CN101486799A

CN101486799A - 一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法

Info

Publication number: CN101486799A
Application number: CNA2008100562520A
Authority: CN
Inventors: 马光辉; 周青竹; 苏志国
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: China Science Senhui (Texas) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2008-01-16
Filing date: 2008-01-16
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2028-01-16
Also published as: CN101486799B

Abstract

本发明提供了一种琼脂糖凝胶微球，其特征在于，以微球的总重量计，微球中琼脂糖含量大于12wt％。本发明还提供了该微球的制备方法。

Description

一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程的生化分离和细胞及其药物载体领域。

背景技术

琼脂糖是一种从海藻中提取的天然多糖，其水溶液在低温下具有形成水凝胶的特征。琼脂糖凝胶用作层析介质早在20世纪60年代就已经出现，它具有理想介质的许多特性：高亲水性、高度多孔性、含较多的可活化羟基、不与生物大分子发生非特异性吸附^[1]。由于琼脂糖上含有较多的可活化羟基，在一定的条件下可以接入不同的配基，作为亲和层析、疏水、反相和离子交换色谱的介质。随着研究与应用的不断深入，琼脂糖凝胶已实现多种生化物质的快速高效层析分离，分离对象涉及蛋白质、核酸、肽类、糖类等^[2]-[4]。琼脂糖凝胶除了作为分离介质外，还可以作为活细胞载体，如Shahab Lahooti^[5]等人采用琼脂糖作为羟乙基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸甲酯共聚物微球的内核物质包埋HEK细胞，琼脂糖凝胶的大孔网络结构一方面可以使细胞得到均匀分散，有利于营养物质和代谢产物的扩散，另一方面也起到了降低微球膜材的浓度，增加膜的通透性的效果，有利于足够的营养物质进入微球内供细胞生长。研究表明琼脂糖的加入有利于被包埋细胞活性的保持和细胞的分裂增殖，实验结果表明与没有琼脂糖相比14天后细胞增殖为其两倍多，这主要是由于琼脂糖凝胶不仅使细胞分散均匀，而且也起到了为细胞提供一种支持的底物的作用。Hiroyuki Hayashi^[6]等人采用琼脂糖制备了三层凝胶囊用来包埋B细胞线MIN6，研究结果表明与未包埋的MIN6相比，胰岛素的分泌速度增加了1倍多。

目前无论是作为分离介质还是活细胞载体，琼脂糖凝胶微球的制备方法主要有乳化冷凝法^[7]和喷射冷凝法^[8]-[9]，这些方法由于本身的特征在制备乳液时不能控制液滴的粒径，所制备的乳液粒径不均一，最终固化后得到的琼脂糖凝胶微球粒径都不均一。由于粒径不均一，在分离过程中小的凝胶珠会聚集到大凝胶珠之间的空隙中，使得分离压力增大，严重时导致分离无法进行。用于细胞包埋时粒径的不均一会使每个微球所包埋的细胞量不相同，在细胞生长过程中导致扩增速度不相同。另外，粒径均一的琼脂糖凝胶微球在研究凝胶的基本性质上也具有重要意义，粒径的不均一会使微球在表征时变得很复杂。另外这些传统的制备方法不能控制所制备微球的粒径。

除了粒径不均一，传统的制备方法^[10]所制备的琼脂糖凝胶微球中琼脂糖含量大多在2wt％到6wt％之间，当微球中琼脂糖含量超过6wt％时，由于浓度增大导致水相粘度急剧增大，而传统的制备方法很难将粘度很高的水相均匀地分散到油相中形成均一的乳液，即使生成的液滴也容易并聚使生成的乳液粒径不均一。而高琼脂糖含量对于琼脂糖凝胶微球的应用有着很重要的意义。在生物大分子的分离纯化中，对分离介质的要求是能获得尽可能高的流速和尽可能高的分离效果，对于在生物分离领域已经广泛应用的琼脂糖介质，这种要求同样存在。然而琼脂糖的凝胶结构是由氢键相互作用形成的(在凝胶状态，多糖链通过链间氢键交错连接形成多孔的网状结构)，这种非共价键的结构使形成的凝胶强度较差。提高琼脂糖凝胶微球强度的途径有两个，其一是通过化学交联^[11]，即通过在多糖链上的羟基间引入共价键提高凝胶的强度。在交联效果相同的情况下，另外一条提高凝胶强度的途径是提高凝胶微球中琼脂糖的含量。提高琼脂糖含量的意义不仅仅提高凝胶强度，有时为了分离特定分子量范围的蛋白也需要高琼脂糖含量的凝胶微球，含量越高微球的孔径越小。鉴于传统的制备方法无法解决因为增大琼脂糖含量带来的水相粘度增大的问题，急需提出新的制备高琼脂糖含量凝胶微球的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种琼脂糖凝胶微球，微球中琼脂糖含量超过12wt％，最高可达20wt％，并且粒径非常均一。本发明的另一个目的是提供一种制备高含量的琼脂糖凝胶微球的方法。

