting the aqueous phase. More preferably, it has a capacity of 150 to 200.
  • the water-in-oil emulsion is a mixture of the above-mentioned oil phase (containing a surfactant if necessary) and the above-mentioned aqueous phase (preferably, the organic solvent / solvent constituting each phase has the above-mentioned volume ratio. It can be obtained by mixing). It is preferable that each phase is heated to a temperature equal to or higher than the dissolution temperature of the maltose unit-containing saccharide and the gelling polysaccharide before mixing.
  • the temperature can be appropriately set depending on the type of maltose unit-containing saccharide and gelling polysaccharide, and is, for example, 50 to 95 ° C, 60 to 90 ° C, 70 to 90 ° C, or 75 to 85 ° C.
  • the aqueous phase it is preferable to dissolve the maltose unit-containing saccharide and the gelling polysaccharide in the solvent by this heating.
  • the mixing of the oil phase and the aqueous phase is carried out under heating that maintains the above temperature.
  • the mixing method is not particularly limited, but for example, a conventionally known stirrer such as a stirrer, a propeller blade, a turbine blade, and a paddle blade, a high-speed rotary centrifugal radiation stirrer such as a homodisper, and a high-speed such as a homomixer.
  • An emulsification disperser such as a rotary shear type stirrer can be used.
  • the particle size of the water droplets in the water droplet type emulsion in oil is preferably less than 1 mm.
  • the number average particle size of the water droplet is more preferably 5 to 800 ⁇ m, further preferably 10 to 500 ⁇ m, still more preferably 50 to 500 ⁇ m, and particularly preferably 50 to 300 ⁇ m, by controlling the particle size to such a size. , It is possible to obtain fine particles suitable as a carrier for purifying a substance with an MBP tag.
  • gelled fine particles containing maltose unit-containing saccharides and gelling polysaccharides are produced by gelling the aqueous phase of the aqueous droplet-type emulsion in oil.
  • the gelling method can be appropriately selected depending on the type of gelling polysaccharide.
  • a gelling polysaccharide that gels by cooling it can be gelled by cooling the water-in-oil emulsion to a temperature equal to or lower than the gelling temperature.
  • the gelation method is preferably cooling of the water-in-oil emulsion.
  • the gelling time can be appropriately set according to the gelling means and conditions, and is, for example, 10 to 60 minutes, preferably 30 to 60 minutes in the case of cooling with an ice bath.
  • the gelation method may be one type alone or a combination of two or more types.
  • the obtained fine particles can be recovered according to or according to a known method. For example, after the emulsion is dissolved with a demulsifier such as ethanol, the fine particles can be recovered by solid-liquid separation such as centrifugation. It is preferable to wash the recovered fine particles with a solvent such as water, if necessary. Further, it is preferable to store the product in an aqueous alcohol solution, for example, to prevent spoilage.
  • a demulsifier such as ethanol
  • a solvent such as water
  • the particle size of the fine particles of the present invention is preferably less than 1 mm.
  • the number average particle size of the fine particles is more preferably 5 to 800 ⁇ m, further preferably 10 to 500 ⁇ m, still more preferably 50 to 500 ⁇ m, and particularly preferably 50 to 300 ⁇ m.
  • fine particles useful as a carrier for purifying a substance with an MBP tag can be easily produced without requiring a chemical cross-linking step. Therefore, it is preferable that the fine particles of the present invention do not contain chemical crosslinks.
  • the fine particles of the present invention are obtained by the above-mentioned production method, in one embodiment, the maltose unit-containing saccharide and the gelling polysaccharide are present in a separate layer. It is considered that, for example, both are dispersed almost uniformly.
  • the fine particles of the present invention can be used as a carrier for purifying a substance with an MBP tag.
  • a method for producing a purified product of an MBP-tagged substance comprises, in one embodiment, competitively eluting the MBP-tagged substance from the fine particles of the present invention to which the MBP-tagged substance is bound. (In the present specification, it may be referred to as "the production method 2 of the present invention”). This will be described below.
  • the MBP tag is a protein tag consisting of the MBP (maltose-binding protein) itself or a variant in which a mutation (eg, substitution, deletion, insertion, addition, etc.) is introduced to the extent that the maltose-binding domain is not significantly impaired in the MBP. As long as it is, there is no particular limitation.
  • the substance with the MBP tag is not particularly limited as long as it is a substance to which the MBP tag is added.
  • the substance is typically a protein, but is not limited thereto, and can be, for example, a nucleic acid, a saccharide, a lipid, an inorganic particle, or a complex of various substances.
  • the maltose unit-containing saccharides in the fine particles of the present invention can be treated.
  • MBP tags combine.
  • the fine particles of the present invention to which the MBP-tagged substance is bound can be obtained.
  • the amount of substances other than the MBP-tagged substance attached can be reduced.
