CN113281505A - 一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。本方法利用金葡菌表面的A蛋白可与IgG的Fc片段特异性结合的原理，结合噻唑蓝(MTT)染色法，快速鉴定牛奶样品中的金葡菌。首先将IgG交联在琼脂糖微球上，进而与牛奶共孵育。经过短暂培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色。如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。该方法操作简单，检测特异性强，检测灵敏度高，对金葡菌的最低检测限介于50CFU/mL牛奶和5×102CFU/mL牛奶之间，检测耗时短(约12h)，不需要昂贵的仪器设备。该技术方法对于临床上快速诊断奶牛金葡菌性乳腺炎具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及金葡菌检测领域，具体涉及一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。
背景技术
乳腺炎(mastitis)是泌乳奶牛最常见的疾病之一，不仅引起产奶量降低和用药成本增加，甚至可导致奶牛泌乳机能丧失而被迫淘汰，给奶牛业带来巨大经济损失。引起乳腺炎的病原菌种类繁多，其中革兰氏阴性菌以大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌为主，革兰氏阳性菌以金黄色葡萄球菌为主。通常情况下，大肠杆菌等革兰氏阴性菌感染可引起乳腺发生强烈的免疫炎症反应，受感染的乳腺可自然痊愈。相反，金葡菌则通常引起慢性乳腺感染，导致乳腺发生严重病变。此外，作为一种兼性胞内菌，金葡菌可逃避抗生素的治疗作用，采用抗生素治疗通常难以奏效。再者，金葡菌具有很强的传染性，可通过多种途径在牛群中传播。迄今，针对金葡菌的疫苗尚未研制成功。因而，要有效防控金葡菌性乳腺炎，必须做到早诊断、早隔离。
临床上常用的乳腺炎诊断方法有加州乳腺炎检测法(California mastitistest,CMT)、牛奶体细胞直接计数法、N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)或乳酸脱氢酶(LDH)检测法等。虽然这些方法可用于判定乳腺是否发生炎症，但均无法明确引起乳腺炎的病原。要明确病原，就必须进行细菌分离培养，并对病原菌进行鉴定。但常规细菌分离培养耗时长，也不适合大规模筛查。鉴于金葡菌性乳腺炎的严重危害，临床上急需一种操作简单、耗时较短、灵敏可靠的微生物学检测法。
发明内容
本发明提供了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。该方法利用金葡菌A蛋白可与IgG特异性结合的特点，将IgG交联在琼脂糖微球上，利用IgG-琼脂糖凝胶捕获牛奶样品中的金葡菌，经过短暂培养后，采用传统MTT显色法指示是否存在金葡菌。本技术方案中利用琼脂糖微球具有较大的比表面积这一特点，实现对牛奶中痕量细菌进行有效捕获。
一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
1)制备琼脂糖微球；
2)将IgG交联在琼脂糖微球上；
3)将交联有IgG的琼脂糖微球加入到待检测牛奶样品中，经过培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色，如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。
步骤1)中，所述的琼脂糖微球的制备包括：
(1.1)水相配置：将琼脂糖加入含NaCl的生理盐水中，微波加热至溶液变澄清，置80℃～95℃水浴保温以去除气泡，得到水相；
步骤(1.1)中，所述的水相中琼脂糖质量分数为1％～4％，进一步优选为2％；
所述的含NaCl的生理盐水中NaCl的质量分数为0.3％～2％，进一步优选为0.9％。
进一步优选，置90℃水浴保温以去除气泡。
(1.2)油相配置：配置含Span80的液体石蜡，搅拌均匀后，加热至60℃～80℃，得到油相。
步骤(1.2)中，所述的油相中Span80的体积百分数为1％～5％，为3％。
加热至65℃～75℃，最优选，加热至70℃。
(1.3)将水相和油相按体积比1：4～8混合，3000～5000rpm乳化5～20min，乳化过程在50℃～70℃水浴锅中进行；
步骤(1.3)中，将水相和油相按体积比1：5～7混合，进一步优选，将水相和油相按体积比1：6混合。
4000rpm乳化10min。
乳化过程在60℃水浴锅中进行。
(1.4)乳化完成后，将乳化产物置于2～8℃环境中保持5～15min。
步骤(1.4)中，将乳化产物置于4℃环境中保持10min。
(1.5)乳化产物依次用去离子水离心、体积百分数10％～30％乙醇水溶液和无水乙醇各洗涤2次；
步骤(1.5)中，作为优选，体积百分数15％～25％乙醇水溶液，离心条件为1900g，4℃，5分钟。
(1.6)沉淀经筛网过滤，收集琼脂糖微球，保存于50％乙醇中备用。