本发明的第一方面提供了一种琼脂糖凝胶微球，微球中琼脂糖含量超过12wt％，最高可达20wt％，优选地，其按下式计算的微球粒径分布系数不大于15％：

C.V.＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％

上式中，C.V.为粒径分布系数，d_i为各个凝胶的直径，d为数均平均粒径，N为用于计算粒径的微球的数量，且N≥200个。

本发明的琼脂糖凝胶微球的尺寸非常均一，凝胶之间无合并现象，在保存的过程中不会出现并聚现象。

本发明的另外一个方面提供了一种制备上述琼脂糖凝胶微球的方法，其包括如下步骤：

(1)提供预定浓度的琼脂糖水溶液作为水相W，其中所述浓度优选为12-20.0wt％；

(2)提供溶解了油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为油相O；

(3)将水相W与油相O混合得到W/O型初乳液，其中水相与油相的体积比优选为1:1-1:1000，更优选为1:2-1:10；

(4)将所述粗乳液在预定压力下快速通过经过疏水微孔膜，优选聚合物多孔膜，以得到粒径均一的W/O型乳液，所用微孔膜的孔径优选为2—100微米；所述压力为0-5.0kgf/cm²，优选压力与所用膜材料、膜孔径、所用水相中琼脂糖含量和温度有关。以70℃下，以平均孔径为11.8微米的聚乙烯微孔膜制备琼脂糖含量为14wt％的微球为例，所用压力为1.1kgf/cm²；70℃下，以孔径为5.7微米的疏水玻璃膜制备琼脂糖含量为14wt％的微球，所用压力为2.5kgf/cm²。所述初乳液通过微孔膜的速度为0.5—3m³m^-2h^-1，优选速度与膜材料、膜孔径、水相中琼脂糖含量、温度和压力有关。以65℃下，以孔径为10.2微米的疏水玻璃膜制备琼脂糖含量为12wt％的微球为例，所用压力为1.0kgf/cm²时，乳液生成速度为0.8m³m^-2h^-1，乳化过程在瞬间完成，和

(5)使W/O型乳液滴凝固，得到琼脂糖凝胶微球。

优选地，步骤(3)和(4)在高于常温的条件下进行。更优选地，在步骤(3)中，操作温度与所用水相中琼脂糖含量及其使用的琼脂糖原料的种类有关。当所用原料为同种琼脂糖时，温度与水相中琼脂糖含量有关，含量越高，温度越高。以高熔点琼脂糖为例，当水相中琼脂糖含量为14wt％时，温度为70℃；当水相中琼脂糖含量为20wt％时，温度为80℃。当水相中琼脂糖含量相同时，温度与所使用的琼脂糖原料有关。以水相中琼脂糖含量为14wt％为例，低熔点琼脂糖所使用的温度为55℃，高熔点琼脂糖所使用的温度为70℃。在步骤(5)中，操作温度为15℃。

