CN103827135A - 具有高耐盐度的离子交换材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种交联的磺化聚合物或者一种用包含氨基基团的交联的的聚合物覆层的交联的磺化聚合物以用作为具有高耐盐度的离子交换材料以将大分子从溶液中分离出来，所述溶液来自于生物源。

Description

具有高耐盐度的离子交换材料

技术领域

本发明涉及一种交联的磺化聚合物或者一种用包含氨基的交联的聚合物覆层的交联的磺化聚合物以用作为具有高耐盐度的离子交换材料以将大分子从溶液中分离出来，所述溶液来自于生物源。

背景技术

离子交换树脂的库伦交互作用是色谱纯化工艺中最常见的交互作用。在离子交换树脂中，离子基团如强酸（例如磺酸）、强碱（例如季胺）、弱酸（例如羧酸）和弱碱（例如伯胺或叔胺）优选作为基团共价地施加到刚性基质材料上。这些离子基团与待纯化的分子的互补的官能团交互作用，所述官能团因此结合到离子交换树脂上。通过离子交互作用被结合的目标分子的洗提通常通过提高洗提剂中的盐浓度来实现，以至于目标分子通过一种或多种相应的盐离子来取代。小于150mmol/L的相对低的盐浓度通常足以中断库伦交互作用并且洗提目标分子。

根据应当从中分离出目标分子的混合物的起源，盐浓度已经能够比通常能够用于洗提的浓度更高。这主要具有如下缺点，即目标分子在存在高的盐浓度时不结合在离子交换树脂上。特别地，从生物源、如发酵溶液、体液或者植物提取物中获得的溶液，传导性（电导率；与盐浓度相对于的参数）对于直接使用离子交换色谱通常是过高的。因此，通常需要不期望的稀释步骤，以便降低混合物的传导性（降低盐浓度）。

存在许多已知的和可用的离子交换树脂，所述离子交换树脂能够在盐浓度相对高时结合物质。当然，所有迄今为止已知的离子交换树脂在氯化钠的浓度高于250mmol/L的情况下不再能够以足够的吸附容量

结合生物的大分子，例如胰岛素。氯化钠在这里被仅示例性地被提及；但是原则上也能够存在处于该摩尔量的其它的盐。此外迄今为止已知的所使用的离子交换树脂在pH1至14的整个pH范围上不是稳定的进而不是可普遍适用的。

发明内容

因此本发明的目的在于，提供一种用于分离大分子的方法，其中大分子能够直接从来自于生物源的溶液中分离。此外期望的是，所使用的离子交换材料在pH1至14的整个pH范围上是稳定的。由于其高的耐盐度，所述离子交换材料应当实现：不必执行附加的稀释步骤以降低盐浓度。这些方法可能具有如下优点，即在纯化包含盐的混合物时，用于附加的稀释步骤的溶剂的成本和用于处理废弃物质的成本能够被减小。

为了实现所提到的目的，本申请提供一种将交联的磺化聚合物用于将大分子从来自于生物源的溶液中分离出来的应用，其中交联的磺化聚合物包含结合到其基本构架上的磺化的芳香族单元，所述芳香族单元被脂肪族残基取代或是未被取代的。

换而言之，本申请涉及一种利用交联的磺化聚合物将大分子从来自于生物源的溶液中分离出来的方法，所述磺化的聚合物包含结合在其基本构架上的磺化的芳香族单元，所述磺化的芳香族单元被脂肪族残基取代或是未被取代的。

将大分子理解为根据本发明的具有大于或等于10000g/mol的摩尔质量的分子。尤其优选地，大分子是生物分子，例如肽和蛋白质、DNA、RNA、多糖和脂多糖，例如内毒素。

