CN102958602A - 层析方法及为此使用的介质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在介质上进行离子交换层析的方法,所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒,其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体,壳提供有带电荷的离子交换配位体,所述方法包括以下步骤:a)使样品分子在第一pH吸附在壳配位体上;b)通过加入缓冲剂物质使内芯配位体在第二pH放电,所述缓冲剂物质能够增加它与芯配位体相同符号/类型的电荷,这同时导致离子从内芯配位体释放,从而导致增加离子强度,增加离子强度从壳配位体置换样品分子,即,产生洗脱。
Description
发明领域
本发明涉及新的离子交换介质及其用途。更准确地讲,本发明涉及在包含壳式珠粒(shell bead)的介质上进行离子交换层析的方法。介质包含在芯中其电荷随pH改变的配位体和在外壳中能够结合样品分子的离子交换配位体。
背景
在生物技术内,最近提出的层析方法基于与靶相互作用的不同模式。因此,例如,在离子交换层析中,官能团为与它们的相反电荷可交换反离子的持久结合的离子基团。
生物分子的离子交换层析一般使用的层析介质用在珠粒中均匀分布的适合带电配位体取代。为了达到用于洗脱被吸附生物分子的盐梯度和/或pH梯度,用具有不同洗脱剂的两个泵得到梯度。最初,非排代流动相泵输送大部分(如果不是全部)流量通过层析介质,而排代流动相泵将很少(或甚至没有)流量输送通过层析介质。然后,连续或间歇改变各泵的流速,以得到适合洗脱被吸附化合物的梯度。
因此,在很多情况下,为了洗脱被吸附的样品分子,希望比使用常规双泵装配用来产生盐梯度和/或pH梯度更简单的进行离子交换层析的方法。
发明概述
本发明提供进行离子交换层析的新原理,所述原理不依赖双泵装配来产生盐梯度和/或pH梯度用于洗脱被吸附的样品分子。
第一方面,本发明提供在介质上进行离子交换层析的方法,所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒,其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体,壳提供有带电荷的离子交换配位体,所述方法包括以下步骤:a)使样品分子在第一pH吸附在壳配位体上;b)通过加入缓冲剂物质使内芯配位体在第二pH放电,所述缓冲剂物质能够增加它与芯配位体相同符号/类型的电荷,这同时导致离子从内芯配位体释放,从而导致增加离子强度,增加离子强度从壳配位体置换样品分子,即,产生洗脱。
可使用任何类型的缓冲剂物质,例如,胺缓冲剂,只要它与芯配位体(例如,胺配位体)为相同类型(具有相同类型的电荷)。根据以下公式,在pH增加时,这引起增加的离子强度:
M=珠粒基质。
优选外壳配位体为强离子交换配位体,例如
-+N(CH3)3和所有类型的季铵配位体,非芳族和芳族-SO3 –配位体。
在优选的实施方案中,官能化芯的电荷改变/pH单位为>30µmol/pHmL凝胶。
根据本发明的方法,壳配位体和芯配位体可具有相同或不同的电荷,并且选自任何类型的阳离子配位体,例如羧酸根(-COO-)、膦酸根或磷酸根(分别为-PO3 2-、-P(OH)O2 -和-OP(OH)O2 -、-OPO3 2-)、磺酸根或硫酸根(分别为-SO3 -和-OSO3 -)、-芳基-O-(酚根/芳醇根(arylolate));或任何类型的阴离子配位体,例如,带正电荷的不同的氮,例如,伯铵、仲铵、叔铵、季铵和脒鎓(amidinium)。
根据前述主张中一项或多项的方法,其中芯的孔隙率防止或允许样品分子穿透进入芯。
优选壳式珠粒具有3至400µm的直径,外壳为0.5-100µm厚。例如,在具有100µm直径的壳式珠粒的情况下,外壳为0.5-10µm。在具有300µm直径的壳式珠粒的情况下,外壳为0.5-30µm。