步骤(1.6)中，沉淀经100μm筛网过滤。
将IgG交联在琼脂糖微球上，具体包括：
(2.1)取琼脂糖微球，用去离子水离心洗涤；
步骤(2.1)中，用去离子水离心洗涤1～3次(优选为2次)，离心洗涤的条件为2500g，5min/次。
(2.2)将洗涤后的琼脂糖微球加入含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中，置摇床中震摇。
步骤(2.2)中，含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中碳酸钠的浓度为0.2～0.9M(优选为0.5M)，含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中环氧氯丙烷的质量百分数为2％～8％(优选为5％)。含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液的pH＝9～10，优选为9.5。
置摇床中震摇1h～3h，最优选为2h。
(2.3)震摇后，用去离子水洗涤琼脂糖微球，再用碳酸钠水溶液洗涤。
步骤(2.3)中，碳酸钠水溶液的浓度优选为0.2～0.8mol/L，优选为0.5mol/L。碳酸钠水溶液的pH＝9～10，优选为9.5。
再用0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)洗涤1次，离心条件为2500g，每次洗涤5min。
(2.4)将IgG抗体溶于PBS中，配成浓度为2.7～3.7mg/mL IgG的PBS溶液，以0.2～0.8M碳酸钠溶液为缓冲液，透析2～4h，得到纯化的IgG溶液；
步骤(2.4)中，将IgG抗体溶于PBS中，配成浓度为3.2mg/mL IgG的PBS溶液，以0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)为缓冲液，室温透析3h，得到纯化的IgG溶液。
(2.5)将步骤(2.3)得到的琼脂糖微球与纯化的IgG溶液混合，震摇18h～30h，得到IgG-琼脂糖微球；
步骤(2.5)中，震摇22h～26h，震摇24h。
(2.6)将IgG-琼脂糖微球(交联有IgG的琼脂糖微球)用去离子水洗涤，加入含乙醇胺的碳酸钠水溶液中作用1～3h去除非特异性吸附，PBS洗涤5次，完成IgG交联在琼脂糖微球。
步骤(2.6)中，所述的含乙醇胺的碳酸钠水溶液中乙醇胺的质量百分数为6％～10％。所述的含乙醇胺的碳酸钠水溶液中碳酸钠的浓度为0.2～0.8M，进一步优选为0.5M。
将IgG-琼脂糖微球(交联有IgG的琼脂糖微球)用去离子水洗涤3次(2500g、5min/次)，加入含8.5％乙醇胺的0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)中作用2h以消除非特异性吸附，PBS洗涤5次，保存于0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)中备用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明方法利用金葡菌A蛋白可与IgG特异性结合的特点，将IgG交联在琼脂糖微球上，利用IgG-琼脂糖凝胶捕获牛奶样品中的金葡菌，经过短暂培养后，采用传统MTT显色法指示是否存在金葡菌。本技术方案中利用琼脂糖微球具有较大的比表面积这一特点，实现对牛奶中痕量细菌进行有效捕获。本检测技术操作简单，检测耗时短，检测特异性强(只针对金葡菌)、灵敏性高(最低检测限介于50～5×102CFU/mL之间)，不需要昂贵的仪器设备，并可实现高通量牛奶样品检测。该技术有效克服了现有技术方法的局限，检测人员可轻松进行操作并判定结果。
本发明方法利用金葡菌表面的A蛋白可与IgG的Fc片段特异性结合的原理，结合噻唑蓝(MTT)染色法，快速鉴定牛奶样品中的金葡菌。首先将IgG交联在琼脂糖微球上，进而与牛奶共孵育。经过短暂培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色。如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。该方法操作简单，检测特异性强，检测灵敏度高，对金葡菌的最低检测限介于50CFU/mL牛奶和5×102CFU/mL牛奶之间，检测耗时短(约12h)，不需要昂贵的仪器设备。该技术方法对于临床上快速诊断奶牛金葡菌性乳腺炎具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1制备的琼脂糖微球的放大图；
图2为考马斯亮蓝染色验证IgG是否与琼脂糖微球交联的效果图，其中，左：未交联IgG的琼脂糖微球；右：交联IgG的琼脂糖微球。
图3为牛奶和琼脂糖微球对MTT呈色反应的影响图；
图4为琼脂糖微球法最低检测限的表征图
图5为对照金葡菌、大肠杆菌、金葡菌、大肠杆菌检测特异性的效果图；
具体实施方式
实施例1
1.实验材料及设备
1.1试剂
