CN102574101A - 分离基质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含基础基质的分离基质，所述分离基质具有包含与所述基础基质共价结合的疏水官能的第一配体，并具有与所述基础基质共价结合的增长剂，所述增长剂包含第二离子交换配体。

Description

分离基质

技术领域

本发明涉及可用于分离生物分子的分离基质，制备分离基质的方法和用分离基质分离生物分子的方法。

发明背景

有许多情况需要从液体或从其它固体材料分离一种化合物，比如杂质或期望的分子。在很多领域使用基于电荷-电荷的相互作用来捕获从而分离带电或可带电的化合物。

在化学和生物技术领域，通常需要将靶化合物比如药物或候选药从制备过程产生的污染物种(specy)分离。例如，由重组体宿主细胞表达产生的蛋白质药物或代药将需要从例如宿主细胞和可能的细胞碎片、其它宿主细胞蛋白质、DNA、RNA和来自发酵肉汤的残留物比如盐分离。由于其对靶化合物的通用性和敏感性，层析在许多目前使用的生物技术纯化方案中作为至少一个步骤涉及。术语层析包括一系列密切相关的分离方法，它们全部基于使两个互不混溶的相接触的原理。更具体来讲，将靶化合物引入流动相内，使其与静止相接触。当靶化合物由流动相携带通过系统时，它将在静止与流动相之间经历一系列相互作用。该相互作用利用样品组分的物理或化学性质差异。

层析的静止相由基础基质组成，其上已偶联配体，所述配体是能够与靶化合物相互作用的官能团。因此，配体将赋予载体进行分离、鉴定和/或纯化感兴趣的分子的能力。液体层析法通常按用于分离化合物的相互作用原理命名。例如，离子交换层析基于电荷-电荷相互作用；疏水相互作用层析(HIC)利用疏水相互作用；和亲和层析基于特异性生物学亲和力。还可同时使用多于一种相互作用原理，比如多元层析，其中最常使用具有离子交换官能度连同又一种官能度(如疏水)的配体。

众所周知，离子交换基于带电靶化合物与带相反电荷的层析基质之间的可逆相互作用。洗脱最常通过增加盐浓度进行，但改变pH同样是可能的。离子交换剂分为阳离子交换剂，其中用带负电荷的层析基质吸附带正电荷的靶化合物；和阴离子交换剂，其中用带正电荷的层析基质吸附带负电荷的靶化合物。术语“强”离子交换剂用于在宽pH区间带电荷的离子交换剂，而“弱”离子交换剂在某些pH值可带电。一种常用的强阳离子交换剂包含磺酸基配体，称为S基团。有时，此类阳离子交换剂通过官能团及其与载体的连接剂所形成的基团而命名；例如SP阳离子交换剂，其中S基团通过丙基(P)与载体连接。

基础基质的性质还将影响层析基质的分离性质。亲水基础基质(如多糖)具有非常低的固有蛋白吸附，而在大多数分离技术中疏水基础基质比如苯乙烯或甲基丙烯酸酯聚合物需要亲水表面改性以防止蛋白吸附。表面改性是复杂的因素，可有助于制造时批次之间的变化。基础基质的另一考虑是便于其官能化。根据用于偶联配体的化学，可将基础基质活化，即转化为更有反应性的形式。此类活化方法在本领域众所周知，比如使亲水基础基质比如多糖的羟基烷化。共价配体附着通常通过使用基础基质上的反应性官能度比如羟基、羧基、巯基、氨基等实现。配体通常经过简称为连接剂的连接臂附着于基础基质。该连接剂可以是所用偶联化学的结果或者故意引入以改善配体立体可及性的结构。在任一情况下连接剂的长度通常小于约10个原子。

也已知将增长剂掺入分离基质，特别是离子交换基质中。增长剂是附着于基础基质的聚合物种，在聚合物链上具有离子交换配体，均匀或无规地散布在链上或特定位置。已发现使用增长剂增加对蛋白及其它生物分子的动态结合容量，这可能是由于涉及固体扩散现象。