术语“分离”不仅应被理解为从溶液中提取/纯化的目标分子以及也应被理解为从溶液中去除不期望的大分子，以至于目标分子保留在被纯化的溶液中。

交联的磺化聚合物的基本构架能够是各已知的聚合物基本构架，所述聚合物基本构架由含烃的重复单元构成。

将聚合物的基本构架理解为聚合物的主链，侧链形式的子基团，如磺化的芳香族单元能够结合到所述主链上。除了磺化的芳香族单元之外，聚合物也还能够包含其它的侧链，所述其它的侧链不算在基本构架内，而是——如已知的那样——属于侧链。换而言之，建立聚合物主链的且与主链的至少两个其它的至少二价的原子键合的所有的原子属于基本构架。结合在已提到的原子上的单键结合的原子，如氢原子，同样属于基本构架的原子。在交联的磺化聚合物是交联的聚苯乙烯的情况下，键合的乙烯基单元能够是基本构架并且磺化的苯基团能够是侧链。

将含烃的重复单元理解为所有下述可考虑的化合物，所述化合物主要由碳和氢构成，但是也能够包含杂原子。重复单元键合到聚合物能够通过各已知的聚合法实现。根据本发明，尤其优选是游离的、阳离子的或者阴离子的烯烃聚合。尤其优选基本构架是聚乙烯构架。基本构架优选是交联的基本构架，以至于产生交联的聚合物。特别是在聚乙烯构架的情况下，交联通过含乙烯基的单体与包含两个乙烯基团的单体的共聚产生。但是原则上也可以考虑的是，首先制造具有线性基本构架的聚合物。紧接着的交联随后能够紧随通过侧链中的官能团与交联反应物的反应来实现。

根据本发明所使用的交联的磺化聚合物优选在侧链中包含磺酸基团。侧链在根据本发明的交联的磺化聚合物中是如在下文中详细描述的芳香族单元。磺化的芳香族单元优选通过共价单键结合到基本构架上。磺化的芳香族单元此外能够通过脂肪族残基来取代。尤其优选的是，磺化的芳香族单元通过共价单键直接结合到基本构架的原子上。

在本发明中将芳香族单元理解为通过脂肪族残基取代的或者未被取代的单环或多环的芳香族环体系。就本发明而言，优选将芳香族环体系理解为具有6至60个碳原子的，优选6至30个，尤其优选6至10个碳原子的芳香族环体系。这些芳香族环体系能够是单环或者多环的，也就是说，所述芳香族环体系能够具有一个环（例如苯基）或者两个或更多个环，所述两个或更多个环也能够缩合（例如萘基）或者能够共价地键合（例如联苯基），或者包含缩合的和键合的环的组合。

优选的芳香族环体系例如是苯基、联苯基、三苯基、萘基、蒽基、联萘基、菲基、二氢菲基、芘、二氢芘、屈（艹屈）、二萘嵌苯、并四苯、并五苯、苯并芘、芴和茚。尤其优选地，芳香族环体系是苯基、联苯基或者萘基，尤其优选是苯基。

如已经提到的，芳香族环体系能够通过脂肪族基团来取代。在这里可以考虑的是，芳香族环体系不是仅通过一个脂肪族团而是通过两个或更多个脂肪族团取代。脂肪族残基优选是具有1至20个，或1至10个碳原子的烃基残基。根据本发明的脂肪族烃基残基优选是线性的或者支化的或者环状的烷基基团，其中一个或多个氢原子也能够通过氟来代替。具有1至20个碳氢原子的脂肪族烃基残基的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基（1-甲基丙基）、叔丁基、异戊基、正戊基、叔戊基（1,2-二甲基丙基）、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基（新戊基）、1-乙基丙基、2-甲基丁基、正己基、异己基、1,2-二甲基丁基、1-乙基-1-甲基丙基、2-甲基丁基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基丁基、1-甲基丁基，1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、2-乙基己基、三氟甲基、五氟乙基和2,2,2-三氟乙基。尤其优选作为脂肪族烃基残基的是甲基或者乙基。

格外优选的是，交联的磺化聚合物的通过脂肪族残基取代的或者未取代的磺化的芳香族单元是苯磺酸基团或者是其衍生物。在苯磺酸基团的衍生物的情况下，衍生物是指通过脂肪族残基取代的衍生物。在这种情况下，苯基残基上的磺酸基团优选位于相对于苯基环上的结合至基本构架位置的对位。脂肪族残基在这里优选是甲基基团或者乙基基团，所述甲基基团或者乙基基团位于苯基基团上的相对于苯基环上的结合至基本构架的位置的邻位或间位。

