CN111333764B - 一种弱阴离子层析介质及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种弱阴离子层析介质及其制备方法和应用，属于离子交换层析技术领域。本发明提供的弱阴离子层析介质的制备方法包括如下步骤：将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，得到油相；将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N‑亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合，得到水相；将所述油相和水相混合，在保护气氛下进行共聚反应，得到弱阴离子层析介质。本发明所提供的制备方法得到的弱阴离子层析介质具有与介质修饰型填料相当的耐压性和色谱展宽行为，且离子交换量大，因而具有更高的吸附载量。

Description

一种弱阴离子层析介质及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及离子交换层析技术领域，尤其涉及一种弱阴离子层析介质及其制备方法和应用。
背景技术
层析是蛋白质分离纯化的关键技术之一，层析介质作为层析技术的核心一直以来是研究的一个热点。在生物制品的生产过程中，由于层析介质具有交换速度快、吸附量大、结构稳定、使用寿命长等优点被广泛应用于核酸、多肽、蛋白质、抗生素及天然产物的分离纯化。
传统的分离纯化介质大都采用纤维素、葡聚糖和交联的琼脂糖凝胶，这类软胶基质的特点是亲水性好、生物相容性高，但是其床体积变化较大、不耐压。为了克服机械强度低的缺点，已经开发出了硬胶基质的分离纯化介质，如以硅胶为基质的离子交换介质，但是硅胶不耐碱，如：Miks(Journal of Chromatography，1976，119，339)等报导了以多孔硅胶为基质，缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷为连接臂，二乙胺乙基为交换基团的弱阴离子交换介质。后期刚性树脂开始用于蛋白质分离纯化，其很好的克服了介质机械强度低以及化学稳定性差等缺点，如Núria Fontanals(Journal of Chromatography A,2008,1215,21-29)使用二乙烯基苯(DVB)和对-乙烯基苄基氯(VBC)制备得到高比表面积超交联聚合物树脂，随后经1,2-乙二胺和哌嗪基团化学修饰超交联聚合物树脂，并将其作为弱阴离子交换吸附剂使用，再如Afeyan等(Journal of Chromatography A,1991,544,267-279)将苯乙烯-二乙烯基苯为骨架的双孔型分离介质应用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。刚性树脂具有很好的机械强度及化学稳定性，但其涉及到亲水改性和表面接枝修饰，制备工艺复杂，生产周期长，使用的试剂对环境的危害较大。
为了避免接枝修饰的复杂操作，也有专利报道了通过一步共聚的方式制备球形离子交换介质，如：美国专利US6423666公开了一种利用季铵盐，如二甲基二烯丙基氯化铵一步共聚制备强阴离子型交换介质的方法，用于蛋白质的分离纯化，但是在应用中，由于此类填料带有强阴离子型交换基团，表现出强碱性，对于敏感性蛋白的分离纯化有很大的局限性。而弱阴离子型分离介质则具有更好的适用性，但是由于弱碱性功能基对自由基聚合的阻聚作用，导致聚合速度缓慢，聚合过程难以控制，从而难以制备弱阴离子型层析介质。虽然美国专利US5645717公开了一种利用N-烯丙基甲胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)混合反应在6×350mm管柱中一步共聚合成整体柱色谱介质的方法，但是该方法仅能得到连续相的介质，而不能得到分散的填料，制备出的色谱介质不适用于工厂大规模的使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种弱阴离子层析介质及其制备方法和应用，本发明所提供的弱阴离子层析介质通过一步聚合即可得到，且弱阴离子层析介质具有良好的球形外观，适于工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种弱阴离子层析介质的制备方法，包括如下步骤：
将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，得到油相；
将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合，得到水相；
将所述油相和水相混合，在保护气氛下进行共聚反应，得到弱阴离子层析介质。
优选地，所述油相中的四氯乙烯的质量浓度为30～40％，司班80的质量浓度为0.35～0.41％。
优选地，所述烯丙基胺类盐在水相中的质量浓度为14.8～18.4％；所述甲基丙烯酸羟基酯在水相中的质量浓度为4.8～6.0％；所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺占烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的总质量的20～45％；所述烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量之和与致孔剂的质量比为10～16:0～6；所述引发剂占烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的总质量的0.1～0.5％。
优选地，所述烯丙基胺类盐为N-甲基二烯丙基胺盐酸盐、二烯丙基胺盐酸盐和N-甲基二烯丙基胺磷酸盐中的至少一种；所述引发剂为4,4-偶氮二氰基戊酸。
优选地，所述致孔剂包括硫酸铵和乙二醇，所述硫酸铵和乙二醇的质量比为0.2～1.8:4。
优选地，所述pH值为7的缓冲液为磷酸钠和氯化氢的混合水溶液，其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L。
优选地，所述油相和水相的体积比为4～6:1。
优选地，所述共聚反应的温度为83～90℃，时间为1.8～2.6h。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法得到的弱阴离子层析介质，所述弱阴离子层析介质为球形颗粒。
本发明还提供了上述技术方案所述的弱阴离子层析介质在牛血清白蛋白的分离纯化中的应用。
本发明提供了一种弱阴离子层析介质的制备方法，包括如下步骤：将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，得到油相；将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合，得到水相；将所述油相和水相混合，在保护气氛下进行共聚反应，得到弱阴离子层析介质。本发明以烯丙基胺类盐作为功能单体，与N,N-亚甲基双丙烯酰胺及甲基丙烯酸羟基酯进行共聚，所得弱阴离子层析介质中的功能基团的量可增加，且能够得到合适的交联结构，适于用作层析填料；本发明所提供的方法采用反相悬浮聚合法，一步即可完成共聚，方法简单，易于实施，且产物易于分离，过程易于控制；通过与接枝修饰型填料(即目前应用广泛的商品化填料)相比，本发明所提供的制备方法得到的弱阴离子层析介质具有与介质修饰型填料相当的耐压性和色谱展宽行为；更为重要的是，本发明所制备的层析介质的离子交换量大，因而具有更高的吸附载量，以牛血清白蛋白(BSA)为模型物，吸附载量(以带负电荷的弱阴离子层析介质的干重计)高达300～500mg/g。
附图说明
图1为实施例1的弱阴离子层析介质的SEM图；
图2为实施例中得到的弱阴离子层析介质的压力-压力曲线图；
图3为实施例1得到的弱阴离子层析介质和UniGel-80DEAE(苏州纳微生物科技有限公司)的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种弱阴离子层析介质的制备方法，包括如下步骤：
将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，得到油相；
将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合，得到水相；
将所述油相和水相混合，在保护气氛下进行共聚反应，得到弱阴离子层析介质。
本发明将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，得到油相。
在本发明中，所述油相中的四氯乙烯的质量浓度优选为30～40％，更优选为36～38％，司班80的质量浓度优选为0.35～0.41％，更优选为0.41％。本发明使用四氯乙烯调节比重，上述浓度的四氯乙烯有利于使所得产物的粒径更加均一，且有利于提高分散性；司班80作为分散保护剂使用，能够降低油/水界面张力，并在液滴表面形成一层保护膜，保护反应体系的稳定性；液体石蜡具有较高的沸点，引发剂的分解温度在其范围内，可保证共聚反应顺利进行，且液体石蜡易于清洗去除。
本发明对四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中的方式没有特殊限定，能够得到均一的油相即可，在本发明实施例中，优选采用加热溶解的方式将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，所述加热溶解的温度优选为60～75℃，更优选为68～72℃，最优选为70℃。
本发明将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合，得到水相。