WO2007027139(GE Healthcare)描述分离基质，其通过使葡聚糖增长剂与琼脂糖基础基质偶联，然后使基质与乙烯基磺酸钠反应以将磺酸盐阳离子交换配体偶联在增长剂上而制备。这种构造具有高刚性并显示高动态蛋白容量。但是在某些应用，比如分离单克隆抗体，需要特定生物分子的更特异性的结合，以在离子交换步骤后实现更高的纯度。

WO2008145270(Merck Patent)描述分离基质，其通过使带电和疏水单体混合物与聚甲基丙烯酸酯基础基质接枝聚合而制备。这种构造产生在增长剂上具有带电基团和疏水基团两者的增长剂，其改善对单克隆抗体的特异性，但不产生高动态容量。期望高动态容量，因为它提供高过程生产量。因此，需要产生高纯度和高生产量以及适合重现性制造的新基质。

发明简述

本发明一方面提供能够以高生产量过程提供高纯度的新分离基质。这用包含基础基质的分离基质实现，所述分离基质具有包含与所述基础基质共价结合的疏水官能的第一配体，并具有与所述基础基质共价结合的增长剂，所述增长剂包含第二离子交换配体。

本发明特殊方面是制造能够以高生产量过程提供高纯度的新分离基质的方法。这通过包含以下的方法实现：a)使包含疏水官能的配体与基础基质偶联和b)使包含离子交换配体的增长剂与所述基础基质偶联。这些操作可按任何顺序实施。

本发明又一方面是制造能够以高生产量过程提供高纯度的新分离基质的备选方法。这通过包含以下(任何顺序)的方法实现：a)使包含疏水官能的配体与基础基质偶联，b)使增长剂与所述基础基质偶联和c)使离子交换配体与所述增长剂偶联。

本发明又一方面是制造能够以高生产量过程提供高纯度的新分离基质的另一种备选方法。这通过包含以下(任何顺序)的方法实现：a)使包含疏水官能的配体与基础基质偶联和b)使包含带电单体的单体与所述基础基质接枝聚合。

本发明特殊方面是以高生产量从液体制剂分离至少一种靶生物分子至高纯度的方法。这通过包括使所述液体制剂与分离基质接触的步骤的方法实现，所述分离基质包含含有与基础基质共价结合的疏水官能的第一配体和包含第二离子交换配体的增长剂。

通过所附权利要求限定的本发明可实现以上一个或多个方面。从以下详细描述和权利要求将出现本发明另外的方面、细节和优点。

附图简述

图1显示用本发明分离基质处理后，正丁基配体含量怎样影响对抗体进料的动态IgG容量和残留宿主细胞蛋白水平。

图2显示用本发明分离基质处理后，正丁基配体含量怎样影响抗体进料中残留的庆大霉素水平。

定义

术语“靶化合物”在本文指希望从水溶液分离的任何化合物、分子或其它实体。靶化合物可以是期望的产物，或者液体产物不期望的杂质。如果靶化合物是生物分子，可将其称为靶生物分子。

术语“杂质”在本文指存在于液体或固体材料中的任何不期望的化合物、分子或其它实体。

术语“多羟基聚合物”在本文指包含许多羟基的任何聚合物。

术语“多糖”用于本文包括天然多糖、合成多糖、多糖衍生物、改性多糖及其任何混合物。

术语“配体”以其在层析中的常规含义用于本文，指包含能够与靶化合物相互作用的官能团的实体。配体基团的实例是带正电或可带正电的基团(阴离子交换配体)；带负电或可带负电的基团(阳离子交换配体)；疏水基团；对靶化合物具有特异性生物学亲和力(比如抗原对抗体的亲和力)的基团(亲和力配体)；等。

术语“增长剂”在本文指在至少一点共价附着于基础基质的聚合物。离子交换配体与增长剂共价结合或者形成增长剂聚合物的整体部分。增长剂也称为例如“柔性臂”、“触须”和有时“绒毛”。在上下文中，增长剂区别于连接剂之处在于增长剂是聚合物种，连接剂不是。

