CN103055773A - 一种大孔琼脂糖微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大孔琼脂糖微球的制备方法及产品，其特征是向琼脂糖水溶液中添加高浓度的表面活性剂使水相中形成大量胶团，然后将水相分散到油相中，利用水相中表面活性剂胶团能够吸油溶胀的特点，制备大孔琼脂糖微球。所得产品既保留了琼脂糖凝胶原有的网状凝胶孔，同时又具备数百纳米级的大孔（100-500nm）。本发明提供的大孔琼脂糖微球制备工艺简单，产品孔径可控。所得大孔琼脂糖微球在保证原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，孔径大大增加，是一种理想的液相色谱固定相介质和优良的固定化酶载体，特别是用作液相色谱介质时，可以在较高流速下工作，实现生物分子特别是生物大分子的快速、高效分离。

Description

一种大孔琼脂糖微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及琼脂糖凝胶介质的制备技术，具体地，本发明涉及一种大孔琼脂糖微球及其制备方法。

背景技术

近年来，随着生物技术的迅猛发展，上游细胞培养和表达技术不断成熟，生产规模持续扩大，这给下游分离纯化带来了巨大的压力，要求下游具有更大的处理量和更高的生产效率。层析分离介质是下游分离纯化的核心，其动力学性能取决于内部的孔结构。

琼脂糖微球因其良好的生物相容性和开放性的网络结构，成为生化分离领域中应用最为广泛的一种液相色谱固定相基质。但是，琼脂糖微球在应用上也存在局限性，主要体现在其内部只存在单一类型的扩散孔，孔径在数纳米到几十纳米左右，当分离蛋白质等生物大分子时，孔内停滞流动相中的传质阻力很大，严重制约了其分离的效率。尤其在大规模生产需要较高的流速时，大分子溶质来不及扩散进入琼脂糖微球内部，仅与介质表面的基团发生交换或吸附，导致琼脂糖微球介质的分辨率大大降低，无法满足快速分离的要求。因此，开发大孔琼脂糖凝胶微球，提高分离介质的通透性，强化介质内的传质，增加有效吸附量，对实现生物大分子的快速分离具有重要意义。

目前，制备亲水性大孔介质的方法比较少。US5723601公开了一种采用复乳法制备超大孔琼脂糖色谱介质的专利技术。这种新型介质具有双孔结构，一种是扩散用的凝胶孔（孔径2-50nm），一种是流通用的超大孔（孔径0.5-1000μm）。这些超大孔内形成的对流流动使得溶质分子的传质行为大大提高，有利于实现生物大分子的快速分离。但是，采用复乳法致孔孔径难以控制，部分孔道直径甚至高达几百微米。这严重影响了琼脂糖凝胶骨架的机械强度，在高流速下介质很容易发生变形和破碎，难以满足实际分离纯化过程中承受压力的需要。此外，由于复乳属于热不稳定体系，很容易产生破乳的现象，因此，对制备工艺的要求较高。

孙彦等报道了以碳酸钙为固体致孔剂，采用油水两相法制备大孔琼脂糖凝胶介质的方法（CN1472002A）。通过调节碳酸钙颗粒的粒度和用量，可以实现对介质孔径和孔隙率的控制，使介质能够在较高的流速下操作。但是，由于上述专利采用盐酸反复浸泡的方式将致孔剂溶解掉，反应过程中产生大量气泡，这会导致介质孔道内产生瞬间高压，容易破坏凝胶骨架结构，影响了大孔琼脂糖凝胶介质的球形和使用寿命。为了解决这一问题，徐伟等（CN1868578A）以金属氧化物为致孔剂也成功制备出了大孔琼脂糖凝胶介质，该法有效避免了去除致孔剂过程中气泡的生成，产品碎球率大大降低，进一步改善了大孔凝胶介质的机械强度。尽管如此，固体颗粒致孔法普遍存在过程繁琐，制备得到的介质中闭合孔较多，孔结构的贯穿性差等问题。而且在制备过程中引入大量无机颗粒致孔剂，微球后处理时难以完全除去，这也给后期应用带来许多问题。

因此，开发一种制备方法简单，并具有良好的机械强度的大孔琼脂糖是所属领域的技术难题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种大孔琼脂糖微球，所述微球既保留了琼脂糖凝胶原有的网状凝胶孔，同时又具备数百纳米级的大孔。