在本发明中，所述烯丙基胺类盐在所述水相中的质量浓度优选为14.8～18.4％，具体可优选为14.8％、16.8％、17.4％或18.4％；所述烯丙基胺类盐优选为N-甲基二烯丙基胺盐酸盐、二烯丙基胺盐酸盐和N-甲基二烯丙基胺磷酸盐中的至少一种。在本发明中，所述烯丙基胺类盐作为功能单体使用，可提高对待分离物的吸附性。
在本发明中，所述甲基丙烯酸羟基酯在水相中的质量浓度优选为4.8～6％，具体可优选为4.8％、5.4％、5.6％或5.9％；所述甲基丙烯酸羟基酯优选为甲基丙烯酸羟丙酯或甲基丙烯酸羟乙酯。在本发明中，所述甲基丙烯酸羟基酯可调节共聚合的竞聚率，使共聚更容易发生。
在本发明中，所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺优选占烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的总质量的20～45％，更优选为29.1～40％，具体还可优选为29.2％、35.1％、35.3％或40％。在本发明中，所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，影响分子链之间的交联度，保证了弱阴离子层析介质的交联结构和必要的功能基种类和含量。
在本发明中，所述烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量之和与致孔剂的质量比优选为10～16:0～6，更优选为10～16:0.01～6，进一步优选为11.65～13.75:4.2～5.8；所述致孔剂优选包括硫酸铵和乙二醇，所述硫酸铵和乙二醇的质量比优选为0.2～1.8:4，具体可优选为0.2:4、1.5:4或1.8:4。在本发明中，所述致孔剂是一种可选的原料，有无致孔剂均可形成弱阴离子层析介质，但是致孔剂的加入会影响大分子空间网络结构的形成，进一步提高吸附性能，由于致孔剂的加入，树脂内部形成多孔结构，有利于待吸附物在其内部扩散。
在本发明中，所述pH值为7的缓冲液优选为磷酸钠和氯化氢的混合水溶液，其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L。在本发明中，以缓冲液为水相的溶剂，能够保持反应体系为中性，有利于后续共聚反应的顺利进行，且有利于得到合适结构的弱阴离子层析介质，以进一步提高所得弱阴离子层析介质的综合性能，而酸性条件下氢离子的存在会影响N,N-亚甲基双丙烯酰胺的聚合活性并降低交联度，从而影响介质的性能，氢离子与二烯丙基甲胺之间还可能会发生加成反应，这可能会改变聚合物的结构，不利于得到合适结构的层析介质。
在本发明中，所述引发剂优选为4,4-偶氮二氰基戊酸，所述引发剂优选占烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的总质量的0.1～0.5％，更优选为0.1～0.4％，具体可优选为0.16％、0.30％、0.31％或33％。
在本发明中，所述烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合的顺序优选为：将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂溶解于pH值为7的缓冲液中，然后加入引发剂；本发明对将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂溶解于pH值为7的缓冲液中的方式没有特殊限定，能够将各物质溶解即可，在本发明实施例中，所述溶解优选为加热溶解，所述加热溶解的温度优选为60～70℃，更优选为68～72℃，最优选为70℃；在本发明中，加入引发剂后，优选立即进行后续步骤。
得到油相和水相后，本发明将所述油相和水相混合，在保护气氛下进行共聚反应，得到弱阴离子层析介质。
在本发明中，所述油相和水相的体积比优选为4～6:1，具体可优选为4:1、5.75:1或5.85:1。在本发明中，上述比例有利于进一步提高生产效率，且能够使反应产生的热量适当散失，维持体系稳定，以得到更规则的球形产品。
本发明对所述油相和水相的混合顺序没有特殊限定，在本发明实施例中，优选将所述水相加入至油相中。
本发明对所述保护气氛的种类没有特殊限定，常规的保护气氛均可，如惰性气体或氮气，在本发明实施例中，更优选为氮气。
在本发明中，所述共聚反应的温度优选为83～90℃，更优选为83～87℃，最优选为85℃；所述共聚反应的时间优选为1.8～2.6h，更优选为2.1～2.2h。在本发明中，所述共聚反应过程优选维持搅拌，所述搅拌的转速以体系中油相液滴的粒径为30～150μm为准。本领域技术人员可通过如下方法检测油相液滴的粒径：从反应釜中取少量液体，在显微镜下观察液滴的粒径，再调节转速，使得粒径为上述范围。在本发明中，共聚反应引发后形成球形颗粒，然后继续进行共聚反应，球形颗粒的强度增强，形成弱阴离子层析介质。