在供选的实施方案中,在方法以柱形式进行时,流的方向在洗脱步骤中反向,即,将柱倒转。这使得能够有足够时间用于离子强度积累,并实现样品分子通过层析床的较短输送距离,从而得到尖峰。
第二方面,本发明涉及用于以上方法的层析介质,所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒,其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体,壳提供有带电荷的离子交换配位体。
第三方面,本发明涉及以上层析介质用于生物和合成源的样品分子的离子交换层析的用途,所述样品分子例如细胞和/或其部分、病毒和/或其部分、蛋白、复合蛋白、融合蛋白、肽、核酸、两性大分子、两性颗粒、药物、药物片段。
该用途可为柱、微量滴定(microtiter)或批形式。
附图简述
图1显示用于阳离子交换介质的珠粒设计,具有芯配位体,芯配位体的电荷和结合相关反离子的能力可由pH转变来改变。
图2显示在用50%的原型HFA 55芯 PEI壳-S(弱阴离子配位体)和50% 的S-壳(强阳离子)原型填充的柱上的核糖核酸酶A的分离(细节参见实验部分)。
发明详述
本发明提出使用具有芯的“壳式珠粒”,芯用可质子化和可去质子化的官能团(弱离子交换配位体)官能化,芯可通过用(缓冲剂)化合物改变pH来减少电荷或放电,(缓冲剂)化合物继而在过程中增加芯的电荷,同时改变周围溶液(流动相)中的离子强度,并实现吸附到带电优选强离子交换配位体的蛋白的洗脱。目标为样品吸附的离子交换配位体优选连接到薄外壳,芯配位体为具有允许在对应用适合的pH范围中改变电荷的pKa的弱离子交换配位体,芯配位体可以为带有与壳配位体相同的电荷或相反的电荷两者。为了通过在短pH间隔中相对尖pH转变来改变电荷或者在宽pH间隔中缓慢地逐渐改变电荷,芯配位体可取决于它们所选择的化学结构。可用后者类型的配位体在层析柱上产生pH和盐梯度。与共同待决SE专利申请1050157-5的色谱聚焦介质比较,为了释放足够高量的盐离子,在本发明的芯中的配位体密度高数倍。为了避免结合样品取代基,可调节芯的孔隙率,以排除蛋白/肽。另外,流动相可使用“一般”缓冲物质的简单混合物,所述缓冲物质能够使芯配位体放电和同时获得具有相同符号的电荷,因此允许从芯配位体释放反离子。当然,只有一个泵(没有洗脱剂混合设备)是在珠粒中和周围得到增加的离子强度所必需的。此类型介质的主要应用领域是蛋白和肽的大规模精制。此类型珠粒也非常适用于分析应用。
现在将结合附图和实验部分描述本发明。
实验部分
在本文中实施例只为了说明目的提出,不应解释为限制附加权利要求限定的发明。
总论
基质的体积是指澄清床体积,以克给出的基质的重量是指抽干重量(去除空隙水的溶胀珠粒)。为了反应,搅拌使用电动搅拌器。将常规方法用于分析官能性和确定烯丙基化度或珠粒上的胺含量度。
以下说明制备本发明的分离基质的一种方法,从交联琼脂糖凝胶(Sepharose™ HFA
55,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)开始。Sepharose HFA 55的珠粒直径为约90μm。
采用基于 Sepharose HFA 55 - HFA 55 芯 -PEI 壳 -SO 3 - 的内部 pH 和离子强度梯度洗脱的等度离子交换层析所用壳介质的制备
Sepharose HFA 55
的烯丙基活化
在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤Sepharose HFA 55。将凝胶(800mL排水凝胶)加入3颈圆底烧瓶。加入NaOH(800mL,50%溶液),并开始机械搅拌,将浆料在水浴上加热到50℃。在约1小时后,加入168mL烯丙基缩水甘油基醚(AGE)。然后使浆料在剧烈搅拌下过夜。在约20小时后,将浆料转移到玻璃过滤器,用蒸馏水(x5)、乙醇(x2)和蒸馏水(x5)洗涤。