但是尤其优选的是，磺化的芳香族单元不被取代。在这里特别考虑磺化的交联的聚苯乙烯。磺化的聚苯乙烯的交联优选通过苯乙烯与二乙烯苯的共聚来实现，随后进行苯基基团的磺化。但是在这里为了制造交联的共聚物也可以考虑任何其它的包含两个乙烯基团的交联剂。

交联的磺化聚合物的交联度根据本发明优选为0.5%至50%，尤其优选5%至45%并且最优选10%至35%。在本发明中，将以百分比表示的交联度理解为所使用的包含两个乙烯基团的化合物与待聚合的单体单元的总数的摩尔百分比。

交联的磺化聚合物的磺化度优选为1%至80%，更优选为3%至60%并且最优选为5%至40%。以百分比表示的磺化度涉及磺酸基团的摩尔数与用于聚合的所有的单体单元之比，所述单体单元具有磺化的基团。将用于聚合的具有可磺化的基团的单体单元理解为包含磺化的芳香族单元的所有的单体单元，也理解为包含可磺化的基团、优选芳香族单元的所有的单体单元以及可选择地理解为引起交联的所有的化合物，只要这些化合物包含可磺化的或者磺化的基团的话。如果使用磺化的聚苯乙烯-二乙烯苯-共聚物作为交联的磺化聚合物，那么百分比形式的磺化度与磺酸基团的数量相对于包含在聚合物中的所有的苯基基团或亚苯基基团的数量之比有关。

在根据本发明的方法中或者在根据本发明的应用中所使用的交联的磺化聚合物优选以规则或者不规则成形的树脂颗粒的形式存在。在本发明中将术语“规则地成形”理解为如下形状，所述形状通过对称操作如面镜像、点镜像或者旋转轴或者其组合来描述。在这里尤其优选的能够是球状的形状。将术语“球状的”不仅理解为纯粹对称的球体，也理解为与之有所不同的形状例如椭圆体。但是两个彼此连接为哑铃的球状的本体也应包括在此。将不规则的形状理解为各不完整的形状，所述不完整的形状不具有对称性。树脂颗粒优选具有1μm至1000μm的中位平均直径，更优选为5μm至100μm的中位平均直径并且尤其优选为10μm至50μm的中位平均直径。

在根据本发明的方法中或在根据本发明的应用中所使用的交联的磺化聚合物优选具有微孔，在所述微孔中，发射与待分离的材料的原本的交互作用。因此其优选是多孔聚合物材料。这些微孔优选具有6nm至400nm的平均直径，尤其优选30nm至100nm的平均直径。微孔直径通过逆体积排阻层析法来确定：在此待研究的相材料被包入到层析柱中并且注入一系列的聚合物尺寸标准。在相对于洗提体积绘制相应的标准中的分子量的对数时，能够从曲线的变化中根据文献中已知的方法确定微孔直径的分布进而确定中位微孔直径。

此外，交联的磺化聚合物具有1mL/g至3mL/g范围中的微孔体积是优选的。微孔体积通过对吸水能力的测量来确定：在干燥状态下确定重量的相材料与溶剂交联，对于所述溶剂应确定微孔体积（不同的溶剂能够由于不同的可润湿性而显示不同的结果）。对于本发明的目的而言，将水作为溶剂来使用。过量的溶剂被滤出并且相材料在离心机中从其它的位于粒子间体积中的溶剂中释放出来。紧接着所述材料重新被称重。仅仅微孔仍应通过溶剂来填充。微孔体积能够经由被填充的微孔和空的微孔之间的质量差以及溶剂的密度来计算。