  • the MBP-tagged substance can be competitively eluted by contacting the fine particles of the present invention to which the MBP-tagged substance is bound with a solution containing a maltose unit-containing substance (preferably maltose).
  • a maltose unit-containing substance preferably maltose
  • the above series of steps can be performed using a column or without using a column (in a batch system).
  • fine particles having a particle size sufficient to secure a sufficient flow rate by natural dropping can be easily obtained, and the fine particles of the present invention can be used with respect to a substance with an MBP tag. Since it is possible to provide a certain level of bondability, it is preferable to perform the above series of steps using a column.
  • a solution containing a purified product of a substance with an MBP tag can be obtained.
  • a large amount of chromatographic carrier is required for large-scale purification and large-scale screening of recombinant proteins.
  • the production method 2 of the present invention using the fine particles of the present invention which can be produced at low cost, can be suitably used in mass purification and large-scale screening.
  • Example 1 Production of Starch / Agarose Beads ⁇ Example 1-1. Reagents used> ⁇ Ultrapure water: Merck Millipore Milli-Q integral 3 system. ⁇ Agarose: Sigma-Aldrich (A9359-50G, Agarose BioReagent for molecular biology, low EEO) -Soluble starch: Nacalai Tesque (32122-75, Nakarai standard first grade) ⁇ Sodium chloride: Nacalai Tesque (31333-45, characteristic reagent for molecular biology research) ⁇ Paraffin oil: Sigma-Aldrich (76235-500ML, Paraffin oil for IR spectroscopy) ⁇ Tween 80: Tokyo Kasei (T0546) -Potassium dihydrogen phosphate: Nacalai Tesque (28736-75, characteristic reagent for molecular biology research) -Phosphate buffer: Sodium dihydrogen phosphate (20 mM), sodium chloride (200
  • Step 1 Add agarose (11.2 g), soluble starch (starch) (4.2 g) and sodium chloride (2.52 g) to ultrapure water (280 mL) until the agarose and soluble starch are completely dissolved 80. It was heated and stirred at ° C. (Step 2) (Tween80 (14.7 mL) was dissolved in paraffin oil (490 mL), and the mixture was heated and stirred at 80 ° C. (Step 3) The heated solutions of ultrapure water and paraffin oil prepared in Steps 1 and 2 were mixed and vigorously stirred while heating at 80 ° C. to prepare a W / O type (water droplet type in oil) emulsion. ..
  • Step 4 The prepared emulsion is cooled in an ice bath for about 30 minutes to solidify the aqueous phase containing agarose and soluble starch to prepare gel-like starch / agarose beads having a size of about 50 to 500 ⁇ m. did.
  • Step 5 After sufficiently cooling, ethanol (about 700 mL) was added and stirred to eliminate the emulsion.
  • Step 6 Starch / agarose beads were precipitated by centrifugation, and the supernatant paraffin oil layer and ethanol layer were removed by decantation.
  • Step 7) The precipitated starch / agarose beads were suspended in ultrapure water and precipitated again by centrifugation to wash the beads.
  • Step 8) The cleaning operation of step 7 was repeated 5 times.
  • Step 9 The washed starch / agarose beads were suspended in a phosphate buffer solution containing 20% ethanol and stored in a refrigerator at 4 ° C.
  • Example 2 Purification of MBP fusion protein ⁇ Example 2-1. Reagents used> ⁇ Ultrapure water: Merck Millipore Milli-Q integral 3 system. ⁇ Potassium dihydrogen phosphate: Nacalai Tesque (28736-75, characteristic reagent for molecular biology research) ⁇ Sodium chloride: Nacalai Tesque (31333-45, molecular biology) Research characteristic reagent) ⁇ D (+)-Maltose monohydrate: Fuji Film Wako Pure Medicine (138-00611, Wako special grade) ⁇ 96-Well filter plate: Macherey-Nagel (CHROMAFIL Multi 96, PE filter element, 20) ⁇ m) -Phosphate buffer: sodium dihydrogen phosphate (20 mM), sodium chloride (200 mM), pH 7.0.
  • Ultrapure water Merck Millipore Milli-Q integral 3 system.
  • Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque (28736-75,
  • Step 1 The suspension (1.0 mL) containing the starch / agarose beads prepared in Example 1 was poured into a 96-well filter plate and filled with 0.5 mL of starch / agarose beads per well.
  • Step 2 Phosphate buffer (3.0 mL) was poured onto the column to wash the filled starch / agarose beads.
  • Step 3 An Escherichia coli cell lysate containing an MBP fusion protein (a protein in which the MBP protein domain (42 kDa) and nitrovinedin (19 kDa) are arranged from the N-terminal side) is poured into the column after washing, and the purpose is MBP fusion protein was adsorbed on starch / agarose beads.
  • Step 4 The column was washed with phosphate buffer (3.0 mL) to elute impurities derived from E. coli.