在本发明中，所述共聚反应后，优选冷却至室温，然后进行固液分离，将所述固液分离所得固体依次进行石油醚清洗、95％乙醇清洗、超声分散和筛分；所述筛分优选为先后过200目和400目筛网，取200目筛网的筛下物，400目筛网的筛上物；本发明对过200目筛网和400目筛网的先后顺序没有特殊限定，可以先过200目筛网，取筛下物，然后过400目筛网，取筛上物，也可以先过400目筛网，取筛上物，然后过200目筛网，取筛下物，还可以将200目筛网和400目筛网层叠放置，直接将固体从上到下依次过200目筛网和400目筛网，取两个筛网之间的产物；本发明对所述超声分散的方法没有特殊限定，采用常规的超声分散方法即可，如浸泡于水中进行超声分散。在本发明中，所述石油醚清洗能够将固体上表面黏附的杂质去除，95％乙醇能够将残留在固体表面的石油醚去除，以使所得弱阴离子层析介质更加干净。
本发明对所述固液分离的方式没有特殊限定，能够将固体分离出来即可，如过滤。在本发明实施例中，所述固液分离的方式优选为过滤，所述过滤所用器件优选为砂芯漏斗，以便于清洗树脂。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法得到的弱阴离子层析介质；所述弱阴离子层析介质为球形颗粒，粒径优选为38～74μm；所述弱阴离子层析介质经氢氧化钠溶液转型后的离子交换量优选为0.0698～0.1402mmol·mL-1，对牛血清白蛋白的吸附载量优选为300～500mg/g，更优选为363.3～469.9mg/g。
本发明所提供的弱阴离子层析介质为球形颗粒，且形貌规整，粒径分布均匀，其含有叔氨基团，对牛血清白蛋白具有较强的吸附力，可用于牛血清白蛋白的分离纯化。
本发明还提供了上述技术方案所述的弱阴离子层析介质在牛血清白蛋白的分离纯化中的应用。
在本发明中，所述应用优选包括如下步骤：将所述弱阴离子层析介质使用氢氧化钠溶液进行转型，然后用于牛血清蛋白的分离纯化。在本发明中，所述转型能够使树脂带负电荷，用于对牛血清白蛋白的层析分析。
在本发明中，所述氢氧化钠溶液的质量浓度优选为3～5％，更优选为4％。
本发明对所述转型的操作没有特殊限定，采用常规的转型方式即可，如使用氢氧化钠溶液对弱阴离子层析介质进行床层过滤。
在本发明中，转型完成后，本发明优选将转型所得产物水洗至中性之后，再使用。本发明优选将转型后的弱阴离子层析介质储存于质量浓度为20％的乙醇溶液中。
下面结合实施例对本发明提供的一种弱阴离子层析介质及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将四氯乙烯95g和司班800.9g、液体石蜡160g混合，升温至70℃，固体溶解，得到230mL油相；
将N-甲基二烯丙基胺盐酸盐6.25g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺5.50g、甲基丙烯酸羟丙酯2g、硫酸铵1.5g和乙二醇4g和pH值为7的缓冲液(其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L)18g混合后升温至70℃，待固体溶解后，加入4,4-偶氮二氰基戊酸45mg，待4,4-偶氮二氰基戊酸溶解完全，得到39.3mL水相；
将水相与油相混合，在搅拌条件下，维持油相液滴的粒径为30～150μm，升温至85℃，通入氮气，在83～85℃反应2.1h，再冷却至室温；将冷却至室温的反应液过滤，将所得固体依次经石油醚清洗、95％乙醇清洗和超声分散，然后依次过200目筛网和400目筛网，取两个筛网之间的产物，得到弱阴离子层析介质；
将所述弱阴离子层析介质使用质量浓度为4％的氢氧化钠溶液进行床层过滤，然后水洗至中性，得到带负电荷的弱阴离子层析介质(为湿品)。
如图1所示，为本实施例所得弱阴离子层析介质的SEM图，本实施例所得弱阴离子层析介质为白色球形颗粒。
按照GB/T5760-2000公开的方法测试本实施例所得带负电荷的弱阴离子层析介质湿品的含水量为86.3％，说明本发明所提供的弱阴离子层析介质具有较高的亲水性，离子交换量为0.1300mmol·mL-1。
采用如下方法测试本实施例所得弱阴离子层析介质对牛血清白蛋白(BSA)的吸附载量：
称取0.2g弱阴离子层析介质湿树脂，加入25mL初始浓度为2mg/mL的BSA溶液，室温下置于恒温水浴摇床中于25℃震荡3h，待吸附平衡后利用针孔过滤器取样测量上清液浓度，并计算吸附载量(以带负电荷的弱阴离子层析介质干品计)，结果为422.0mg/g。
实施例2
将四氯乙烯95g和司班800.9g、液体石蜡160g混合，升温至70℃，固体溶解，得到230mL油相；
