JP2010525138A - 多糖ビーズの製造 - Google Patents

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Abstract

【課題】 エマルション法の公知の欠点は、液滴の粒径が制御できず、生成エマルションは一様でない粒径を有し、硬化アガロースゲルビーズは一様でない粒径を有することである。分離プロセスにおいて、小さなゲルビーズはゲルビーズの間に集まって、カラム背圧を上昇させ、均一でない粒径のため均等には分離させない。ゲルビーズを使用して細胞を埋め込むとき、それぞれのビーズは様々な数の細胞を埋め込み、その一様でない粒径のため細胞増殖の間に様々な増殖速度となる。さらに均一な粒径をもつアガロースゲルビーズは、ゲル特性を研究するのに非常に重要である。一様でない粒径によりビーズは複雑な特性となることがある。さらに、製造したビーズの粒径を制御すること及び、これらの従来の製造プロセスにおいて約10μｍ未満などの小さなサイズのビーズを製造するのは非常に困難である。
【解決手段】 本発明は、比較的均一粒径であるビーズ集団が得られる、アガロースビーズの製造法に関する。好都合な態様では、ビーズは10μｍ未満の粒径であり、集団の変動係数C.V.は15％未満である。本発明に従ったビーズは、クロマトグラフィー充填材料の製造；薬剤キャリヤまたは生物工学の任意の方法などの生物学的分離で好都合に使用される。
【選択図】 図1

Description

本発明は、薬剤キャリヤとして、タンパク質及び／または細胞精製などの生物学的分離において、または一般に生物工学の分野で使用するためのアガロースビーズなどの多糖粒子の製造に関する。
アガロースは藻類から抽出された天然の多糖であり、その水溶液は低温でヒドロゲルを形成する。アガロースは1960年代よりクロマトグラフィー媒体として使用されており、高い親水性、高い多孔度及び官能基化に利用可能なヒドロキシル基などの多くの好都合な特徴を有する。アガロースはアフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、逆相クロマトグラフィー(RPC)及びイオン交換クロマトグラフィーなどでベースマトリックスとして使用されることが多い。
たとえば、Shahab Lahootiら(Shahab Lahooti及びMichael V.Sefton、Effect of an immobilization matrix and capsule permeability on the variability of encapsulated HEK cells、Biomaterials．21巻(2000年)987〜995頁)(非特許文献１)は、HEK細胞を埋め込むためにヒドロキシエチルメタクリレート-メチルメタクリレートコポリマーシェルに取り囲まれた、コア物質としてアガロースを記載した。一方では、アガロースの大きな多孔網状構造は細胞を均等に分散させ、栄養物及び代謝産物を拡散させ易くでき、他方ではビーズ膜濃度を減少させ、膜透過性を高め、細胞増殖のために十分な栄養物をビーズに入り易くもさせる。研究から、アガロースは、埋め込まれた細胞活性の保持並びに細胞分裂及び増殖を促進することが判明している。実験結果から、細胞は、14日後、アガロース存在下ではアガロース非存在下の二倍増殖したことが知見された。これは主にアガロースが細胞を均一分散させて、細胞に対して支持基材を提供したためである。
Hiroyuki Hayashiら(Hiroyuki Hayashi、Kazutomo Inoue、Tun Aungら、Application of a novel B cell line MIN6 to a mesh-reinforced polyvinyl alcohol hydrogel tube and three layer agarose microcapsules：An in vitro study，Cell Transplantation ５巻(1996年)S65〜S69)(非特許文献２)は、B細胞株MIN６を埋め込むために使用した三層ゲルカプセルの製造におけるアガロースの使用について記載した。この研究から、埋め込まれたB細胞株MIN6は、埋め込まれていないMIN６の二倍の高いインスリン分泌速度であることが判明している。
Stellan Hjerten(Stellan Hjerten、The Preparation of agarose spheres for chromatography of molecules and particles，Biochimica Et Biophysica Acta．79巻(1964年)393〜398頁)(非特許文献３)は、攪拌機による乳化を用いて逆懸濁液ゲル化法(inverse suspension gelation method)におけるアガロースの乳化について記載した。
分離媒体または生体細胞キャリヤとしてアガロースビーズを製造するために、ノズルを使用する噴霧法が提案されてきた(A.M.Egorev，A.Kh.Vakhabov及びV.Ya.Chernyak、Isolation of agarose and granulation of agar and agarose gel，Journal of chromatography．46巻(1970年)143〜148頁(非特許文献４)；並びにS.Bengtsson及びL.Philipsson，Chromatography of animal viruses on pearl-condensed agar，Biochimia Et Biophysica Acta．79(1964年)399〜406頁(非特許文献５))。
しかしながら、そのようなエマルション法の公知の欠点は、液滴の粒径が制御できず、生成エマルションは一様でない粒径を有し、硬化アガロースゲルビーズは一様でない粒径を有することである。分離プロセスにおいて、小さなゲルビーズはゲルビーズの間に集まって、カラム背圧を上昇させ、均一でない粒径のため均等には分離させない。ゲルビーズを使用して細胞を埋め込むとき、それぞれのビーズは様々な数の細胞を埋め込み、その一様でない粒径のため細胞増殖の間に様々な増殖速度となる。さらに均一な粒径をもつアガロースゲルビーズは、ゲル特性を研究するのに非常に重要である。一様でない粒径によりビーズは複雑な特性となることがある。さらに、製造したビーズの粒径を制御すること及び、これらの従来の製造プロセスにおいて約10μｍ未満などの小さなサイズのビーズを製造するのは非常に困難である。