  • Step 5 After the washing operation, a phosphate buffer solution (0.60 mL) containing 25 mM maltose was poured onto the column to competitively elute the target MBP fusion protein.
  • the column flow rate is about 3 mL / min when using starch / agarose beads, while it is about 1 mL / min when using amylose resin, and the time required for purification is also starch. / Agarose beads were shorter.
  • amylose resin 100,000 yen or more per 50 mL, and it is expensive when used in large quantities.
  • the manufacturing cost of starch / agarose beads is as low as about 1000 yen per 50 mL.
  • the manufacturing process is also simple.

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Abstract

MBPタグ付き物質の精製用担体として有用な微小粒子の簡便な製造方法、及びそれにより得られる微小粒子を提供すること。 油相とマルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類を含有する水相とを含有する油中水滴型エマルジョンの前記水相をゲル化させることを含む、微小粒子の製造方法、並びにそれにより得られる微小粒子。

Description

微小粒子の製造方法
　本発明は、微小粒子の製造方法等に関する。
　マルトース結合タンパク質（MBP）は、目的の組み換えタンパク質と融合して利用さえる有用なアフィニティータグである。大腸菌等を利用して組み換えタンパク質を発現する際に、MBPと融合させることにより、目的タンパク質の収量及び可溶性を向上させることができる。MBPタグは、その他の一般に使用される精製タグであるHisタグ、GSTタグ、Strep等に比べて、特に可溶性向上の点で優れており、分子量の大きなタンパク質の精製における有用性が高い。MBP融合タンパク質の精製には、アミロースレジンによるアフィニティークロマトグラフィーが広く利用されている（特許文献１）。しかしながら、アミロースレジンは、セファロース等のビーズ担体にアミロース分子を化学修飾してなるものであり、非常に高価である。組み換えタンパク質の大量精製や大規模スクリーニングには、大量のクロマトグラフィー担体が必要となるため、より安価なクロマトグラフィー担体の開発が望まれてきた。
特開2013-100273号公報
　本発明は、MBPタグ付き物質の精製用担体としてより有用な微小粒子のより簡便な製造方法、及びそれにより得られる微小粒子を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、油相とマルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類を含有する水相とを含有する油中水滴型エマルジョンの前記水相をゲル化させることにより、MBPタグ付き物質の精製用担体として有用な微小粒子を簡便に製造できることを、見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　油相とマルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類を含有する水相とを含有する油中水滴型エマルジョンの前記水相をゲル化させることを含む、微小粒子の製造方法。
　項２．　前記マルトース単位含有多糖類がデンプン、アミロース、及びアミロペクチンからなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載の製造方法。
　項３．　前記マルトース単位含有多糖類が可溶性デンプンである、項１又は２に記載の製造方法。
　項４．　前記ゲル化性多糖類がアガロース、カラギーナン、ペクチン、ジェランガム、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、及びカードランからなる群より選択される少なくとも1種である、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
　項５．　前記ゲル化性多糖類がアガロースである、項１～４のいずれかに記載の製造方法。
　項６．　前記水相における前記マルトース単位含有糖類の含有量が、水相を構成する溶媒100質量部に対して0.5～3質量部である、項１～５のいずれかに記載の製造方法。
　項７．　前記水相における前記ゲル化性多糖類の含有量が、水100質量部に対して2～6質量部である、項１～６のいずれかに記載の製造方法。
　項８．　前記ゲル化の方法が前記油中水滴型エマルジョンの冷却である、項１～７のいずれかに記載の製造方法。
　項９．　項１～８のいずれかに記載の製造方法で得られる、微小粒子。
　項１０．　粒子径が1mm未満である、項９に記載の微小粒子。
　項１１．　MBPタグ付き物質の精製用担体である、項９又は１０に記載の微小粒子。
　項１２．　MBPタグ付き物質が結合した項９～１１のいずれかに記載の微小粒子から、前記MBPタグ付き物質を競合溶出させることを含む、MBPタグ付き物質の精製物の製造方法。
　本発明によれば、MBPタグ付き物質の精製用担体として有用な微小粒子の簡便な製造方法、及びそれにより得られる微小粒子を提供することができる。