琼脂糖干粉(翌圣生物科技有限公司)，液体石蜡(国药集团)，氯化钠(国药集团)，Span80(索莱宝)，乙醇(国药集团)，环氧氯丙烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，碳酸钠(国药集团)，人IgG干粉(索莱宝)，乙醇胺(国药集团)，MTT(索莱宝)
1.2试验菌株
大肠杆菌(ATCC25922)，金黄色葡萄球菌(Newbould 305)
1.3牛奶样品
市售巴氏灭菌鲜牛奶
1.4实验设备
实验室乳化机(北京卓川电子科技有限公司，FF.1-ESB-300)，恒温水浴锅，细菌培养箱，pH计。
2.琼脂糖珠的制备
(1)水相配置：将琼脂糖加入含0.9％NaCl的生理盐水中(琼脂糖质量分数为2％)，微波加热至溶液变澄清，置90℃水浴保温以去除气泡。
(2)油相配置：配置含3％(v/v)Span80的液体石蜡，搅拌均匀后，加热至70℃。
(3)将水相和油相按体积比1:6混合，4000rpm乳化10min，乳化过程在60℃水浴锅中进行。
(4)乳化完成后，将乳化产物置于4℃环境中保持10min。
(5)乳化产物依次用去离子水离心、20％乙醇和无水乙醇各洗涤2次，离心条件为1900g，4℃，5分钟。
(6)沉淀经100μm筛网过滤，收集琼脂糖微球(图1)，保存于50％乙醇中备用。
3.IgG与琼脂糖微球交联
(1)取2.5mL琼脂糖微球，用去离子水离心洗涤2次(2500g，5min/次)。
(2)将琼脂糖微球加入5mL含5％环氧氯丙烷的0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)中，置摇床中震摇2h。
(3)用去离子水洗涤琼脂糖微球2次，再用0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)洗涤1次，离心条件为2500g，每次洗涤5min。
(4)将IgG抗体溶于PBS中，配成浓度为3.2mg/mL IgG的PBS溶液，以0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)为缓冲液，室温透析3h，得到纯化的IgG溶液。
(5)将琼脂糖微球与纯化的IgG溶液混合，室温震摇24h。
(6)将交联有IgG的琼脂糖微球(IgG-琼脂糖微球)用去离子水洗涤3次(2500g、5min/次)，加入含8.5％乙醇胺的0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)中作用2h以消除非特异性吸附，PBS洗涤5次，保存于0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)中备用。
4.IgG与琼脂糖微球交联结果鉴定
根据蛋白可被考马斯亮蓝染色这一特性，采用考马斯亮蓝染色法鉴定IgG与琼脂糖微球的交联效果。将IgG-琼脂糖微球加入适量考马斯亮蓝染色液中，置水平摇床上缓慢摇动，室温染色1h。离心去上清，加入考马斯亮蓝脱色液，室温脱色24h，期间更换脱色液2～4次，观察呈色反应。如图2所示，交联有IgG的琼脂糖微球被考马斯亮蓝染成蓝色，未交联IgG的微球不着色。上述结果表明IgG与琼脂糖微球交联成功。
5.牛奶、琼脂糖微球对MTT呈色反应的干扰试验
分别将琼脂糖微球、无菌牛奶样品和牛奶/琼脂糖微球混合液(牛奶：微球＝1：1，v/v)加入96孔板中(100μL/孔)，置37℃培养箱放置1～12h，向每孔中加入10μL MTT(5mg/mL)，于37℃反应1h，观察呈色反应。如图3所示，琼脂糖微球和牛奶在37℃条件下放置12h均不能导致MTT变色，但牛奶/琼脂糖微球混合物在37℃条件下放置11h后则可引起MTT发生明显的颜色改变，故在采用琼脂糖微球检测牛奶中的金葡菌时，培养时间不超过10h。
6.琼脂糖微球法最低检测限的确定
金葡菌在BHI培养基中培养至对数生长期，采用平板法计数后，将菌液用灭菌牛奶进行倍比稀释，使金葡菌数量达到(50～5×108CFU/mL)。将交联有IgG的琼脂糖微球加入96孔板中(100μL/孔)，再加入含不同数量金葡菌的牛奶样品(100μL/孔)，使金葡菌的起始数量分别为10、102、103、104、105、106、107和108CFU/孔，以灭菌纯牛奶为对照，置37℃培养箱中培养10h。培养结束时，800g离心5min，沉淀用去离子水离心洗涤3次(800g，5min/次)，弃上清，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)，继续培养1h，观察颜色反应。如图4所示，当金葡菌起始数量为10CFU/孔时(即50CFU/mL牛奶)，MTT转变为微弱的紫色；当金葡菌起始数量≥102CFU/孔时(即5×102CFU/mL牛奶)，MTT的颜色改变得明显可见。上述结果表明，本检测方法对牛奶中金葡菌的最低检测限介于50～5×102CFU/mL之间。
7.琼脂糖微球法的检测特异性