术语“基础基质”在本文指适合用于分离方法比如层析、分批吸附或膜分离的任何固体材料，也称为支持物或载体。

术语“疏水官能”在本文指配体具有能够通过疏水相互作用与溶质相互作用的部分。包含疏水官能的配体实例是用于疏水相互作用层析(HIC)的配体。

术语“生物分子”在本文指可由生物体产生的任何种类物质的成员(包括合成或半合成成员)。此类种类的实例是肽、蛋白、碳水化合物、核酸、质粒、病毒和细胞。

“蛋白”指任何类型的蛋白、糖蛋白、磷蛋白、蛋白缀合物、蛋白集合或蛋白片段。抗体构成商业上重要的蛋白质种类。其它商业上关注的蛋白质是肽、胰岛素、促红细胞生成素、干扰素、酶、血浆蛋白、细菌蛋白、病毒样颗粒等。

“抗体”指任何免疫球蛋白分子、抗原结合免疫球蛋白片段或免疫球蛋白融合蛋白，单克隆或多克隆的衍生自人或其它动物的细胞系，包括天然或基因修改的形式比如人源化、人、嵌合、合成、重组体、杂交、突变、接枝和体外产生的抗体。通常已知的天然免疫球蛋白抗体包括IgA、IgG、IgE、IgG和IgM。

术语“解吸液体”在本文指引起靶生物分子从分离基质解吸的此类组成(其它组分的pH、离子强度、浓度)的液体(通常是缓冲液)。在液体层析分离中，解吸缓冲液也通常称为洗脱缓冲液或洗脱液。

术语“动态结合容量”在本文指分离基质在穿透测试中能够结合的测试物种比如蛋白的量。

发明详述

本发明一方面涉及包含基础基质的分离基质，所述分离基质具有包含与所述基础基质共价结合的疏水官能的第一配体，并具有与所述基础基质共价结合的增长剂，所述增长剂包含第二离子交换配体。本发明一个优点是增长剂与疏水配体在基础基质上的组合意外地得到对蛋白(如单克隆抗体)的高选择性以及高动态蛋白容量。还可通过改变包含疏水官能的配体的量和/或类型来微调选择性。

在一个实施方案中包含疏水官能的配体包含至少一个C₂-C₁₈烃链(线性或支化)，比如C₄-C₁₈烃链，或者至少一个烃环。烃链和烃环都可在末端，即只在一个点上附着于残留配体结构或连接剂。它们还可以未被取代，即除了附着于残留配体结构/连接剂以外没有非烃取代基。具体来讲，它们可采用丁基、己基、辛基或苯基形式。在一个实施方案中包含疏水官能的配体只具有疏水官能。它们可由饱和烃链和/或芳环组成，任选被醚和/或羟基取代。

在另一个实施方案中增长剂包含平均分子量≥1000Da比如超过10 000Da或甚至超过30 000Da的聚合物。这些聚合物可以为线性或支化的、取代或非取代的、天然或合成的。它们可包含用于偶联离子交换配体的反应性基团和/或它们可固有包含离子交换配体作为取代基或作为主链的组分。增长剂聚合物的实例是聚乙烯醚、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等的组(group)。在一个实施方案中增长剂包含多羟基聚合物，其中考虑的一组多羟基聚合物是多糖，如葡聚糖、支链淀粉、淀粉、纤维素衍生物等。另一组多羟基聚合物是合成聚合物如聚乙烯醇、聚羟烷基乙烯基醚、聚甲基丙烯酸羟烷酯、聚甲基丙烯酸甘油酯和与二醇或多元醇反应的甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物。

在一个实施方案中基础基质包含交联多羟基聚合物。这些多羟基聚合物可以是合成或天然来源。考虑的一组天然多羟基聚合物是多糖(如纤维素、葡聚糖)或热胶凝化多糖(如琼脂糖或琼脂)。合成多羟基聚合物的实例包括聚乙烯醇、聚羟烷基乙烯基醚、聚甲基丙烯酸羟烷酯、聚甲基丙烯酸甘油酯和与二醇或多元醇反应的甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物的组。用多糖及其它多羟基聚合物制备的基础基质的一个优点是它们固有亲水，即在未取代形式它们没有或具有非常低的蛋白解吸。这允许配体官能化基质良好的控制和重现性，因为与生物分子的相互作用基本只受可以良好精确度偶联的配体的影响。