所述大孔琼脂糖微球具有凝胶孔和大孔，所述凝胶孔的孔径为1-80nm，大孔的孔径为100-500nm。

所述凝胶孔的孔径取决于琼脂糖的浓度，凝胶孔的孔径随琼脂糖浓度的增加而减少。

本发明的目的之一还在于提供一种所述大孔琼脂糖微球的用途。所述大孔琼脂糖微球在保证原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，孔径大大增加，并且具有优异的机械强度，是一种理想的液相色谱固定相介质和优良的固定化酶载体，特别是用作液相色谱介质时，可以在较高流速（例如高达1000cm/h的流速）下工作，实现生物分子特别是生物大分子的快速、高效分离。

为了解决现有致孔方法普遍存在的制备工艺复杂、致孔剂残留等问题，本发明的目的之一还在于提供一种所述大孔琼脂糖微球的制备方法。

所述大孔琼脂糖微球的制备方法包括：将含有亲水性表面活性剂和琼脂糖的水相和与水互不相溶的油相混合乳化，固化，得到大孔琼脂糖微球。

优选地，所述油相含有亲油性表面活性剂。

优选地，所述大孔琼脂糖微球的制备方法包括以下步骤：

（1）将亲水性表面活性剂溶于琼脂糖溶液中，作为水相；以含有亲油性表面活性剂且与水互不相溶的溶液作为油相；

（2）将水相与油相混合乳化，反应；

（3）降温，固化，除杂，得到大孔琼脂糖微球。

本发明所述大孔琼脂糖微球的制备方法为胶团溶胀致孔法，其示意图见附图1。

优选地，所述水相的制备包括：向琼脂糖水溶液中加入亲水性表面活性剂，搅拌形成均匀的乳浊液，作为水相；优选地，所述琼脂糖水溶液中琼脂糖的浓度为0.1～20wt%，例如：0.11wt%、0.15wt%、0.2wt%、0.5wt%、0.9wt%、1.1wt%、2wt%、2wt%、9wt%、11wt%、15wt%、18wt%、19wt%等，特别优选为1~10wt%；优选地，所述搅拌速度为50~500rpm，优选为100~250rpm。

优选地，向琼脂糖溶液中加入所述亲水性表面活性剂时体系温度为40~100℃，进一步优选为50~100℃，特别优选为65~90℃。

优选地，所述琼脂糖的平均分子量为1kDa~1500kDa，进一步优选为5kDa~1200kDa，特别优选为10kDa~1000kDa。

优选地，所述琼脂糖的熔点为120℃以下，进一步优选为60~110℃，特别优选为65~100℃。

优选地，所述亲水性表面活性剂的HLB为10~40，特别优选为10~25。

优选地，所述亲水性表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60、Tween85、PEG400、Triton X-100、聚乙二醇、油酸钠或十二烷基硫酸钠中的1种或至少2种的组合，所述组合典型但非限制性的实例包括：Tween20和Tween40的组合，Tween60和Tween85的组合，PEG400、Triton X-100和聚乙二醇的组合，Tween20、PEG400和Triton X-100的组合，Triton X-100、聚乙二醇、油酸钠和十二烷基硫酸钠的组合，Tween40、Tween60、PEG400、Triton X-100、聚乙二醇和油酸钠的组合等。所述Tween20、Tween40、Tween60、Tween85、PEG400和Triton X-100都是所属领域已知的亲水性表面活性剂，所属领域技术人员可通过市售得到，也可根据现有技术/新技术制备得到。

当所述亲水性表面活性剂在琼脂糖溶液中的浓度大于临界胶束浓度时才能形成胶束，进一步聚集成胶团，所述胶团的表面呈亲水性，内核呈亲油性。但是，如果表面活性剂浓度过高，反而会引起表面活性剂相和琼脂糖溶液发生分层，不利于胶团的形成。优选地，所述亲水性表面活性剂在水相中的体积浓度为5~40%(v/v)，特别优选为10~30%(v/v)。

低黏度的油相更容易被表面活性剂胶团吸收，进一步溶胀形成大孔。优选地，所述油相的黏度为0.1~30.0mPa·S，特别优选为1.0~10.0mPa·S。

优选地，所述油相的溶剂为液体石蜡、石油醚、环己烷、甲苯或四氯化碳中的1种或至少2种的组合，特别优选为液体石蜡和石油醚的混合物或环己烷和四氯化碳的混合物。

优选地，所述亲油性表面活性剂为Span80、PO-500、Arlacel83或PO-310中的1种或至少2种的组合，特别优选为Span80或PO-500。所述Span80、PO-500、Arlacel83和PO-310都是所属领域已知的亲油性表面活性剂，所属领域技术人员可通过市售得到，也可根据现有技术/新技术制备得到。