カナダ特許第CN200410000087.9号(特許文献１)は、制御可能な均一粒径をもつアガロースゲルビーズを製造するための従来のミクロ多孔質膜乳化について記載する(以後、従来の膜乳化法を使用するアガロースゲルビーズの製造と示す)。従来の膜乳化は均一サイズの粒子となり得る。このプロセスでは、３〜60μｍ範囲の粒径をもつビーズを製造するために、様々な孔径(pore diameter)をもつ膜を選択する。10μｍ未満のより小さな粒径をもつアガロースゲルビーズは、相応じて小さな孔径をもつ膜で製造される。高窒素ガス圧では乳化速度は非常に遅い。高い圧力では乳化速度をある程度上昇させることもできるが、高すぎる圧力はビーズの粒径の均一性を低下させることが判明した。ビーズが高アガロース含有量であると、高圧によりビーズサイズ分布を酷く拡大させる。高いアガロース含有量と小さな粒径の両方が重要である特定の用途については、この従来法の実質的な欠点とみなされる。
生物学的分子のクロマトグラフィー分離及び精製の間、分離媒体が高い流速に耐え得るのであれば好都合である。かくして、生物学的分離分野で広く使用されるアガロース媒体では問題が知られている。公知のように、アガロースゲル構造は水素結合の相互作用によって形成される。ゲル化状態では、多糖類鎖は鎖間の互い違いの(staggered)水素結合により多孔質網状構造を形成する。非共有構造により形成したこのゲルは機械的強度が低いので、非常に高い流速には耐えられない。アガロースゲルビーズの強度は二種類の方法を使用して高められる。
米国特許第US4,665,164号(Per-Åke Pernemalm，Mats Lindgren及びGoran Lindgren．1984年、Polysaccharide crosslinked separation material and its preparation)(特許文献２)は、化学的架橋、即ち、ゲルの機械的強度を増加させるために多糖類鎖上のヒドロキシル基の間に共有結合を導入する、化学的架橋に関する。一定の架橋密度であれば、別法では水相のアガロースゲル濃度を増加させることにより、ゲルビーズのアガロース含有量を増加させる。しかしながらアガロース水溶液濃度を増加させると、その粘度が上昇する。アガロースゲルビーズを製造するための従来の膜乳化法を使用する場合、水相の粘度上昇により、乳化製造プロセスを困難にする。水相の高い粘度のため、形成した液滴を膜表面から引き離すことは非常に困難である。小さなサイズの液滴が形成する場合には、これらの小滴は長い乳化プロセス後に膜の細孔を閉塞するだろう。実験から、従来の多孔質膜乳化法を使用して小さな粒径及び高いアガロース含有量のゲルビーズを製造するとき、水相の高い粘度により、高圧であってもW/Oエマルション製造プロセスを遅くすることが明らかになっている。
カナダ特許第CN200410000087.9号 米国特許第US4,665,164号(Per-Ake Pernemalm，Mats Lindgren及びGoran Lindren、1984年、Polysaccharide crosslinked separation material and its preparation)
Shahab Lahootiら(Shahab Lahooti及びMichael V.Sefton、Effect of an immobilization matrix and capsule permeability on the variability of encapsulated HEK cells、Biomaterials．21巻(2000年)987〜995頁) Hiroyuki Hayashiら(Hiroyuki Hayashi、Kazutomo Inoue、Tun Aungら、Application of a novel B cell line MIN6 to a mesh-reinforced polyvinyl alcohol hydrogel tube and three layer agarose microcapsules：An in vitro study，Cell Transplantation ５巻(1996年)S65〜S69 Stellan Hjerten(Stellan Hjerten、The Preparation of agarose spheres for chromatography of molecules and particles，Biochimica Et Biophysica Acta．79巻(1964年)393〜398頁) A.M.Egorev，A.Kh.Vakhabov及びV.Ya.Chernyak、Isolation of agarose and granulation of agar and agarose gel，Journal of chromatography．46巻(1970年)143〜148頁 S.Bengtsson及びL.Philipsson，Chromatography of animal viruses on pearl-condensed agar，Biochimia Et Biophysica Acta．79(1964年)399〜406頁
第一の側面において、本発明は上記欠点の一つ以上を回避するアガロースゲルビーズの製造法に関する。本方法は、付記請求の範囲の一つ以上に定義される通りである。
本発明の具体的な側面は上記方法であり、それにより10μｍ未満の平均粒径などの小さな粒径をもつアガロースゲルビーズが得られる。別の側面では、本発明は、アガロース含有量が20重量％(総ビーズ重量の)までも高いアガロースビーズの製造法に関する。
別の側面では、本発明は、小さな粒径をもつアガロースゲルビーズに関する。具体的な態様では、そのような粒子の集団は10μｍ未満の平均粒径、及び／または均一粒径を示すだろう。一側面では、本発明は10μｍ未満の平均粒径を示すアガロースゲルビーズの集団を提供する。具体的な態様では、ビーズのアガロース含有量は20重量％(総ビーズ重量の)までも高い。