在又一个实施方案中离子交换配体包含阳离子交换配体比如磺酸基、硫酸基、羧基或磷酸基。在备选实施方案中离子交换配体包含阴离子交换配体，如季铵基或叔胺。

在一个实施方案中离子交换配体在分离基质上的总量是25-250微摩尔每ml基质，比如50-150微摩尔/ml基质或75-125微摩尔/ml基质。

在另一个实施方案中，增长剂不含或包含少量包含疏水官能的配体。该量可小于5微摩尔/g疏水配体(按每g增长剂计算)或甚至实质上为零。技术人员将领会即使制造方法已指导在增长剂上完全不给出任何疏水配体，但假的疏水配体仍可附着于增长剂。前提是它们的量低，比如低于5或2微摩尔/g增长剂，这些少数配体将不会对蛋白容量或其它层析性质有害。在增长剂上具有少量或基本为零的疏水配体有利于分离基质的蛋白容量。

在一个实施方案中，包含疏水官能的配体在分离基质上的量为10-100微摩尔/ml分离基质比如20-70微摩尔/ml分离基质。这可通过本领域已知的方法测量，比如NMR、振动光谱、热解GC等。

在又一个实施方案中包含疏水官能的配体通过包含醚和羟基的连接剂附着于基础基质。此类连接剂水解稳定，且通过环氧或卤代醇化学而偶联来方便地制备。考虑的连接剂的实例是甘油醚、二甘油醚和甘油-丁烯-甘油醚。

在一个实施方案中分离基质的动态IgG结合容量(QB10％)≥100mg/ml基质。这可在穿透测试中测定，其中将基质限制在柱或膜吸附器设备中。通过柱/吸附器泵送缓冲的IgG溶液，关于UV吸光度监测流出物的蛋白浓度。当流出物蛋白浓度达到进料中浓度的10％时，计算进料至柱/吸附器的IgG总量，除以基质体积，并报告为10％穿透容量。用于QB10％测定的合适的实验细节在实施例2给出。

在某些实施方案中分离基质具有特定形状。它们可以是例如颗粒、膜或单块多孔材料的形式。当它们采用颗粒形式时，这些颗粒可以是球形、实质上球形或不规则形和多孔或非多孔。颗粒可具有多种形态并可含有能够与外力场相互作用的材料，如磁性(超顺磁性)或高密度材料。在一个实施方案中分离基质多孔，平均孔径＞50nm和/或孔隙率＞80％，这有利于例如蛋白在基质中的质量输运。

本发明一方面涉及制造分离基质的方法。在一个实施方案中该方法包含a)使包含疏水官能的第一配体与基础基质偶联和b)使包含第二离子交换配体的增长剂与所述基础基质偶联。该方法的优点是离子交换配体将只位于增长剂上。所述步骤可按任何顺序实施，但在一个实施方案中步骤a)在步骤b)前实施以避免在增长剂上具有任何疏水配体。步骤a)可包括配体试剂与基础基质上的反应性基团比如羟基、羧基、胺、醛等直接反应或者将基础基质上的反应性基团用活化试剂活化接着与配体试剂反应。配体试剂的实例是包含疏水官能的环氧化物、卤代醇、胺、羧基和羧基卤素。本领域已知的活化试剂的实例是：表氯醇、双环氧化物、氯三嗪、卤化氰、与卤素、甲苯磺酰基、三氟乙磺酰基(tresyl)或其它离去基团组合的烯丙基化或乙烯基化试剂(如烯丙基卤或烯丙基缩水甘油醚)。在步骤b)可以使反应性增长剂(具有环氧化物、卤代醇、胺、醛等官能度)与基础基质上的反应性基团偶联或者首先活化基础基质然后与增长剂聚合物反应。