スターチ/アガロース・ビーズ（実施例1）の光学顕微鏡写真を示す。 各精製フラクション（実施例2）のSDS-PAGEゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色像を図２に示す。 実施例2で算出されたビーズ／レジンへのタンパク質結合量の相対比を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．微小粒子
　本発明は、その一態様において、油相とマルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類を含有する水相とを含有する油中水滴型エマルジョンの前記水相をゲル化させることを含む、微小粒子の製造方法（本明細書において、「本発明の製造方法1」と示すこともある。）に関する。また、本発明は、その一態様において、本発明の製造方法1で得られる、微小粒子（本明細書において、「本発明の微小粒子」と示すこともある。）に関する。以下、これらについて説明する。
　油相を構成する有機溶媒は、水性溶媒と油中水滴型エマルジョンを形成可能であり、冷却時（例えば0℃、10℃、20℃）でも液体状態であるものである限り、特に制限されない。有機溶媒としては、例えば炭化水素油、シリコーン油等の非極性油；　脂肪族アルコール、エステル等の極性油等が挙げられる。これらの中でも、非極性油が好ましい。
　炭化水素油としては、例えば、直鎖状、分岐状、又は環状であってよい、炭素数6～16の低級アルカンが挙げられる。例えば、ヘキサン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン及びイソパラフィン等である。または、炭素原子を17個以上有する直鎖状または分岐状の炭化水素であってもよく、例えば、流動パラフィン、流動ワセリン、ポリデセン、水素化ポリイソブテン、オリーブ油、ごま油、米ぬか油、サフラワー油、大豆油、とうもろこし油、菜種油、パーム油、パーム核油、ひまわり油、アルモンド油、綿実油、やし油、落花生油、魚油、スクワレン、及びスクワラン等が挙げられる。
　シリコーン油は、例えば、ジメチルポリシロキサン、トリストリメチルシロキシメチルシラン、カプリリルメチコン、フェニルトリメチコン、テトラキストリメチルシロキシシラン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルヘキシルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン、ジメチルシロキサン・メチルフェニルシロキサン共重合体等の低粘度から高粘度の直鎖あるいは分岐状のオルガノポリシロキサンや、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサシロキサン、テトラメチルテトラハイドロジェンシクロテトラシロキサン、テトラメチルテトラフェニルシクロテトラシロキサン等の環状オルガノポリシロキサン、ガム状のジメチルシロキサン・メチルフェニルシロキサン共重合体等のシリコーンゴム、及びシリコーンガムやゴムの環状オルガノポリシロキサン溶液、アルキル変性シリコーン、長鎖アルキル変性シリコーン、シリコーン樹脂、及びシリコーンレジンの溶解物等が挙げられる。好ましくは、ジメチルポリシロキサン、フェニルトリメチコン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルヘキシルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン、ジメチルシロキサン・メチルフェニルシロキサン共重合体等の低粘度から高粘度の直鎖あるいは分岐状のオルガノポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン等の環状オルガノポリシロキサンなどが挙げられる。
　上記シリコーン油は有機変性されていてもよい。有機変性されたシリコーン油とは、前記シリコーン油の構造中に1以上の有機官能基を有するシリコーン油であり、例えば、アミノ変性シリコーン油、エポキシ変性シリコーン油、ポリエーテル変性シリコーン油、カルボキシ変性シリコーン油、アルコール変性シリコーン油、アルキル変性シリコーン油、アンモニウム塩変性シリコーン油、及びフッ素変性シリコーン油等の変性シリコーン油等が挙げられる。
　脂肪族アルコールは、R－OH構造を有し、Rは炭素原子数4～40、好ましくは炭素原子数6～30、より好ましくは炭素原子数12～20の、飽和又は不飽和の直鎖状または分岐状の一価炭化水素基である。例えば、炭素数12～20のアルキル基及びアルケニル基が挙げられる。Rは、少なくとも1つのヒドロキシル基で置換されていても良い。
　該脂肪族アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ウンデシレニルアルコール、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、ヘキシルデカノール、及びそれらの混合物等を挙げることができる。
　エステル油は、飽和または不飽和の直鎖状または分岐状のC1～C26脂肪族一酸、またはポリ酸と、飽和または不飽和の直鎖状あるいは分岐状のC1～C26脂肪族モノアルコール、またはポリアルコールとの縮合反応から得られる液体エステルであり、このエステルの炭素原子の総数は10以上であることが望ましい。