优选地，所述亲油性表面活性剂在油相中的质量浓度为0.5~15wt%，例如：0.6wt%、0.7wt%、0.9wt%、1.1wt%、1.2wt%、2wt%、3wt%、wt%、6wt%、8wt%、9wt%、11wt%、12wt%、13wt%、14wt%等，进一步优选为1~10wt%，特别优选为1~5wt%。

优选地，所述水相与油相混合乳化为将水相加入油相中混合乳化。

优选地，所述混合乳化的方法为机械搅拌法、喷射法、均质乳化法、超声乳化法、微流控乳化法或微孔膜乳化法，特别优选为机械搅拌法；优选地，所述机械搅拌转速为100~1500rpm，特别优选为500~900rpm。

优选地，所述混合乳化温度为40~100℃，进一步优选为45~85℃，特别优选为55~70℃。

优选地，所述油相和水相的体积比为2:1~30:1(v/v)，例如：2.1:1(v/v)、2.2:1(v/v)、2.5:1(v/v)、2.9:1(v/v)、3.1:1(v/v)、3.5:1(v/v)、4:1(v/v)、5:1(v/v)、9:1(v/v)、11:1(v/v)、15:1(v/v)、19:1(v/v)、21:1(v/v)、25:1(v/v)、28:1(v/v)、29:1(v/v)等，进一步优选为2:1~20:1(v/v)，特别优选为3:1~10:1(v/v)。

优选地，步骤（2）所述反应在搅拌下进行。

优选地，步骤（2）所述反应在恒温水浴振荡器中进行；将所述乳液置于恒温水浴振荡器中，在乳化温度下继续反应一定时间，使琼脂糖液滴中的胶团充分吸油溶胀。在低速振荡条件下，琼脂糖液滴在体系中均匀分散，可以有效避免反应过程中发生沉降和聚集影响产品粒径；优选地，所述振荡速率为至少30rpm，例如：31rpm、32rpm、40rpm、49rpm、51rpm、60rpm、80rpm、100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、290rpm、299rpm、301rpm、10rpm、350rpm、390rpm、410rpm、450rpm、480rpm、490rpm、498rpm、499rpm等，进一步优选为50~500rpm，特别优选为100~300rpm。

优选地，步骤（2）所述反应时间为0-24h，特别优选为1-10h；所述反应时间为0时，表示水相和油相混合乳化后即进行步骤（3）。

步骤（2）所述反应可以为例如：所述乳液在转速50-500rpm条件下反应0-24h，优选反应转速100-300rpm，反应时间1-10h。

优选地，步骤（3）所述降温终点温度为30℃以下，例如：29℃、28℃、27℃、26℃、24℃、20℃、15℃、10℃、5℃、2℃或1℃等，进一步优选为28℃以下，特别优选为25℃以下。

优选地，步骤（3）所述除杂为洗涤；优选地，所述洗涤采用乙醇和/或去离子水；优选地，所述洗涤次数为至少2次，例如3次、4次、5次、6次、8次、10次、15次、20次等，特别优选至少3次。

所述固化过程中，胶团本身会与多糖骨架发生相分离，固化速率越慢越有助于大孔结构的生成。所述固化速率由所述降温速率控制。优选地，步骤（3）所述降温速率为8℃/min以下，例如：0.01℃/min、0.05℃/min、0.09℃/min、0.11℃/min、0.12℃/min、0.15℃/min、0.19℃/min、0.21℃/min、0.25℃/min、0.3℃/min、0.5℃/min、1℃/min、1.5℃/min、1.9℃/min、2.1℃/min、2.5℃/min、3℃/min、4℃/min、4.5℃/min、4.8℃/min、4.9℃/min、5.1℃/min、5.5℃/min、6℃/min、7℃/min、7.5℃/min、7.8℃/min、7.9℃/min等，进一步优选为0.1-5℃/min，特别优选为0.2-2℃/min。