本発明のさらなる側面及び好都合な点は、以下の詳細な開示より明らかになろう。
図１は小さな粒径をもつアガロースゲルビーズを製造するための原理の略図である。 図２は、均質エマルション製造プラントの略図である。 図３は、実施例１で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真である。 図４は、比較例１で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真である。 図５は、比較例２で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真である。 図６は、比較例３で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真である。 図７は、比較例１、２及び３と実施例１で製造したアガロースゲルビーズの実測粒度分布である。 図８は、様々な孔径をもつ膜で製造したアガロースゲルビーズの平均粒径と膜孔径との関係である。 図９は、様々なアガロース含有量をもつビーズの平均粒径とアガロース溶液濃度との関係である。 図１０は、様々なアガロース含有量をもつビーズの変動係数とアガロース溶液濃度との関係である。
発明の詳細な開示
本発明に従って、改良された膜乳化法を使用して、比較的小さな粒径となり得るアガロースビーズを製造する。他に特記しない限り、本明細書及び請求の範囲では、粒径はμｍで、濃度は重量％で、温度は℃で表す。本発明を以下、詳細に記載する。
本発明の第一の側面は、以下の段階：
(a)アガロースを含むアガロース水相Wを準備する；
(b)少なくとも一種の乳化剤が溶解している水不混和性油相Oを準備する；
(c)前記水相Wと油相Oとを混合してW/Oエマルションを得る；
(d)圧力を加えることにより前記エマルションを疎水性微孔質膜に通してW/Oエマルションを得る；及び
(e)前記W/Oエマルション小滴の温度を低下させてアガロースゲルビーズを形成する；
各段階を含む、アガロースゲルビーズの製造法である。
より具体的には段階(a)において、設定濃度を示すアガロースゲル溶液を提供する。段階(a)で提供された溶液は本方法において水性相(aqueous phase)、即ち水相(water phase)を構成するので、（水を表して）Wと示される。かくしてアガロース溶液は水不混和性相内で水性小滴(aqueous droplet)を形成するだろう。一態様において、この溶液中のアガロース濃度は0.1重量％〜20.0重量％であり、より具体的には4.0〜15.0重量％；たとえば＞6.0または＞12.0重量％である。
段階(b)において、油相を提供する。この相は、少なくとも一種の油溶性及び／または油分散可能な乳化剤が溶解/分散されている、油性物質から構成される。この相は水と非混和性であるので、(油を表して)Oと示される。
段階(c)において、水相Wと油相Oとの間で混合してエマルションを得る。一態様において、水相対油相の容積比は１：１及び１：1000であり、より具体的には１：２〜１：10である。
段階(d)において、エマルション、即ち段階(c)で提供されたエマルションは、圧力を加えることによって疎水性多孔質膜内を通す。一態様において、その圧力は段階(d)で0.5〜3.0kgf/cm2である。一態様において、エマルションは比較的高い流速で膜を通すように製造される。別の態様では、膜はガラス膜である。具体的な態様では、膜は、公知方法に従って化学的処理によって疎水性とされたガラス膜である。そのような疎水性膜は市販品である。別の態様では、膜はそれ自体疎水性である材料から製造される。これに関連して、「疎水性」なる用語は、膜が本明細書中に開示されたようなゲルビーズが製造できるように十分な疎水性を示すことを意味するものと理解される。膜の表面に対して垂直な真っ直ぐな円筒状の細孔または蛇行性細孔(tortuous pore)をもつ網状の細孔構造などの任意の種類の基本的な細孔構造をもつことができる。膜の形状は、筒状、中空繊維、平板またはプリーツシート状であり得る。一態様において、膜にエマルションを押し通すのに使用される圧力は、予め選択した値に設定する。本発明に従って、設定圧力値(preset pressure value)でアガロース小滴のエマルションを膜に通すために圧力を使用することによって、均一粒径をもつW/Oエマルションを得ることができる。一態様において、本方法で使用される微孔質膜は２〜50μｍ、たとえば２〜40、または２〜30、または実に２〜20μｍの孔径を有する。別の態様では、適用する圧力は0.5〜3.0kgf/cm2である。当業者には理解されるように、好都合な圧力値は、膜の孔径、水相中のアガロース含有量及び温度に依存する。たとえば10.2μｍの孔径をもつ膜を使用して、65℃未満で10重量％のアガロース含有量のビーズを製造する場合、好適な圧力は1.0kgf/cm2であり；5.7μｍの孔径をもつ膜を使用して、65℃未満で10重量％のアガロース含有量のビーズを製造する場合、好適な圧力は2.5kgf/cm2である。一態様において、エマルションは、0.5〜1.5m3m-2h-1で微孔質膜を通過するだろう。好都合な速度は、膜の孔径、水相中のアガロース含有量、温度及び圧力に依存する。10.2μｍの孔径をもつ膜を使用して1.0kgf/cm2で10重量％のアガロース含有量をもつビーズを製造する場合、エマルション製造速度は、約0.8m3m-2h-1であり、このことは乳化プロセスが短時間のうちに完了することを意味する。
好都合には段階(c)及び(d)は、周囲温度を超える温度で実施する。具体的な態様では、段階(c)の操作温度は、水相のアガロース含有量及びアガロースの原材料に依存する。原材料が同一種類のアガロースである場合、温度は水相中のアガロース含有量に依存する。即ち含有量が高ければ、温度は高い。一例として高融点のアガロースを挙げる。水相中のアガロース含有量が４重量％である場合、温度は60℃であり；水相中のアガロース含有量が８重量％である場合、温度は65℃であり；水相中のアガロース含有量が12重量％である場合、温度は70℃である。水相中で同一アガロース含有量の場合、温度はアガロースの種類に依存する。一例として水相中でアガロース含有量４重量％を挙げる。低融点のアガロースを使用する場合、温度は40 であるが、高融点のアガロースの場合、温度は60 である。
