JP2013532829A - クロマトグラフィーの媒介性能を改善するためのグラフト法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)拡散性細孔及びビーズにカップリングされている表面反応性官能基を有する多孔質クロマトグラフィービーズを用意するステップ;
b)グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物を含む溶液、及び可溶性ラジカル重合開始剤を用意するステップ;
c)クロマトグラフィービーズを溶液と接触させるステップ;
d)溶液中にラジカル重合開始剤を導入することによりビーズ上の表面反応性官能基とグラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物の間でフリーラジカル重合を開始して、ビーズにカップリングされているポリマー鎖エキステンダーを形成するステップ;
e)ビーズを洗浄して余分の未反応のグラフト化モノマー、グラフト化モノマーの混合物、または未結合のポリマー鎖を除去して、100g/Lを超えるタンパク質結合能力を有する多孔質支持体を得るステップ;
f)クロマトグラフィービーズ表面に結合されているポリマー鎖にリガンドをカップリングさせるステップ;
ことを含む。
アガロースビーズ(セファロース4B)(GE Healthcare,ニュージャージー州ピスカタウェイ)は、開示内容を参照により本明細書に組み入れるPorath and Fornstedt,“Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers”(Journal of Chromatography,vol.51,1970,p.479−489)の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋された。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャーにおいて8M NaOH(18g)、AGE(4g)、Na2SO4(3g)にビーズ(10mL)を添加した後、50℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをMilli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ(10mL)をプラスチックバッグ中の2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(2.4g)、Milli−Q(登録商標)水(17.3g)、Ν,Ν−ジメチルアクリルアミド(0.2g)及びイルガキュア(登録商標)2959(CIBA)(0.12g)を含有している20mL溶液に添加した。プラスチックバッグを2枚のポリエチレンシートの間に挟んだ。次いで、ポリエチレンサンドイッチを輸送ユニットにテープで貼り付け、このユニットは“H”バルブがあるフュージョン・システムズUV露光ラボユニットを介してアセンブリを運ぶ。露光時間はアセンブリをどれだけ速くUVユニット中を移動させるかによりコントロールされる。この例では、アセンブリを15フィート/分でUVチャンバー中を移動させる。アセンブリを5分間静置させた後、バッグを取り出し、ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄する。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表1に示す。
アガロースビーズ(セファロース4B)(GE Healthcare,ニュージャージー州ピスカタウェイ)をPorath and Fornstedt,“Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers”(Journal of Chromatography,vol.51,1970,p.479−489)の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。
アガロースビーズ(セファロース4B)(GE Healthcare,ニュージャージー州ピスカタウェイ)をPorath and Fornstedt,“Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers”(Journal of Chromatography,vol.51,1970,p.479−489)の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャーにおいて1M NaOH(18g)、AGE(12g)、Na2SO4(3g)にビーズ(10mL)を添加した後、50℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをMilli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキを75%(3−アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド溶液(6g)、Milli−Q(登録商標)水(13.6g)及び過硫酸アンモニウム(0.2g)を含有する溶液に添加した。混合物を65℃で17時間撹拌した。次いで、ビーズをMilli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表1に示す。
アガロースビーズ(セファロース4B)(GE Healthcare,ニュージャージー州ピスカタウェイ)を開示内容を参照により本明細書に組み入れるPorath and Fornstedt,“Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers”(Journal of Chromatography,vol.51,1970,p.479−489)の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャーにおいて1M NaOH(18g)、AGE(2.4g)、Na2SO4(3g)にビーズ(10mL)を添加した後、50℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをMilli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキをジャー中の2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(1g)、Milli−Q(登録商標)水(18.8g)、Ν,Ν−ジメチルアクリルアミド(0.15g)及び過硫酸アンモニウム(0.08g)を含有している20mL溶液に添加した。ジャーを撹拌し、65℃に1時間加熱した。ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表1に示す。