优选地，将步骤（3）得到的大孔琼脂糖微球进行交联，进一步提高介质的机械强度；所述交联可以采用传统方法；优选地，所述交联包括：将大孔琼脂糖微球分散于水中，然后向体系中加入交联剂和氢氧化钠，进行交联反应；优选地，所述大孔琼脂糖微球的浓度为0.01~2g/mL，进一步优选为0.05~1.5g/mL，特别优选为0.1~1g/mL；优选地，所述交联反应温度为20~80℃，进一步优选为22~60℃，特别优选为25~50℃；优选地，所述交联反应在水浴中进行；优选地，所述交联反应时间为至少1小时，进一步优选为2~48小时，特别优选为3~24小时；优选地，所述交联剂在体系中的浓度为0~30%(v/v)，例如0.01%(v/v)、0.02%(v/v)、0.09%(v/v)、0.11%(v/v)、0.2%(v/v)、0.5%(v/v)、0.9%(v/v)、1.1%(v/v)、2%(v/v)、5%(v/v)、10%(v/v)、15%(v/v)、19%(v/v)、21%(v/v)、24%(v/v)、26%(v/v)、28%(v/v)、29%(v/v)等，进一步优选为0.1~25%(v/v)，特别优选为1~20%(v/v)；所述交联剂浓度为0时，表示不进行交联；优选地，[OH]^-浓度为0~5mol/L，进一步优选为0.1~3mol/L，特别优选为0.2~2mol/L；所述[OH]^-浓度为0时，表示不进行交联；优选地，所述交联剂为环氧氯丙烷、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、二溴丙醇或二乙烯砜中的1种或至少2种的组合。

采用本发明所述方法制备的大孔琼脂糖微球具有凝胶孔和大孔，所述凝胶孔的孔径为1-80nm，大孔的孔径为100-500nm；通过调节水相中表面活性剂的用量，可以方便地控制琼脂糖液滴的最大吸油量，进而实现对产品孔径的调控；所制备的大孔琼脂糖微球孔道直径合理，既能够实现生物大分子的快速分离，又能得到优异的机械强度，因而可以在较高流速（例如高达1000cm/h的流速）下使用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）本发明提供的胶团溶胀法制备大孔琼脂糖微球工艺简单，无需制备复乳体系，仅靠向水相中添加一定浓度的亲水性表面活性剂，即可得到大孔结构。该法有效避免了复乳法致孔过程中由于初乳稳定性差导致内相液滴融合，引起的孔径过大以及孔径不可控的问题。根据本发明提供的方法，高浓度的表面活性剂在水相中自发聚集形成胶团，其亲油性的内核可以吸收外油相进而溶胀形成数百纳米级的贯穿孔。通过调节水相中表面活性剂的用量，可以方便地控制琼脂糖液滴的最大吸油量，进而实现对产品孔径的调控。

（2）与油/水体系不同，本发明是利用亲水性胶团内核吸油溶胀的特点，在琼脂糖液滴内形成油水双连续结构，进而固化得到大孔通道。因此，油相的选择会对孔道形成产生一定的影响，要求油相的流动性好，黏度低，这样更容易被胶团吸收，有助于大孔网络结构的生成。

（3）本发明所述水相表面活性剂的浓度不宜太高，应控制在水相的45%(v/v)以下。这是因为琼脂糖体系本身具有较高的黏度，过高浓度的表面活性剂难以在其中均匀分散。尤其当琼脂糖浓度较高时，表面活性剂相和水相之间很容易发生分层。因此，为了在有限的表面活性剂浓度范围内最大限度的增加孔径，本发明提出在乳化成球后，将所得乳液置于恒温水浴振荡器中继续反应一定时间，这样可以使形成的胶团内核充分吸油溶胀，有助于孔道进一步扩大，形成大孔连续通道。

（4）本发明采用乙醇和水反复浸泡洗涤的方式将微球孔道内的致孔剂逐渐抽提出来，致孔剂残留低于5wt‰。洗球条件温和，不会破坏凝胶骨架结构。因此，本发明提供的大孔琼脂糖微球可以在较高流速（例如高达1000cm/h的流速）下使用。

（5）本发明提供的大孔琼脂糖微球在保证原有琼脂糖凝胶优良性能的基础上，增加了大孔结构，能够在介质内产生对流，提高介质的通透性，扩大了琼脂糖微球的应用范围。该产品在生物大分子的快速分离以及固定化酶等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为胶团溶胀致孔法制备大孔琼脂糖微球的示意图。

图2为实施例1制备的浓度2wt%的大孔琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片（×40000）。

图3为对比例1制备的浓度2wt%的琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片（×40000）。