附图说明

图1制备高浓度琼脂糖凝胶微球的原理示意图。

图2制备均一乳液的装置示意图。

图3实施例1制备的琼脂糖凝胶微球的光学显微照片。

图4实施例1制备的琼脂糖凝胶微球的粒径分布。

图5不同孔径的疏水性聚乙烯膜制备的琼脂糖凝胶微球的平均粒径与膜孔径之间关系图。

图6不同琼脂糖含量的微球的平均粒径与琼脂糖溶液浓度的关系。

图7不同琼脂糖含量的微球的粒径分布系数与琼脂糖浓度之间关系图。

附图中，附图标记的含义如下：

1—氮气进口；2—压力表；3—排空阀；4—保温层；5—初乳液储存器；6—排空阀；7—膜；8—均一乳液收集器；

具体实施方式

如果没有特别指明，本发明中所有的粒径单位均为微米，浓度单位均为wt％，温度单位均为℃。

下面对本发明进行更为详尽的描述。

总体上讲，本发明采用了一种新的膜乳化法制备出了粒径均一且具有高琼脂糖含量的凝胶微球。

根据一个优选的实施方案，本发明采用表面疏水的微孔膜，先将油水两相在高温下通过均质乳化或者搅拌制得W/O的初乳液，之后在较高的压力下使初乳液快速通过微孔膜降低乳液中液滴的尺寸，经过反复几次膜乳化可以得到粒径均一的乳液，之后将乳液冷却固化得到粒径均一的琼脂糖微球。本发明采用这种新型的膜乳化法可以制备尺寸均一、琼脂糖浓度高达20wt％的琼脂糖微球，在粒径小于10微米的情况下得到的微球粒径均一性依然很高。本发明除了能制备得到粒径均一、琼脂糖含量高的凝胶微球，还可以通过选择不同的膜孔径控制所得微球的平均粒径。

作为本发明的优选方案，本发明的制备方法包括如下步骤：(1)将一定量的琼脂糖在加热条件下溶解于蒸馏水中，所得溶液作为水相。取一定量的油溶性乳化剂溶于与水不相溶的有机相中并预热到一定温度作油相。将水相与油相迅速混合后通过均质乳化或机械搅拌制备得到W/O型初乳液，在较高温度下该乳液在一定压力下迅速通过疏水性的微孔膜得到粒径均一的W/O型乳液，为使粒径更均一可将每次得到的乳液作为初乳液反复通过膜孔压出；(2)将此乳液转入到冷却装置中在缓慢搅拌的条件下冷却至15℃以下使乳液滴胶凝固化得尺寸均一的琼脂糖凝胶微球。在优化条件下，琼脂糖凝胶微球的粒径分布系数控制在15％以内。

本发明中琼脂糖的浓度可根据需要进行配制，不同浓度的琼脂糖溶液膜乳化时所需要的温度也不相同，可根据需要进行选择；制备细胞或药物载体时应先将琼脂糖在较高的温度下溶解后冷却到细胞或药物能承受同时又不会导致琼脂糖溶液凝固的温度，该溶液与细胞或药物均匀混合后用作水相。水相添加剂可包括白蛋白、卵磷脂、葡萄糖、甘露醇等对人体无害的水溶性物质。当需要制备具有特殊孔结构的琼脂糖凝胶微球时，可以在水相中加入一定量的致孔剂。

油相为在常温下呈液体状且与水不互溶的油性物质，可使用液体石蜡和石油醚橄榄油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷类碳氢化合物等，也可使用其混合物。一般所选择的油相沸点要比较高，挥发性弱较好。油性乳化剂必须溶解于所使用的油相，油相乳化剂的选择应考虑到其加入前后对油水两相之间界面张力的影响，优选的乳化剂为那些能迅速降低油水界面张力的共聚物。可使用失水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel83)、甘油醚的聚合物(如PO-500、PO-310)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇单油酸酯(司班80)、失水山梨醇三硬脂酸酯(司班65)、亲油-亲水嵌段共聚物等。

油相中乳化剂的浓度既要考虑到油水相界面张力的变化同时又要考虑到乳化剂链与疏水膜表面不能有太强的作用，一般优选为为0.5-10wt％。乳液中水相与油相的体积比为既要考虑到提高琼脂糖凝胶微球的产率同时又要避免水相体积过多导致乳液粒径不均一的问题，一般为1：1-1：1000，优选为1:2-1:10。

本发明中所用疏水性微孔膜可以为经化学修饰的玻璃膜，也可以为疏水性的聚合物膜，其孔径范围为2—100μm，所制备的微球的平均粒径与所用的膜材料有关，当使用同种材料的疏水性微孔膜制备琼脂糖凝胶微球时，微球的平均粒径与所使用的膜孔径存在线性关系，可由改变膜孔径来制备所需粒径的琼脂糖微球。

本发明中，乳化过程优选在高于常温的条件下进行，不同浓度的琼脂糖溶液的凝固温度不同，进行膜乳化所需要的温度也不相同，浓度越大所需要的温度越高；浓度相同凝固点不同的琼脂糖溶液作为水相进行快速膜乳化时所需要的温度也不相同，对于浓度相同的水相低熔点琼脂糖所需要的温度较低，高凝固点琼脂糖所需要的温度较高。