分别向灭菌纯牛奶中加入金葡菌、大肠杆菌及其混合菌液(金葡菌：大肠杆菌＝1：1)，使牛奶样品中细菌总数达到1×104CFU/mL。取100μL牛奶样品加入EP管中，再加入100μL交联有IgG的琼脂糖微球，旋涡振荡混匀，置37℃培养箱中培养10h。培养结束后，用去离子水离心洗涤3次(800g，5min/次)，去上清，加入20μL MTT(5mg/mL)，37℃继续培养1h，观察颜色反应。如图5所示，含有金葡菌的牛奶样品可使MTT转变为肉眼明显可见的紫色，而仅含大肠杆菌的牛奶样品不能使MTT变色。上述结果表明，本检测方法对金葡菌具有特异性。
8.结论
本研究成果成功构建了一种检测牛奶中金葡菌的方法，该方法操作简单，检测特异性强，检测灵敏度高，最低检测限介于50CFU/mL牛奶和5×102CFU/mL牛奶之间，检测耗时短(约12h)，不需要昂贵的仪器设备。该技术方法对于临床上快速诊断奶牛金葡菌性乳腺炎具有潜在的应用价值。
Claims (10)
1.一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备琼脂糖微球；
2)将IgG交联在琼脂糖微球上；
3)将交联有IgG的琼脂糖微球加入到待检测牛奶样品中，经过培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色，如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。
2.根据权利要求1所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的琼脂糖微球的制备包括：
(1.1)水相配置：将琼脂糖加入含NaCl的生理盐水中，微波加热至溶液变澄清，置80℃～95水浴保温以去除气泡，得到水相；
(1.2)油相配置：配置含Span80的液体石蜡，搅拌均匀后，加热至65℃～85℃，得到油相；
(1.3)将水相和油相按体积比1：2～6混合，2000～4000rpm乳化5～20min，乳化过程在50℃～70℃水浴锅中进行；
(1.4)乳化完成后，将乳化产物置于2～8℃环境中保持5～15min；
(1.5)乳化产物依次用去离子水离心、体积百分数10％～50％乙醇水溶液和无水乙醇洗涤；
(1.6)沉淀经筛网过滤，收集琼脂糖微球。
3.根据权利要求2所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(1.1)中，所述的水相中琼脂糖质量分数为1％～5％。
4.根据权利要求2所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(1.2)中，所述的油相中Span80的体积百分数为1％～4％。
5.根据权利要求2所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(1.3)中，将水相和油相按体积比1：2～6混合。
6.根据权利要求1所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤2)中，将IgG交联在琼脂糖微球上，具体包括：
(2.1)取琼脂糖微球，用去离子水离心洗涤；
(2.2)将洗涤后的琼脂糖微球加入含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中，置摇床中震摇；
(2.3)震摇后，用去离子水洗涤琼脂糖微球，再用碳酸钠水溶液洗涤；
(2.4)将IgG抗体溶于PBS中，配成浓度为1～4mg/mL IgG的PBS溶液，以0.2～0.5M碳酸钠溶液为缓冲液，透析1～4h，得到纯化的IgG溶液；
(2.5)将步骤(2.3)得到的琼脂糖微球与纯化的IgG溶液混合，震摇12h～24h，得到IgG-琼脂糖微球；
(2.6)将IgG-琼脂糖微球用去离子水洗涤，加入含乙醇胺的碳酸钠水溶液中作用1～3h去除非特异性吸附，PBS洗涤，完成IgG交联在琼脂糖微球。
7.根据权利要求6所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(2.2)中，含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中碳酸钠的浓度为0.2～0.6M，含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中环氧氯丙烷的质量百分数为2％～10％。
8.根据权利要求6所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(2.3)中，所述的碳酸钠水溶液的浓度为0.2～0.5M。
9.根据权利要求6所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(2.5)中，震摇12h～24h。
10.根据权利要求6所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(2.6)中，所述的含乙醇胺的碳酸钠水溶液中乙醇胺的质量百分数为2％～10％；所述的含乙醇胺的碳酸钠水溶液中碳酸钠的浓度为0.2～0.6M。
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