将纯度为98％的二烯丙基胺盐酸盐6.13g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺4.40g、甲基丙烯酸羟乙酯2g、硫酸铵1.8g、乙二醇4g和pH值为7的缓冲液(其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L)23g混合后升温至70℃，待固体溶解后，加入4,4-偶氮二氰基戊酸20mg，待4,4-偶氮二氰基戊酸溶解完全，得到40mL水相；
将水相与油相混合，在搅拌条件下，维持油相液滴的粒径为30～150μm，升温至85℃，通入氮气，在83～85℃反应2.1h，再冷却至室温；将冷却至室温的反应液过滤，将所得固体依次经石油醚清洗、95％乙醇清洗和超声分散，然后依次过200目筛网和400目筛网，取两个筛网之间的产物，得到弱阴离子层析介质；
将所述弱阴离子层析介质使用质量浓度为4％的氢氧化钠溶液进行床层过滤，然后水洗至中性，得到带负电荷的弱阴离子层析介质(为湿品)。
对本实施例所得弱阴离子层析介质进行SEM表征，为白色球形颗粒。
采用实施例1的测试方法测试本实施例所得带负电荷的弱阴离子层析介质湿品的含水量、离子交换量和对BSA的吸附载量，结果依次为85.3％、0.1005mmol·mL-1、363.3mg/g。
实施例3
将四氯乙烯95g和司班800.9g、液体石蜡160g混合，升温至70℃，固体溶解，得到230mL油相；
将N-甲基二烯丙基胺磷酸盐6.25g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺4.50g、甲基丙烯酸羟乙酯2g、硫酸铵0.2g、乙二醇4g和pH值为7的缓冲液(其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L)19g混合后升温至70℃，待固体溶解后，加入4,4-偶氮二氰基戊酸40mg，待4,4-偶氮二氰基戊酸溶解完全，得到40mL水相；
将水相与油相混合，在搅拌条件下，维持油相液滴的粒径为30～150μm，升温至85℃，通入氮气，在83～85℃反应2.1h，再冷却至室温；将冷却至室温的反应液过滤，将所得固体依次经石油醚清洗、95％乙醇清洗和超声分散，然后依次过200目筛网和400目筛网，取两个筛网之间的产物，得到弱阴离子层析介质；
将所述弱阴离子层析介质在质量浓度为4％的氢氧化钠溶液进行床层过滤，然后水洗至中性，得到电负电荷的弱阴离子层析介质(为湿品)。
对本实施例所得弱阴离子层析介质进行SEM表征，为白色球形颗粒。
采用实施例1的测试方法测试本实施例所得带负电荷的弱阴离子层析介质湿品的含水量、离子交换量和对BSA的吸附载量，结果依次为80.6％、0.1005mmol·mL-1、469.9mg/g。
实施例4
将四氯乙烯95g和司班800.9g、液体石蜡160g混合，升温至70℃，固体溶解，得到230mL油相；
将N-甲基二烯丙基胺磷酸盐6.25g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺3.40g、甲基丙烯酸羟乙酯2g、硫酸铵0.2g、乙二醇4g和pH值为7的缓冲液(其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L)18g混合后升温至70℃，待固体溶解后，加入4,4-偶氮二氰基戊酸35mg，待4,4-偶氮二氰基戊酸溶解完全，得到40mL水相；
将水相与油相混合，在搅拌条件下，维持油相液滴的粒径为30～150μm，升温至85℃，通入氮气，在83～85℃反应2.2h，再冷却至室温；将冷却至室温的反应液过滤，将所得固体依次经石油醚清洗、95％乙醇清洗和超声分散，然后依次过200目筛网和400目筛网，取两个筛网之间的产物，得到弱阴离子层析介质；
将所述弱阴离子层析介质在质量浓度为4％的氢氧化钠溶液进行床层过滤，然后水洗至中性，得到带负电荷的弱阴离子层析介质(为湿品)。
对本实施例所得弱阴离子层析介质进行SEM表征，为白色球形颗粒，粒径为40～100μm。
采用实施例1的测试方法测试本实施例所得带负电荷的弱阴离子层析介质湿品的含水量、离子交换量和对BSA的吸附载量，结果依次为84.5％、0.0698mmol·mL-1、445.2mg/g。
实施例5
将四氯乙烯62g和司班800.68g、液体石蜡105g混合，升温至70℃，固体溶解，得到160mL油相；
将N-甲基二烯丙基胺盐酸盐6.25g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺5.50g、甲基丙烯酸羟丙酯2g、硫酸铵1.5g、乙二醇4g和pH值为7的缓冲液(其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L)18g混合后升温至70℃，待固体溶解后，加入4,4-偶氮二氰基戊酸45mg，待4,4-偶氮二氰基戊酸溶解完全，得到40mL水相；