本发明中，所用压力较高，该优选压力与所用膜孔径、所用水相中琼脂糖含量和温度有关。以70℃下，以孔径为11.8微米的疏水聚乙烯膜制备琼脂糖含量为14wt％的微球为例，所用压力为1.1kgf/cm²；70℃下，以孔径为5.9微米的疏水聚乙烯膜制备琼脂糖含量为14wt％的微球，所用压力为2.5kgf/cm²。

根据本发明提供的尺寸均一的琼脂糖凝胶微球的制备方法，可以制备用于生物活性物质的分离纯化和用作细胞及其药物包埋载体的琼脂糖凝胶微球。微球中琼脂糖含量可高达20wt％，而且粒径均一可控。该技术解决了传统乳化法难以制备粒径均一可控且琼脂糖含量较高的微球的问题，在保证粒径均一的前提下能快速制备琼脂糖浓度高达20wt％的微球。

本发明提供的尺寸均一的高琼脂糖含量的凝胶微球及其制备方法还能够带来下列效应：

(1)本发明提供的制备方法除了可以制备作为生化分离介质的琼脂糖凝胶微球外，还可用制备用于作为活细胞、基因等载体的琼脂糖凝胶微球，为细胞增殖和发挥体内的治疗效果提供有利的微观环境，有效避免体内淋巴细胞的识别和免疫排斥作用。

(2)采用本发明的制备方法，能够很容易的制备出传统乳化法很难制备的高琼脂糖含量的凝胶微球，从而得到较高机械强度的凝胶微球，能在较高压力下实现生物活性物质的快速分离。

(3)本发明提供的琼脂糖凝胶微球，由于粒径均一，使用此凝胶微球作为分离介质可以有效地提高分离效果，将以常规介质无法分离的生物活性物质分离开来。

(4)本发明可以提供不同琼脂糖含量的凝胶微球，由于孔径可控，使用此凝胶微球可以有效开展不同孔径与不同尺寸大小的蛋白质、核酸等大分子物质及其分离效果之间的关系研究，从而找出不同分离物质所需要的最适合孔径的凝胶微球。

(5)本发明提供的制备方法，条件温和，作为活细胞等活性物质载体可望能够保持其生物活性和生物稳定性。用作细胞及药物载体时被包埋物质分布均匀，后续分析迅速且准确。

(6)本发明所使用的试验设备简单，不需要使连续相流动的泵或搅拌装置，容易实现工艺的放大，而且制备工艺比较简单，操作易于控制，乳液的生成速率比较快。

下面，对本发明的琼脂糖凝胶微球的制备方法举例加以说明。但是，应当理解，这些举例说明仅仅是为了便于更好地理解本发明，而决非对本发明范围的限制。

琼脂糖凝胶微球的制备按图1所示的步骤制备，该过程在图2所示的装置中完成。具体方法和步骤说明如下：

1)W/O型乳液的制备

将一定量的琼脂糖、NaCl以及其它添加剂加入到一定量的水中，并在加热条件下充分溶解作为水相；将一种以上的油溶性乳化剂溶于油性液体，并加热到一定的温度下作为油相。将水相与油相迅速混合后通过均质乳化或搅拌制备得到W/O型初乳液，之后该乳液在图2所示的装置中使用快速膜乳化得到粒径均一的乳液，整个快速膜乳化装置置于恒温箱内(4—保温层)。具体过程如下：上述所得的W/O型初乳液加入到初乳液储存器中(5—初乳液储存器；6—排空阀；)在一定压力(1—氮气进口；2—压力表；3—排空阀)下迅速通过7—疏水性的微孔膜(7—疏水性的微孔膜)进入到乳液收集器中(8—均一乳液收集器)得到粒径均一的W/O型乳液；

2)琼脂糖凝胶微球的制备

将上述步骤1)所得到的乳液转入到降温装置中，在缓慢的搅拌下缓慢降温至15℃以下使乳液滴胶凝固化，并进行洗涤，所得凝胶微球保存于蒸馏水中。制备低熔点琼脂糖凝胶微球时应使乳液在冰浴中降温至2℃左右后洗涤。胶凝固化时降温速度要缓慢，降温幅度为低于2℃/min，降温时进行缓慢搅拌，转数为50-200rpm。

乳液滴胶凝固化后，将所得凝胶微球依次用石油醚、乙醇、蒸馏水等洗涤(用作细胞载体时不得用丙酮或乙醇洗涤)，并将所得凝胶常温或低温保存于蒸馏水或细胞培养液中。

实施例1

将孔径为11.8微米的疏水聚乙烯膜置于亲油性的物质中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为14wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在70℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至70℃作为油相。趁热迅速将4g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至70℃的膜乳化装置中，在1.1kgf/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.1kgf/cm²压力下再次通过疏水性膜，反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E测量，在水中微球的平均直径为6.23微米，C.V.值为7.9％，光学显微镜照片如图3所示，粒径均一。

实施例2

将孔径为5.9微米的疏水聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为14wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在70℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至70℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至70℃的膜乳化装置中，在2.5kgf/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在2.5kgf/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为3.26微米，C.V.为14.20％

实施例3

将孔径为15.4微米的疏水聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为14wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在70℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至70℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至70℃的膜乳化装置中，在0.8kgf/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.8kgf/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为8.33微米，C.V.为7.77％

实施例4

将孔径为19.6微米的疏水聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为14wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在70℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至70℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至70℃的膜乳化装置中，在0.6kgf/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.6kgf/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为10.03微米，C.V.为12.18％。

实施例5

将孔径为48微米的疏水聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为14wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在70℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至70℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至70℃的膜乳化装置中，在0.1kgf/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.1kgf/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为23.07微米，C.V.为13.82％。

实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5所制备的微球平均粒径与膜孔径之间的关系如图5所示，由图上可以看出微球平均粒径与膜孔径成线性关系，微球的平均粒径大约是膜孔径的0.46倍左右。

实施例6

将孔径为11.8微米的疏水聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为12wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在65℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至65℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至65℃的膜乳化装置中，在1.0kfg/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.0kfg/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为6.36微米，C.V.值10.98％。

实施例7

将孔径为11.8微米的疏水聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为18wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在75℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至75℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至75℃的膜乳化装置中，在1.2kfg/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.2kfg/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰使乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为6.4微米，C.V.值为12.03％。

实施例8

将孔径为11.8微米的疏水聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的琼脂糖加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为20wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在80℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至80℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至80℃的膜乳化装置中，在1.4kfg/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.4kfg/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为6.44微米，C.V.值为10.22％。

不同浓度的琼脂糖凝胶微球的平均粒径和粒径分布系数与浓度之间的关系如图6和图7所示。当琼脂糖的浓度高达20wt％时还可制备得到粒径均一的琼脂糖凝胶微球。

实施例9

将孔径为13微米的经疏水修饰的SPG玻璃膜置于亲油性的物质中浸润，使孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。准确称取一定量的琼脂糖和一定量的NaCl加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为16wt％，NaCl的浓度为0.9wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在70℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7：5)中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至70℃作为油相。趁热迅速将4g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至70℃的膜乳化装置中，在1.0kgf/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.0kgf/cm²压力下再次通过疏水性膜，反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在空气中缓慢降温，降至室温时，向水浴中加入少量冰将乳液继续降温至15℃以下，使琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer2000E测量，在水中微球的平均直径为6.65微米，C.V.值为9.9％。

实施例10

将孔径为11.8微米的疏水性聚乙烯膜置于液体石蜡中浸润，使孔膜充分湿润。准确称取一定量的低熔点琼脂糖和一定量的NaCl加入到一定量的水中，使琼脂糖的浓度为16wt％，NaCl的浓度为0.9wt％，在加热条件下使其充分溶解，并使溶液保持在55℃下备用。将油溶性乳化剂PO—500加入到16ml的液体石蜡和石油醚的混合物(体积比为7：5)中，其浓度为4wt％，搅拌至完全溶解并加热至55℃作为油相。趁热迅速将4.0g左右的水相与油相混合并以均质乳化在6000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至55℃的膜乳化装置中，在1.0kgf/cm²压力下快速通过孔径均一的疏水性微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.0kgf/cm²压力下再次通过疏水性膜反复乳化三次；乳化完毕，将乳液转入到降温装置中，以50rpm转速缓慢搅拌在冰水浴中缓慢降温至2℃左右，使低熔点琼脂糖乳滴胶凝固化。最后将所得凝胶微球过滤，依次用石油醚和蒸馏水洗涤，并将其保存在蒸馏水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Masterrizer 2000E进行测量，在水中微球的平均粒径为6.62微米，C.V.为14.66％。