图4为实施例1和对比例1制备的浓度2wt%的琼脂糖微球的压力-流速曲线对比图。

图5为实施例2制备的浓度4wt%的大孔琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片（×40000）。

图6为实施例2制备的浓度4wt%的大孔琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片（×2000）。

图7为实施例3制备的浓度6wt%的大孔琼脂糖的扫描电子显微镜照片（×40000）。

图8为实施例4制备的浓度8wt%的大孔琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片（×40000）。

图9为实施例5制备的浓度10wt%的大孔琼脂糖微球的扫描电子显微镜照片（×40000）。

附图标记如下：

1—含有大量胶团的琼脂糖液滴             2—吸油溶胀的琼脂糖液滴

3—大孔琼脂糖微球                       4—水相         5—内油相

6—数百纳米级大孔                       7—琼脂糖凝胶骨架。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1：胶团溶胀致孔制备2wt%大孔琼脂糖微球

准确称取1.0g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为2wt%的琼脂糖溶液。调节体系温度至60℃，向其中加入7.5g表面活性剂Tween85（HLB=11.0），使其在琼脂糖溶液中的体积浓度为15%。在100rpm条件下，充分搅拌0.5h，使表面活性剂在水相中均匀分散，形成胶团。油相为环己烷300mL，其中含有4wt%的油相乳化剂Arlacel83。将上述水相倒入提前预热至55℃的油相中，300rpm搅拌10min，制备W/O乳液。然后，将乳液转移至恒温水浴振荡器中，在55℃和250rpm条件下继续反应1h，使胶团充分吸油溶胀形成连续的大孔通道。反应结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下降温至25℃以下，降温速率1℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，直至上清液无泡沫产生，得到浓度为2wt%的大孔琼脂糖微球。其中，大孔平均孔径142nm，电镜照片如图2所示。

为了增加大孔琼脂糖微球的机械强度，采用传统方法对其进行交联。将10g上述大孔琼脂糖微球分散于20mL去离子水中，逐渐升温至40℃，反应2h。之后，向体系中缓慢滴加1.0mL环氧氯丙烷和1.2mL40%NaOH溶液（含有2%NaBH₄），继续反应12h。交联结束后，用大量去离子水将产品洗至中性，得到交联的大孔琼脂糖微球。将其装填于1.0cm×10cm的层析柱中，考察不同流速下柱压随流速的变化规律，发现交联后大孔琼脂糖微球在线性范围内所承受的最大流速为917cm/h，压力流速曲线如图4所示。

对比例1：2wt%琼脂糖微球的制备

准确称取1.0g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为2wt%的琼脂糖溶液。油相为环己烷300mL，其中含有4wt%的油相乳化剂Arlacel83。将上述水相倒入提前预热至55℃的油相中，300rpm搅拌10min，制备W/O乳液。乳化结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下降温至25℃以下，降温速率1℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，得到浓度为2wt%的琼脂糖微球，平均孔径54nm，电镜照片如图3所示。然后按照实施例1中的交联方法对所得琼脂糖微球进行交联，交联后大孔琼脂糖微球在线性范围内所承受的最大流速为535cm/h，仅为实施例1中大孔琼脂糖微球的一半左右，压力流速曲线如图4所示。

实施例2：胶团溶胀致孔制备4wt%大孔琼脂糖微球

准确称取2.0g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为4wt%的琼脂糖溶液。调节体系温度至90℃，向其中加入20.0g表面活性剂Tween40（HLB=15.6），使其在琼脂糖溶液中的体积浓度为40%。在150rpm条件下，充分搅拌0.5h，使表面活性剂在水相中均匀分散，形成胶团。油相为液体石蜡500mL，其中含有2wt%的油相乳化剂Span80。将上述水相倒入提前预热至60℃的油相中，800rpm搅拌5min，制备W/O乳液。然后，将乳液转移至恒温水浴振荡器中，在60℃和150rpm条件下继续反应3h，使胶团充分吸油溶胀形成连续的大孔通道。反应结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下降温至25℃以下，降温速率0.5℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，直至上清液无泡沫产生，得到浓度为4wt%的大孔琼脂糖微球。其中，大孔平均孔径233nm，电镜照片如图5、6所示。