在根据本发明的方法中或在根据本发明的应用中所使用的交联的磺化聚合物具有如下优点，即其除了在侧链中的具有芳香族单元的亲脂性的基本构架之外，还具有可离子化的基团如磺酸基团。以这种方式其适合于不仅通过离子的交互作用也通过亲脂性的交互作用来与大分子相互作用。在这里磺酸基团优选用作为阴离子-SO₃ ^--基团，所述阴离子-SO₃ ^--基团能够允许与大分子的阳离子进行离子交互作用。此外，来自于生物源的大分子，例如蛋白质、DNA或者RNA也具有亲脂性的区域，所述亲脂性的区域能够作为亲脂性的基质与交联的磺化聚合物的芳香族单元交互作用。以这种方式可能的是，使用来自于生物源的溶液，所述溶液能够包含直至1mol/L的非常高的盐，而不会导致从离子交换材料中洗提大分子。

根据本发明所使用的交联的磺化聚合物优选用于提取或纯化包含阳离子基团的大分子。大分子优选是生物大分子。生物大分子优选是肽。肽更尤其优选是胰岛素。换而言之，本发明因此优选涉及将交联的磺化聚合物用于从来自于生物源的溶液中纯化或提取胰岛素的应用。

制造交联的磺化聚合物优选通过借助使用硫酸或类似的材料对已经交联的聚合物进行磺化来实现，如这例如在制造磺化的交联的聚苯乙烯中从英国的专利文献GB 1116800和GB 1483587中已知。交联的聚合物的制造是现有技术并且能够由各个聚合物化学领域的技术人员在不需要创造性的劳动的情况下执行。

但是尤其优选按如下所示执行磺化：根据所寻求的磺化度，例如聚苯乙烯-二乙烯苯-聚合物在具有2%至15%水含量的硫酸和水组成的混合物中在20℃至80℃的温度中搅拌1至6个小时。硫酸含量、温度和反应时间的提高中的每一项本身都引起磺化度的提高。通过调节所有三个参数，能够相对精确地达到所寻求的磺化度。在反应之后，聚合物通过稀释的硫酸和水来冲洗。

根据本发明，也优选的是，交联的磺化聚合物用包含氨基基团的交联的聚合物来覆层。

包含氨基基团的交联的聚合物的基本构架优选与在上文中对于交联的磺化聚合物所提到的内容相同。因此基本构架在这里也尤其优选是聚乙烯构架。在这个聚乙烯构架上，氨基基团优选通过共价单键直接键合在基本构架的原子上。

根据本发明，将氨基基团理解为伯、仲、叔或季氨基基团以及还有脒基团或者胍基团。但是包含氨基基团的交联的聚合物尤其优选是交联的聚乙烯胺。

通过包含伯或者仲氨基基团的线性的聚合物与交联反应物进行转换的方式，优选执行包含氨基基团的交联的聚合物的交联，所述交联反应物能够允许在两个端部上与氨基基团的共价结合。对此原则上能够使用任何可考虑的交联反应物。但是根据本发明尤其优选使用如下交联反应物，在所述交联反应物中用于交联的所有的氨基基团在交联之后总是仍以氨基基团的形式存在。以这种方式确保了，氨基基团通过质子化/烷基化总是仍能够作用为阳离子的离子交换基团。这引起离子交换基团在其它的亲脂性的基质上的高密度。在交联之后，之前为伯或仲的氨基基团随后作为仲或叔氨基基团存在。

为了给予氨基基团正电荷，所述氨基基团能够被质子化。但是对此可替选的是，伯、仲或者叔氨基基团也能够通过借助烷基化反应物进行三烷基化、双烷基化或者单烷基化而过渡为季氨离子。

包含氨基基团的交联的聚合物的交联度优选在5%至80%的范围中，尤其优选在6%至60%的范围中并且最优选10%至40%的范围中。百分数在这里与用于交联的氨基基团的数量相对于未交联的聚合物的所有氨基基团的数量有关。

尤其优选的是，包含氨基基团的交联的聚合物与交联的磺化聚合物的质量比位于0.05至0.3的范围中、尤其优选位于0.08至0.25的范围中并且最优选位于0.11至0.20的范围中。