　エステル油は、アジピン酸ジイソブチル、コハク酸ジエチルヘキシル、2－エチルヘキサン酸セチル、トリ2－エチルヘキサン酸グリセリル、エチルヘキサン酸ヘキシルデシル、トリエチルヘキサノイン、ジエチルヘキサン酸ネオペンチルグリコール、トリエチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、テトラエチルヘキサン酸ペンタエリスリチル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、イソノナン酸エチルヘキシル、イソノナン酸イソノニル、イソノナン酸イソデシル、イソノナン酸イソトリデシル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソセチル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸エチルヘキシル、パルミチン酸オクチル、ステアリン酸エチル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸エチル、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、イソステアリン酸イソステアリル、トリイソステアリン酸グリセリル、トリイソステアリン酸ポリグリセリル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトライソステアリン酸ペンタエリスリチル、オレイン酸エチル、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル、及び1，2－ステアロイルステアリン酸オクチルドデシル等が挙げられる。
　油相を構成する有機溶媒は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　水相を構成する溶媒（水性溶媒）は、通常、水である。また、水と混和性のある有機溶媒を含んでもよく、例としては2～20個の炭素原子、好ましくは2～10個の炭素原子、優先的には2～6個の炭素原子を有する、グリセロール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコール、ジプロピレングリコール、またはジエチレングリコール等のポリオール、モノー、ジーまたはトリプロピレングリコールアルキルエーテル、モノー、ジーまたはトリエチレングリコールアルキルエーテル等のグリコールエーテルが挙げられる。
　水相を構成する溶媒は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　水相にはマルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類が含まれる。
　マルトース単位含有糖類は、マルトース単位（グルコース残基2分子がα－1,4－グリコシド結合してなる2糖残基）を含む糖類である限り、特に制限されない。マルトース単位含有糖類としては、好ましくはマルトース単位を多く含む糖類、例えば構成糖残基数100％に対するマルトース単位を構成する糖残基数が50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、又は95％以上の糖類が挙げられる。マルトース単位含有糖類は、冷水（例えば10℃以下）にほとんど溶けない（例えば、1gを溶解させるために10000mL以上の水が必要）ものであり、且つ熱水（例えば80℃以上、90℃以上、又は95℃以上）に溶ける（例えば、1gを溶解させるために必要な水が30mL未満）ものであることが好ましい。マルトース単位含有糖類として、具体的には、例えばデンプン、デンプン加工物、アミロース、アミロペクチン等が挙げられる。これらの中でも、MBPタグ付き物質の精製用担体としての性能、製造コスト等の観点から、好ましくはデンプン、アミロース等が挙げられ、より好ましくはデンプンが挙げられる。デンプンとしては、MBPタグ付き物質の精製用担体としての性能、製造コスト等の観点から、可溶性デンプンが特に好ましい。
　マルトース単位含有糖類は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　水相におけるマルトース単位含有糖類の含有量は、得られる微小粒子がMBPタグ付き物質の精製用担体として機能する程度の量であり、またゲル化性多糖類によるゲル化を著しく阻害しない程度の量である限り、特に制限されない。該含有量は、水相を構成する溶媒100質量部に対して、例えば0.1～15質量部である。該含有量は、MBPタグ付き物質の精製用担体としての性能、製造コスト等の観点から、好ましくは0.2～10質量部、より好ましくは0.5～5質量部、さらに好ましくは0.5～3質量部、よりさらに好ましくは1～2質量部である。
　ゲル化性多糖類は、水に溶解後に冷却及び／又はイオン添加することによりゲル化する多糖類である限り、特に制限されない。このような多糖類としては、公知のものを広く利用することができる。ゲル化性多糖類の水への溶解温度は、例えば65～95℃、好ましくは75～95℃、より好ましくは85～95℃である。また、ゲル化性多糖類のゲル化温度は、例えば20～80℃、好ましくは25～60℃、より好ましくは25～50℃、さらに好ましくは30～45℃である。各多糖類の溶解温度及びゲル化温度は、公知であり、例えば多糖類に関するWebサイト（例えばhttps://www.tatourui.com/about/03_outcome.html等）を参照することができる。ゲル化性多糖類として、具体的には、例えばアガロース、カラギーナン、ペクチン、ジェランガム、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、カードラン等が挙げられる。これらの中でも、MBPタグ付き物質の精製用担体としての性能、製造コスト等の観点から、アガロースが特に好ましい。
　ゲル化性多糖類は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　水相におけるゲル化性多糖類の含有量は、水相が冷却及び／又はイオン添加によりゲル化する程度の量である限り、特に制限されない。該含有量は、水相を構成する溶媒100質量部に対して、例えば0.5～10質量部である。該含有量は、MBPタグ付き物質の精製用担体としての性能、製造コスト等の観点から、好ましくは1～8質量部、より好ましくは2～6質量部、さらに好ましくは3～5質量部である。
　水相には、さらに他の成分が含まれていてもよい。