为了满足色谱分离对介质机械强度方面的要求，以二溴丙醇为交联剂对上述大孔琼脂糖微球进行交联。将15g大孔琼脂糖微球分散于20mL去离子水中，逐渐升温至42.5℃，反应4h。之后，向体系中缓慢滴加2.0mL二溴丙醇和1.6mL40%NaOH溶液（含有2%NaBH₄），继续反应16h。交联结束后，用大量去离子水将产品洗至中性，得到交联的大孔琼脂糖微球。

分别取10g上述交联大孔琼脂糖微球和商品化介质Sepharose4FF置于反应釜中，加入15mL20%NaOH溶液，在60℃下碱化30min，然后加入3.0gDEAE-HCl固体颗粒继续反应3h，反应完成后用去离子水充分洗涤至中性，得到DEAE修饰的大孔琼脂糖阴离子交换介质。其中，自制大孔介质的配基密度为0.143mol/mL gel，商品化介质4FF-DEAE的配基密度为0.137mol/mL gel。将自制阴离子交换介质与商品化介质分别装填于1.0cm×10cm的层析柱中，考察其对混合体系中牛血清白蛋白（BSA）和免疫球蛋白（IgG）的分离效果。实验结果表明，当操作流速为1146cm/h时，自制大孔琼脂糖微球仍然能够对两种模型蛋白实现很好的分离，分离度R为1.26。而对于商品化介质4FF-DEAE，当流速超过458cm/h时，柱内反压迅速上升，介质被压塌，分离无法正常进行。

实施例3：胶团溶胀致孔制备6wt%大孔琼脂糖微球

准确称取3.0g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为6wt%的琼脂糖溶液。将1.0g SDS于80℃下溶解于9.0g Triton X-100中（HLB=17.0），然后加入到恒温至80℃的琼脂糖溶液中，使表面活性剂相在琼脂糖溶液中的体积浓度为20%。在200rpm条件下，充分搅拌0.5h，使表面活性剂在水相中均匀分散，形成胶团。油相为体积比为3:1的环己烷和四氯化碳的混合物200mL，其中含有1wt%的油相乳化剂PO-500。将上述水相倒入提前预热至65℃的油相中，900rpm搅拌5min，制备W/O乳液。然后，将乳液转移至恒温水浴振荡器中，在65℃和100rpm条件下继续反应6h，使胶团充分吸油溶胀形成连续的大孔通道。反应结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下降温至25℃以下，降温速率0.1℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，直至上清液无泡沫产生，得到浓度为6wt%的大孔琼脂糖微球。其中，大孔平均孔径475nm，电镜照片如图7所示。

为了增加大孔琼脂糖微球的机械强度，采用传统方法对其进行交联。将10g上述大孔琼脂糖微球分散于1000mL去离子水中，逐渐升温至20℃，反应1h。之后，向体系中缓慢滴加0.1mL1,4-丁二醇双缩水甘油醚和1.0mL40%NaOH溶液（含有2%NaBH₄），继续反应48h。交联结束后，用大量去离子水将产品洗至中性，得到交联的大孔琼脂糖微球。将其装填于1.0cm×10cm的层析柱中，考察不同流速下柱压随流速的变化规律，发现交联后大孔琼脂糖微球在线性范围内所承受的最大流速为1265cm/h。

实施例4：胶团溶胀致孔制备8wt%大孔琼脂糖微球

准确称取4.0g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为8wt%的琼脂糖溶液。将5.0g SDS于100℃下溶解于15.0g Tween20中（HLB=22.5），然后加入到恒温至100℃的琼脂糖溶液中，使表面活性剂相在琼脂糖溶液中的体积浓度为40%。在250rpm条件下，充分搅拌0.5h，使表面活性剂在水相中均匀分散，形成胶团。油相为体积比为7:5的液体石蜡和石油醚的混合物100mL，其中含有10wt%的油相乳化剂PO-310。将上述水相倒入提前预热至65℃的油相中，700rpm搅拌5min，制备W/O乳液。然后，将乳液转移至恒温水浴振荡器中，在65℃和200rpm条件下继续反应10h，使胶团充分吸油溶胀形成连续的大孔通道。反应结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下缓慢至25℃以下，降温速率2℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，直至上清液无泡沫产生，得到浓度为8wt%的大孔琼脂糖微球。其中，大孔平均孔径338nm，电镜照片如图8所示。

