CN112341663B - PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法和应用。包括如下步骤:对聚甲基丙烯酸甲酯微球进行亲水化处理,制备亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球;将该亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球、碱和环氧化合物混合,反应,制备环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球;将环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球、Protein A、乙二胺四乙酸、巯基甘油、助剂混合,反应,制备PMMA基质的Protein A亲和层析介质,其具有亲水性好,耐碱性强,耐酸性强,粒径较小,粒径均一,机械强度高的优点,分离效果好,可在高流速下使用,可提高生产效率,成本低廉,适合用于生物大分子的快速分离纯化、连续流层析,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化学领域,特别是涉及一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法和应用。
背景技术
亲和层析是利用生物活性物质之间的特异性亲和力,使目标产物得以分离纯化的液相层析方法,可应用于任何两种有特异性相互作用的生物大分子。由于抗体与抗原作用具有高度的专一性,且该亲和力极强,亲和层析技术兼具高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点,因而被广泛应用于生物大分子的分离纯化。
以Protein A为亲和配基是目前应用最为广泛的亲和介质,其在抗体纯化实际生产中,一步亲和层析即可去除大部分的宿主细胞蛋白、DNA和色素等杂质,纯度达到95%以上。但是Protein A亲和层析介质也具有一些局限性,比如价格昂贵,容量有限,产率低等,难以满足巨大的抗体市场需求。
连续流层析是一种基于模拟移动床概念的新型层析分离模式。传统的批次层析过程中,为防止蛋白的损失,通常采取低穿透点上样,介质的利用率低,而连续流层析通过多柱串联上样,并交替进行洗脱再生,大大地提高了介质利用率,降低蛋白在层析柱中地保留时间,极大地增加了过程产率。由于Protein A价格昂贵,提高产能和降低成本成为抗体生产下游过程变革的关键,实现连续流层析介质是重要的趋势之一。连续流层析最理想的Protein A亲和层析介质粒径、孔径均较小。因为较小的粒径可以缩短传质路径,提高孔内传质。而较小的孔径可以有效地提高介质的比表面积,提供更多的配基偶联位点,有利于蛋白结合,拥有相对较高的载量。不过,粒径越小,床层压降也会越大。
通常认为,介质的基质及其结构对于介质的性能如机械强度、比表面积、传质性能等具有重要影响。抗体亲和介质的基质主要有天然多糖类(如琼脂糖、葡聚糖等)、高分子聚合物(如聚苯乙烯、聚丙烯酸等)和无机材料类(如多孔玻璃和硅胶)。
其中,琼脂糖微球具有良好的生物相容性和易于衍生功能基团的优点,而交联技术的引入,部分克服了琼脂糖微球机械低和孔径小的不足,可将其耐压指标提高到0.3MP,大大拓宽了其应用领域,但其耐压性能仍难以同时满足高流速和大规模化层析的要求。目前,国内抗体生产大多采用进口的Protein A亲和层析介质,如GE的MabSelect SuRe,其基质为高交联的琼脂糖微球,优点是亲水性极佳,生物相容性好,非常适合抗体类生物功能团的分离纯化;但缺点是其结构偏软,粒径分布较宽,在实际使用过程中存在装柱重复性差,机械强度低等问题。
Millipore公司的Prosep Ultra Plus也是一种使用较为广泛的蛋白A亲和层析介质,其基质为孔道可控的玻璃珠结构,具有耐压、高流速的特点。但是,玻璃珠结构的缺陷为疏水性强,与宿主蛋白易产生非特异性的结合。另外,其不可耐高浓度NaOH,结合在柱上的杂质不易除去,因而限制其在大规模生物样品中应用。
发明内容
基于此,有必要提供一种制备亲水性好,耐碱性强,耐酸性强,粒径较小,粒径均一,同时机械强度高,可在高流速下使用,分离效果好,成本低廉的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基质的ProteinA亲和层析介质的方法,适合用于生物大分子(如抗体)的快速分离纯化、连续流层析,可提高生产效率,提高介质利用率、减少缓冲液使用量。
技术方案如下:
一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,包括如下步骤:
亲水化处理:将具有式(1)所示的结构的聚甲基丙烯酸甲酯微球、碱1、环氧氯丙烷、水和葡聚糖混合,制备具有式(2)所示的结构的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球;
环氧化处理:将所述的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球、碱2和式(2-1)所示的环氧化合物混合,反应,制备具有式(3)所示的结构的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球;
将所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球、Protein A、乙二胺四乙酸、巯基甘油、助剂混合,反应,制备具有式(I)所示的结构的所述PMMA基质的Protein A亲和层析介质;
合成路线如下:
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的交联度为5%-80%;
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径为10μm~70μm;
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径分布变异系数小于5%。
在其中一个实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的交联度为10%-70%;。
在其中一个实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的多分散系数为1.04~1.18。