将水相与油相混合，在搅拌条件下，维持油相液滴的粒径为30～150μ，升温至85℃，通入氮气，在83～85℃反应2.1h，再冷却至室温；将冷却至室温的反应液过滤，将所得固体依次经石油醚清洗、95％乙醇清洗和超声分散，然后依次过200目筛网和400目筛网，取两个筛网之间的产物，得到弱阴离子层析介质前驱体；
将所述弱阴离子层析介质前驱体在质量浓度为4％的氢氧化钠中进行转型，然后水洗至中性，得到弱阴离子层析介质(为湿品)。所得弱阴离子层析介质为白色球形颗粒。
使用AKTA纯化系统编程进行实验，测试实施例1～4所得带负电荷的弱阴离子层析介质的压力-流速曲线，设定AKTA纯化系统检测波长为280nm，将分别装填有实施例1～4所得带负电荷的弱阴离子层析介质的层析柱接入系统，以超纯水为缓冲液，设定压力上限DeltaP为0.3MPa，流速分别为5、10、20、40、60mL/min，每个流速平衡3个柱体积，结束后降低流速至5mL/min，继续冲洗3个柱体积，观察柱子状态是否稳定，实验运行过程中由于超压报警或柱头顶开导致系统暂停，则视为到达了该层析介质的压力上限，实验终止。结果如图2所示，由图2可知，实施例1～4所得带负电荷弱阴离子层析介质的流速均可以到达60mL/min，说明本发明所得弱阴离子层析介质具有很高的机械强度。
使用AKTA层析系统测试实施例1所得弱阴离子层析介质和UniGel-80DEAE(苏州纳微生物科技有限公司)的色谱图，如图3所示，由图3可知，实施例1所得层析介质的保留体积为40.517mL，而UniGel-80 DEAE的保留体积为40.970mL，两者保留体积相当；实施例1所得层析介质的洗脱峰面积为17580.4100mL*mAU，流穿峰面积2440.170*mAU，而UniGel-80DEAE的洗脱峰面积为14327.0000mL*mAU，流穿峰面积为2634.174*mAU，实施例1所得层析介质的洗脱峰面积更大，说明其对BSA的吸附量更大。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种弱阴离子层析介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将四氯乙烯和司班80溶解于液体石蜡中，得到油相；将烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、致孔剂、pH值为7的缓冲液及引发剂混合，得到水相；将所述油相和水相混合，在保护气氛下进行共聚反应，得到弱阴离子层析介质；
所述烯丙基胺类盐在水相中的质量浓度为14.8～18.4％；
所述甲基丙烯酸羟基酯在水相中的质量浓度为4.8～6.0％；
所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺占烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的总质量的20～45％；
所述烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量之和与致孔剂的质量比为10～16:0～6；
所述引发剂占烯丙基胺类盐、甲基丙烯酸羟基酯和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的总质量的0.1～0.5％；
所述烯丙基胺类盐为N-甲基二烯丙基胺盐酸盐、二烯丙基胺盐酸盐和N-甲基二烯丙基胺磷酸盐中的至少一种；
所述引发剂为4,4-偶氮二氰基戊酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油相中的四氯乙烯的质量浓度为30～40％，司班80的质量浓度为0.35～0.41％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述致孔剂包括硫酸铵和乙二醇，所述硫酸铵和乙二醇的质量比为0.2～1.8:4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述pH值为7的缓冲液为磷酸钠和氯化氢的混合水溶液，其中磷酸钠的浓度为1mol/L，氯化氢的浓度为2mol/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油相和水相的体积比为4～6:1。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述共聚反应的温度为83～90℃，时间为1.8～2.6h。
7.权利要求1～6任一项所述的制备方法得到的弱阴离子层析介质，所述弱阴离子层析介质为球形颗粒。
8.权利要求7所述的弱阴离子层析介质在牛血清白蛋白的分离纯化中的应用。
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