包含交联的氨基基团的聚合物优选以交联的磺化聚合物上的层/覆层的形式存在。在这里优选使用树脂颗粒形式的交联的磺化聚合物并且用包含氨基基团的未交联的聚合物覆层，以及紧接着与交联剂交联。以这种方式能够在表面上实现氨基基团的高浓度，不会由该方法而完全地损失基质的亲脂性的特性。因此提供了一种离子交换树脂，所述离子交换树脂通过氨基基团的质子化/烷基化能够与大分子的阴离子基团交互作用。附加地，亲脂性的基质也能够允许与大分子的亲脂性的交互作用。

位于磺化的聚合物的表面上的、包含氨基基团的交联的聚合物优选沉积在磺化的聚合物的树脂颗粒的微孔中，也就是说，其优选位于磺化的聚合物的微孔中。

包含氨基基团的交联的聚合物优选具有在20000g/mol至50000g/mol的范围中的中位分子重量，更优选在30000g/mol至46000g/mol的范围中的中位分子重量。

尤其优选通过所述阳离子的离子交换树脂从溶液中去除大分子如DNA或者RNA，以至于溶液被所述离子交换树脂纯化，并且能够从溶液中提取出不具有DNA或者RNA的期望的目标分子。

同样优选通过根据本发明的离子交换树脂（阴离子交换剂）从溶液中去除大分子如内毒素，以至于所述大分子首先结合在离子交换树脂上并且溶液绝大部分没有内毒素。因此或者原始的溶液能够没有内毒素并且被继续使用，或者内毒素能够通过将离子交换树脂用适当的溶液的洗提来提取。将内毒素理解为一类生化物质。所述生物物质是细菌的分解产物，所述分解产物在人体中能够触发众多的生理反应。内毒素是革兰氏阴性菌或者蓝绿藻的外部的细胞膜（OM=outer membrane外膜）的组成部分。在化学上，它是脂多糖（LPS），所述脂多糖由亲水性的多糖和亲脂性的脂质部分构成。相反于细菌，内毒素是极其热稳定的并且甚至经受得住灭菌，其中内毒素来自于所述细菌。用于测量内毒素的当前最灵敏的方法经由在变形细胞的溶解产物中活化凝血级联来起作用，所述变形细胞从马蹄蟹（limulus polyphemus）中离析出来。该测试一般而言被称为LAL-测试。

如已经提到的，根据本发明的大分子来自于生物源。在这里，大分子优选具有1000至0.2kDa的范围中的分子重量，更优选500至1kDa并且最优选从300至5kDa的范围中的分子重量。

将来自于生物源的溶液理解为体液或者植物提取物或者例如通过发酵或者发酵过程获得的溶液，所述体液或者植物提取物或者溶液优选具有0.1mS/cm至120mS/cm，更优选从1mS/cm至60mS/cm的范围中并且最优选从10mS/cm至20mS/cm的范围中的离子电导率。这些溶液优选是水的溶液。它们优选具有直至1.2mol/L的含盐量。其含盐量尤其优选位于0.01mol/L至1.2mol/L的范围中，更优选在0.05mol/L至1.0mol/L的范围中并且最优选在0.25mol/L至0.6mol/L的范围中。在本发明中，将盐理解为各种盐，如无机盐和有机盐，所述盐优选以生物液体存在。在这里，将这些溶液不仅理解为直接从生物源中提取并使用的溶液，而是将其理解为已经以任何方式处理过的溶液。将“处理过的”理解为，溶液已经以任何方式被预处理，例如在根据本发明的应用之前改变pH值或者分离物质。

根据本发明，通过Greisinger公司的型号为GMH 3430的电导率测量设备来确定离子电导率。

因此，来自于具有极高含盐量的溶液的生物的大分子能够与根据本发明所使用的交联的磺化聚合物，或者与用包含氨基基团的交联的聚合物的层包覆的交联的磺化聚合物结合，所述溶液之前不必通过附加的稀释步骤或者透析来稀释。本发明以这种方式提供用于纯化生物的大分子的一种成本适宜的方法/一种成本适宜的应用，所述生物的大分子优选是胰岛素、单克隆抗体、DNA或者RNA。