为了增加大孔琼脂糖微球的机械强度，采用传统方法对其进行交联。将20g上述大孔琼脂糖微球分散于10mL去离子水中，逐渐升温至80℃，反应1h。之后，向体系中缓慢滴加4mL二乙烯砜和2.0mL40%NaOH溶液（含有2%NaBH₄），继续反应1h。交联结束后，用大量去离子水将产品洗至中性，得到交联的大孔琼脂糖微球。将其装填于1.0cm×10cm的层析柱中，考察不同流速下柱压随流速的变化规律，发现交联后大孔琼脂糖微球在线性范围内所承受的最大流速为1540cm/h。

实施例5：胶团溶胀致孔制备10wt%大孔琼脂糖微球

准确称取5.0g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为10wt%的琼脂糖溶液。调节体系温度至50℃，向其中加入5.0g SDS(HLB=40.0)，使其在琼脂糖溶液中的体积浓度为10%。在250rpm条件下，充分搅拌0.5h，使表面活性剂在水相中均匀分散，形成胶团。油相为体积比为11:1的液体石蜡和石油醚的混合物1000mL，其中含有5wt%的油相乳化剂Span80。将上述水相倒入提前预热至70℃的油相中，850rpm搅拌5min，制备W/O乳液。然后，将乳液转移至恒温水浴振荡器中，在70℃和300rpm条件下继续反应24h，使胶团充分吸油溶胀形成连续的大孔通道。反应结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下降温至25℃以下，降温速率5℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，直至上清液无泡沫产生，得到浓度为10wt%的大孔琼脂糖微球。其中，大孔平均孔径110nm，电镜照片如图9所示。

实施例6：胶团溶胀致孔制备0.1wt%大孔琼脂糖微球

准确称取0.05g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为0.1wt%的琼脂糖溶液。将1.25g SDS于100℃下溶解于1.25g Tween85中（HLB=25），然后加入到恒温至40℃的琼脂糖溶液中，使表面活性剂相在琼脂糖溶液中的体积浓度为5%。在50rpm条件下，充分搅拌2h，使表面活性剂在水相中均匀分散，形成胶团。油相为体积比为2:1的甲苯和四氯化碳的混合物1500mL，其中含有0.5wt%的油相乳化剂PO-500。将上述水相倒入提前预热至40℃的油相中，100rpm搅拌30min，制备W/O乳液。然后，将乳液转移至恒温水浴振荡器中，在40℃和30rpm条件下继续反应5h，使胶团充分吸油溶胀形成连续的大孔通道。反应结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下降温至30℃以下，降温速率8℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，直至上清液无泡沫产生，得到浓度为0.1wt%的大孔琼脂糖微球。其中，大孔平均孔径272nm。

实施例7：胶团溶胀致孔制备20wt%大孔琼脂糖微球

准确称取12.5g琼脂糖粉，加入50mL去离子水，加热溶解，得到浓度为20wt%的琼脂糖溶液。将15.75g SDS于70℃下溶解于6.75g PEG400中（HLB=31.4），然后加入到恒温至98℃的琼脂糖溶液中，使表面活性剂相在琼脂糖溶液中的体积浓度为45%。在500rpm条件下，充分搅拌0.5h，使表面活性剂在水相中均匀分散，形成胶团。油相为石油醚120mL，其中含有15wt%的油相乳化剂PO-310。将上述水相倒入提前预热至100℃的油相中，1500rpm搅拌30min，制备W/O乳液。然后，将乳液转移至恒温水浴振荡器中，在100℃和500rpm条件下继续反应15h，使胶团充分吸油溶胀形成连续的大孔通道。反应结束后，将乳液转入三口瓶中，在90rpm下降温至28℃以下，降温速率6℃/min。最后，将所得微球依次用乙醇及蒸馏水反复离心洗涤，直至上清液无泡沫产生，得到浓度为20wt%的大孔琼脂糖微球。其中，大孔平均孔径115nm。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种大孔琼脂糖微球，其特征在于，所述大孔琼脂糖微球具有凝胶孔和大孔，大孔的孔径为100-500nm。

2.一种如权利要求1所述的大孔琼脂糖微球的用途，其特征在于，所述大孔琼脂糖微球用作液相色谱固定相介质或固定化酶载体。

3.一种如权利要求1所述的大孔琼脂糖微球的制备方法，包括：将含有亲水性表面活性剂和琼脂糖的水相和与水互不相溶的油相混合乳化，固化，得到大孔琼脂糖微球。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述油相含有亲油性表面活性剂；