アガロースビーズ(セファロース4B)(GE Healthcare,ニュージャージー州ピスカタウェイ)を開示内容を参照により本明細書に組み入れるPorath and Fornstedt,“Group Fractionation of Plasma Proteins on Dipolar Ion Exchangers”(Journal of Chromatography,vol.51,1970,p.479−489)の教示に従ってエピクロロヒドリンを用いて架橋した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャーにおいて1M NaOH(18g)、AGE(2.4g)、Na2SO4(3g)にビーズ(10mL)を添加した後、50℃で一晩撹拌した。次いで、ビーズをMilli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキをジャー中の2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(2g)、Milli−Q(登録商標)水(17.8g)、Ν,Ν−ジメチルアクリルアミド(0.2g)及び過硫酸アンモニウム(0.08g)を含有している20mL溶液に添加した。ジャーを撹拌し、65℃に1時間加熱した。ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表1に示す。
ポリメタクリレートビーズ(HW−65,45um,TOSOH Bioscience)(50mL)を1M NaOH中に25℃で2時間浸漬した後、Milli−Q水(登録商標)(500mL)で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャー中にビーズ(15mL)、1M NaOH(18g)、AGE(2.4g)、Na2SO4(3g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。次いで、湿ったケーキ(10mL)をジャー中の2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(1.2g)、過硫酸アンモニウム(0.08g)、Milli−Q(登録商標)水(18.5g)及びN,N−ジメチルアクリルアミド(0.24g)を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、65℃に1時間加熱した。ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表2に示す。
ポリメタクリレートビーズ(HW−65,45um,TOSOH Bioscience)(50mL)を1M NaOH中に25℃で2時間浸漬した後、Milli−Q水(登録商標)(500mL)で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャー中にビーズ(15mL)、1M NaOH(18g)、AGE(2.4g)、Na2SO4(3g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。次いで、湿ったケーキ(10mL)をジャー中の2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(2.8g)、過硫酸アンモニウム(0.08g)、Milli−Q(登録商標)水(17g)及びN,N−ジメチルアクリルアミド(0.12g)を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、65℃に1時間加熱した。ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表2に示す。
ポリメタクリレートビーズ(HW−65,45um,TOSOH Bioscience)(50mL)を1M NaOH中に25℃で2時間浸漬した後、Milli−Q水(登録商標)(500mL)で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャー中にビーズ(15mL)、1M NaOH(18g)、AGE(2.4g)、Na2SO4(3g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。表面反応基を次の方法により標準のカチオン交換官能基に変換した:ジャー中にビーズ(6g)、Milli−Q(登録商標)水(4.7mL)、50%wt NaOH(0.8g)及びメタ亜硫酸水素ナトリウム(2.3g)を添加し、室温で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)クオリティー水(3×500mL)で洗浄した。この手順により、樹脂の表面へのタンパク質結合は可能であるが、エキステンダー、すなわちグラフト化鎖を利用しないエキステンダーなしの対照樹脂が生じた。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表2に示す。