　他の成分としては、無機塩が好ましい。無機塩により、MBPタグ付き物質の精製用担体として好適な微小粒子を作り易くなる。無機塩としては、特に制限されず、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等が例示され、好ましくは塩化ナトリウム等が例示される。無機塩は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。水相が無機塩を含有する場合、水相における無機塩の含有量は、水相を構成する溶媒100質量部に対して、例えば0.1～2質量部、好ましくは0.5～1.5質量部、より好ましくは0.8～1.1質量部である。
　油中水滴エマルジョンは、油中水滴型エマルジョンの形成及び維持の観点から、界面活性剤を含有することが好ましい。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤のいずれであってもよい。界面活性剤としては、好ましくは非イオン性界面活性剤が挙げられる。
　非イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、脂肪酸エステル、脂肪アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド及び脂肪酸アルカノールアミド、並びにポリオキシエチレンヒマシ油及び硬化ヒマシ油等が挙げられる。脂肪酸エステルとしては、特に限定されないが、糖脂肪酸エステルが好ましい。具体的には、エルカ酸、オレイン酸、ラウリン酸、ステアリン酸及びベヘニン酸等の脂肪酸と糖（好ましくはショ糖）とのエステル等が挙げられる。その他の脂肪酸エステルとしては、特に限定されないが、グリセリン、ポリグリセリン、ポリオキシエチレングリセリン、ソルビタン、及びポリオキシエチレンソルビット等のうち少なくとも一種と脂肪酸とのエステル等が挙げられる。
　陰イオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、脂肪酸塩及びリン酸エステル塩等が挙げられる。
　陽イオン性界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩及びアミン塩類等が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン及びアルキルアミンオキシド等が挙げられる。
　界面活性剤は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　油中水滴エマルジョンが界面活性剤を含有する場合、その含有量は、油相を構成する有機溶媒100質量部に対して、例えば0.3～10質量部、好ましくは1～6質量部、より好ましくは2.5～4.5質量部である。
　油中水滴型エマルジョンにおける油相を構成する有機溶媒と水相を構成する溶媒の容量比は、油中水滴型エマルジョンを形成及び維持可能な程度の容量比である限り、特に制限されない。水相を構成する有機溶媒100容量に対する油相を構成する有機溶媒の容量は、MBPタグ付き物質の精製用担体としての性能等の観点から、例えば100～500容量、好ましくは130～300容量、より好ましくは150～200容量である。
　油中水滴型エマルジョンは、上記した油相（必要に応じて界面活性剤を含有する）と上記した水相とを混合する（好ましくは、各相を構成する有機溶媒／溶媒が上記容量比になるように混合する）ことにより、得ることができる。各相は、混合前に、マルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類の溶解温度以上の温度に加温しておくことが好ましい。該温度は、マルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類の種類により応じて適宜設定することができるが、例えば50～95℃、60～90℃、70～90℃、又は75～85℃である。また、水相においては、この加温により、マルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類を溶媒中に溶解させておくことが好ましい。油相と水相との混合は、上記温度を保つ加温下で行われる。混合方法は、特に制限されるものでないが、例えば攪拌子、プロペラ羽根、タービン羽根、およびパドル翼等の従来公知の攪拌機、もしくはホモディスパー等の高速回転遠心放射型攪拌機、及びホモミキサー等の高速回転せん断型攪拌機等の乳化分散機が使用できる。
　油中水滴型エマルジョンにおける水滴の粒径は、1mm未満であることが好ましい。該水滴の数平均粒径は、より好ましくは5～800μm、さらに好ましくは10～500μm、よりさらに好ましくは50～500μm、とりわけ好ましくは50～300μmである、このような粒径に制御することにより、MBPタグ付き物質の精製用担体として好適な微小粒子を得ることができる。
　本発明の製造方法1においては、油中水滴型エマルジョンの水相をゲル化することにより、マルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類を含有する、ゲル化した微小粒子が生成される。ゲル化の方法は、ゲル化性多糖類の種類に応じて適宜選択することができる。冷却によりゲル化するゲル化性多糖類の場合は、油中水滴型エマルジョンをゲル化温度以下の温度に冷却することにより、ゲル化することができる。また、陽イオン（カルシウムイオン、ナトリウムイオン等）によりゲル化するゲル化性多糖類の場合は、油中水滴型エマルジョンに対して陽イオンの塩を添加することによりゲル化することができる。簡便性の観点から、ゲル化の方法は油中水滴型エマルジョンの冷却であることが好ましい。ゲル化の間は、油中水滴型エマルジョン全体を均一に冷却する及び／または、油中水滴型エマルジョン全体に均一に陽イオンを分散させる観点から、エマルジョンを緩やかに攪拌することが好ましい。ゲル化の時間は、ゲル化手段及び条件に応じて適宜設定することができるものであり、例えば氷浴により冷却する場合であれば、例えば10～60分間、好ましくは30～60分間である。ゲル化の方法は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　得られた微小粒子は、公知の方法に従って又は準じて回収することができる。例えばエタノール等の解乳化剤によりエマルジョンを解消した後、遠心分離等の固液分離により微小粒子を回収することができる。回収した微小粒子は、必要に応じて、水等の溶媒で洗浄することが好ましい。また、保存は、例えば腐敗防止のためにアルコール水溶液中で行うことは好ましい。