在其中一个实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径为20μm~60μm。
在其中一个较为优选的实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径分布变异系数小于3%。
在其中一个实施例中,所述的Protein A由葡萄球菌蛋白A的E、C和Z-domain拼接得到。
在其中一个实施例中,所述亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球的制备方法包括以下步骤:
将聚甲基丙烯酸甲酯微球、部分的碱1、环氧氯丙烷混合,制备中间体;
将所述中间体、葡聚糖和剩余的碱1混合,制备所述亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球。
在其中一个实施例中,所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球和葡聚糖的质量比1:0.1~1:0.4。
在其中一个实施例中,所述的碱1和碱2分别独立地选自氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾和叔丁醇钾中的一种或几种。
在其中一个实施例中,所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球和碱1的质量比1:0.1~1:0.4。
在其中一个实施例中,所述的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球、碱2的质量比1:2-1:4。
在其中一个实施例中,所述的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球和环氧化合物的质量比1:0.8-1:1.5。
在其中一个实施例中,制备环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球的反应时间为2h~20h,反应温度为10℃~40℃。
在其中一个实施例中,所述环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球与Protein A的质量比1:2~1:3。
在其中一个实施例中,所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球和乙二胺四乙酸的质量比为2.0:1~2.5:1。
在其中一个实施例中,所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球和巯基甘油的质量比为2.0:1~2.5:1。
在其中一个实施例中,所述助剂包括偶联促进剂、PB缓冲液或封尾缓冲液中的一种或多种。
在其中一个实施例中,所述偶联促进剂选自硫酸钠;和/或,所述封尾缓冲液选自碳酸钠或碳酸氢钠。
本发明还提供根据上述的制备方法制备得到的PMMA基质的Protein A亲和层析介质。
本发明还提供上述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质在分离纯化生物大分子中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的PMMA基质的Protein A亲和层析介质,其化学结构中包含ProteinA、高交联的PMMA微球和大量的羟基。其中,采用高交联的PMMA微球作为固体基质,可赋予亲和层析介质优异的机械性能,使其表现出优异的耐压性,既可以耐高流速,提高分离效率,也可以提高装柱重复性和介质利用率,减少缓冲液消耗,多方面节约成本,解决Protein A亲和层析介质成本高,产率低,难以满足市场需求的问题。同时,PMMA微球的表面含有大量的羟基,赋予亲和层析介质优异的亲水性,使其不会与宿主蛋白产生非特异性的结合。同时,通过链状醚间隔臂以键合的形式将Protein A连接在固体基质上,使Protein A亲和层析介质呈树枝状,提高了Protein A亲和层析介质的稳定性,耐酸性强,耐碱清洗性增强,用碱冲洗时Protein A配基脱落量少,可重复使用。
此外,采用单分散微球结构,亲和层析介质的粒径及其分布更为可控,将ProteinA与PMMA微球连接,有利于制备粒径较小,且粒径均一的PMMA基质的Protein A亲和层析介质。本发明将聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径控制为10μm~70μm,粒径分布变异系数设置为小于5%,既可以缩短传质路径,提高传质效率,又不会使床层压降增大太多,导致分离效果变差。
可见,本发明的PMMA基质的Protein A亲和层析介质综合性能优异,特别适合用于生物大分子(如抗体)的快速分离纯化、连续流层析,制备方法简单,效率高,适合工业化生产,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的机械性能和耐压性测试结果;
图2是实施例1的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的耐碱性测试结果;
图3是采用实施例1的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;
图4是采用实施例4的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;
图5是采用实施例5的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;
图6是采用实施例6的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;
图7是采用对比例2的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;
图8是采用对比例3的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;
图9是采用对比例4的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以高交联的琼脂糖微球为基质的Protein A亲和层析介质,亲水性极佳,生物相容性好,非常适合抗体类生物功能团的分离纯化;但结构偏软,粒径分布较宽,在实际使用过程中存在装柱重复性差,机械强度低等问题。以孔道可控的玻璃珠结构为基质的Protein A亲和层析介质,具有耐压、高流速的特点。但是,疏水性强,与宿主蛋白易产生非特异性的结合;并且,其不可耐高浓度NaOH,结合在柱上的杂质不易除去,因而限制其在大规模生物样品中应用。
对此,本发明提供了一种亲水性好,耐碱性强,耐酸性强,粒径较小,粒径均一,同时机械强度高,可在高流速下使用,分离效果好,成本低廉的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基质的ProteinA亲和层析介质,适合用于生物大分子(如抗体)的快速分离纯化、连续流层析,可提高生产效率,提高介质利用率、减少缓冲液使用量。
本发明的PMMA基质的Protein A亲和层析介质,具有式(I)所示的结构:
在本发明中,PMMA的交联度指制备PMMA时交联剂与MMA单体的质量比。
粒径分布变异系数:标准物质的粒径分布变异系数用于表示标准物质的颗粒粒径分散程度,常用标准差或标准差与标准物质平均粒径的比值的百分数表示,也称分散度。
本发明的技术方案如下:
一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,包括如下步骤:
亲水化处理:将具有式(1)所示的结构的聚甲基丙烯酸甲酯微球、碱1、环氧氯丙烷、水和葡聚糖混合,制备具有式(2)所示的结构的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球;
环氧化处理:将所述的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球、碱2和式(2-1)所示的环氧化合物混合,反应,制备具有式(3)所示的结构的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球;
将所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球、Protein A、乙二胺四乙酸、巯基甘油、助剂混合,反应,制备具有式(I)所示的结构的所述PMMA基质的Protein A亲和层析介质;
合成路线如下:
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的交联度为5%~80%;
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径为10μm~70μm;
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径分布变异系数小于5%。
本发明提供的PMMA基质的Protein A亲和层析介质,其化学结构中包含ProteinA、高交联的PMMA微球和大量的羟基。其中,采用高交联的PMMA微球作为固体基质,可赋予亲和层析介质优异的机械性能,使其表现出优异的耐压性,既可以耐高流速,提高分离效率,也可以提高装柱重复性和介质利用率,减少缓冲液消耗,多方面节约成本,解决Protein A亲和层析介质成本高,产率低,难以满足市场需求的问题。同时,PMMA微球的表面含有大量的羟基,赋予亲和层析介质优异的亲水性,使其不会与宿主蛋白产生非特异性的结合。同时,通过链状醚间隔臂以键合的形式将Protein A连接在固体基质上,使Protein A亲和层析介质呈树枝状,提高了Protein A亲和层析介质的稳定性,耐碱清洗性增强,用碱冲洗时Protein A配基脱落量少,可重复使用。此外,采用微球结构,其粒径及其分布更为可控,将Protein A与PMMA微球连接,有利于制备粒径较小,且粒径均一的PMMA基质的Protein A亲和层析介质。本发明将聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径控制为10μm~70μm,粒径分布变异系数设置为小于5%,既可以缩短传质路径,提高传质效率,又不会使床层压降增大太多,导致分离效果变差。
优选地,上述PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法如下:
包括如下步骤:将具有式(1)所示的结构的聚甲基丙烯酸甲酯微球、碱1、环氧氯丙烷、水和葡聚糖混合,制备具有式(2)所示的结构的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球。即对PMMA微球进行亲水化处理,使其表面含有大量的亲水性的羟基。
优选地,所述亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球的制备方法包括以下步骤:
将聚甲基丙烯酸甲酯微球、部分的碱1、环氧氯丙烷混合,制备中间体;
将所述中间体、葡聚糖和剩余的碱1混合,制备所述亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球。
在其中一个实施例中,所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球和葡聚糖的质量比1:0.1~1:0.4。
在其中一个实施例中,所述的碱1选自氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾和叔丁醇钾中的一种或几种。
在其中一个实施例中,所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球和碱1的质量比1:0.1~1:0.4。
后处理步骤:抽滤并用水洗涤至中性,在30℃~60℃条件下真空干燥2h~10h。
再将所述中间体A和环氧化合物混合,继续反应。
在其中一个实施例中,所述的碱2选自氢氧化钠、氢氧化钾、叔丁醇钾、甲醇钾和甲醇钠中的一种或几种。优选地,所述的碱2选自氢氧化钠。
在其中一个实施例中,制备环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球的反应时间为2h~20h,反应温度为10℃~40℃。
后处理步骤:抽滤并用水洗涤至中性,在30℃~60℃条件下真空干燥2h~10h。
即将获得间隔臂上的环氧基开环与Protein A配基中的巯基偶联生成Protein A亲和层析介质。
在其中一个实施例中,所述的Protein A由葡萄球菌蛋白A的E、C和Z-domain拼接得到(详见中国专利202010747812.8)。
在其中一个实施例中,所述环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球与Protein A的质量比1:2~1:3。
在其中一个实施例中,所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球和乙二胺四乙酸的质量比为2.0:1~2.5:1。
在其中一个实施例中,所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球和巯基甘油的质量比为2.0:1~2.5:1。
在其中一个实施例中,所述助剂包括偶联促进剂、PB缓冲液或封尾缓冲液中的一种或多种。优选地,偶联促进剂、PB缓冲液或封尾缓冲液与所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球与质量比分别为1.5:1、2.0:1和1.5:1。
在其中一个实施例中,所述偶联促进剂选自硫酸钠;和/或,所述封尾缓冲液选自碳酸钠或碳酸氢钠。
后处理步骤:抽滤并用水洗涤至中性,在30℃~60℃条件下真空干燥2h~10h。
在其中一个较为优选的实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的交联度为10%~70%。
在其中一个实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的多分散系数为1.04~1.18。
在其中一个较为优选的实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径为20μm~60μm。采用这个粒径范围内的聚甲基丙烯酸甲酯微球作为基质,既可以较好地缩短传质路径,提高孔内传质。更优选地,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径为40μm~50μm。采用这个粒径范围内的聚甲基丙烯酸甲酯微球作为基质,既可以较好地缩短传质路径,提高孔内传质,同时对床层压降几乎没有影响,生产效率高、耐压性强和分离效果好。
在其中一个较为优选的实施例中,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球的粒径分布变异系数小于3%,更利于制备粒径均一的PMMA基质的Protein A亲和层析介质,提高分离效果。
可以理解,本发明的聚甲基丙烯酸甲酯微球可以为无孔结构,也可以是具有多孔结构的微球。多孔结构有利于提高介质的比表面积,提供更多的配基偶联位点,有利于蛋白结合,拥有相对较高的载量。
本发明还提供根据上述的制备方法制备得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质。
本发明还提供上述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质在分离纯化生物大分子中的应用。
以下为具体实施例部分。
如无特殊说明,实施例和对比例中所用的原料均为市售产品。
实施例1
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
(1)制备亲水的PMMA微球1
在氮气保护下,量取10g PMMA微球1置于三角烧瓶中,并向其中加入2mol/L NaOH水溶液30mL,将盛有上述溶液的三角瓶放入摇床中振荡10min,然后加入5g环氧氯丙烷(alalddin,纯度99.7%)25℃继续震荡5h,反应完毕后,抽滤并用水洗涤至中性。将以上微球置于三角烧瓶中,并向其中加入30mL去离子水和2g葡聚糖(分子量100KDa),将盛有上述溶液的三角瓶放入摇床中振荡10min,然后加入1g氢氧化钠,35℃继续震荡16h,反应完毕后,抽滤并用水洗涤至中性,30℃真空中干燥4h得到亲水性的PMMA微球1。
(2)制备环氧化的PMMA微球1:
在氮气保护下,量取10g亲水性的PMMA微球1置于三角烧瓶中,并向其中加入50mL2mol/L的NaOH水溶液,将盛有上述溶液的三角瓶放入摇床中振荡10min,然后加入10g环氧氯丙烷(购自alalddin,纯度99.7%)25℃继续震荡5h,反应完毕后,抽滤并用水洗涤至中性,在50℃真空中干燥6h得到环氧化的PMMA微球1。
(3)制备PMMA基质的Protein A亲和层析介质1:
在氮气保护下,将1.5g环氧化的PMMA微球1置于15mL EP管中,向该管中加入3.75mL 10mg/mL的Protein A,5mL 1.3M Na2SO4,7.5mL 50mM PB,2.25mL 1mM EDTA溶液。用封口膜封口后,通氮气5min,密封,放入摇床中,在37℃条件下震荡24h。将反应后的蛋白溶液用针管过滤器滤去蛋白溶液,并分别测量反应后OD值,并记录。
当OD值小于0.8时,向该EP管加入0.5mL巯基甘油,4.5mL pH值为10.0的Na2CO3溶液,通氮气5min,封口膜封口后放入摇床震荡4h,反应温度37℃。反应完毕后,抽滤并用水洗涤至中性,在50℃真空中干燥6h得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质1。
实施例2
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球2,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质2。
实施例3
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球3,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质3。
实施例4
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球4,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质4。
实施例5
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球5,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质5。
实施例6
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球6,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质6。
实施例7
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球7,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质7。
PMMA微球7购自购自苏州纳微科技股份有限公司,无孔,粒径为40μm,CV为2.5%,交联度为60%,多分散系数为1.10。
对比例1
本对比例提供一种琼脂糖基质的Protein A亲和层析介质的制备方法。
产品型号MabSelect SuRe LX,生产商GE,基质琼脂糖,粒径60μm~165μm,
对比例2
本实施例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球8,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质8。
对比例3
本对比例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球9,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质9。
对比例4
本对比例提供一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质及其制备方法。
制备方法与实施例1基本相同,区别仅在于将PMMA微球1替换为PMMA微球10,得到PMMA基质的Protein A亲和层析介质10。
试验例
(1)机械强度测试:
层析柱:取实施例1制备的Protein A亲和层析介质填装XK16-250mm层析柱。
仪器:AKTApurifier(苏州赛谱仪器有限公司)
流动相:0.15M NaCl溶液
柱温:25℃
测试条件:去离子水平衡至基线归零,用0.5M氯化钠平衡液冲洗。提高流速,观察压力变化情况。
测试结果如图1所示,可承受压力大于0.8MPa,且柱压与流速保持线性关系,说明机械强度好。柱高升高,可承受压力随之增大。可在30cm柱高以上更快流速运行,最高耐受压力1MPa。
采用相同的方法对实施例2至7以及对比例1至4的Protein A亲和层析介质的机械性能以及柱压进行了测试,结果见表1。
表1
(2)耐碱性测试
层析柱:取实施例1制备的Protein A亲和层析介质填装1mm PP柱(7*25mm);
样品:单克隆抗体澄清发酵液,3.6mg/mL;
测试条件:使用10个柱体积的20mM PBS缓冲液,150mM NaCl,pH 7.0;洗脱:6个柱体积的20mM柠檬酸pH 3.0;平衡:3个柱体积的PBS缓冲液;5个柱体积的CIP:0.5M NaOH(每轮接触时间15min);再平衡:10个柱体积的PBS缓冲液;流速:1mL/min(150cm/h)。反复循环120次。
测试结果如图2所示,结果显示10%流穿动态载量不低于起始流穿动态载量的90%,表明Protein A亲和层析介质1耐碱清洗性强,配基脱落少。
采用相同的方法对实施例2至7以及对比例1至4的Protein A亲和层析介质的耐酸碱稳定性进行了测试,结果见表2。
表2
由表2可知,本申请实施例1至7和对比例1至4制备得到的Protein A亲和层析介质对酸碱稳定。
(3)单克隆抗体的纯化应用
层析柱:取实施例1制备的Protein A亲和层析介质填装10mm PP柱(高25mm);
设备:AKTA pure(NM-BD-004)(苏州赛谱仪器有限公司)
测试样品:IgG1发酵液2.7mg/mL;
测试条件:使用15个柱体积的10mM PBS缓冲液,pH 6.0;洗脱:10个柱体积的20mM柠檬酸pH 3.4;平衡:15个柱体积的10mM PBS缓冲液;保留时间5min,流速800cm/h。
测试结果如图3所示,IgG1洗脱峰为尖峰,其中一些变体也得到分离,表明其适用于mAb分离。
采用同样的方法对实施例4至7和对比例1至4的制备的Protein A亲和层析介质进行了测试。
图4是采用实施例4的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;从图4中可以看出IgG1洗脱峰对成性稍差,有一点拖尾,表明其可用于mAb分离,分离效果较差。
图5是采用实施例5的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图;从图5中可以看出IgG1洗脱峰为尖峰,与图3相比,与杂质之间保留时间少,洗脱峰不单一,表明其可用于mAb分离,分离效果较差。
图6是采用实施例6的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图,从图6中可以看出IgG1洗脱峰为尖峰,与图3相比,与杂质之间保留时间少,洗脱峰不单一,表明其可用于mAb分离,分离效果较差。
采用对比例1的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1,尾塌。
图7是采用对比例2的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图,从图7中可以看出IgG1洗脱峰对成性差,拖尾明显,洗脱峰不单一,表明其不适合用于mAb分离。
图8是采用对比例3的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图,从图8中可以看出IgG1洗脱峰对成性差,拖尾明显,洗脱峰不单一,表明其不适合用于mAb分离。
图9是采用对比例4的PMMA基质的Protein A亲和层析介质分离IgG1的色谱图,从图9中可以看出IgG1洗脱峰对成性差,拖尾明显,洗脱峰不单一,表明其不适合用于mAb分离。
对实施例1至7以及对比例1至4的Protein A亲和层析介质在连续流中的分离效果进行表征,方法如下:
连续流层析分离IgG1的应用
层析柱:取实施例1至7制备的Protein A亲和层析介质填装4.7mL PP柱;
仪器:四柱循环连续流层析系统);
样品:IgG1(50mg/mL);
工作条件:
首先用5CV平衡缓冲液平衡层析柱,上样,用5CV平衡缓冲液冲洗,然后用5CV高盐缓冲液(20mMPBS缓冲液,pH 6.0,1.0M NaCl淋洗,再用5CV平衡缓冲液冲洗,然后用5CV柠檬酸盐缓冲液(0.1M,pH 3.0)进行洗脱,5CV醋酸溶液1.0M充分清洗,5CV平衡缓冲液平衡层析柱,再用0.1M NaOH对层析柱再生15min,最后用5CV平衡缓冲液进行平衡。分离过程中上样的保留时间1.5min,冲洗步骤的保留时间与上样一致,再生步骤的保留时间固定为4min,其它步骤(包括平衡、淋洗、洗脱等)的保留时间都为1.5min。
表3不同层析介质在连续流中的分离效果
在连续流层析系统的应用中,与琼脂糖基质的介质相比,本发明制备的PMMA基质的Protein A亲和层析介质纯化抗体的产率和介质利用率更高,缓冲液消耗更少。随着PMMA基质粒径、平均粒径的增大,产率、介质利用率、缓冲液消耗等相应有不同差别。粒径越小,越均一,机械强度高的介质,流速越快,介质利用率越高,可有效降低生产成本。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.一种PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
亲水化处理:将聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)、碱1、环氧氯丙烷、水和葡聚糖混合,制备亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球(2);
环氧化处理:将所述的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球(2)、碱2和式(2-1)所示的环氧化合物混合,反应,制备环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球(3);
将所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球(3)、Protein A、乙二胺四乙酸、巯基甘油、助剂混合,反应,制备所述PMMA基质的Protein A亲和层析介质(I);
合成路线如下:
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)的交联度为60%~80%;
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)的粒径为20μm~60μm;
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)的粒径分布变异系数小于3%;
所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)具有多孔结构,所述多孔结构中每个孔的孔径为100Å-2000Å;
所述的碱1和碱2分别独立地选自氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾和叔丁醇钾中的一种或几种;
所述的Protein A由葡萄球菌Protein A的E结构域、C结构域和Z结构域拼接得到。
2.根据权利要求1所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)的交联度为60%;和/或,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)的粒径为40μm或50μm。
3.根据权利要求1所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)的多分散系数为1.04~1.18。
4.根据权利要求1~3任一项所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)的多孔结构中每个孔的孔径为500Å、1000Å或2000Å。
5.根据权利要求1所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球(2)的制备方法包括以下步骤:
将聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)、部分的碱1、环氧氯丙烷混合,制备中间体;
将所述中间体、葡聚糖和剩余的碱1混合,制备所述亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球(2)。
6.根据权利要求1或5所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)和葡聚糖的质量比为(1:0.1)~(1:0.4)。
7.根据权利要求1所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述的聚甲基丙烯酸甲酯微球(1)和碱1的质量比为(1:0.1)~(1:0.4);和/或,
所述的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球(2)、碱2的质量比为(1:2)-(1:4)。
8.根据权利要求1~3任一项所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述的亲水性聚甲基丙烯酸甲酯微球(2)和环氧化合物的质量比为(1:0.8)~(1:1.5)。
9.根据权利要求1所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球(3)与Protein A的质量比为(1:2)~(1:3);和/或,
所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球(3)和乙二胺四乙酸的质量比为(2.0:1)~(2.5:1);和/或,
所述的环氧化聚甲基丙烯酸甲酯微球(3)和巯基甘油的质量比为(2.0:1)~(2.5:1)。
10.根据权利要求1~3任一项所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述助剂包括偶联促进剂、PB缓冲液或封尾缓冲液中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法,其特征在于,所述偶联促进剂选自硫酸钠;和/或,所述封尾缓冲液选自碳酸钠或碳酸氢钠。
12.一种根据权利要求1~11任一项所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质的制备方法制备得到的PMMA基质的Protein A亲和层析介质。
13.权利要求12所述的PMMA基质的Protein A亲和层析介质在分离纯化生物大分子中的应用。
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