段階(e)では、W/Oエマルション小滴(droplet)は固化させる、即ちアガロースビーズに固まる。一態様において、操作温度は段階(e)では約15℃である。
本発明に従った方法は、以下詳細に考察されるように、小さな粒径をもつアガロースビーズの製造に使用することができる。そのようなビーズは、ゲル濾過法などのクロマトグラフィー充填材料として有用である。
本方法の具体的な態様においては、段階(e)の後で固化したアガロースビーズに官能基(functionality)を加えることを含む追加の段階を加える。当業者は、そのような官能性を加える方法を熟知しており、これはたとえばイオン交換クロマトグラフィーでビーズを使用するための荷電基(charged group)であってもよい。
一般的な例として、疎水性ガラスの化学的修飾面は、本方法の多孔質膜として使用することができる。油相及び水相をホモジナイズ及び乳化、または高温で混合してW/Oエマルションを得る；このエマルションを高圧で微孔質膜に迅速に通して、エマルション中の液滴(liquid droplet)のサイズを小さくする。これを繰り返し乳化して、均一粒径のエマルションを得る。エマルションを冷却し、固化して均一粒径のアガロースビーズを得る。本発明に従った新規膜乳化法を使用して、均一サイズ及び10μｍ未満の粒径をもつアガロースビーズを製造することができる。アガロース濃度が20重量％までも高い濃度である場合、得られたビーズは好都合には未だに高い粒径均一性を有するだろう。本発明を使用して、10μｍ未満の平均粒径、均一粒径及び高いアガロース含有量をもつビーズ集団を製造し、且つ様々な膜の孔径を選択することにより得られたビーズの平均粒径も制御することができる。
本発明の具体的な態様では、製造法は以下の各段階を含む：
(a)アガロースを蒸留水中で加熱及び溶解して溶液を得、これを水相として使用する。
(b)少なくとも一種の乳化剤を水不混和性油相に溶解し、好ましくは予熱する。
(c)前記水相と油相とを迅速に混合し、ホモジナイズし、乳化して、次いで機械的に攪拌してW/Oエマルションを得る。
(d)このエマルションを高温及び高圧で疎水性微孔質膜に迅速に通して、実質的に均一小滴サイズのW/Oエマルションを得る。さらにより均一な小滴サイズを得るためには、毎回得られたエマルションを、膜の細孔に繰り返し通すためのエマルションとして使用することができる。
(e)エマルションを冷却プラントに移し、ゆっくりと攪拌しながら15℃未満の温度で冷却すると、エマルション小滴が実質的に均一サイズのゲル化アガロースのビーズに固化する。好都合な条件下では、アガロースゲルビーズの粒径分配係数(distribution coefficient)は15％未満に制御され、膜孔径により粒径サイズ１〜10μｍ(10μｍを除く)が制御される。
種々の濃度のアガロース溶液は様々な固化温度及び様々な膜乳化温度を有しているが、本発明に従い乳化プロセスは周囲温度よりも高い温度で実施することができる。濃度が高ければ高いほど、温度は高い。アガロース溶液は同一濃度と様々な固化温度を有しているが、乳化するために膜に迅速に通すために水相として使用する場合には様々な温度が必要である。同一濃度の水相の場合には、低融点のアガロースは低温が必要であり、高い固化温度のアガロースでは高温が必要である。
好都合な態様では、本発明に従ったプロセスでは圧力は比較的高い。好適な圧力は、膜孔径、水相のアガロース含有量及び温度に依存するだろう。たとえば10.2μｍの孔径をもつ膜を使用して65℃未満でアガロース含有量10重量％のビーズを製造する場合、圧力は1.0kgf/cm2であり；5.7μｍの孔径をもつ膜を使用して65℃未満でアガロース含有量10重量％のビーズを製造する場合、圧力は2.5kgf/cm2である。
本発明に従った方法を使用して、化学的に活性な物質を分離精製、または細胞及び薬剤の封入用のキャリヤとして使用されるアガロースゲルビーズを製造することができる。ビーズは10μｍ未満のサイズ及び／または20重量％までも高いアガロース含有量を有することができる。かくして本方法の好都合な点の一つは、均一粒径を制御できるということである。かくして本発明は、均一且つ制御可能な粒径を得、且つ小さな粒径及び高いアガロース含有量をもつビーズを製造するために従来の膜乳化法の無能などの問題点を解決し、10μｍ未満の粒径、及び／または20重量％以下のアガロース濃度をもつビーズなど、比較的小さなビーズを迅速に製造するのに使用することができる。
本発明の第二の側面は、上記のようにして製造した少なくとも一種のアガロースビーズである。具体的な態様では、本発明のこの側面は、小さな粒径をもつアガロースゲルビーズである。これに関連して「小さな」粒径なる用語は、そのようなビーズ集団において、平均粒径が10μｍ未満であることを意味する。別の態様では、本発明に従ったビーズ集団は、実質的に均一粒径を示すだろう。具体的な態様では、ビーズのアガロース含有量は20重量％(総ビーズ重量の)までも高い。より具体的には、以下の式に従って計算した変動係数(coefficient of variation)は15％以下である：
Figure 2010525138
｛式中、C.V.は変動係数であり、diはビーズ径であり、dは数平均粒径であり、Nは粒径計算に使用したビーズ数であり、N＞200である｝。
本発明で採用される微硬質膜の孔径は、２〜20μｍなどの上記の通りであり得、製造したビーズの平均粒径は、採用した膜の孔径と直線関係を有する。かくして所要の粒径をもつアガロースビーズは、膜の孔径を変えることによって製造できるだろう。
本発明の好都合な点は以下の通りである。本発明の製造法を使用して、生物学的分離媒体として使用されるアガロースゲルビーズを製造し、細胞増殖の有益な微環境及びエンドソマチック(endosomatic)処理作用を提供し、且つエンドソマチックリンパ球識別及び免疫拒絶反応を効果的に回避するために、生細胞または遺伝子キャリヤとして使用されるアガロースゲルビーズも提供することができる。