在另一个实施方案中制造方法包含a’)使包含疏水官能的第一配体与基础基质偶联，b’)使增长剂与所述基础基质偶联和c’)使第二离子交换配体与所述增长剂偶联。所述步骤可按任何顺序实施，但在一个实施方案中步骤a’)在步骤b’)或c’)前实施。在特定实施方案中步骤a)在步骤b’)前实施，步骤b’)在步骤c’)前实施，以避免在增长剂上具有任何疏水配体。步骤a’)和b’)可按照上文a)和b)实施，而步骤c’)可包括带电试剂与增长剂聚合物上的反应性基团之间的反应。带电试剂的实例是亚硫酸根离子、乙烯基磺酸、胺(如三甲胺)、缩水甘油基三甲基氯化铵、二乙基氨基乙基氯、氯乙酸、溴乙酸等，而增长剂上的反应性基团的实例是环氧化物、卤代醇、双键、羟基、胺等。

在一个实施方案中制造方法包含a”)使包含疏水官能的配体与基础基质偶联和b”)使包含带电单体的单体与所述基础基质接枝聚合。所述步骤可按任何顺序实施，但在一个实施方案中步骤a”)在步骤b”)前实施以避免在增长剂上具有任何疏水配体。步骤a”)可按照上文a)或a’)实施。接枝聚合是公知技术且已知几种不同技术。在“由…接枝(grafting from)”技术中，用例如铈(IV)盐、Fe²⁺/H₂O₂、铜(I)盐、UV-照射的二苯甲酮、电离辐射等在基础基质上产生引发位点。然后使单体与引发位点反应并扩散以便形成与基础基质共价结合的聚合物链。在“通过…接枝(grafting through)”技术中，使可共聚的基团比如乙烯基、烯丙基、丙烯基或甲基丙烯基与基础基质偶联。然后使基质与单体接触，引发聚合，以便单体与偶联的可聚合基团共聚。

在一个实施方案中通过使基础基质与烷基或烷基芳基缩水甘油醚反应使包含疏水官能的配体与基础基质偶联。烷基缩水甘油醚的实例是乙基缩水甘油醚、正丙基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、正丁基缩水甘油醚、异丁基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、戊基缩水甘油醚(所有异构体)、己基缩水甘油醚(所有异构体)、环己基缩水甘油醚、庚基缩水甘油醚(所有异构体)、辛基缩水甘油醚(所有异构体)、癸基缩水甘油醚等。烷基芳基缩水甘油醚的实例是苯基缩水甘油醚、苄基缩水甘油醚等。

本发明一方面涉及从液体制剂分离至少一种靶生物分子的方法，其包括使所述液体制剂与分离基质接触的步骤，所述分离基质包含含有与基础基质共价结合的疏水官能的第一配体和包含第二离子交换配体的增长剂。在一个实施方案中基础基质包含琼脂糖，在另一个实施方案中增长剂包含葡聚糖。在又一个实施方案中离子交换配体包含阳离子交换配体。

在一个实施方案中靶生物分子是蛋白质比如抗体。抗体是工业上重要的蛋白质，本发明的基质对抗体显示高得惊人的选择性和容量。

在一个实施方案中靶生物分子与分离基质结合，同时从基质洗去或解吸未结合/较小强结合的杂质，然后使基质与解吸液体接触以解吸靶生物分子。当在柱中实施时，该方式也称为结合-洗脱层析，它通过选择不同缓冲液(结合缓冲液、洗涤缓冲液和解吸缓冲液)和任选使用缓冲液梯度用于解吸，提供充足的可能性使分离步骤的选择性最佳。在备选实施方案中靶生物分子和杂质两者与分离基质结合，接着使分离基质与选择性解吸靶生物分子的解析液体接触。然后可将基质上的残余杂质用再生液体解吸，然后再次使用分离基质。碱性溶液比如0.1M-2M NaOH可用作再生液体，但也可使用其它液体。