附加地，所使用的离子交换材料具有如下优点，即它们能够在1至14的整个pH范围中使用，如所述pH范围存在于来自于生物源的液体中那样。

此外，本发明还涉及其它的实施形式：

（i）用于利用交联的磺化聚合物将大分子从来自于生物源的溶液中分离出来的方法，所述磺化聚合物包含结合在其基本构架上的磺化的芳香族单元，所述芳香族单元被脂肪族残基取代或者是未取代的。

（ii）根据实施形式（i）所述的方法，其中所述基本构架是交联的聚乙烯构架。

（iii）根据实施形式（i）或（ii）所述的方法，其中所述磺化的芳香族单元是苯磺酸基团。

（iv）根据实施形式（i）至（iii）中任一项所述的方法，其中所述交联的磺化聚合物是磺化的聚苯乙烯-二乙烯苯-共聚物。

（v）根据实施形式（i）至（iv）中任一项所述的方法，其中所述交联的磺化聚合物的交联度为0.5%至50%。

（vi）根据实施形式（i）至（v）中任一项所述的方法，其中磺化度以与磺酸基团的摩尔数与全部用于聚合的能磺化的单体单元之比计为1%至80%。

（vii）根据实施形式（i）至（vi）中任一项所述的方法，其中所述交联的磺化聚合物以树脂颗粒的形式存在。

（viii）根据实施形式（vii）所述的方法，其中所述树脂颗粒具有1μm至1000μm的中位平均直径。

（ix）根据实施形式（vii）或（viii）所述的方法，其中所述树脂颗粒具有微孔，所述微孔具有10nm至400nm范围中的平均直径。

（x）根据实施形式（i）至（ix）中任一项所述的方法，其中所述大分子是肽。

（xi）根据实施形式（x）所述的方法，其中所述肽是胰岛素。

（xii）根据实施形式（i）至（ix）中任一项所述的方法，其中所述交联的磺化聚合物用包含氨基基团的交联的聚合物覆层。

（xiii）根据实施形式（xii）所述的方法，其中所述包含氨基基团的交联的聚合物的交联度在5%至80%的范围中。

（xiv）根据实施形式（xii）或（xiii）所述的方法，其中所述包含氨基基团的交联的聚合物是交联的聚乙烯胺。

（xv）根据实施形式（xii）至（xiv）中任一项所述的方法，其中用于交联的所有的氨基基团在交联之后以胺的形式存在。

（xvi）根据实施形式（xii）至（xv）中任一项所述的方法，其中所述交联的磺化聚合物与所述包含氨基基团的交联的聚合物的质量比在3至20的范围中。

（xvii）根据实施形式（xii）至（xvi）中任一项所述的方法，其中所述大分子是内毒素、DNA或者RNA。

附图说明

在下文中应根据附图和实例阐述本发明，但是本发明不能够理解为受限于此保护范围。

附图：

图1：通过测量胰岛素的吸附容量与盐浓度的相关性，示出根据本发明所使用的离子交换剂与根据现有技术的两种离子交换剂的不根据本发明的使用的对比。

图2：绘制出在通过根据本发明所使用的阴离子交换材料流经发酵溶液流经之后洗提液相对于时间的耗尽图。

图3：通过测量DNA的吸附容量与盐浓度的相关性，示出根据本发明所使用的离子交换剂与根据现有技术的两种离子交换剂的不根据本发明的使用的对比。

具体实施形式

实例：

实例1：基于交联的磺化聚合物制造阳离子交换树脂。

方案的目的：在20℃的情况下对聚苯乙烯载体Amberchrom XT 30进行磺化（从前身是罗门哈斯的陶氏化学公司中是市售的）。

将165mL的浓H2SO4加入到可控温的250mL的反应器中。将30.0g的载体材料加到硫酸中并且称量瓶借助各20mL的浓硫酸再清洗三次。在添加载体材料之后，搅拌悬浮液并且控温到20℃。在2小时的反应时间后，从反应器中倒出悬浮液并且将其分配给两个150mL的注射器。硫酸被吸出并且对这个相依次用200mL的稀释的（62%的）硫酸、125mL的水、175mL的甲醇、125mL的水和紧接着用175mL的甲醇来冲洗。所述相被吸干并且紧接着在50℃的情况下在真空中被干燥。