然后通过滴定(230µmol/mL)测定烯丙基含量。
壳活化
(
部分溴化
)
将100mL烯丙基化凝胶称入烧瓶,并加入1000mL蒸馏水。使0.354mL溴溶于100mL蒸馏水,将此溶液加到烯丙基化凝胶浆料。该量的溴相当于约5µm的壳厚度。在剧烈搅拌期间,将溴溶液以5个等份加到烯丙基凝胶浆料。在约10分钟后,在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤凝胶。
阳离子交换基团的壳偶联
(S-
壳原型
)
将100mL部分溴化凝胶(见上)转移到烧瓶,并与溶于25mL蒸馏水的12,5g亚硫酸钠混合。在搅拌的同时,加入50%
NaOH到pH 12,随后在50℃搅拌20小时。然后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤凝胶。
离子交换容量估计为25µmol/mL。
PEI(
聚乙烯亚胺
)
在珠粒的芯中的偶联
将25mL “S-壳凝胶(见上)与蒸馏水(25mL)和0.5g乙酸钠在烧杯中利用顶置搅拌混合。加入溴直到浆料具有保持的深橙/黄色。在搅拌2分钟后,加入甲酸钠,直到浆料完全褪色。然后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤凝胶。
将25mL排水芯溴化凝胶转移到烧杯,并与10mL水和10g聚乙烯亚胺(750000g/mol)混合。然后将混合物在20℃搅拌20小时,随后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。凝胶的PEI官能化芯的离子交换容量估计为150µmol/mL凝胶床。
HFA
55
芯
PEI
壳
-S
的层析评估
为了试验壳介质原型(HFA 55芯 PEI壳-S)的性质,将柱用S-壳原型(见上)和HFA 55芯 PEI壳-S的混合物填充。使用50%的原型HFA 55芯 PEI壳-S仅是证明介质(HFA 55芯 PEI壳-S)产生pH梯度和离子强度梯级/梯度的效率的一种方式。
实验
关于层析性能,将壳介质的混合物(见上)在HR 5/20柱中填充,在用缓冲溶液(50mM甲酸,pH 2.7)平衡后,将样品(100µL核糖核酸酶A,10mg/mL)注入柱中。将流速调节到0.25mL/min,通过施加缓冲剂B(300mM三乙醇胺,pH 9.7),“等度”洗脱蛋白(核糖核酸酶A)。
样品
样品为溶于50mM甲酸(pH
2.7)的核糖核酸酶A,将浓度调节到10.0mg/ml。样品体积为100µL。
仪器
LC系统:Äkta Explore 10
软件:Unicorn
柱HR 5/20
结果和讨论
为了改进下游层析平台,使蛋白制备较大地简化,保持或提高分离介质的层析性能非常重要。在本发明中,我们提出,离子交换珠粒(其可在柱中在等度运行下)产生内部pH变化或pH梯度和叠加的离子强度梯级/梯度。分离配位体连接在壳中,在洗脱过程中所用的配位体则在芯中。通过与较早的平衡pH相比而言调节到不同pH的洗脱剂/缓冲剂,芯配位体的电荷可以转变,从而产生pH梯度和离子强度变化。另外,可调节芯的孔隙率,以排除蛋白/肽。用于阳离子交换层析,此类型珠粒的设计说明于图1中。
在图1中,我们已表明PEI(聚乙烯亚胺)作为可放电IEX芯配位体(当然,也可使用其它可放电IEX配位体),它使得能够产生逐渐的电荷转变和在pH3到至少10 之间的pH梯度。用于此类型珠粒的芯配位体用平衡和吸附缓冲剂或者调节到芯配位体带电荷所在的pH (即,在利用酸性缓冲剂的阴离子交换配位体的情况下,例如3的pH)的具有较高浓度缓冲剂物质的单独的平衡缓冲剂的反离子平衡和预饱和,然后用例如调节到10的三乙醇胺缓冲剂洗脱。在洗脱步骤中使用的流动相中的带电荷缓冲剂组分,由于它们的低浓度而不是由它们自身,能够从-SO3 -基团置换/洗脱结合的(在此实施例中,带正电荷的)样品生物分子。在PEI配位体中的氮使用高pH三乙醇胺缓冲剂的滴定导致减少它们的电荷,并在pH升高时从PEI配位体释放反离子。释放的离子继而充当在滴定过程中已获得增加的电荷的缓冲剂化合物的反离子。以此方式,产生在珠粒中和周围在流动相中增加的离子强度。通过用调节到胺不完全质子化或根本不质子化的pH的胺缓冲剂溶液缓慢滴定PEI配位体,除了pH梯度外,还可能得到内部产生的离子强度梯度。通过使用在珠粒的芯中的高PEI密度,可强化此离子强度增加。