在一个实施方案中解吸液体具有与结合缓冲液和洗涤缓冲液不同的电导率和/或pH，比如比结合缓冲液和洗涤缓冲液更高的电导率。

在另一个实施方案中液体制剂含有宿主细胞蛋白。每当生物分子在细胞中表达，细胞也将表达其自己的蛋白，通常称为宿主细胞蛋白(HCP)。这是宽范围的不同蛋白，取决于细胞类型，残余HCP是经常在下游处理时难以除去的杂质种类。当CHO细胞用于表达蛋白(如单克隆抗体)时，宿主细胞蛋白有时称为CHO细胞蛋白(CHOP)。有效除去HCP/CHOP是期望的特征。在一个实施方案中在分离步骤将宿主细胞蛋白浓度减少≥5或甚至≥10的系数。在分离步骤之前和之后测定HCP/CHOP水平的方法是公知的，包括例如免疫测定。

在另一个实施方案中将分离基质填在柱中。有许多不同的柱构造可市售获得，且用颗粒形式的分离基质填柱的方法在本领域公知。

在又一个实施方案中杂质与分离基质结合，而在柱的流过物中回收靶生物分子。该方法经常称为流过(flow-through)层析，得到高生产量，特别是如果杂质水平相对低(如低于10 000ppm)时。

在一个实施方案中使分离基质颗粒的混悬液与液体制剂接触，接着从液体制剂除去分离基质颗粒。该方法经常用于分批方式，但也可采用连续方式。在一个实施方案中通过外力场促进(完成？)分离基质颗粒的除去。外力场典型地可以是重力场(其中基质颗粒可根据密度沉降或漂浮)、离心力场、磁场、电场或流体流动力场(如通过过滤除去基质颗粒时)。对于重力场和离心力场，可以使用分离基质颗粒与周围液体之间的固有密度差异，但也可以在分离基质颗粒中包括高或低密度填料以增加密度差异。对于磁场，方便的是在分离基质颗粒中包括磁性(如超顺磁性)填料。

本发明的其它特征和优点将从以下实施例和从权利要求显而易见。

本书面描述用实施例公开本发明，包括最佳实施方式，还使本领域任何技术人员能够实施本发明，包括制备和使用任何设备或系统和执行任何并入的方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，可包括本领域技术人员想到的其它实施例。此类其它实施例旨在落入权利要求范围内，如果它们具有不与权利要求的文字语言不同的结构元件，或者如果它们包括与权利要求的文字语言无实质差异的等价结构元件。

附图详述

图1.对单克隆抗体的动态结合容量和阳离子交换池中的HCP水平作为加入基础基质的正丁基量的函数。

图2.庆大霉素(细胞培养物的添加剂)的清除率作为加入基础基质的正丁基配体量的函数。

实施例

进料样品

进料是IgG单克隆抗体的蛋白A柱洗出液，在pH 9.2具有其等电点，表达于CHO细胞。抗体浓度为约5g/L，宿主细胞蛋白浓度为16 000ppm，庆大霉素(细胞培养物的添加剂)浓度为约175ng/ml。将进料电导率调节至约4mS/cm。

实施例1：在基础基质上具有正丁基配体的阳离子交换剂原型

将按照US 6,602,990(Berg)描述制备的琼脂糖凝胶珠(即具有改良的流动/压力性质的琼脂糖)，通过使用描述于下文合成实施例1a)的条件，经历与正丁基缩水甘油醚的反应，以将受控疏水性引入基质内。接着用描述于下文合成实施例1b)的条件，通过琼脂糖珠的环氧活化和葡聚糖偶联至所选水平来引入增长剂。最后根据合成实施例1c)使凝胶与乙烯基磺酸钠反应以将阳离子交换配体引入至期望的水平。

合成实施例1a)疏水配体的引入

使凝胶(125克沉淀)悬浮于水(37.5mL)中，加入硫酸钠(20.6克)，接着在室温下搅拌(30分钟)。向搅拌的浆料内加入50％氢氧化钠(w/w)(37.5克)和硼氢化钠(0.52克)的溶液。将混合物在室温搅拌1小时，然后加入丁基缩水甘油醚(31.25mL)，接着在50℃另外搅拌20小时。反应完成后加入水(100mL)，将反应混悬液用乙酸中和至中性pH。