本发明中[]内的数字分别相应地表示如下参考文献。这些文献的全部内容都全文引入本发明作为本发明说明书的一部分。

[1]C.R.Lowe，An introduction to affinity chromatography Elsevier/North-HollandBiomedical Press.1979；

[2]Stellan Hjerten，I.Zelikman，J.Lindeberg，J.-I.Liao，K.-O.Eriksson and J.Mohammad，High-performance adsorption chromatography of proteins on deformed non-porousagarose beads coated with insoluble metal compounds.I.Coating：Ferric oxyhydroxidewith stoichimetrically bound phosphate，J Chromatography 481(1989)175-186；

[3]Stellan Hjerten and Jiali Liao，High-performance liquid chromatography of proteins oncompressed，non-porous agarose beads.I.Hydrophobic-interaction chromatography，JChromatography.457(1988)165-174；

[4]Stellan Hjerten and Jinping Li，High-performance liquid chromatography of proteins ondeformed non-porous agarose beads.II.Fast boronate affinity chromatography ofhemoglobin at neutral pH，J Chromatography.500(1990)543-553；

[5]Shahab Lahooti and Michael V.Sefton，Effect of an immobilization matrix and capsulemembrane permeability on the viability of encapsulated HEK cells，Biomaterials.21(2000)987-995；

[6]Hiroyuki Hayashi，Kazutomo Inoue，Tun Aung ect.，Application of a novel B cell lineMIN6 to a mesh-reinforced polyvinyl alcohol hydrogel tube and three-layer agarosemicrocapsules：An in vitro study，Cell Transplantation.5(1996)S65-S69；

[7]Stellan Hjerten，The preparation of agarose spheres for chromatography of moleculesand particles，Biochimica Et Biophysica Acta.79(1964)393-398；

[8]A.M.Egorov，A.Kh.Vakhabov and V.Ya.Chernyak，Isolation of agarose andgranulation of agar and agarose gel，Journal of chromatography.46(1970)143-148；

[9]S.Bengtsson and L.Philipson，Chromatography of animal viruses on pearl-condensedagar，Biochimica Et Biophysica Acta.79(1964)399-406；

[10]马光辉，苏志国，王连艳，周青竹.2004.一种尺寸均一的琼脂糖凝胶微球及其制备方法.中国专利200410000087—9；

[11]Per-Ake Pernemalm，Mats Carlsson and Goran Lindgren.1984.Polysaccharidecrosslinked separation material and its preparation.United States Patent 4,665,164。

Claims

1、一种琼脂糖凝胶微球，以微球的总重量计，微球中琼脂糖含量大于12wt％。

2、如权利要求1所述的琼脂糖凝胶微球，以微球的总重量计，微球中琼脂糖含量不大于20wt％。

3、如权利要求1所述的琼脂糖凝胶微球，其按下式计算的粒径分布系数不大于15％：

C.V.＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％

4、如权利要求1的琼脂糖凝胶微球，其平均粒径不大于100微米。

5、如权利要求1所述的琼脂糖凝胶微球，其平均粒径不大于50微米。

6、一种制备权利要求1-5中任一项所述的琼脂糖凝胶微球的方法，其包括如下步骤：

(1)提供浓度高于12wt％的琼脂糖水溶液作为水相W；

(3)将水相W在一定外力作用下分散到油相O中得到W/O型粗乳液；

(4)将所述粗乳液在一定压力下通过疏水性的微孔膜以得到粒径均一的W/O型乳液；和

(5)将(4)中粒径均一的W/O型乳液滴凝固得到琼脂糖凝胶微球。

7、如权利要求6所述的方法所制备的琼脂糖凝胶微球，以微球的总重量计，微球中琼脂糖含量大于12wt％。

8、如权利要求6所述的方法所制备的琼脂糖凝胶微球，其平均粒径不大于50微米。

9、如权利要求7和8所述的琼脂糖凝胶微球，其按下式计算的粒径分布系数不大于15％：

C.V.＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％

上式中，C.V.为粒径分布系数，d_i为各个凝胶的直径，d为数均平均粒径，

10、如权利要求6所述的方法，其中，步骤(4)中所述压力为0-10.0kgf/cm²。

11、如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述初乳液通过微孔膜的速度为0.5—3m³m^-2h^-1。

12、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所用微孔膜的孔径为0—100微米。

13、如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述水相浓度的范围为12wt％-20.0wt％。

14、如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)在加热条件下进行。