ポリメタクリレートビーズ(HW−65,45um,TOSOH Bioscience)(20mL)を1M NaOH中に25℃で2時間浸漬した後、Milli−Q水(登録商標)(500mL)で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャー中にビーズ(15mL)、1M NaOH(18g)、AGE(2.4g)、Na2SO4(3g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。次いで、湿ったケーキ(10mL)をジャー中の75%(3−アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド溶液(6g)、過硫酸アンモニウム(0.12g)及びMilli−Q(登録商標)水(13.6g)を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、65℃に1時間加熱した。ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表2に示す。
ポリメタクリレートビーズ(HW−65,45um,TOSOH Bioscience)(50mL)を1M NaOH中に25℃で2時間浸漬した後、Milli−Q水(登録商標)(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキをジャー中の75%(3−アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド溶液(6g)、過硫酸アンモニウム(0.12g)及びMilli−Q(登録商標)水(13.6g)を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、65℃に1時間加熱した。次いで、ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。この手順により、樹脂の表面へのタンパク質結合は可能であるが、エキステンダー、すなわちグラフト化鎖を利用しないエキステンダーなしの対照樹脂が生じた。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合能力を表2に示す。
ポリメタクリレートビーズ(HW−65,45um,TOSOH Bioscience)(50mL)を1M NaOH中に25℃で2時間浸漬した後、Milli−Q水(登録商標)(500mL)で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャー中にビーズ(10g)、2M NaOH(18g)、AGE(12g)、Na2SO4(3g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ(5g)をジャー中のN−フェニルアクリルアミド(0.2g)、過硫酸アンモニウム(0.08g)、Ν,Ν−ジメチルアセトアミド(DMAC)(3.4g)、ヘキシレングリコール(3.4g)及びMilli−Q(登録商標)水(3g)を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、80℃に17時間加熱した。ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合(IgG)能力は33g/Lであると判明した。
ポリメタクリレートビーズ(HW−65,45um,TOSOH Bioscience)(50mL)を1M NaOH中に25℃で2時間浸漬した後、Milli−Q水(登録商標)(500mL)で洗浄した。次いで、ビーズを次の方法に従って表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した:ジャー中にビーズ(10g)、8M NaOH(18g)、AGE(12g)、Na2SO4(3g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ(5g)をジャー中のN−フェニルアクリルアミド(0.2g)、過硫酸アンモニウム(0.08g)、Ν,Ν−ジメチルアセトアミド(DMAC)(3.4g)、ヘキシレングリコール(3.4g)及びMilli−Q(登録商標)水(3g)を含有する溶液に添加した。ジャーを撹拌し、80℃に17時間加熱した。ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄した。実施例6の方法に従って測定した平衡タンパク質結合(IgG)能力は40g/Lであると判明した。
内部構造の作成:
非対称アガロースビーズを米国特許出願公開No.2007/0212540に教示されている方法に従って作成した:15% アガロース溶液(Hispanagar製D−5アガロース)(1,000ml)を第1の油浴において80℃で絶えず撹拌しながらSpan 80乳化剤(120ml)を含有している鉱油(2,000ml)に添加して、油相が連続しているエマルジョンを得た。次いで、エマルジョンを直径0.5インチ(12.7mm)、長さ6インチ(152.4mm)のKenicsスタティックミキサー(KMR−SAN−12)を用いて3L/分の流速で5℃の鉱油の第2の油浴に圧送した。最大粒径が200umの球状均質アガロースビーズを得た。このビーズを沈降させ、水、エタノール、次いで水で洗浄し、篩い分けして、ビーズサイズを75〜125μmの範囲とした。次いで、ビーズを開示内容を参照により本明細書に組み入れるPorathら,“Agar derivatives for chromatography,electrophoresis and gel bound enzymes.Desulphated and reduced crosslinked agar and agarose in spherical bead form”(Journal of Chromatography,vol.60,1971,p.167−177)に教示されている方法に従って架橋した。次いで、ビーズをアリルグリシジルエーテル(AGE)で修飾した。ジャー中にビーズ(120g)、8M NaOH(150mL)、硫酸ナトリウム(30g)及びAGE(100g)を添加し、45℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)クオリティー水(3×500mL)で洗浄した。選択性試験結果を表3に示す。