　本発明の微小粒子の粒径は、1mm未満であることが好ましい。該微小粒子の数平均粒径は、より好ましくは5～800μm、さらに好ましくは10～500μm、よりさらに好ましくは50～500μm、とりわけ好ましくは50～300μmである、このような粒径であることにより、MBPタグ付き物質の精製用担体として好適に使用することができる。
　本発明の製造方法1によれば、化学架橋工程を要せずとも、MBPタグ付き物質の精製用担体として有用な微小粒子を簡便に製造可能である。よって、本発明の微小粒子は、化学架橋を含まないことが好ましい。
　限定的な解釈を望むものではないが、本発明の微小粒子は、上記製造方法により得られているが故に、一態様において、マルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類とが別の層に存在するのではなく、例えば両者がほぼ均一に分散している、と考えられる。
　本発明の微小粒子は、MBPタグ付き物質の精製用担体として利用することができる。
　2．MBPタグ付き物質の精製物の製造方法
　本発明は、その一態様において、MBPタグ付き物質が結合した本発明の微小粒子から、前記MBPタグ付き物質を競合溶出させることを含む、MBPタグ付き物質の精製物の製造方法（本明細書において、「本発明の製造方法2」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　MBPタグは、MBP（マルトース結合タンパク質）そのもの、或いはMBPにおいてマルトース結合ドメインが著しく損なわれていない程度の変異（例えば置換、欠失、挿入、付加等）が導入されてなる変異体からなるタンパク質タグである限り、特に制限されない。
　MBPタグ付き物質は、MBPタグが付加されてなる物質である限り、特に制限されない。物質は、代表的にはタンパク質であるが、これに制限されず、例えば核酸、糖類、脂質、無機粒子等、又は各種物質の複合体であることができる。
　本発明の微粒子に、原料液（MBPタグ付き物質を含む液）（例えば、細胞破砕液、細胞粗精製画分等）を接触させることにより、本発明の微粒子中のマルトース単位含有糖類に対してMBPタグが結合する。これにより、MBPタグ付き物質が結合した本発明の微小粒子が得られる。この微粒子を必要に応じて洗浄することにより、MBPタグ付き物質以外の物質の付着量を低減することができる。
　MBPタグ付き物質が結合した本発明の微小粒子に対して、マルトース単位含有物質（好適にはマルトース）を含む溶液を接触させることにより、MBPタグ付き物質を競合溶出させることができる。
　上記一連の工程は、カラムを使用して行うこともできるし、カラムを使用せずに（バッチ式で）行うこともできる。ただ、本発明の製造方法によれば、自然落下により十分なフロー速度を確保できる程度の粒径の微小粒子を簡便に得ることができ、また本発明の微小粒子はMBPタグ付き物質に対して一定以上の結合性も備えることができるので、上記一連の工程はカラムを使用して行うことが好ましい。
　本発明の製造方法2により、MBPタグ付き物質の精製物を含む溶液を得ることができる。
　組み換えタンパク質の大量精製や大規模スクリーニングには、大量のクロマトグラフィー担体が必要となる。安価に製造可能な本発明の微粒子を利用する本発明の製造方法2は、大量精製や大規模スクリーニングおいて、好適に利用することができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　実施例1．スターチ/アガロース・ビーズの製造
　＜実施例1-1．使用した試薬＞
・超純水：Merck Millipore Milli-Q integral 3 system.・アガロース：Sigma-Aldrich (A9359-50G, Agarose BioReagent for molecular biology, low EEO)
・可溶性デンプン：ナカライテスク (32122-75, ナカライ規格一級)
・塩化ナトリウム：ナカライテスク (31333-45, 分子生物学研究用特性試薬)・パラフィンオイル：Sigma-Aldrich (76235-500ML, Paraffin oil for IR spectroscopy)
・Tween 80：東京化成（T0546）
・リン酸二水素カリウム：ナカライテスク (28736-75, 分子生物学研究用特性試薬)・リン酸緩衝液：リン酸二水素ナトリウム (20 mM)、塩化ナトリウム (200 mM)、pH 7.0。
　＜実施例1-2．製造方法＞
（工程1）超純水（280 mL）に対してアガロース（11.2 g）、可溶性デンプン（スターチ）（4.2 g）、塩化ナトリウム（2.52 g）を加え、完全にアガロースと可溶性デンプンが溶解するまで80℃で加熱・攪拌した。
（工程2）（Tween80（14.7 mL）をパラフィンオイル（490 mL）に溶解させ、80℃で加熱・攪拌した。
（工程3）工程1および工程2で調製した超純水およびパラフィンオイルの加熱溶液を混合し、80℃で加熱しながら激しく攪拌し、W/O型（油中水滴型）のエマルジョンを調製した。
（工程4）調製したエマルジョンを、氷浴中で約30分間冷却し、アガロースおよび可溶性デンプンを含む水相を固化させ、大きさ約50～500 μm程度のゲル状のスターチ/アガロース・ビーズを作成した。