さらに本発明では、ゲルビーズは、均一粒径により、分離作用を効果的に上昇させ、通常の媒体では分離できない化学的活性物質を分離するための分離媒体として使用する。
さらに本発明は、様々なアガロース含有量のゲルビーズを提供することができる。ゲルビーズを使用して、様々な孔径及び様々なサイズの高分子物質、たとえばタンパク質、核酸などと、その分離効果との間の関係を効果的に研究し、且つ様々な物質を分離するのに使用される最も好適な孔径のゲルビーズを見つけることができる。本発明に従った製造法を使用して、従来の乳化法では製造が困難である、高アガロース含有量のゲルビーズを容易に製造し、高い機械的強度のゲルビーズを得、高圧で化学的活性物質を迅速に分離することができる。
本発明の製造法では穏和な条件を利用する。生細胞などの活性物質のキャリヤとして、ビーズは、その化学的活性及び化学的安定性を保持すると思われる。細胞及び薬剤キャリヤとして、ビーズは埋め込まれた物質の均一分散と、続く迅速且つ正確な分離を保証する。
本発明は、簡単な実験装置が必要で、連続相流を作るためにポンプやスターラーは必要でなく、簡単なプロセスのスケールアップ、簡単な製造プロセス、容易な操作制御及び迅速なエマルション形成などのような特徴をもつ。
第三の側面では、本発明は以下に記載するようなアガロースゲルビーズを充填したクロマトグラフィーカラムに関する。クロマトグラフィーカラムはタンパク質、抗体またはフラグメントまたはその融合タンパク質、ペプチド、核酸、たとえばプラスミド、ウイルス、細胞、脂質などの有機及び／または生物学的物質及び成分の分離、単離または精製用の方法で使用することができる。クロマトグラフィーカラムは、本発明に従って製造したアガロースビーズの精密な性質に依存して、ゲル濾過、またはイオン交換法で使用することができる。別の側面では、官能基化は、疎水性相互作用(HIC)；混合若しくは多モードクロマトグラフィー；またはアフィニティクロマトグラフィー用のクロマトグラフィー媒体を製造することである。
図面の詳細な説明
図１は、本発明に従った小さな粒径をもつアガロースゲルビーズを製造するための原理の略図である。より具体的には、熱水性アガロース溶液を熱油相と混合し、初期w/oエマルションを攪拌機を使用して製造する。次いでこのエマルションを膜に押し通して、均一サイズの小滴のエマルションを得る。
図２は、均質エマルション製造プラントの略図を示す。図２において、数字は以下のものを示す。１−窒素ガス入口；２−圧力ゲージ；３−通気弁；４−断熱層；５−エマルション貯蔵タンク；６−通気弁；７−膜；８−均質エマルション捕集器。
図３は、実施例１で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真を示す。5.1ミクロン平均径の均一サイズビーズが得られた。図３では、１cmは50ミクロンに対応する。
図４は、比較例１で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真を示す。攪拌機乳化により大きな多分散ビーズが製造した。図４では、１cmは50ミクロンに対応する。
図５は、比較例２で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真を示す。攪拌機乳化により大きな多分散ビーズが製造した。図５では、１cmは50ミクロンに対応する。
図６は、比較例３で製造したアガロースゲルビーズの光学顕微鏡写真を示す。従来の膜乳化により製造した平均径3.7ミクロンとC.V.18％のビーズが得られた。図６では、１cmは50ミクロンに対応する。
図７は、比較例１、２及び３と実施例１で製造したアガロースゲルビーズの実測粒度分布を示す。X軸はアガロースビーズのサイズ(ミクロン)を示し、Y軸は体積(％)を示す。図７では、曲線１−比較例３、曲線２−実施例１、曲線３−比較例２、曲線４−比較例１である。
図８は、様々な孔径をもつ膜で製造したアガロースゲルビーズの平均粒径(Y軸上に示されているアガロースビーズ/(ミクロン)の平均径)と膜孔径(X軸上に示されている膜孔径/(ミクロン))との関係を示す。この図から解るように、傾斜0.46の一次従属性が得られた：ｙ＝0.46ｘ＋0.5569、R2＝0.9878。
図９は、様々なアガロース含有量をもつビーズの平均粒径とアガロース溶液濃度との関係を示す。X軸は水相中のアガロース濃度を示し、Y軸はアガロースビーズ/(ミクロン)の平均数径(mean number diameter)を示す。この図から解るように、粒径はアガロース濃度に強く依存しない。
図１０は、様々なアガロース含有量で製造したビーズの粒径変動係数とアガロース溶液濃度との関係を示す。X軸は水相中のアガロース濃度を示し、Y軸はC.V*100を示す。この図から解るように、本発明に従って、少なくとも20％以下のアガロース濃度C.V.10％のビーズを得ることができる。
実験部分
本発明で提案されたアガロースビーズ製造法を実施例を使用して記載する。以下の実施例は説明の目的のためだけに提供するものであり、付記請求の範囲で定義される本発明を限定するものと解釈すべきではない。
アガロースゲルビーズは、以下のように図１に示すように段階に従って製造する。
１）W/Oエマルション製造
アガロース、NaCl及び他の添加剤を水に加え、加熱下で完全に溶解させて、水相として使用する混合物を形成し、油溶性乳化剤を油性流体に溶解し、油相として使用される混合物を形成する温度まで加熱する。水相と油相とを迅速に混合し、ホモジナイズし、乳化または攪拌してW/Oエマルションを得、これを高い温度及び圧力で疎水性微孔質膜に通して、均一粒径のW/Oエマルションを得る。このプロセスは、図２に示されているような設備(setup)で完了する。エマルションを冷却設備に移し、15℃未満にゆっくりと攪拌しながら冷却して、エマルション小滴を均一サイズのアガロースゲルビーズに固化させる。