最后将凝胶在玻璃过滤器上用水，乙醇，然后再用水洗涤。

分析用这些特定条件引入的配体水平得到50μmol/mL沉淀凝胶。

合成实施例1b)环氧活化和葡聚糖偶联

向具有引入的疏水配体的凝胶(120克沉淀)内加入水(32.8mL)和50％氢氧化钠(w/w)的溶液(36mL)，然后将浆料在室温搅拌20分钟。然后，使用剂量仪泵，加入表氯醇(总计40mL，0.33mL/分钟)，接着在室温另外搅拌2小时。最后将凝胶在玻璃过滤器上用水洗涤。这些条件得到11μmol/mL沉淀凝胶的环氧活化水平。

将溶于水(275mL)的葡聚糖(平均分子量：40kD)(240克)加入以上制备的凝胶(110克沉淀)中，接着在30℃搅拌1小时。然后加入50％氢氧化钠(w/w)(10.45mL)和硼氢化钠(0.05克)的溶液，接着在30℃搅拌过夜(17小时)。

这些反应条件得到约29克葡聚糖/mL沉淀凝胶。

合成实施例1c)磺酸基配体的引入

将根据上文制备的凝胶(60克沉淀)在玻璃过滤器上用120mL乙烯基磺酸钠盐(30％)(VSA)洗涤4次，使最后一次洗涤得到120克的凝胶加VSA重量。加入50％氢氧化钠(w/w)溶液(75mL)，接着在3.75小时期间在52℃搅拌。然后将凝胶在玻璃过滤器上用水洗涤。这些条件得到离子配体密度为99μmol/mL沉淀凝胶的凝胶。

通过调节反应条件，可以非常精确的方式控制引入的正丁基配体量，如下表1所指示。

表1

实施例2.动态IgG容量

用20cm床高柱和20分钟样品停留时间测定对于IgG单克隆抗体在10％穿透的动态结合容量(QB10％)。在应用样品之前将柱用25mM乙酸钠pH 5.0平衡。当负载完成时将柱用平衡缓冲液洗涤并通过流动相洗脱，条件是pH 5和4mS/cm。

实施例3：用阳离子交换剂原型除去杂质

通过和测定动态结合容量的描述类似的方法测试杂质的除去，除了将单克隆抗体的负载减少至130mg/ml凝胶，即远低于动态穿透容量，以得到在过程条件下杂质清除率的更现实的观点。通过将电导率梯度增加至500mM乙酸钠，将结合的单克隆抗体洗脱。通过在280nm的UV吸光度监测洗脱相，收集峰前端光密度(OD)0.5和尾端OD 0.5之间的洗脱池，分析残余HCP和庆大霉素。

表2

阳离子交换池中的动态IgG容量和HCP水平(作为与基础基质偶联的正丁基配体量的函数)显示于图1。

图2显示庆大霉素(细胞培养物中的添加剂)的清除率作为与基础基质偶联的正丁基配体量的函数。

如在表2和图1可注意到，较高水平的引入的疏水性(正丁基配体)导致洗脱的材料中HCP污染水平下降而不丧失高结合容量。但是，图2中的数据指示太高的疏水性水平可能对其它杂质的除去有负面影响。

本文提到的所有专利、专利出版物及其它公开的参考文献特此通过引用全部结合，如同其各自已个别和具体地通过引用结合到本文中。虽然描述了本发明的优选示例性实施方案，本领域技术人员将理解本发明可通过所述实施方案以外来实施，所述实施方案只用于说明的目的而提出且并不作为限制。本发明只受随后的权利要求限制。

Claims (35)

1.包含基础基质的分离基质，所述分离基质具有包含与所述基础基质共价结合的疏水官能的第一配体，并具有与所述基础基质共价结合的增长剂，所述增长剂包含第二离子交换配体。