优选地，所述方法包括以下步骤：

（1）将亲水性表面活性剂溶于琼脂糖溶液中，作为水相；以含有亲油性表面活性剂且与水互不相溶的溶液作为油相；

（2）将水相与油相混合乳化，反应；

（3）降温，固化，除杂，得到大孔琼脂糖微球。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述水相的制备包括：向琼脂糖水溶液中加入亲水性表面活性剂，搅拌形成均匀的乳浊液，作为水相；优选地，所述琼脂糖水溶液中琼脂糖的浓度为0.1~20wt%，特别优选为1~10wt%；优选地，所述搅拌速度为50~500rpm，优选为100~250rpm。

6.如权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，向琼脂糖溶液中加入所述亲水性表面活性剂时体系温度为40~100℃，进一步优选为50~100℃，特别优选为65~90℃；

优选地，所述琼脂糖的平均分子量为1kDa~1500kDa，进一步优选为5kDa~1200kDa，特别优选为10kDa~1000kDa；

优选地，所述琼脂糖的熔点为120℃以下，进一步优选为60~110℃，特别优选为65~100℃；

优选地，所述亲水性表面活性剂的HLB为10~40，特别优选为10~25；

优选地，所述亲水性表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60、Tween85、PEG400、Triton X-100、聚乙二醇、油酸钠或十二烷基硫酸钠中的1种或至少2种的组合；

优选地，所述亲水性表面活性剂在水相中的浓度按体积百分比为5~40%，特别优选为10~30%。

7.如权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，所述油相的黏度为0.1~30.0mPa·S，特别优选为1.0~10.0mPa·S；

优选地，所述油相的溶剂为液体石蜡、石油醚、环己烷、甲苯或四氯化碳中的1种或至少2种的组合，特别优选为液体石蜡和石油醚的混合物或环己烷和四氯化碳的混合物；

优选地，所述亲油性表面活性剂为Span80、PO-500、Arlacel83或PO-310中的1种或至少2种的组合，特别优选为Span80或PO-500；

优选地，所述亲油性表面活性剂在油相中的质量浓度为0.5~15wt%，进一步优选为1~10wt%，特别优选为1~5wt%。

8.如权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述水相与油相混合乳化为将水相加入油相中混合乳化；

优选地，所述混合乳化的方法为机械搅拌法、喷射法、均质乳化法、超声乳化法、微流控乳化法或微孔膜乳化法，特别优选为机械搅拌法；优选地，所述机械搅拌转速为100~1500rpm，特别优选为500~900rpm；

优选地，所述混合乳化温度为40~100℃，进一步优选为45~85℃，特别优选为55~70℃；

优选地，所述油相和水相的体积比为2:1~30:1，进一步优选为2:1~20:1，特别优选为3:1~10:1；

优选地，步骤（2）所述反应在搅拌下进行。

9.如权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述反应在恒温水浴振荡器中进行；优选地，所述振荡速率为至少30rpm，进一步优选为50~500rpm，特别优选为100~300rpm；

优选地，步骤（2）所述反应时间为0-24h，特别优选为1-10h；

优选地，步骤（3）所述降温终点温度为30℃以下，进一步优选为28℃以下，特别优选为25℃以下；

优选地，步骤（3）所述除杂为洗涤；优选地，所述洗涤采用乙醇和/或去离子水；优选地，所述洗涤次数为至少2次，特别优选至少3次；

优选地，步骤（3）所述降温速率为8℃/min以下，进一步优选为0.1-5℃/min，特别优选为0.2-2℃/min。

10.如权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于，将步骤（3）得到的大孔琼脂糖微球进行交联；

优选地，所述交联包括：将大孔琼脂糖微球分散于水中，然后向体系中加入交联剂和氢氧化钠，进行交联反应；

优选地，所述大孔琼脂糖微球的浓度为0.01~2g/mL，进一步优选为0.05~1.5g/mL，特别优选为0.1~1g/mL；

优选地，所述交联反应温度为20~80℃，进一步优选为22~60℃，特别优选为25~50℃；

优选地，所述交联反应在水浴中进行；

优选地，所述交联反应时间为至少1小时，进一步优选为2~48小时，特别优选为3~24小时；

优选地，所述交联剂在体系中的浓度按体积百分比为0~30%，进一步优选为0.1~25%，特别优选为1~20%；

优选地，[OH]^-浓度为0~5mol/L，进一步优选为0.1~3mol/L，特别优选为0.2~2mol/L；

优选地，所述交联剂为环氧氯丙烷、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、二溴丙醇或二乙烯砜中的1种或至少2种的组合。

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