アガロース溶液は、所要の濃度に製造することができる。様々な濃度のアガロース溶液は、膜の乳化に様々な温度が必要なので、所要の濃度を選択することができる。細胞または薬剤キャリヤの製造の間、アガロースを高温で溶解し、細胞または薬剤が耐え得る温度であるが、アガロース溶液の固化となるほど低くはない温度に冷却する。この溶液を細胞または薬剤とよく混合して、水相として使用する。水相添加剤としては、アルブミン、レシチン、グルコース、マンニトールなどの人体に無害の水溶性物質が挙げられる。油相は周囲温度で液体であり、水不溶性の油性物質であるので、液体パラフィン及び石油エーテル、オリーブ油、綿実油、豆油、ヒマワリ油または他のアルキル炭化水素、あるいはその混合物を油相として使用することができる。好ましい油相は通常、高い沸点と低い揮発性を有する。油性乳化剤は油相に溶解しなければならないので、ソルビタンセスキオレート(sorbitan sesquiolate)(Arlace 183)、グリセロールエーテルポリマー(たとえばSakamoto Yakuhin Kogyo Co Ltd．PO-500，PO-310)、ポリエチレングリコール水素化ひまし油、ソルビタントリオレエート(Span 85)、ソルビタンモノオレエート(Span 80)、ソルビタントリステアレート(Span 65)または脂肪親和性-親水性ブロックポリマーを油性乳化剤として使用することができる。油相中の乳化剤は0.5〜1.0重量％の濃度であり、水相対油相の体積比は１：１〜１：1000である。
２）アガロースゲルビーズ製造
段階１）で得られたエマルションを冷却設備に移し、15℃未満にゆっくりと攪拌しながら冷却すると、エマルション小滴が固化する。得られたゲルビーズを蒸留水中に貯蔵する。
ゲル固化の間、温度はゆっくりと２℃/分未満で低下し、攪拌はゆっくりであり、攪拌速度は50〜200rpmである。
エマルション小滴が固化した後、得られたゲルビーズを順に石油エーテル、エタノール、蒸留水で洗浄し(細胞キャリヤとして使用する場合、アセトンもエタノールも洗浄に使用することはできない)、得られたゲルを周囲温度または低温で、蒸留水または細胞培地流体中に貯蔵する。
実施例１
細孔径10.2μｍの疎水性膜を、多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸張させるために、脂肪親和性物質中に漬す。アガロースとNaClを、確実にアガロース濃度10重量％、NaCl濃度0.9重量％となるように水に対して正確に秤量した。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約４gの水相と油相とを混合し、ホモジナイズし、6000rpmで30秒間乳化し、次いで得られたエマルションを、65℃に予熱した迅速に膜乳化設備に移し、1.0kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜に迅速に通して、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを、三回乳化できるように、1.0kgf/cm2で疎水性膜を通すためのエマルションとして使用する。乳化後、エマルションを冷却設備に移し、空気中50rpmの攪拌速度で攪拌下、ゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に加えて、アガロースエマルション小滴を固化させるために15℃未満に連続的にエマルションを冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径5.11μｍ及びC.V.9.8％であり、図３に示されているように光学顕微鏡写真のビーズは均一粒径である。
比較例１(機械的攪拌法)
実施例１の方法と同様に、確実にアガロース濃度10重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を20mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約６gの水相を油相に移し、約1000rpmで30分間攪拌してW/Oエマルションを得、これを迅速に冷却設備に移し、空気中、50rpmの攪拌速度で攪拌しながらゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に添加して、アガロースエマルション小滴を固化させるために、エマルションを15℃未満に連続的に冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径15.34μｍ及びC.V.115.97％であり、図４に示されているように光学顕微鏡写真のビーズは不均一粒径である。
比較例２(ホモエマルション法：homoemulsifiation method)
実施例１の方法と同様に、確実にアガロース濃度10重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約6gの水相を油相に移し、6000rpmで60秒間攪拌してW/Oエマルションを得、これを迅速に冷却設備に移し、空気中、50rpmの攪拌速度で攪拌しながらゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に添加して、アガロースエマルション小滴を固化させるために、エマルションを15℃未満に連続的に冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径15.48μｍ及びC.V.84.34％であり、図５に示されているように光学顕微鏡写真のビーズは一様でない粒径である。
比較例３(従来の膜乳化法)
多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸ばすために、孔径1.4μｍの疎水性膜を脂肪親和性物質中に漬す。確実にアガロース濃度10重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を60mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約6gの水相を油相中、65℃に予熱しておいた膜乳化プラントに移し、0.75kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜にゆっくりと通し、油相に入って、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを冷却設備に移し、空気中、50rpmの攪拌速度で攪拌下でゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に添加して、アガロースエマルション小滴を固化させるために、エマルションを15℃未満に連続的に冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径3.69μｍ及びC.V.17.97％であり、図６に示されているように光学顕微鏡写真のビーズは一様でない粒径である。