2.权利要求1的分离基质，其中所述包含疏水官能的配体包含至少一个C₂-C₁₈烃链或至少一个烃环。

3.权利要求1的分离基质，其中所述增长剂包含平均分子量≥1000Da比如超过10 000Da的聚合物。

4.权利要求1-3中任一项的分离基质，其中所述增长剂包含多羟基聚合物比如葡聚糖。

5.任何前述权利要求的分离基质，其中所述基础基质包含交联多羟基聚合物比如多糖。

6.任何前述权利要求的分离基质，其中所述基础基质包含琼脂糖或琼脂。

7.任何前述权利要求的分离基质，其中所述离子交换配体包含阳离子交换配体比如磺酸基。

8.任何前述权利要求的分离基质，其中所述包含疏水官能的配体包含至少一个末端C₂-C₁₈烃链和/或至少一个末端烃环。

9.任何前述权利要求的分离基质，其中所述包含疏水官能的配体包含丁基、己基、辛基或苯基。

10.任何前述权利要求的分离基质，其中所述增长剂包含小于5微摩尔/g疏水配体。

11.任何前述权利要求的分离基质，其中包含疏水官能的配体的量是10-100微摩尔/ml分离基质比如20-70微摩尔/ml分离基质。

12.任何前述权利要求的分离基质，其中包含疏水官能的配体经过包含醚和羟基的连接剂附着于基础基质。

13.任何前述权利要求的分离基质，其中所述分离基质的动态IgG结合容量(QB10％)≥100mg/ml。

14.任何前述权利要求的分离基质，其中所述分离基质采用颗粒比如球形颗粒的形式。

15.任何前述权利要求的分离基质，其中所述分离基质采用膜的形式。

16.一种制造分离基质的方法，其包含(以任何顺序)a)使包含疏水官能的第一配体与基础基质偶联和b)使包含第二离子交换配体的增长剂与所述基础基质偶联。

17.一种制造分离基质的方法，其包含(以任何顺序)a’)使包含疏水官能的第一配体与基础基质偶联，b’)使增长剂与所述基础基质偶联和c’)使第二离子交换配体与所述增长剂偶联。

18.权利要求16或17的方法，其中在增长剂偶联之前使包含疏水官能的配体与基础基质偶联。

19.一种制造分离基质的方法，其包含(以任何顺序)a”)使包含疏水官能的配体与基础基质偶联和b”)使包含带电单体的单体与所述基础基质接枝聚合。

20.权利要求16-19中任一项的方法，其中通过使基础基质与烷基或烷基芳基缩水甘油醚反应使包含疏水官能的配体与基础基质偶联。

21.一种从液体制剂分离至少一种靶生物分子的方法，其包括使所述液体制剂与分离基质接触的步骤，所述分离基质包含含有与基础基质共价结合的疏水官能的第一配体和包含第二离子交换配体的增长剂。

22.权利要求21的方法，其中所述基础基质包含琼脂糖。

23.权利要求21或22的方法，其中所述增长剂包含葡聚糖。

24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述离子交换配体包含阳离子交换配体。

25.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述靶生物分子是蛋白比如抗体。

26.权利要求25的方法，其中所述蛋白是单克隆IgG抗体。

27.权利要求21-26中任一项的方法，其中所述靶生物分子与分离基质结合，同时从基质洗去或解吸未结合/较小强结合的杂质，然后使基质与解吸液体接触以解吸靶生物分子。

28.权利要求27的方法，其中所述解吸液体具有与结合缓冲液和洗涤缓冲液不同的电导率和/或pH。

29.权利要求28的方法，其中所述解吸液体具有比结合缓冲液和洗涤缓冲液更高的电导率。

30.权利要求21-29中任一项的方法，其中所述液体制剂含有宿主细胞蛋白。

31.权利要求30的方法，其中使所述宿主细胞蛋白浓度减少≥5的系数。

32.权利要求21-31中任一项的方法，其中将所述分离基质填在柱中。

33.权利要求32的方法，其中杂质与所述分离基质结合，同时在柱的流过物中回收靶生物分子。

34.权利要求21-32中任一项的方法，其中使分离基质颗粒的混悬液与液体制剂接触，接着从所述液体制剂除去分离基质颗粒。

35.权利要求34的方法，其中通过外力场促进分离基质颗粒的除去。

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