（工程5）十分に冷却した後、エタノール（約700 mL程度）を加え攪拌し、エマルジョンを解消した。
（工程6）遠心分離によりスターチ/アガロース・ビーズを沈殿させ、上澄みのパラフィンオイル層とエタノール層をデカンテーションにより除去した。
（工程7）沈殿したスターチ/アガロース・ビーズを、超純水に懸濁させ、再度遠心分離により沈殿させることでビーズの洗浄を行った。
（工程8）工程7の洗浄操作を5回繰り返した。
（工程9）洗浄後のスターチ/アガロース・ビーズを、20％のエタノールを含むリン酸緩衝液に懸濁させ、４℃冷蔵庫内に保存した。
　＜実施例1-3．結果＞
　得られたスターチ/アガロース・ビーズの光学顕微鏡写真を図１に示す。粒径が50～500μm程度の微小粒子が得られた。
　実施例2．MBP融合タンパク質の精製
　＜実施例2-1．使用した試薬＞
・超純水：Merck Millipore Milli-Q integral 3 system.・リン酸二水素カリウム：ナカライテスク (28736-75, 分子生物学研究用特性試薬)・塩化ナトリウム：ナカライテスク (31333-45, 分子生物学研究用特性試薬)・D(+)-マルトース一水和物：富士フィルム和光純薬（138-00611, 和光特級）・96-ウェルフィルタープレート：Macherey-Nagel（CHROMAFIL Multi 96, PE filter element, 20 μm）
・リン酸緩衝液：リン酸二水素ナトリウム (20 mM)、塩化ナトリウム (200 mM)、pH 7.0。
　＜実施例2-2．精製方法＞
（工程1）実施例1で調製したスターチ/アガロース・ビーズを含む懸濁液（1.0 mL）を、96-ウェルフィルタープレートに流し込み、1ウェルあたり0.5 mLのスターチ/アガロース・ビーズを充填した。
（工程2）リン酸緩衝液（3.0 mL）をカラムに流し、充填したスターチ/アガロース・ビーズを洗浄した。
（工程3）洗浄後のカラムへ、MBP融合タンパク質（N末端側からMBPタンパク質ドメイン（42 kDa）、ニトロバインディン（19 kDa）が配置されてなるタンパク質）を含む大腸菌細胞溶解液を流し込み、目的のMBP融合タンパク質をスターチ/アガロース・ビーズに吸着させた。
（工程4）カラムを、リン酸緩衝液（3.0 mL）で洗浄し、大腸菌由来の不純物を溶出させた。
（工程5）洗浄操作後、25 mMのマルトースを含むリン酸緩衝液（0.60 mL）をカラムへ流し、目的のMBP融合タンパク質を競合溶出させた。
　＜実施例2-3．結果＞
　各精製フラクションのSDS-PAGEゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色像を図２に示す。
　さらに、スターチ/アガロース・ビーズに代えてアミロースレジン（New England Biolabs社製、＃8021）を使用して同様の試験を行った結果から、式：Abs/Abs0 (at 280 nm) （280 nmにおける吸光度の比）基づいて、ビーズ／レジンへのタンパク質結合量の相対比を算出した。その結果を図３に示す。
　また、カラム流量は、スターチ/アガロース・ビーズを使用した場合は約3 mL/minであるのに対して、アミロースレジンを使用した場合は約1 mL/minであり、精製に要する時間についてもスターチ/アガロース・ビーズの方が短縮されていた。
　アミロースレジンの市販価格は50 mLあたり10万円以上であり、これを大量に使用する場合は高コストである。一方、スターチ/アガロース・ビーズの製造コストは50mLあたり1000円程度と安価である。また、製造工程も簡便である。

Claims (12)

  1. 油相とマルトース単位含有糖類及びゲル化性多糖類を含有する水相とを含有する油中水滴型エマルジョンの前記水相をゲル化させることを含む、微小粒子の製造方法。
  2. 前記マルトース単位含有多糖類がデンプン、アミロース、及びアミロペクチンからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記マルトース単位含有多糖類が可溶性デンプンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 前記ゲル化性多糖類がアガロース、カラギーナン、ペクチン、ジェランガム、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、及びカードランからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 前記ゲル化性多糖類がアガロースである、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 前記水相における前記マルトース単位含有糖類の含有量が、水相を構成する溶媒100質量部に対して0.5～3質量部である、請求項１～５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 前記水相における前記ゲル化性多糖類の含有量が、水100質量部に対して2～6質量部である、請求項１～６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 前記ゲル化の方法が前記油中水滴型エマルジョンの冷却である、請求項１～７のいずれかに記載の製造方法。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の製造方法で得られる、微小粒子。
  10. 粒子径が1mm未満である、請求項９に記載の微小粒子。
  11. MBPタグ付き物質の精製用担体である、請求項９又は１０に記載の微小粒子。
  12. MBPタグ付き物質が結合した請求項９～１１のいずれかに記載の微小粒子から、前記MBPタグ付き物質を競合溶出させることを含む、MBPタグ付き物質の精製物の製造方法。
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