実施例１と、比較例１、２及び３で製造したアガロースゲルビーズの粒度分布を比較すると、急速膜乳化法を使用して得られたビーズは図７に示されているように最も均一粒径をしている。
実施例２
多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸ばすために、孔径5.7μｍの疎水性膜を脂肪親和性物質中に漬す。確実にアガロース濃度10重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約４gの水相と油相とを混合し、6000rpmで30秒間ホモジナイズ及び乳化し、次いで得られたエマルションを65℃に予熱しておいた膜乳化設備に移し、2.5kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜に迅速に通し、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを三回乳化できるように、2.5kgf/cm2で疎水性膜を通すためのエマルションとして使用する。乳化後、エマルションを冷却プラントに移し、空気中50rpmの攪拌速度で攪拌下、ゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に加えて、アガロースエマルション小滴を固化させるために15℃未満に連続的にエマルションを冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径3.06μｍ及びC.V.19.18％である。
実施例３
多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸ばすために、孔径15μｍの疎水性膜を脂肪親和性物質中に漬す。確実にアガロース濃度10重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約４gの水相と油相とを混合し、6000rpmで30秒間ホモジナイズ及び乳化し、次いで得られたエマルションを65℃に予熱しておいた膜乳化設備に移し、0.8kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜に迅速に通し、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを三回乳化できるように、0.8kgf/cm2で疎水性膜を通すためのエマルションとして使用する。乳化後、エマルションを冷却プラントに移し、空気中50rpmの攪拌速度で攪拌下、ゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に加えて、アガロースエマルション小滴を固化させるために15℃未満に連続的にエマルションを冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径7.66μｍ及びC.V.6.72％である。
実施例４
多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸ばすために、孔径19μｍの疎水性膜を脂肪親和性物質中に漬す。確実にアガロース濃度10重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約4gの水相と油相とを混合し、6000rpmで30秒間ホモジナイズ及び乳化し、次いで得られたエマルションを65℃に予熱しておいた膜乳化設備に移し、0.6kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜に迅速に通し、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを、三回乳化できるように、0.6kgf/cm2で疎水性膜を通すためのエマルションとして使用する。乳化後、エマルションを冷却設備に移し、空気中50rpmの攪拌速度で攪拌下、ゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に加えて、アガロースエマルション小滴を固化させるために15℃未満に連続的にエマルションを冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径9.02μｍ及びC.V.14.66％である。実施例１、２、３及び４で製造したビーズの平均粒径と膜孔径との間の関係を図８に示す。図８から、平均粒径と膜孔径は直線関係があり、平均ビーズ径は膜孔径の約0.46倍であることが解る。
実施例５
多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸ばすために、孔径10.2μｍの疎水性膜を脂肪親和性物質中に漬す。確実にアガロース濃度４重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約４gの水相と油相とを混合し、6000rpmで30秒間ホモジナイズ及び乳化し、次いで得られたエマルションを65℃に予熱しておいた膜乳化設備に迅速に移し、1.0kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜に迅速に通し、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを三回乳化できるように、1.0kgf/cm2で疎水性膜を通すためのエマルションとして使用する。乳化後、エマルションを冷却プラントに移し、空気中50rpmの攪拌速度で攪拌下、ゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に加えて、アガロースエマルション小滴を固化させるために15℃未満に連続的にエマルションを冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径5.66μｍ及びC.V.11.66％である。