在HPLC柱中通过吸附乙酸铵、紧接着洗提所结合的乙酸并且经由靛酚蓝证明，来进行磺酸基团的确定。得出375μmol/mL的磺酸含量。这相应于近似13%的磺化度。颗粒大小平均为30μm。颗粒是具有22nm的中位微孔直径和1.25mL/g的中位微孔体积的球。

实例2：制造基于用包含氨基基团的交联的聚合物包覆的交联的磺化聚合物的阴离子交换剂：

罗门哈斯的Amberchrom CG1000S用作为离子交换材料的基础。如在例1中所阐述的一样，这在80℃的情况下用98%的硫酸磺化3小时。在此获得具有30μm的中位平均大小的和22nm至25nm的中位微孔直径的颗粒。通过称重被干燥的、磺化的聚苯乙烯、添加并且接下来离心分离多余的水的方式，从所产生的磺化的聚苯乙烯确定吸水能力或者微孔体积。位于微孔中的水在此保留在其位置中。在再次称重后，能够从与干燥的聚苯乙烯的称量差中确定微孔体积为大约1.2mL/g至1.3mL/g。

为了对聚苯乙烯覆层，提供水相的聚乙烯胺溶液，所述聚乙烯胺溶液由具有35000g/mol的中位摩尔重量的聚乙烯胺构成。pH值被调节到9.5。聚乙烯胺的量在这里为待覆层的聚苯乙烯的15%，并且所述溶液的体积为聚苯乙烯的所确定的微孔体积的95%。聚乙烯胺溶液与聚苯乙烯一起被加入到紧闭的PE瓶中并且在振动筛上在高频的情况下振动6小时。在此必须注意充分的混合。在所述程序之后，聚乙烯胺溶液进入到聚苯乙烯的微孔中。聚苯乙烯紧接着在50℃的情况下在真空干燥箱中被干燥为恒重。为了使聚乙烯胺交联，被覆层的聚苯乙烯容纳在三倍体积的异丙醇中，并且与以聚乙烯胺的氨基基团数计为5%的二乙二醇二缩水甘油基醚交联。反应混合物在反应器中以在55℃的情况下被搅拌六小时。紧接着，其被转送到玻璃吸滤器上并且用2柱床体积的异丙醇、3柱床体积的0.5M TFA-溶液、2柱床体积的水、4柱床体积的1M氢氧化钠溶液冲洗并且紧接着用8柱床体积的水冲洗。

实例3：通过在实例1中制造的阳离子交换剂纯化胰岛素

在实例1中制造的耐盐的离子交换剂的胰岛素的吸附容量的确定借助10mg/mL的胰岛素的溶液在具有50mM的乳酸的30%的异丙醇中在pH为3.5且NaCl浓度不同的情况下来进行。吸附容量在10%的穿透量的情况下被确定，并且与两种竞争材料比较。结果在图1中示出。使用Merck公司市售的离子交换材料“Eshumo S”（聚乙烯醚，离子吸收能力50μmol/mL至100μmol/mL，颗粒大小75μm至95μm）和GEHealthcare公司的“Source30S”（聚苯乙烯/二乙烯苯，颗粒大小30μm）作为对比材料。

当对比材料在流动相中在250mM的NaCl含量的情况下仅示出非常低的吸收能力时，所述吸收能力在更高的盐含量的情况下不再是可测量的，根据本发明所使用的离子交换剂仍示出明显的直至1M NaCl的吸收能力。这可清晰地从图1中读出。