実施例3Aで作成したビーズの一部を修飾して、標準のカチオン交換材料を作成した。ビーズをメタ重亜硫酸ナトリウムで修飾した。ジャー中にビーズ(60g)、Milli−Q(登録商標)水(47mL)、50%wt NaOH(7.9g)及びメタ重亜硫酸ナトリウム(23.4g)を添加し、室温で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)クオリティー水(3×500mL)で洗浄した。
実施例3Aで作成したビーズの一部を修飾して、改善された結合強度/選択性を有するカチオン交換エキステンダーを作成した。ビーズをMilli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄し、濾過して湿ったケーキを得た。湿ったケーキ(10mL)をプラスチックバッグ中の2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(2.4g)、Milli−Q(登録商標)水(17.3g)、Ν,Ν−ジメチルアクリルアミド(0.2g)及びイルガキュア(登録商標)2959(CIBA)(0.12g)を含有している20mL溶液に添加した。プラスチックバッグを2枚のポリエチレンシートの間に挟んだ。次いで、ポリエチレンサンドイッチを輸送ユニットにテープで貼り付け、このユニットは“H”バルブがあるフュージョン・システムズUV露光ラボユニットを介してアセンブリを運ぶ。露光時間はアセンブリをどれだけ速くUVユニット中を移動させるかによりコントロールされる。この例では、アセンブリを5フィート/分でUVチャンバー中を移動させる。アセンブリを5分間静置させた後、バッグを取り出し、ビーズを濾過し、Milli−Q(登録商標)水(500mL)で洗浄する。
実施例3Aからのビーズを実施例3Cと同様に、次のような追加の最終修飾ステップを加えて修飾した:ビーズをブロモプロパンスルホン酸(BPSA)で修飾した。ジャー中にビーズ(10g)、5M NaOH(30mL)、BPSA(7.2g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)クオリティー水(500mL)で洗浄した後、20% エタノール中に保存した。選択性試験結果を表3に示す。
実施例3Aからのビーズを実施例3Cと同様に、次のような2つの追加の最終修飾ステップを加えて修飾した:ビーズをブロモプロパンスルホン酸(BPSA)で修飾した。ジャー中にビーズ(10g)、5M NaOH(30mL)、BPSA(7.2g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)クオリティー水(500mL)で洗浄した。次いで、ビーズをブロモプロパンスルホン酸(BPSA)で修飾した。ジャー中にビーズ(10g)、5M NaOH(30mL)、BPSA(7.2g)を添加し、50℃で一晩撹拌した。ビーズをMilli−Q(登録商標)クオリティー水(500mL)で洗浄した後、20% エタノール中に保存した。選択性試験結果を表3に示す。
異なる実効電荷及び分子量を有する2つのタンパク質を使用して、典型的なカチオン交換(CEX)条件下で選択性または分離係数を試験した。pH4.5で10mSの導電率を与えるべくNaClを含む50mM 酢酸緩衝液中に0.5mg/ml ポリクローナルIgG(Sigma)及び0.5mg/ml リゾチーム(Sigma)を含有するタンパク質の混合物を担体に充填した正味タンパク質が10mg/mLであるように各サンプルカラム(7cmのベッド高,0.66cmの直径)に200cm/時で適用した。次いで、タンパク質混合物を、10mSで始め、80mSで終わる30CV NaCl勾配を用いて200cm/時で溶離させた。各タンパク質のピークを溶離勾配の開始からのカラム容積(CV)に換算して記録した(ボイド容積を補正した)。
表面反応基のアリルグリシジルエーテル(AGE)を付加した後、上に教示した例示的修飾の代表的サンプルを洗浄し、以下のように水性臭素を用いて滴定した:10% NaOBr(20mL)及び50mM 酢酸ナトリウム(80mL,pH4.5)の混合物を調製した。水中AGE(100uL)を滴定することにより溶液中の臭素濃度を較正した。AGE表面基が完全に反応したことを示す臭素の色が持続するまで表面修飾したビーズの10mLサンプルを臭素溶液で滴定した。
上の実施例に教示されている生成物及び市販のベンチマークの各々についての静的、すなわち平衡能力を以下の方法を用いて測定した:
1.ビーズ懸濁液(10% ビーズ)を適切な平衡緩衝液(EQ緩衝液,表4を参照されたい)中の各サンプルから作成した;
2.ビーズ懸濁液を撹拌し、100μlサンプルを3つの15mLプラスチック製コニカルチューブにピペットで移した;
3.EQ緩衝液中の適切なタンパク質溶液(供給物,タンパク質はすべてSigma−Aldrich製ポリクローナルであった,表2を参照されたい)を各チューブに添加した(10mL);
4.チューブに蓋を被せ、Labquakeローター/シェーカーを用いてゆっくり(<10rpm)回転させた;
5.16時間後、ビーズを沈降させ、結合後溶液からUV測定値を得た;
6.UV吸光度を供給物タンパク質に対する適切な吸光係数を用いてタンパク質濃度に換算し、物質収支を用いて飽和能力を調べた。
Claims (21)
- 拡散性細孔及び表面反応性不飽和官能基を有する多孔質支持体の修飾方法であって、前記方法は、
a)拡散性細孔及び支持体の表面に結合されている表面反応性不飽和官能基を有する多孔質支持体を用意し;
b)グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物を含む溶液、及び可溶性ラジカル重合開始剤を用意し;
c)支持体を溶液と接触させ;
d)溶液にフリーラジカル重合開始剤を導入することにより支持体の表面上の表面反応性不飽和官能基とグラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物の間でフリーラジカル重合を開始して、支持体にカップリングされているポリマー鎖を形成する
ことを含む前記方法。 - 支持体は多孔質ポリマービーズ、多孔質アガロースビーズ及び多孔質セラミックビーズからなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 更に、ステップ(d)の後に、