为了证明此类型介质可用于分离蛋白,将柱用50%的原型HFA
55芯 PEI壳-S和50%的S-壳原型(见上)填充。根据图2,得到pH梯度,也观察到传导率中的梯级。核糖核酸酶A以尖峰精细地洗脱。结果清楚地显示,此类型珠粒设计(图1)可用于蛋白的纯化。通过调节壳厚度、芯中缓冲配位体和壳中配位体的类型,可优化珠粒的性能。
为了洗脱,有利地改变柱中流的方向。这使得能够有足够时间用于离子强度积累,并实现样品分子通过层析床的较短输送距离,从而得到尖峰。
Claims (12)
1. 一种在介质上进行离子交换层析的方法,所述介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒,其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体,壳提供有带电荷的离子交换配位体,所述方法包括以下步骤:a)使样品分子在第一pH吸附在壳配位体上;b)通过加入缓冲剂物质使内芯配位体在第二pH放电,所述缓冲剂物质能够增加它与芯配位体相同符号/类型的电荷,这同时导致离子从内芯配位体释放,从而导致增加离子强度,增加离子强度从壳配位体置换样品分子,即,产生洗脱。
2. 权利要求1的方法,其中壳配位体为强离子交换配位体,例如-+N(CH3)3和所有类型的季铵配位体、非芳族和芳族-SO3–配位体。
3. 权利要求1至2的方法,其中官能化芯的电荷改变/pH单位为>30µmol/pHmL凝胶。
4. 前述权利要求中一项或多项的方法,其中壳配位体和芯配位体可具有相同或不同的电荷,并且选自任何类型的阳离子配位体,例如羧酸根(-COO-)、膦酸根或磷酸根(分别为-PO3 2-、-P(OH)O2 -和-OP(OH)O2 -、-OPO3 2-)、磺酸根或硫酸根(分别为-SO3 -和-OSO3 -)、-芳基-O-(酚根/芳醇根);或任何类型的阴离子配位体,例如,带正电荷的不同的氮,例如,伯铵、仲铵、叔铵、季铵和脒鎓。
5. 前述权利要求中一项或多项的方法,其中芯的孔隙率防止样品分子穿透进入芯。
6. 前述权利要求中一项或多项的方法,其中芯的孔隙率允许样品分子穿透进入芯。
7. 前述权利要求中一项或多项的方法,其中壳式珠粒具有3至400μm之间的直径。
8. 权利要求7的方法,其中外壳为0.5-100µm厚。
9. 前述权利要求中一项或多项的方法,其中方法以柱形式进行,并且流的方向在洗脱步骤中反向。
10. 用于前述权利要求中一项或多项的层析介质,所述层析介质包含具有多孔内芯和外壳的壳式珠粒,其中内芯提供有其电荷随pH改变的配位体,壳提供有带电荷的离子交换配位体。
11. 权利要求10的层析介质用于生物和合成源的样品分子的离子交换层析的用途,所述样品分子例如细胞和/或其部分、病毒和/或其部分、蛋白、复合蛋白、融合蛋白、肽、核酸、两性大分子、两性颗粒、药物、药物片段。
12. 权利要求11的用途,所述用途为柱、微量滴定或批形式。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20151028 |
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C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |