KR101673631B1 - 이온 교환 크로마토그래피용 그라프트 공중합체 - Google Patents

이온 교환 크로마토그래피용 그라프트 공중합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 특성을 갖는 변형된 분리재, 이의 제조, 및 액체로부터의 하전된 생체중합체의 분리를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

이온 교환 크로마토그래피용 그라프트 공중합체 {GRAFT COPOLYMERS FOR ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 개질된 분리재, 이의 제조 및 액체로부터의 하전된 생체중합체의 분리를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
이온 교환 크로마토그래피는 아마도 단백질, 펩티드 및 기타 생체중합체의 정제를 위해 가장 빈번하게 사용되는 방법일 것이다. 실질적으로 모든 산업적 정제 방법은 하나 이상의 이온 교환 단계를 포함한다. 특히 관심의 대상이 되는 것은 표적 분자에 대해 높은 결합 용량을 갖는 이온 교환 수지이다.
지지체 표면에 차례로 공유 결합되는 선형 그라프트 중합체에 이온성 기가 배타적으로 편재화되어 있는 적합한 분리재를 사용하는 것이 특히 유리하다 (W. Mueller, J. Chromatography 1990, 510, 133-140).
상응하는 관능화 단량체를 다수의 상이한 표면에 그라프트시킴으로써 수득되는 관능화 중합체가 여러 해 동안 공지되었다. 관능화가 화학 결합된 이온성 기와 관련된 경우, 상응하는 재료는 이온 교환 크로마토그래피에 사용될 수 있다.
생체중합체의 분획이 의도된 비교적 다수의 가능한 그라프트 중합체 구조가 특허 EP 0 337 144 또는 US 5,453,186 에서 제시된다. 1 개 초과의 단량체 단위를 포함하는 그라프트 중합체 (공중합) 가 또한 특허 문헌에 청구되어 있다. 이러한 그라프트 공중합의 경우, 적합한 교환체를 수득하기 위한 단량체는 모든 단량체가 염기성 또는 산성 기를 포함하거나 하나의 단량체가 중성인 방법으로 선택되어야만 한다. 그라프트 공중합에 바람직한 단량체의 조합 및 유형은 설명되지 않았는데, 이는 당업자가 약학적 단백질, 펩티드 및 기타 생체중합체의 정제에 적합한 분리재를 수득하기 전에 다수의 실험을 수행해야 한다는 것을 의미한다.
EP 1 473 075 A 는 이온 교환 크로마토그래피용 재료를 기재한다. 재료의 제조를 위해서, 2-아크릴-아미도-2-메틸-1-프로판술폰산, N(이소부톡시메틸)아크릴아미드 및 히드록시메틸 메타크릴레이트로 이루어지는 중합체 용액은, 예를 들어 다공성 셀룰로오스 니트레이트와 같은 히드록실-함유 지지체에 흡착된다. 그러나, 이러한 "흡착" 은 지지체 재료와 적용된 코팅물 사이의 화학적 연결을 뜻하지는 않는다. 흡착의 경우, 수-팽윤성, 가교 중합체인 히드로겔이 지지체의 기공에서 중합된다. 이는 적용시에 압력-안정성이도록 재료가 충분히 입체적으로 안정해지는 기공에서의 중합을 통해서만 이루어진다. 사용된 히드로겔의 제조에는 3 개 이상의 단량체가 필요하고; 실제 분리재의 제조에는 5 개 이상의 성분, 즉 지지체, 단량체 1, 단량체 2 및 가교제 및 덱스트란이 필요하다.
Kobayashi 등의 [Journal of Chromatography, Vol.958, No. 1-2, 109 - 119, (2002)] 는 한편 실리카겔 또는 실리카에 이소프로필아크릴아미드 및 아크릴산을 포함하는 중합체를 그라프트시킴으로써 수득되는 크로마토그래피 재료를 기재한다. 이러한 그라프트의 목적은 비하전된 단량체를 도입함으로써 소수성을 제공하는 것이다. 지방족 히드록실기가 지지체 표면에 존재하지 않고 실리카가 가수분해에 대해 안정하다는 사실 때문에, 무기 실리카에 중합체를 결합시키는데 어려움이 더 많다.
US 2004/203149 A1 은 지지체 재료 및 겔로 이루어지는 크로마토그래피 재료를 기재한다. 지지체-지지된 다공성, 가교 겔이 얻어진다. 또한 EP 1 473 075 A 에 기재된 바와 같이, 히드로겔은 지지체의 기공에서 중합되어 적용시에 압력-안정성인 충분히 입체적으로 안정한 재료가 수득된다. 지지체에 대한 공유 결합은 발생하지 않지만, 대신 히드로겔이 지지체와 서로 얽힌다. 소수성 지지체 재료가 바람직하게 사용된다. 또한 Kobayashi 에 의해 기재된 바와 같이, 모든 경우에서 원하는 분리재의 제조는 재료의 적용시의 결합 거동에 상당한 영향을 갖는 가교제를 필요로 한다. 또한, 바람직하게 사용되는 아크릴아미드는 가수분해에 대해 충분히 안정하지 않다.
목적
따라서 본 발명의 목적은 높은 용량으로 단백질 및 기타 생체중합체를 결합시키고 산업적 규모에서의 제조적 용도로 사용될 수 있는 이온성 기를 갖는 지지체 재료를 제조하는 것이다.
이러한 지지체 재료는 지지체의 본질적인 특성이 유지되는 pH 13 이상에서 분리재의 정제 또는 재생을 가능하게 할 수 있도록, 가수분해에 대해, 특히 알칼리에 대해 안정해야만 한다.
발명의 주제
본 발명은 2 개 이상의 단량체 단위로부터 구축된 중합체가 지지체 재료에 결합되며, 여기서 2 개 이상의 상이한 반복 단위가 분리재에 존재하는 한편, 이러한 단위 중 하나는 전하를 수반하고 이러한 단위 중 하나 이상은 중성 기를 수반하는 것을 특징으로 하는, 무기 또는 유기 지지체 재료를 포함하는 분리재에 관한 것이다.
실험은 중성 공단량체로서 N-알콕시알킬아크릴아미드로 유도화된 지지체 재료가, 하전된 생체분자, 특히 하전된 생체중합체를 분리 제거하기 위한 분리재로서 적합하다는 것을 보여주었다. N-알콕시알킬아크릴아미드와의 그라프트 공중합으로 인해, 표면에서 저전하 밀도의 양호한 이용이 달성되었다.
따라서 본 발명의 목적은 다공성 입자 또는 기타 몰딩의 히드록실-함유 표면 상에서 상응하는 그라프트 공중합체를 제조함으로써 또한 달성된다. 반응에 의해 이러한 표면에 결합되는 그라프트 중합체는 본 발명에 따라, 이러한 그라프트 중합체가 이온성 상호작용에 의해 하전된 물질을 결합할 수 있도록 단위 중 하나 이상은 전하를 수반하고 하나 이상의 단위는 중성 기에 연결되는, 2 개 이상의 반복 단위로부터 구축된다.
따라서 본 발명은 또한 이온성 상호작용에 의해 하전된 물질, 특히 생체중합체를 결합시킬 수 있는 분리재에 관한 것이다. 이러한 지지체 재료의 제조의 경우, 단위 중 하나 이상이 전하를 수반하고 단위 중 하나 이상이 중성 기에 연결되는, 2 개 이상의 반복 단량체 단위로부터 구축되는 그라프트 중합체는 화학적 반응에 의해 다공성 입자 또는 기타 몰딩의 히드록실-함유 표면에 결합될 수 있다.
특히, 본 발명은 가교된 합성 중합체 또는 가교된 아가로스 또는 덱스트란, 또는 염기 지지체로서 유기 코팅을 갖는 무기 지지체를 포함하는 복합재를 갖는 상응하는 분리재에 관한 것이다.
공중합체가 공유 결합되는 표면에 대하여 상응하는 히드록실-함유 염기 지지체를 기재로 하는 이온 교환 크로마토그래피용의 상기 유형의 분리재는 하기와 같은 사실에 의해 구별된다:
a) 염기 지지체는 지방족 히드록실기를 함유하고,
b) 공중합체는 지지체에 공유 결합되고,
c) 공중합체는 2 개 이상의 상이한 단량체 단위를 함유하고,
d) 단량체 단위는 선형 방식으로 연결되고,
e) 공중합체는, 술폰산 또는 카르복실산의 형태 또는 아민 또는 암모늄기의 형태로 전하를 수반하고, 또한 알킬 및/또는 알킬렌기 및 임의로는 아미드기를 함유하지만 아릴기는 함유하지 않거나, 술폰산 또는 카르복실산의 형태 또는 아민 또는 암모늄기의 형태로 음전하를 수반하고, 또한 알킬 및/또는 알킬렌기를 함유하지만 아릴기는 함유하지 않는, 하나 이상의 단량체 단위를 갖고,
f) 공중합체는 하기 화학식 (1) 의 하나 이상의 비하전된 단량체 단위를 갖고:
Figure 112011013900324-pct00001
[식 중,
R1 은 수소를 나타내고,
R2 는 수소 또는 메틸을 나타내고,
R3 및 Y 는 서로 독립적으로 수소, 4 개 이하의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬, 메톡시프로필, 에톡시에틸 또는 메톡시에틸을 나타냄],
g) 전하를 갖는 1 개 초과의 단량체가 존재하는 경우, 동일한 전하의 단량체 단위만이 결합되고,
h) 전하를 갖지 않는 단량체 단위에 대한 전하를 갖는 단량체 단위의 비율은 1:99 내지 90:10 의 범위임.
본 발명은 바람직하게는 또한 공중합체가 공유 결합되는 표면에 대하여 상응하는 히드록실-함유 염기 지지체를 기재로 하는 이온 교환 크로마토그래피용의 분리재에 관한 것이며, 이는 하기를 특징으로 한다:
a) 염기 지지체는 지방족 히드록실기를 함유하고,
b) 공중합체는 지지체에 공유 결합되고,
c) 공중합체는 2 개 이상의 상이한 단량체 단위를 함유하고,
d) 단량체 단위는 선형 방식으로 연결되고,
e) 공중합체는 화학식 (1):
[식 중,
R1 은 수소를 나타내고,
Y 는 수소를 나타내고,
R3 은 R4-SO3M, R4-COO, R4-NR9R10 또는 R4-NR9R10R11X
(식 중,
R4 는 2 내지 4 개의 C 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 알킬렌을 나타내고,
R9, R10 및 R11 은 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 페닐 또는 벤질을 나타내고,
M 은 수소, Na, K 또는 NH4 를 나타내고,
X 는 Cl, Br, I 또는 메틸술페이트를 나타냄) 를 나타냄]
의 전하를 갖는 하나 이상의 단량체 단위를 갖거나, 공중합체는 하기 화학식 (2) 의 하나 이상의 단량체 단위를 가짐:
Figure 112011013900324-pct00002
[식 중,
R7 은 수소를 나타내고,
R8 은 메틸을 나타내고,
Z 는 수소, Na, K 또는 NH4 를 나타냄].
하기를 특징으로 하는 본 발명에 따른 분리재가 바람직하다:
f) 결합되는 공중합체는 하기 화학식 (1) 의 하나 이상의 비하전된 단량체 단위를 가짐:
Figure 112011013900324-pct00003
[식 중,
R1 은 수소를 나타내고,
R2 는 수소 또는 메틸을 나타내고,
R3 은 메틸, 에틸, 프로필, 메톡시프로필, 메톡시에틸 (Y 가 수소를 나타내는 경우) 을 나타내거나,
R3 은 메틸 또는 에틸 (Y 가 메틸을 나타내는 경우) 을 나타냄].
특히 바람직한 본 발명에 따른 분리재의 변형은 하기와 같은 사실에 의해 구별된다:
c) 공중합체는 2 개 이상의 상이한 단량체 단위로부터 구축되고,
e) 공중합체는 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산, 2-아크릴아미도에탄술폰산, 카르복시메틸아크릴아미드; 카르복시에틸아크릴아미드, 카르복시프로필아크릴아미드, 카르복시메틸메타크릴아미드, 카르복시에틸메타크릴아미드, 카르복시프로필메타크릴아미드, 아크릴산 및 메타크릴산의 군으로부터 선택되는, 음전하를 갖는 하나 이상의 단량체 단위를 갖고,
f) 공중합체는 디메틸아크릴아미드, 에톡시에틸아크릴아미드, 메톡시에틸아크릴아미드 및 메톡시프로필아크릴아미드의 군으로부터 선택되는 1 개 이상의 비하전된 단량체 단위를 함유함.
본 발명에 따라 기재된 분리재의 또다른 바람직한 구현예는 하기와 같은 사실에 의해 구별된다:
c) 공중합체는 2 개 이상의 상이한 단량체 단위를 함유하고,
e) 공중합체는 2-(아크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드, 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드, 2-(디에틸아미노에틸)아크릴아미드, 2-(디에틸아미노에틸)메타크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)아크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)메타크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드, 2-(메타크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드 및 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드의 군으로부터 선택되는 양전하를 갖는 하나 이상의 단량체 단위를 갖고,
f) 공중합체는 디메틸아크릴아미드, 에톡시에틸아크릴아미드, 메톡시에틸아크릴아미드 및 메톡시프로필아크릴아미드의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비하전된 단량체 단위를 함유함.
본 발명은 또한, 그라프트 중합체가 2 개 이상의 반복 단량체 단위로부터 구축되며, 여기서 이들 단위 중 1 개 이상이 전하를 수반하고 단위 중 1 개 이상이 화학 반응에 의해 히드록실-함유 표면에 결합되는 비하전된 기를 수반하여, 이온성 상호작용에 의해 하전된 물질, 특히 생체중합체를 결합시킬 수 있는 재료를 수득하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 분리재, 바람직하게는 그라프트 공중합체의 다공성 입자 또는 기타 몰딩의 히드록실-함유 표면 상의 제조 방법에 관한 것이다.
이온 교환 기로서 지지체 표면에 결합되는 유연한 그라프트 중합체 ("텐타클 (tentacle)") 의 용도는 공지되어 있다. 따라서, 시판되는 양이온 교환체 Fractogel
Figure 112011013900324-pct00004
EMD SO3 -(M) 에서 그라프트 중합체는 술폰산기를 갖는 하나의 반복 단위만으로부터 구축된다.
특허 EP 0 337 144 또는 US 5,453,186 은 이온 교환체의 합성에 바람직할 단량체 조합에 대한 정보를 제공하지 않는다. 실시예는 또한 직접적으로 이온 교환체를 생성하는 하나의 단량체와의 그라프트 중합만을 기재한다.
특히, 관능화 아크릴아미드와 아크릴산의 그라프트가 조사되었는데, 이는 이로부터 형성된 중합체가 알칼리성 조건 하에서 가수분해에 대해 안정하기 때문이다. 또한, 폴리(아크릴아미드) 는 수용액에서의 더 양호한 팽윤성 및 이에 따른 이의 친수성 때문에 사용시의 큰 이점인 수소 결합을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 분리재의 제조의 경우, 예를 들어 Fractogel TSK HW65 (M) 또는 시판되는 Toyopearl HW-65 (S) 와 같은 친수성 크로마토그래피 지지체가 사용될 수 있다. 이러한 지지체는 그라프트 공중합체로 개질된다.
본 발명에 따른 재료의 제조의 경우, 기타 크로마토그래피 지지체가 또한 사용될 수 있다. 그러나, 사용된 재료가 그라프트 중합 반응에 접근할 수 있는 반응성기, 바람직하게는 OH 기를 갖는 것이 바람직하다. 따라서 적합한 지지체 재료는 예를 들어 유기 중합체로 또한 이루어질 수 있다. 상기 유기 중합체는 아가로스, 덱스트란, 전분, 셀룰로오스 등과 같은 다당류, 또는 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(아크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 친수성적으로 치환된 폴리(알킬 알릴 에테르), 친수성적으로 치환된 폴리(알킬 비닐 에테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(n-비닐우레아), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(스티렌) 및 상응하는 단량체의 공중합체와 같은 합성 중합체일 수 있다. 이러한 유기 중합체는 바람직하게는 가교 친수성 네트워크의 형태로 또한 사용될 수 있다. 이러한 가교 친수성 중합체는 기타 소수성 중합체처럼 친수성화 형태로 바람직하게 사용될 수 있는 스티렌 및 디비닐벤젠을 포함하는 것들을 또한 포함한다.
대안적으로, 실리카, 산화지르코늄, 이산화티타늄, 산화알루미늄 등과 같은 무기 재료가 지지체로서 사용될 수 있다. 그와 동시에, 복합재가 적합한 지지체 재료로서 사용될 수 있다 (즉, 예를 들어 본 발명에 따른 분리재는 본 발명에 따른 방식으로 유도화된 무기 입자 또는 몰딩의 표면의 유도화에 의해 수득될 수 있음). 이의 예는 자성 입자 또는 자성 코어의 공중합에 의해 그 자체가 자화될 수 있는 입자이다.
그러나, 본 발명에 따른 재료는 연장된 사용 기간에 걸쳐 pH 13 이상에서 알칼리성 정제 또는 재생을 견뎌내야만 하므로, 가수분해에 대해 안정하거나 가수분해되기 어려울 수 있는 친수성 지지체 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 지지체는 이미 저분자량 리간드를 수반할 수 있다. 리간드는 하나 이상의 하전된 기, 소수성 기 또는 수소 결합을 형성할 수 있는 기를 수반할 수 있다. 그라프트 중합체와 동일한 전하를 수반하는 리간드가 바람직하다.
지지체 재료는 또한 입자 크기가 2 내지 1000 ㎛ 일 수 있는 비정형 형상 또는 구형 입자로 이루어질 수 있다. 입자 크기가 3 내지 300 ㎛ 인 것이 바람직하다.
특히, 지지체 재료는 비다공성, 바람직하게는 다공성 입자의 형태일 수 있다. 기공 크기는 2 내지 300 ㎚ 일 수 있다. 기공 크기가 5 내지 200 ㎚ 인 것이 바람직하다.
그와 동시에, 지지체 재료는 또한 막, 섬유, 중공 섬유, 코팅 또는 모놀리식 (monolithic) 몰딩의 형태이다. 모놀리식 몰딩은 3 면체, 예를 들어 원통형 형태일 수 있다.
바람직한 그라프트 중합의 경우, 하나 이상의 양 또는 음으로 하전된 단량체가 사용된다. 다수의 하전된 단량체가 사용되는 경우, 본 발명에 따라 개선된 특성을 갖는 분리재를 수득하기 위해서 동일한 전하를 갖는 단량체만이 혼합될 수 있다. 음성 기를 갖는 단량체는 예를 들어 술폰산 또는 카르복실기를 가질 수 있다.
술폰산기를 갖는 적합한 단량체는 예를 들어 Z 가 R4-SO3M 인 화학식 (2) 의 아크릴레이트이고, 여기서의 R7 및 R8 은 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸, 카르복실 또는 카르복시메틸의 의미를 가질 수 있고, R4 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬렌기 또는 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기일 수 있다.
M 은 수소 원자 또는 나트륨 또는 칼륨과 같은 금속 양이온, 또는 암모늄 양이온이다. M 은 단량체가 수용성이도록 선택된다.
예로써, 3-술포프로필 아크릴레이트 또는 2-술포에틸 아크릴레이트와 같은 술포알킬 아크릴레이트, 및 3-술포프로필 메타크릴레이트 또는 2-술포에틸 메타크릴레이트와 같은 술포알킬 메타크릴레이트가 언급된다.
R3 가 R4-SO3M 인 하기 화학식 (1) 의 아크릴아미드를 사용하는 것이 바람직하다:
Figure 112011013900324-pct00005
[식 중,
R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬의 의미를 가질 수 있고, 바람직하게는 수소 또는 메틸임].
R1 및 R2 는 마찬가지로 서로 독립적으로 카르복실 또는 카르복시메틸일 수 있다.
R3 는 또한 R4-SO3M 일 수 있고, 여기서의 R4 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄형 알킬렌기일 수 있거나, 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기일 수 있다.
M 은 수소 원자 또는 나트륨 또는 칼륨과 같은 금속 양이온, 또는 암모늄 양이온이다. M 은 단량체가 수용성이도록 선택된다.
이때 예로써 언급될 수 있는 적합한 아크릴아미드는 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산 (AMPS) 및 2-아크릴아미도-에탄술폰산이다.
카르복실기를 갖는 적합한 단량체는 또한 예를 들어 Z 가 R5-COOM 인 하기 화학식 (2) 의 아크릴레이트일 수 있다:
Figure 112011013900324-pct00006
[식 중,
R1 및 R2 는 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸, 카르복실 또는 카르복시메틸의 의미를 가질 수 있고,
R5 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬렌기, 또는 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기일 수 있음].
M 은 수소 원자 또는 나트륨 또는 칼륨과 같은 금속 양이온, 또는 암모늄 양이온이다. M 은 단량체가 수용성이도록 선택된다.
예로써, 카르복시에틸 아크릴레이트와 같은 카르복시알킬 아크릴레이트, 및 카르복시알킬 메타크릴레이트가 언급될 수 있다. R3 가 R5-COOM 인 화학식 (1) 의 아크릴아미드를 사용하는 것이 바람직하며, 여기서의 R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸의 의미를 갖고, R1 및 R2 는 마찬가지로 서로 독립적으로 카르복실 또는 카르복시메틸일 수 있다.
R3 는 또한 R5-COOM 일 수 있고, 여기서의 R5 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같이 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬렌기; 또는 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같이 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기일 수 있다.
M 은 수소 원자 또는 나트륨 또는 칼륨과 같은 금속 양이온 또는 암모늄 양이온이다. M 은 단량체가 수용성이도록 선택된다.
Z 가 M 인 화학식 (2) 의 불포화 카르복실산을 사용하는 것이 특히 바람직하며, 여기서의 R7 및 R8 은 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸, 카르복실 또는 카르복시메틸의 의미를 가질 수 있다. M 은 수소 원자 또는 나트륨 또는 칼륨과 같은 금속 양이온이거나, 암모늄 양이온이다. M 은 단량체가 수용성이도록 선택된다. 예로써, 말레산, 이타콘산, 시트라콘산, 메사콘산 또는 푸마르산이 언급될 수 있다. 이들 중, Z 가 M 인 하기 화학식 (2) 의 단량체가 특히 바람직한데, 여기서의 R7 은 수소를 나타내고 R8 은 수소 또는 3 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬을 나타낸다. 이러한 목적의 경우, 예로써 아크릴산 및 메타크릴산이 언급될 수 있다.
Figure 112011013900324-pct00007
양성 기를 갖는 단량체는 예를 들어 1 차, 2 차 또는 3 차 아미노기를 수반할 수 있거나, 4 차 암모늄염일 수 있다. 아미노기를 갖는 적합한 단량체는 예를 들어 Z 가 R4-NR9R10 인 화학식 (2) 의 아크릴레이트이고, 여기서의 R7 및 R8 은 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸의 의미를 가질 수 있고, R4 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬렌기, 또는 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기일 수 있고, R9 및 R10 은 서로 독립적으로 수소, 알킬, 페닐 또는 알킬페닐, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 벤질의 의미를 갖는다. 예로써 2-(디에틸아미노에틸) 아크릴레이트, 2-(디메틸아미노에틸) 아크릴레이트 또는 2-(디메틸아미노프로필) 아크릴레이트와 같은 아미노알킬 아크릴레이트, 및 2-(디에틸아미노에틸) 메타크릴레이트, 2-(디메틸아미노에틸) 메타크릴레이트 또는 3-(디에틸아미노프로필) 메타크릴레이트와 같은 아미노알킬 메타크릴레이트가 언급될 수 있다.
R3 가 R4-R4-NR9R10 인 화학식 (1) 의 아크릴아미드를 사용하는 것이 바람직하며, 여기서의 R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸의 의미를 갖고, R4 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬렌기, 또는 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기일 수 있고, R9 및 R10 은 서로 독립적으로 수소, 알킬, 페닐 또는 알킬페닐, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 벤질의 의미를 갖는다. 이때 예로써 언급될수 있는 적합한 아크릴아미드는 2-(디에틸아미노에틸)아크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)아크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드 또는 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드일 수 있고, 이때 예로써 언급될 수 있는 적합한 메타크릴아미드는 2-(디에틸아미노에틸)메타크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)메타크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드 또는 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드이다.
4 차 암모늄염인 적합한 단량체는 예를 들어 화학식 (2) 의 아크릴레이트이며, 여기서의 Z 는 R4-NR9R10R11X 의 의미를 갖고, 여기서의 R7 및 R8 은 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸의 의미를 가질 수 있고, R4 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬렌기, 또는 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기일 수 있고, R9, R10 및 R11 은 서로 독립적으로 수소, 알킬, 페닐 또는 알킬페닐, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 벤질의 의미를 갖는다. X 는 음이온이고, 단량체가 수용성이도록 선택되며, 예를 들어 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드 또는 메틸술페이트일 수 있다. 예로써 [2-(아크릴옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 아크릴옥시알킬암모늄염, 및 [2-(메타크릴옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 메타크릴옥시알킬암모늄염이 언급될 수 있다.
R3 가 R4-NR9R10R11X 인 화학식 (1) 의 아크릴아미드를 사용하는 것이 바람직하며, 여기서의 R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 수소 또는 6 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸의 의미를 갖고, R4 는 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 헥실렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 직쇄 알킬렌기 또는 예를 들어 이소프로필렌 또는 이소부틸렌과 같은 1 내지 8 개의 C 원자를 갖는 분지형 알킬렌기이고, R9, R10 및 R11 은 서로 독립적으로 수소, 알킬, 페닐 또는 알킬페닐, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 벤질의 의미를 갖는다. X 는 음이온이고, 단량체가 수용성이도록 선택되며, 예를 들어 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드 또는 메틸술페이트일 수 있다. 이때 예로써 언급될 수 있는 적합한 아크릴아미드는 2-(아크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드 및 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드이다. 이때 예로써 언급될 수 있는 적합한 메타크릴아미드는 2-(메타크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드 및 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드이다.
또다른 성분으로서, 바람직하게는 친수성인 하나 이상의 비하전된 단량체가 필요하다. 이러한 목적에 적합한 중성 단량체는 예를 들어 메틸 아크릴레이트와 같은 저급 알킬 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트와 같은 저급 알킬 메타크릴레이트이다. Y 가 R6 인 화학식 1 의 아크릴아미드를 사용하는 것이 바람직하며, 여기서의 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 수소 또는 메틸이고, R3 및 R6 는 서로 독립적으로 수소 또는 4 개 이하의 C 원자를 갖는 알킬을 나타낸다. R3 및/또는 R6 는 따라서 수소 또는 저급 알킬을 나타낸다. 이때 저급 알킬은 바람직하게는 메틸, 에틸, 부틸, 이소프로필, 3-부틸 또는 이소부틸의 의미를 갖고, 또한 예를 들어 메톡시에틸 또는 에톡시에틸과 같은 4 개 이하의 C 원자를 갖는 알콕시알킬의 의미를 갖는다. 예로써, 아크릴아미드 (AAm), 디메틸아크릴아미드, 에톡시에틸아크릴아미드, 메타크릴아미드, 메톡시에틸아크릴아미드 및 메톡시프로필아크릴아미드가 언급될 수 있다. N-치환 아미드는 에스테르 및 비치환 아미드보다 가수분해에 대해 더 안정하므로 바람직하다.
실제 중합체는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. "~로 그라프트되는" 경우, 중합체 사슬은 먼저 단량체로부터 형성되어야 하고, 제 2 단계에서 표면에 결합된다. "~로부터 그라프트되는" 경우, 중합 반응은 표면에서 개시되고, 그라프트 중합체는 개별 단량체로부터 직접적으로 구축된다. 지지체 재료의 표면에 결합시킬 수 있는 기타 중합 방법이 또한 사용될 수 있다.
두 번째 방법이 바람직하며, 분리 제거되어야 하는 비공유 결합된 중합체와 같은 부산물이 극소수만 형성되는 변형이 특히 바람직하다. 예를 들어 원자-수송 자유-라디칼 중합 (ATRP) 방법과 같은 제어된 자유-라디칼 중합으로의 방법이 특히 관심 방법인 것으로 나타난다. 이때, 개시제 기는 제 1 단계에서 원하는 밀도로 지지체 표면에 공유 결합된다. 개시제 기는 예를 들어 2-브로모-2-메틸프로피온산 에스테르에서와 같이 에스테르 관능기를 통해 결합된 할라이드일 수 있다. 그라프트 중합은 제 2 단계에서 구리(I) 염의 존재 하에 수행된다. 바람직한 1 단계 그라프트 중합 반응은 활성화되어야 하는 지지체 없이 히드록실-함유 지지체에서 세륨(IV) 에 의해 개시될 수 있다. 이러한 반응은 통상적으로 희석 미네랄 산에서 수행된다. 이러한 그라프트 중합을 수행하기 위해, 산은 통상적으로 1 내지 0.00001 mol/ℓ, 바람직하게는 0.1 내지 0.001 mol/ℓ 범위의 농도를 갖는 수용액으로 사용된다. 0.1 내지 0.001 mol/ℓ 범위의 농도로 사용되는 희석 질산을 사용하는 것이 매우 특히 바람직하다.
그라프트에 대한 일련의 실험의 경우, 관능화 아크릴아미드 및 아크릴산을 사용하는 것이, 이로부터 형성된 중합체가 알칼리성 조건 하에서 가수분해에 대해 안정하기 때문에 바람직하다. 적합한 지지체 재료가 하기 표에 언급된 단량체와 그라프트-중합되는 경우, 본 발명에 따라 개선된 특성을 갖는 그라프트 중합에 의해 유도화된 분리재가 수득된다는 것이 밝혀졌다.
2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산 (AMPS)
2-아크릴아미도에탄술폰산
아크릴산
2-(아크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드
2-(디에틸아미노에틸)아크릴아미드
디메틸아크릴아미드
메톡시에틸아크릴아미드
예로써, 하기 지지체-결합되는 그라프트 공중합체는 2 개의 단량체를 조합함으로써 예를 들어 Fractogel TSK HW65 (M) 또는 (S) 와 같은 적합한 지지체 상에서 제조되며, 이의 양이온 교환체로서의 특성, 특히 이의 결합 용량에 대해 조사된다:
폴리(AMPS, 디메틸아크릴아미드),
폴리(AMPS, 메톡시에틸아크릴아미드).
유리한 특성을 갖는 그라프트 중합체를 수득하기 위해서, 하전된 단량체 및 비하전된 단량체는 바람직하게는 하전된 성분의 비율이 단량체의 총량에 대해 1-90 mol% 인 서로에 대한 비율로 혼합되며, 단량체의 총량을 기준으로 3-70 mol% 범위인 비율이 바람직하다. 본 발명에 따른 분리재 제조의 경우, 단량체는 통상적으로 지지체 재료에 과량으로 첨가된다. 침전된 중합체 재료 1 ℓ 당 0.05 내지 100 mol 의 총 단량체가 사용되고, 바람직하게는 0.05-25 mol/ℓ 가 사용된다.
하전 및 비하전된 아크릴아미드가 혼합물로서 그라프트-중합될 수 있고, 사용된 단량체 농도에 상응하는 도입 비율이 수득된다는 것이 밝혀졌다 (표 1).
하전된 단량체 및 비하전된 단량체로부터 본 발명에 따라 제조된 그라프트 중합체는, 카르복실레이트 또는 술포네이트기 또는 양성자화 2 차 또는 3 차 아미노기 또는 4 차 암모늄기의 형태의, 이에 존재하는 각각의 이온화기의 pH 값에 상응하고 수성 환경의 현재 pH 에 따라 가변적인 수성 매질 중 더 또는 덜 강하게 이온화된 형태이다. 본 발명에 따른 재료는 따라서 이온 교환 크로마토그래피에 사용하기에 특히 적합하다. 비하전된 단량체 단위는 그라프트 중합체에서의 두 전하 사이의 평균 분리가 1 개의 하전된 단량체 단위만으로 이루어진 그라프트 중합체에서보다 더 크다는 것을 명백하게 한다. 그라프트 중합체는 표면에 모두 연결되므로, 이는 중성기의 존재로 인해 하나의 하전된 단량체 단위로만 이루어지는 히드로겔보다 상대적으로 더 낮은 전하 밀도를 갖는 히드로겔을 그 위에 형성한다.
양이온 교환체의 평가의 경우, 먼저 리소자임 및 다클론 인간 IgG (Gammanorm) 의 정적 결합 능력이 pH 5 - 7의 범위에서 조사된다. 결합 용량은 염 농도를 약 1 M NaCl 로 증가시킴으로써 단백질의 용리 후에 측정된다.
동적 결합 용량은 컬럼에 패킹된 양이온 교환체가 2 또는 8 분의 접촉 시간 하에서 단백질로 충전되도록, 다양한 흐름 속도 하에서 측정된다. 이를 위해, pH 5.0 에서 25 mM 나트륨 포스페이트 및 25 mM 나트륨 아세테이트를 포함하는 완충액에 용해된 IgG (Gammanorm) 로 10% 의 파과 (breakthrough) 까지 충전을 수행한다. 용리는 결합 완충액의 pH 에서 염 농도를 약 1 M NaCl 까지 증가시킴으로써 수행된다. 결합 용량은 용리액 내의 단백질 농도 (280 nM) 로부터 계산된다. 상응하는 실험의 결과를 하기 표 2 에 나타냈다.
놀랍게도, 비록 덜 하전된 단량체가 그라프트 중합에 제공된다고 할지라도 필적할만한 정적 결합 용량이 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, AMPS 및 디메틸아크릴아미드를 포함하는 08PP063 으로 지칭되는 생성물은, 비록 07PP221 에 대해 사용된 AMPS 의 양의 66% 만이 08PP063 에 대해 사용된다고 할지라도, 심지어 생성물 07PP221 에 비해 리소자임 및 IgG 에 대하여 더 높은 정적 결합 용량을 갖는다.
놀랍게도, 그라프트 공중합체를 포함하는 본 발명에 따른 분리재가 비교 겔보다 상당히 더 높은 동적 결합 용량을 달성한다는 것이 또한 밝혀졌다. 이는 특히 IgG 와 같은 큰 분자의 결합에 대해, 및 충전 동안의 높은 유속 (짧은 접촉 시간) 에서 적용된다. 예를 들어, AMPS 및 메톡시에틸아크릴아미드를 포함하는 그라프트 공중합체 07SW261 (하전물 대 중성 단량체 단위의 몰비는 약 1:0.9 임 (실시예 참조)) 은 pH 5.0 및 2 분의 접촉 시간에서 시판되는 Fractogel
Figure 112011013900324-pct00008
EMD SO3M 보다 30% 더 높은 결합 용량을 달성하였다.
지지체 표면 상부의 공간에서의 음전하의 신규한 배열은 특히, 상대적으로 크게 하전된 분자를 히드로겔 내로 더 쉽게 확산시킬 수 있게 한다. 따라서, IgG 는 pH 5.0 에서 음전하보다 더 양성을 갖는데 (pH < pI), 이때의 결합이 조사된다. 가능하게는, 음전하와 그라프트 중합체의 더 적은 반발 상호 작용이 IgG 에서 발생한다. 따라서, 다공성 지지체 상의 본 발명에 따른 그라프트는 큰 분자가 지지체의 외부 표면으로부터 내부 기공 시스템으로 더 빨리 수송되고, 그럼에도 불구하고 이온 교환 크로마토그래피에 충분히 강하게 결합될 수 있게 한다.
본 발명에 따른 재료는 분리 효과제 (separation effector) 와 함께 제공된 중합체로서 또한 기재될 수 있다. 이는 매트릭스 밖으로의 분리를 목적으로 하는 하나 이상의 표적 성분의 선택적, 일부 선택적 또는 비선택적 결합 또는 흡착, 또는 매트릭스 밖으로의 2 차 성분의 분리를 목적으로 하는 하나 이상의 2 차 성분의 선택적, 일부 선택적 또는 비선택적 결합 또는 흡착뿐만 아니라, 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 단지 분자 크기를 기초로 하는 1 개 이상의 성분의 결합 또는 흡착이 없는 물질 혼합물의 분리, 천연 공급원으로부터의 생체중합체의 단리, 농후 및/또는 소모, 재조합 요소로부터의 생체중합체의 단리, 농후 및/또는 소모, 불멸 세포주 및 이의 배양 상청액으로부터의 생체중합체의 단리, 농후 및/또는 소모, B-세포주 및 이의 유도체, 림프 세포 및 하이브리도마 세포주 및 이의 배양 상청액으로부터의 생체중합체의 단리, 농후 및/또는 소모, 단백질 및 펩티드의 단리, 농후 및/또는 소모, 효소의 단리, 농후 및/또는 소모, 단일클론 및 다클론 항체 및 천연적 발생 또는 재조합 항체 단편의 단리, 농후 및/또는 소모, 포스포릴화 펩티드/단백질 및 핵산의 단리, 농후 및/또는 소모, 식품 첨가제의 단리, 농후 및/또는 소모, 단- 및 다당류의 단리, 농후 및/또는 소모, 글리코실화 단백질의 단리, 농후 및/또는 소모, 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 의 단리, 농후 및/또는 소모, 플라스미드 DNA 의 단리, 농후 및/또는 소모, RNA 의 단리, 농후 및/또는 소모, 바이러스의 단리, 농후 및/또는 소모, 숙주 세포 단백질의 단리, 농후 및/또는 소모, 올리고- 및 폴리뉴클레오티드의 단리, 농후 및/또는 소모, 리포솜의 단리, 농후 및/또는 소모, 혈액 및 우유로부터의 생성물의 단리, 농후 및/또는 소모, 저분자량 약제 활성 화합물 (API: 활성 약학 성분) 의 단리, 농후 및/또는 소모, API 약제 담체 (예를 들어 API/리포솜 부가 생성물 또는 API/나노입자 부가 생성물) 로부터의 API 의 분리, 거울상 이성질체의 단리, 농후 및/또는 소모에도 사용될 수 있다.
생체중합체는 우세하지만 비배타적으로 액체 공급원으로부터 기원하거나, 예를 들어 혈액, 혈청, 타액 또는 소변과 같은 체액, 장기 추출물, 우유, 유장, 식물 추출물, 세포 추출물, 세포 배양물, 발효 배양액, 동물 추출물과 같은 것 내에 존재한다. 항체는 예를 들어 설치류의 포유류 세포 또는 하이브리도마 세포로부터 기원할 수 있다.
표적 분자는 샘플로부터 하나 이상의 기타 물질로부터 분리되며, 이때 표적 분자를 포함하는 샘플은 본 발명에 따른 재료와 접촉되는 액체에 용해된다. 접촉 시간은 통상적으로 30 초 내지 24 시간의 범위이다. 본 발명에 따른 분리재를 함유하는 크로마토그래피 컬럼을 통해 액체를 통과시킴으로써 액체 크로마토그래피의 원리에 따라 작업하는 것이 유리하다. 액체는 단지 이의 중력을 통해서 컬럼을 빠져나가거나 펌프에 의해 펌핑될 수 있다. 대안적인 방법은 표적 분자 또는 생체중합체가 분리재에 결합할 수 있는데에 필요한 만큼 교반 또는 진탕시킴으로써 분리재가 액체와 혼합되는 배치식 크로마토그래피이다. 예를 들어 분리재의 높은 밀도 및/또는 자기 코어로 인하여 원하는 분리에 적합하도록 선택되는 분리재를 포함하는 현탁액에, 분리될 액체를 도입함으로써 크로마토그래피 유동층의 원리에 따라 마찬가지로 작업할 수 있다.
표적 분자는 통상적으로 본 발명에 따른 재료에 결합한다. 분리재는 그 후에 바람직하게는 표적 분자가 분리재와 접촉되는 액체와 동일한 이온 강도 및 동일한 pH 를 갖는 세정 완충액으로 세척될 수 있다. 세정 완충액은 분리재에 결합하지 않은 모든 물질을 제거한다. 기타 적합한 완충액으로의 추가적인 세척 단계가 표적 분자의 탈착 없이 뒤따를 수 있다. 결합된 표적 분자의 탈착은 용리액의 이온 강도를 증가시키거나 용리액의 pH 를 변화시킴으로써 수행된다. 표적 분자는 이에 따라 용리액 중 정제 및 농축된 형태로 수득될 수 있다. 표적 분자는 통상적으로 탈착 후에 70% 내지 99%, 바람직하게는 85% 내지 99%, 특히 바람직하게는 90% 내지 99% 의 순도를 갖는다.
그러나, 표적 분자의 경우에는 액체에 남지만, 기타 수반하는 물질의 경우에는 분리재에 결합시킬 수 있다. 표적 분자는 이후 관통-흐름으로 컬럼 용리액을 회수함으로써 직접적으로 수득된다. 특정 생체중합체를 분리재에 결합시키기 위해서 어떻게 조건, 특히 pH 및/또는 전도도를 적합화시켜야 하는지, 또는 정제 과제를 위해서 표적 분자를 결합시키지 않는 것이 유리한지 아닌지는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 분리재는 생체중합체에 대한 반응 종결 과정의 제 1 크로마토그래피 정제 단계 (포획 단계) 에서 사용될 수 있다. 포획 단계가 기타 분리재와 함게 수행되는 경우, 이는 잔류 불순물을 제거하기 위해서 포획 단계를 따르는 크로마토그래피 정제 단계 중 하나에 사용될 수 있다.
본 설명은 당업자가 본 발명을 포괄적으로 적용할 수 있게 한다. 따라서, 추가적인 설명 없이도 당업자가 넓은 범주에서 상기 설명을 이용할 수 있을 것임이 가정된다.
무엇이든 불분명한 경우, 언급된 발행물 및 특허 문헌이 참고되어야 한다는 것은 당연한 것이다. 따라서, 이러한 문헌은 본 명세서의 개시 내용의 일부로서 고려된다.
더 나은 이해를 위해서 및 본 발명을 설명하기 위해서, 본 발명의 보호 범주 내에 있는 실시예가 아래에 주어진다. 이러한 실시예는 또한 가능한 변형을 설명하는 역할을 한다.
또한, 주어진 실시예 및 또한 상세한 설명의 나머지 모두에서, 조성물에 존재하는 성분의 양은 전체로서의 조성물을 기준으로 항상 100 중량% 또는 mol% 이하로만 첨가되고, 나타낸 백분율 범위로부터 더 높은 값이 발생할 수 있는 경우일지라도 이를 초과할 수 없다는 것은 당업자에게는 당연한 것이다. 달리 나타내지 않는 한, % 데이터는 따라서 중량% 또는 mol% 이지만, 부피 데이터에 나타낸 비율은 예외이다.
실시예 및 상세한 설명 뿐만 아니라 청구항에 주어진 온도는 항상 ℃ 이다.
실시예
2- 아크릴아미도 -2- 메틸프로판술폰산 및 2- 메톡시에틸아크릴아미드를 포함하는 그라프트 공중합체의 제조 방법 (배치 07 SW261 )
패들 (paddle) 교반기를 갖춘 유리 반응 장치에서 30 ㎖ 의 탈이온수 중의 4.2 g 의 메톡시에틸아민을 0-5 ℃ 로 냉각시켰다. 0-5 ℃ 의 내부 온도에서 강한 교반과 함께 6.6 g 의 32 % 수산화나트륨 용액을 적하 깔대기를 통해 계량하고, 4.8 g 의 아크릴로일 클로라이드를 제 2 적하 깔대기로부터 계량하였다. 첨가가 완료되었을 때, 용액을 5 ℃ 에서 추가로 30 분 동안 교반시키고, 65% 질산을 사용하여 pH 6 으로 조정하고, 탈이온수로 180 ㎖ 의 총 부피로 만들었다.
이러한 용액, 78 g 의 여과-습윤성 Fractogel TSK HW65 (M) (희석 미네랄산 및 탈이온수로 세척함) 및 30 ㎖ 의 탈이온수 중의 16.4 g 의 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산 (AMPS) 및 9.9 g 의 32% 수산화나트륨 용액의 용액으로부터 현탁액을 제조하였다. 32% 수산화나트륨 용액 및 65% 질산을 사용하여 pH 를 6 으로 조정하였다.
40 ㎖ 의 탈이온수 중 1.6 g 의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트 및 0.4 g 의 65% 질산을 포함하는 개시제 용액을 압력 균일화 하에 적하 깔대기에 초기에 도입하였다. 탈기를 반복 (3x) 하고 질소로 탈압착하여 전체 장치를 불활성 상태로 만들었다. 현탁액을 그 후에 장치에서 40 ℃ 로 가온하였다.
40 ℃ 의 내부 온도에서 교반하면서 개시제 용액을 불활성화 현탁액에 첨가하였다. 질소의 연기류 (gentle stream) 하에서, 현탁액을 18 시간 동안 40 ℃ 에서 교반시켰다. 반응 용액을 이후 유리 여과 프릿 (filter frit) (P2) 을 통해 흡입 하에 여과 제거하고, 각 경우에서 하기와 같이 100 ㎖ 의 세정 용액으로 프릿 상에서 겔을 세척하였다:
3x 탈이온수
8x 1M 황산, 0.2M 아스코르브산
3x 탈이온수
2x 1M NaOH
3x 탈이온수
겔을 200 ㎖ 의 탈이온수에 현탁시키고, 25% 염산을 사용하여 pH 7 로 조정하였다. 실온에서 20% 에탄올 중에 저장을 수행하였다.
2- 아크릴아미도 -2- 메틸프로판 -술폰산 및 디메틸아크릴아미드를 포함하는 그 라프트 공중합체의 제조 (배치 07 PP221 )
패들 교반기를 갖춘 유리 반응 장치에서 78 g 의 여과-습윤성 Fractogel TSK HW65 (M) (희석 미네랄산 및 탈이온수로 세척함) 및 97 ㎖ 의 탈이온수 중의 5.1 g 의 디메틸아크릴아미드, 16.7 g 의 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산 및 10.4 g 의 32% 수산화나트륨 용액의 용액으로부터 현탁액을 제조하였다. 32% 수산화나트륨 용액 및 65% 질산을 사용하여 pH 를 6 으로 조절하고, 혼합물을 탈이온수로 200 ㎖ 의 총 부피로 만들었다.
15 ㎖ 의 탈이온수 중에 1.6 g 의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트 및 0.4 g 의 65% 질산을 포함하는 개시제 용액을 압력 균일화 하에 적하 깔대기에 초기에 도입하였다. 탈기를 반복 (3x) 하고 질소로 탈압착하여 전체 장치를 불활성 상태로 만들었다. 현탁액을 그 후에 장치 내에서 40 ℃ 로 가온하였다.
40 ℃ 의 내부 온도에서 교반하면서 개시제 용액을 불활성화 현탁액에 첨가하였다. 질소의 연기류 하에서, 현탁액을 22 시간 동안 40 ℃ 에서 교반시켰다. 반응 용액을 이후 유리 여과 프릿 (P2) 을 통해 흡입 하에 여과 제거하고, 각 경우에서 하기와 같이 100 ㎖ 의 세정 용액으로 프릿 상에서 겔을 세척하였다:
7x 탈이온수
10x 1M 황산, 0.2M 아스코르브산
5x 탈이온수
2x 1M 수산화나트륨 용액
3x 탈이온수
1x 50mM 포스페이트 완충액 pH 7
2x 탈이온수
실온에서 20% 에탄올 중에 생성물을 저장하였다.
2- 아크릴아미도 -2- 메틸프로판술폰산 및 디메틸아크릴아미드를 포함하는 그라 프트 공중합체의 제조 (배치 08 PP063 )
패들 교반기를 갖춘 유리 반응 장치에서 100 g 의 여과-습윤성 Fractogel TSK HW65 (S) (희석 미네랄산 및 탈이온수로 세척함) 및 60 ㎖ 의 탈이온수 중의 8.0 g 의 디메틸아크릴아미드, 11.1 g 의 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산 및 6.9 g 의 32% 수산화나트륨 용액의 용액으로부터 현탁액을 제조하였다. 32% 수산화나트륨 용액 및 65% 질산을 사용하여 pH 를 6.2 로 조정하고, 혼합물을 탈이온수로 190 ㎖ 의 총 부피로 만들었다.
25 ㎖ 의 탈이온수 중에 1.6 g 의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트 및 0.4 g 의 65% 질산을 포함하는 개시제 용액을 압력 균일화 하에 적하 깔대기에 초기에 도입하였다. 탈기를 반복 (3x) 하고 질소로 탈압착하여 전체 장치를 불활성 상태로 만들었다. 현탁액을 그 후에 장치 내에서 40 ℃ 로 가온하였다.
40 ℃ 의 내부 온도에서 교반하면서 개시제 용액을 불활성화 현탁액에 첨가하였다. 질소의 연기류 하에서, 현탁액을 22 시간 동안 40 ℃ 에서 교반시켰다. 반응 용액을 이후 유리 여과 프릿 (P2) 을 통해 흡입 하에 여과 제거하고, 각 경우에서 하기와 같이 100 ㎖ 의 세정 용액으로 프릿 상에서 겔을 세척하였다:
7x 탈이온수
10x 1M 황산, 0.2M 아스코르브산
5x 탈이온수
2x 1M 수산화나트륨 용액
3x 탈이온수
1x 50mM 포스페이트 완충액 pH 7.0
2x 탈이온수
2x 20% 에탄올/150mM NaCl
실온에서 20% 에탄올 중에 생성물을 저장하였다.
그라프트 중합체의 화학적 조성의 측정
관능기는 산 가수분해에 의해서, 폴리아크릴아미드 사슬인 그라프트 중합체로 절단될 수 있다. 관능기는 아민으로서 유리된다. 1 차 아민은 오르토-프탈알데히드 및 메르캅토에탄올과의 유도화 후에 HPLC 에 의하여 정량 분석될 수 있다. 보정을 위해, 시판 아민을 사용하거나 이후 그라프트 중합체와 같이 가수분해되어야만 하는 합성시 사용되는 단량체를 사용하였다.
10 ㎎ 의 건조 겔에 1000 ㎕ 의 5 M 염산을 첨가하고, 혼합물을 초음파조에서 처리한 후, 1 ㎖ 압력 용기에서 10 시간 동안 125 ℃ 에서 가열하였다.
실온으로 냉각시킨 후, 압력 용기를 열었다. 약 200 ㎕ 의 상청액을 피펫으로 옮겨내고, 5 분 동안 원심분리 (8000 rpm) 하였다.
40 ㎕ 의 맑은 상청액을 176 ㎕ 의 1 M 수산화나트륨 용액을 사용하여 중성화시키고, 325 ㎕ 의 0.5 M 보레이트 완충액, pH 9.5 및 119 ㎕ 의 아세토니트릴/물 8:2 (V/V) 을 첨가하고 혼합하였다. 100 ㎎ 의 오르토-프탈알데히드로부터 제조된 100 ㎕ 의 OPA 시약, 9 ㎖ 의 메탄올, 1 ㎖ 의 0.5 M 보레이트 완충액 pH 9.5 및 100 ㎕ 의 메르캅토에탄올을 첨가하고, 혼합물을 강하게 진탕시켰다. 2 분의 반응 시간 후에, 샘플을 HPLC 로 분석하였다 (UV 검출 330 nm)
사용된 단량체의 양과 비교한 07SW261 의 그라프트 중합체의 분석 (AMPS 및 에탄올아민을 사용한 보정)
단위 여과-습윤성 겔 1 g 당 단량체의 사용 건조 그라프트 겔 1 g 당 단량체 단위
AMPS 1.0 mmol/g 0.70 μmol/g
메톡시에틸아크릴아미드 0.67 mmol/g* 0.63 μmol/g
*아크릴로일 클로라이드의 사용
정적 IgG 결합 용량의 측정 ( 마이크로타이터 플레이트 형식)
모든 겔 현탁액을 수중 20% 에탄올을 사용하여 50% 의 겔 침전 부피로 조정하였다. 여과 플레이트를 결합 완충액 및 각 경우에 20 ㎕ 의 균질화 겔 현탁액으로 충전시켰다. 여과 플레이트를 이후 진공 스테이션 (vaccum station) 에서 흡입시켰다.
딥-웰 (deep-well) 플레이트를 결합 완충액으로 충전하고, 농도가 1 ㎖ 당 9.3 ㎎ 의 pIgG 또는 1 ㎖ 당 12.5 ㎎ 의 리소자임이 되도록 단백질 저장 용액 (수중 다클론 인간 IgG Gammanorm, Octapharma 또는 리소자임) 을 첨가하고 혼합하였다.
200 ㎕ 의 단백질 용액을 여과 플레이트 내의 겔에 첨가하고 진탕기에서 15 분 동안 진탕시켰다. 여과 플레이트를 진공 스테이션에서 흡입시켰다. 100 ㎕ 의 결합 완충액으로 매번 세척하고 흡입을 2 회 수행하였다. 각 경우에서 200 ㎕ 의 용리 완충액 (20 mM 포스페이트, 1 M 염화나트륨, pH 7) 을 이후 여과 플레이트에 첨가하고, 5 분 동안 진탕을 수행하였다. 상청액을 진공 스테이션에서 UV 플레이트로 흡입시키고, 플레이트를 광도계로 280 nm 에서 측정하였다.
겔 침전 부피의 1 ㎖ 당 용리액으로부터 계산된 IgG 결합 용량 (IgG SBC) 을 표 2 에 열거하였다. 사용된 결합 완충액은 PIgG 에 대해서는 25 mM 나트륨 포스페이트, 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 5 이고, 리소자임에 대해서는 25 mM 나트륨 포스페이트, 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 7 이었다.
동적 IgG 결합 능력의 측정
1 ㎖ 의 용량을 갖는 컬럼을 패킹하였다 (19 mm 의 층 깊이 및 20% 압착을 갖는 Proteo-Cart 컬럼). 컬럼을 10% 파과이도록 완충액 A 중에 1 g/ℓ 의 함량을 갖는 IgG 용액 (다클론 인간 IgG Gammanorm, Octapharma 로부터 제조됨) 으로 충전하였다. 컬럼에서의 접촉 시간이 2 또는 8 분이 되도록 유속을 선택하였다. 완충액 A 로 헹군 후, 컬럼을 완충액 B 로 용리시켰다.
완충액 A: 25 mM 나트륨 포스페이트, 25 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0
완충액 B: 25 mM 나트륨 포스페이트, 25 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 5.0
다클론 인간 IgG 의 동적 결합 용량 (DBC) 을 용리액 내의 광도계적으로 (280 nm) 측정된 양의 단백질로부터 계산하고, 패킹된 겔 1 ㎖ 당 나타냈다 (표 2).
침전 또는 패킹된 겔 1 ㎖ 당 단백질의 ㎎ 으로의 pH 5.0 에서의 다클론 인간 IgG (Gammanorm) 의 고정 및 동적 결합 능력 (SBC 및 DBC)
배치 리소자임 SBC IgG SBC IgG DBC1 IgG DBC2
Fractogel
EMD SO3 M		 104 124 70 131
07SW261 110 121 91 139
07PP221 86 126 82 138
08PP063 119 130 157 164
1접촉 시간 2 분
2접촉 시간 8 분

Claims (7)

  1. 하기를 특징으로 하는, 공중합체가 공유 결합되는 표면에 대해 지지체 재료로서 가교된 합성 중합체 또는 가교된 아가로스 또는 가교된 덱스트란,
    또는 공중합체가 공유 결합되는 표면에 대해 지지체 재료로서 유기 코팅을 갖는 무기 지지체를 포함하는 복합재를 포함하는 이온 교환 크로마토그래피용 분리재:
    a) 상기 지지체 재료는 지방족 히드록실기를 함유하고,
    b) 공중합체는 지지체에 공유 결합되고,
    c) 공중합체는 2 개 이상의 상이한 단량체 단위를 함유하고,
    d) 단량체 단위는 선형 방식으로 연결되고,
    e) 공중합체는 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산, 2-아크릴아미도에탄술폰산, 카르복시메틸아크릴아미드; 카르복시에틸아크릴아미드, 카르복시프로필아크릴아미드, 카르복시메틸메타크릴아미드, 카르복시에틸메타크릴아미드, 카르복시프로필메타크릴아미드, 아크릴산 및 메타크릴산의 군으로부터 선택되는, 음전하를 갖는 하나 이상의 단량체 단위를 갖거나,
    또는 2-(아크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드, 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드, 2-(디에틸아미노에틸)아크릴아미드, 2-(디에틸아미노에틸)메타크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)아크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)메타크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드, 2-(메타크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드 및 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드의 군으로부터 선택되는 양전하를 갖는 하나 이상의 단량체 단위를 갖고,
    f) 공중합체는 디메틸아크릴아미드, 에톡시에틸아크릴아미드, 메톡시에틸아크릴아미드 및 메톡시프로필아크릴아미드의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비하전된 단량체 단위를 갖고,
    g) 전하를 갖는 1 개 초과의 단량체가 존재하는 경우, 동일한 전하의 단량체 단위만이 결합되고,
    h) 전하를 갖지 않는 단량체 단위에 대한 전하를 갖는 단량체 단위의 비율은 1:99 내지 90:10 의 범위임.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 다공성 입자 또는 기타 몰딩의 히드록실-함유 표면 상의 그라프트 공중합체 제조 방법으로서, 상기 그라프트 공중합체가 2 개 이상의 반복 단량체 단위로부터 구축되며, 이들 단위 중 1 개 이상이 전하를 수반하고 이들 단위 중 1 개 이상이 화학 반응에 의해 히드록실-함유 표면에 결합되는 모노- 또는 디-알킬- 및/또는 알콕시에틸- 또는 알콕시프로필-치환된 아미드기를 수반하는 비하전된 기를 수반하여, 이온성 상호작용에 의해 하전된 물질을 결합시킬 수 있는 재료를 수득하는 것을 특징으로 하며,
    상기 전하를 수반하는 단량체 단위는 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산, 2-아크릴아미도에탄술폰산, 카르복시메틸아크릴아미드; 카르복시에틸아크릴아미드, 카르복시프로필아크릴아미드, 카르복시메틸메타크릴아미드, 카르복시에틸메타크릴아미드, 카르복시프로필메타크릴아미드, 아크릴산 및 메타크릴산의 군으로부터 선택되는, 음전하를 갖는 단량체 단위,
    또는 2-(아크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드, 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드, 2-(디에틸아미노에틸)아크릴아미드, 2-(디에틸아미노에틸)메타크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)아크릴아미드, 2-(디메틸아미노에틸)메타크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드, 3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드, 2-(메타크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드 및 3-(아크릴로일아미노프로필)트리메틸암모늄 클로라이드의 군으로부터 선택되는 양전하를 갖는 단량체 단위이고,
    상기 비하전된 기를 수반하는 단량체 단위는 디메틸아크릴아미드, 에톡시에틸아크릴아미드, 메톡시에틸아크릴아미드 및 메톡시프로필아크릴아미드의 군으로부터 선택되는 비하전된 단량체 단위인, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 하전된 물질이 생체중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
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