e)支持体を洗浄して余分の未反応のグラフト化モノマー、グラフト化モノマーの混合物、または未結合のポリマー鎖を除去して、100g/Lを超えるタンパク質結合能力を有する多孔質支持体を得る
ことを含む請求項1に記載の方法。 - 更に、ステップ(e)の後に、
f)多孔質支持体表面に結合されているポリマー鎖にリガンドをカップリングさせる
ことを含む請求項3に記載の方法。 - ラジカル重合開始剤を過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、アゾビス(4−シアノ吉草酸)、イルガキュア(登録商標)2959、2,2’−アゾビス(2−アミジノ−プロパン)塩酸塩及びその組合せからなる群から選択する請求項1に記載の方法。
- 不飽和官能基はアリル基からなる請求項1に記載の方法。
- アリル基は式R−O−CH2−CH=CH2(式中、Rは多孔質支持体表面、または表面とアリル基間のリンカーである)からなる請求項6に記載の方法。
- 表面反応基の約20〜約400μmol/mLは式R−O−CH2−CH=CH2(式中、Rは多孔質支持体表面、または表面とアリル基間のリンカーである)を有する請求項1に記載の方法。
- グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物をメタクリレート、アクリレート、アクリルアミド、アクリル酸、2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸、[3−(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2−アクリルアミド−グリコール酸、イタコン酸またはエチルビニルケトン、グリシジルメタクリレート、N,N−ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、ヒドロキシプロピルメタクリレート、N−フェニルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルアクリルアミド及びその組合せからなる群から選択する請求項1に記載の方法。
- 多孔質支持体上の拡散性細孔は孔径が約100Åから約1μの範囲である請求項1に記載の方法。
- 拡散性細孔を有する多孔質クロマトグラフィービーズを表面ポリマー鎖エキステンダーを用いて修飾する方法であって、その方法は、
a)拡散性細孔、表面及び該表面にカップリングされている表面反応性不飽和官能基を有する多孔質クロマトグラフィービーズを用意し;
b)グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物を含む溶液、及び可溶性ラジカル重合開始剤を用意し;
c)クロマトグラフィービーズを溶液と接触させ;
d)溶液にラジカル重合開始剤を導入することによりビーズ上の表面反応性不飽和官能基とグラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物の間でフリーラジカル重合を開始して、ビーズにカップリングされているポリマー鎖エキステンダーを形成し;
e)ビーズを洗浄して余分の未反応のグラフト化モノマー、グラフト化モノマーの混合物、または未結合のポリマー鎖を除去して、100g/Lを超えるタンパク質結合能力を有する多孔質クロマトグラフィービーズを形成し;
f)クロマトグラフィービーズ表面に結合されているポリマー鎖にリガンドをカップリングさせる;
ことを含む前記方法。 - 多孔質クロマトグラフィービーズをポリマービーズ、アガロースビーズ及びセラミックビーズからなる群から選択する請求項11に記載の方法。
- ラジカル重合開始剤を過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、アゾビス(4−シアノ吉草酸)、イルガキュア(登録商標)2959、2,2’−アゾビス(2−アミジノ−プロパン)塩酸塩及びその組合せからなる群から選択する請求項11に記載の方法。
- 不飽和官能基はアリル基からなる請求項11に記載の方法。
- アリル基は式R−O−CH2−CH=CH2(式中、Rは多孔質支持体表面、または表面とアリル基間のリンカーである)からなる請求項14に記載の方法。
- 表面反応基の約20〜約400μmol/mLは式R−O−CH2−CH=CH2(式中、Rは多孔質クロマトグラフィービーズ、またはビーズの表面とアリル基間のリンカーである)を有している請求項11に記載の方法。
- グラフト化モノマーまたはグラフト化モノマーの混合物をメタクリレート、アクリレート、アクリルアミド及びその組合せからなる群から選択する請求項11に記載の方法。
- 多孔質クロマトグラフィービーズ上の拡散性細孔は孔径が約100Åから約1μの範囲である請求項11に記載の方法。
- リガンドを強カチオン交換基、スルホプロピル、スルホン酸、アニオン交換基、トリメチルアンモニウムクロリド、弱カチオン交換基、カルボン酸、弱アニオン交換基、N,N−ジエチルアミノ、DEAE、疎水性相互作用基、フェニル基、ブチル基及びプロピル基、及びアフィニティー基、タンパク質A、タンパク質G及びタンパク質Lからなる群から選択する請求項11に記載の方法。
- リンカーをメタクリレート、アミド、アクリルアミド、エポキシド、アミン、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エピクロロヒドリン、ポリエチレンジオールジグリシジルエーテル、エチレンジオールジグリシジルエーテル、アリルクロロアセテート、アリルクロリド、アリル(クロロ)ジメチルシラン、アリルグリシジルエーテル、アリルブロミド、アリルメタクリレート及びその組合せからなる群から選択する請求項7、8、15及び16のいずれか1項に記載の方法。
- リガンドを強カチオン交換基、スルホプロピル、スルホン酸、アニオン交換基、トリメチルアンモニウムクロリド、弱カチオン交換基、カルボン酸、弱アニオン交換基、N,N−ジエチルアミノ、DEAE、疎水性相互作用基、フェニル基、ブチル基及びプロピル基、及びアフィニティー基、タンパク質A、タンパク質G及びタンパク質Lからなる群から選択する請求項4に記載の方法。
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