实例4：通过使用在实例2中所制造的阴离子交换树脂分离DNA：

在从发酵溶液中提纯单克隆抗体的过程中的第一步骤是耗尽所包含的DNA。这通过经由实例2中制造的阴离子交换剂的相“过滤”发酵溶液的方式起作用。DNA在这个步骤中结合到这个相上，并且定量地穿过的发酵溶液因此近似没有DNA。对此在实例2中制造的阴离子交换剂被包入具有21.2mL柱床体积的270×10mm的柱中并且首先以pH7.0的500mM的NaKPO₄来平衡并且紧接着以pH7.0的50mM的NaKPO₄来平衡。发酵溶液经由0.45μm-过滤器来过滤并且没有沉淀物。发酵溶液中的300mL经由外部的泵被提供到柱上。穿流量、具有pH6.5的1M NaCl的洗提液和具有1M NaOH的冲洗步骤被采集。

图2中称作为穿流量的部分几乎仅包含单克隆抗体并且不包含DNA。但是DNA的洗提仅通过施加NaOH来实现。

穿流量中的和发酵溶液中的DNA的含量借助Picogreen-Assay根据制造商说明来确定。

表1：

从表1中看出，DNA的99.3%能够在过滤时经由相材料去除。结合的DNA不在1M NaCl步骤中洗提，而是仅通过用1M NaOH冲洗来洗提，因为在这里所述相的氨基基团被去质子化，并且不再存在与DNA的结合。

对于在实例2中制造的阴离子交换剂可替选的是，如在实例4中一样，也使用Amersham Biosciences公司市售的Q Sepharose FF的材料和Merck公司的Fractogel TMAE作为分离剂。在与Q Sepharose FF和Fractogel TMAE相比不同的盐含量的情况下确定静态的吸收能力时，也在盐含量高的情况下得到所研发的离子交换剂的更高的吸附容量。

实例5：通过使用在实例2中制造的阴离子交换树脂从发酵溶液中分离内毒素：

包含内毒素的发酵溶液经由实例2中制造的阴离子交换剂的相被“过滤”。内毒素在这个步骤中结合到所述相上，并且定量地穿过的发酵溶液因此近似没有所述内毒素。

对此在实例2中制造的阴离子交换剂被包入具有21.2mL的柱床体积的270×10mm柱中。发酵溶液经由0.45μm过滤器来过滤并且没有沉淀物。发酵溶液中的300mL经由外部的泵被提供到柱上。

来自于柱的穿流量包含比发酵溶液少至少90%的内毒素。为了证明内毒素含量使用LAL-测试。以这种方式能够使发酵溶液大部分地没有内毒素。内毒素紧接着借助适当的洗提液从离子交换剂中清洗。

Claims (16)

1.一种将交联的磺化聚合物的用于从溶液中分离大分子的应用，所述溶液来自于生物源，其中所述交联的磺化聚合物包含结合在其基本构架上的磺化的芳香族单元，所述芳香族单元以通过脂肪族残基取代的形式或者以未取代的形式存在。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述基本构架是交联的聚乙烯构架。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述磺化的芳香族单元是苯磺酸基团。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其中所述交联的磺化聚合物是磺化的聚苯乙烯-二乙烯苯-共聚物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述交联的磺化聚合物的交联度为0.5%至50%。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中磺化度以与磺酸基团的摩尔数与全部用于聚合的能磺化的单体单元之比计为1%至80%。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的应用，其中所述交联的磺化聚合物以树脂颗粒的形式存在。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述树脂颗粒具有1μm至1000μm的中位平均直径。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其中所述树脂颗粒具有微孔，所述微孔具有10nm至400nm范围中的平均直径。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的应用，其中所述大分子是肽。

11.根据权利要求10所述的应用，其中所述肽是胰岛素。

12.根据权利要求1至9中任一项所述的应用，其中所述交联的磺化聚合物用包含氨基基团的交联的聚合物覆层。

13.根据权利要求12所述的应用，其中所述包含氨基基团的交联的聚合物的交联度在5%至80%的范围中。

14.根据权利要求12或13所述的应用，其中所述包含氨基基团的交联的聚合物是交联的聚乙烯胺。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的应用，其中用于交联的所有的氨基基团在交联之后以胺的形式存在。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的应用，其中所述大分子是内毒素、DNA或者RNA。

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