実施例６
多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸ばすために、孔径10.2μｍの疎水性膜を脂肪親和性物質中に漬す。確実にアガロース濃度８重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約４gの水相と油相とを混合し、6000rpmで30秒間ホモジナイズ及び乳化し、次いで得られたエマルションを65℃に予熱しておいた膜乳化設備に迅速に移し、1.0kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜に迅速に通し、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを三回乳化できるように、1.0kgf/cm2で疎水性膜を通すためのエマルションとして使用する。乳化後、エマルションを冷却設備に移し、空気中50rpmの攪拌速度で攪拌下、ゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に加えて、アガロースエマルション小滴を固化させるために15℃未満に連続的にエマルションを冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径5.09μｍ及びC.V.12.06％である。
実施例７
多孔質膜を完全に湿潤させ、膜上の疎水性鎖を完全に伸ばすために、孔径10.2μｍの疎水性膜を脂肪親和性物質中に漬す。確実にアガロース濃度20重量％とNaCl濃度0.9重量％となるようにアガロースとNaClを正確に水に対して秤量する。これらを加熱し、水に完全に溶解させて溶液を形成し、これを65℃未満に保持する。油溶性乳化剤PO-500を16mlの液体パラフィンと石油エーテル混合物(体積比７：５)に添加して、確実に４重量％濃度となるようにして、油相として使用される混合物を形成するためにこれらが完全に溶解するまで攪拌し、65℃に加熱する。加熱下で、約４gの水相と油相とを混合し、6000rpmで30秒間ホモジナイズ及び乳化し、次いで得られたエマルションを80℃に予熱しておいた膜乳化設備に迅速に移し、1.4kgf/cm2で均一孔径をもつ疎水性微孔質膜に迅速に通し、均一粒径のW/Oエマルションを得る。得られたエマルションを三回乳化できるように、1.4kgf/cm2で疎水性膜を通すためのエマルションとして使用する。乳化後、エマルションを冷却設備に移し、空気中50rpmの攪拌速度で攪拌下、ゆっくりと室温に冷却し、次いで少量の氷を水浴に加えて、アガロースエマルション小滴を固化させるために15℃未満に連続的にエマルションを冷却する。得られたゲルビーズを濾過し、順に石油エーテル、エタノール及び蒸留水で洗浄し、蒸留水中に貯蔵する。ビーズの平均粒度分布をLaser Particle Sizer Mastersizer 2000Eで試験する。水中のビーズは平均径5.70μｍ及びC.V.10.22％である。様々な濃度のアガロースゲルビーズの粒径及び粒度分布係数と濃度の間の関係を図９及び１０に示す。アガロース濃度が20重量％までも高いとき、アガロースを使用して均一粒径をもつアガロースゲルビーズを得ることができる。

Claims (12)

  1. アガロースゲルビーズの製造法であって、
    (a)アガロースを含むアガロース水性相Wを準備する；
    (b)少なくとも一種の乳化剤が溶解している水不混和性油相Oを準備する；
    (c)前記水相Wと油相Oとを混合してW/Oエマルションを得る；
    (d)圧力を加えることにより前記エマルションを疎水性微孔質膜に通してW/Oエマルションを得る；及び
    (e)アガロースゲルビーズが形成されるまで、前記W/Oエマルション小滴の温度を低下させる；
    各段階を含む、前記方法。
  2. 段階(d)における前記圧力が0.5〜3.0kgf/cm2である、請求項１に記載の方法。
  3. 段階(d)における前記微孔質膜内のエマルション流速が0.5〜1.5m3m-2h-1である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記微孔質膜の孔径が２〜20μｍである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
  5. 段階(a)における前記アガロース濃度は0.1重量％〜20.0重量％である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
  6. 段階(a)、(c)及び(d)を加熱下で実施する、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
  7. 段階(d)により、実質的に均一粒径をもつアガロースゲルビーズとなる、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
  8. 段階(e)から得られたアガロースゲルビーズに荷電基(charged group)などの官能性を加える段階を含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記平均粒径が10μｍ未満である、請求項１〜７のいずれか1項に従って製造したアガロースゲルビーズ。
  10. 前記粒度分布の変動係数は、以下の式：
    Figure 2010525138
     ｛式中、C.V.は変動係数であり、
    diはビーズ径であり、
    dは数平均粒径であり、
    Nは粒径計算に使用したビーズ数であり、N＞200である｝
    によって計算して15％未満である、請求項９に記載のアガロースゲルビーズ。
  11. 請求項９〜１０のいずれか１項に従ったアガロースゲルビーズを含むクロマトグラフィーカラム。
  12. ゲル濾過における請求項１１に記載のクロマトグラフィーカラムの使用。
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