CN109536578A - 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109536578A
CN109536578A CN201910077575.6A CN201910077575A CN109536578A CN 109536578 A CN109536578 A CN 109536578A CN 201910077575 A CN201910077575 A CN 201910077575A CN 109536578 A CN109536578 A CN 109536578A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
escherichia coli
colloid gold
lamp
zflp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910077575.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张雪寒
张碧成
王警
郭芸芸
周俊明
祝昊丹
俞正玉
李彬
倪艳秀
温立斌
范宝超
朱雪娇
汪伟
胡屹屹
郭容利
肖琦
周金柱
何孔旺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201910077575.6A priority Critical patent/CN109536578A/zh
Publication of CN109536578A publication Critical patent/CN109536578A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。该试剂盒包括LAMP引物组和胶体金试纸；所述LAMP引物组包括引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP，所述引物ZFLP的5'端标记有FITC，所述引物ZBLP的5'端标记DIG；所述引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。本发明本发明试剂盒克服了现有检测方法耗时长、操作繁琐、准确性差的缺点，操作简单、价格低廉，可实现快速、准确地检测大肠杆菌O157:H7的胶体金免疫检测试剂盒。

Description

一种大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒及其应用。
背景技术
大肠杆菌O157:H7是重要的食源性病原菌，能够在全世界范围内引起动物、家禽和人类爆发感染，不仅关乎食品安全，而且与医疗和公共卫生问题密切相关。
现如今，许多报道尝试研制更特异和敏感的方法检测大肠杆菌O157:H7。传统的培养鉴定技术使用选择性培养基或者显色平板检测大肠杆菌O157:H7，但是这种方法费时，费力，准确性差。
发明内容
本发明的目的在于克服现有检测方法耗时长、操作繁琐、准确性差的缺点，提供一种操作简单、价格低廉，可实现快速、准确地检测大肠杆菌O157:H7的胶体金免疫检测试剂盒。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒，其特征在于包括LAMP引物组和胶体金试纸；所述LAMP引物组包括引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP，所述引物ZFLP的5'端标记有FITC，所述引物ZBLP的5'端标记DIG；所述引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。
在本发明中，所述引物浓度均为15～25μM。
在本发明中，所述胶体金试纸包括硝酸纤维素膜和胶体金结合垫，所述胶体金结合垫包被有地高辛单克隆抗体的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有抗FITC抗体；所述质控线包被有葡萄球菌A蛋白。
优选的技术方案中，所述抗FITC抗体包被浓度为0.5-0.7mg/mL，所述葡萄球菌A蛋白的包被浓度为0.15-0.35mg/mL。
优选的技术方案中，所述胶体金试纸还包括吸水纸、样品层析垫和底板。
优选的技术方案中，所述底板上设有硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜的两端分别设有吸水纸和胶体金结合垫，在胶体金结合垫上设有所述样品层析垫。
本发明还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下步骤：
(1)提取大肠杆菌O157:H7的基因组DNA；
(2)将步骤1获得的基因组DNA作为LAMP反应中的模板DNA，进行LAMP扩增，获得扩增产物；
(3)将步骤(2)得到的扩增产物滴加到胶体金试纸上，观察结果；若只有质控线出现条带，则样品中无大肠杆菌O157:H7；若质控线和检测线均出现条带，则样品中含有大肠杆菌O157:H7。
优选的技术方案中，所述LAMP扩增的反应条件为55-65℃反应50-70min，然后在75-90℃反应10-20min。
优选的技术方案中，LAMP扩增体系包括2×LAMP Mix 10μl、ZFIP引物0.8μl、ZBIP引物0.8μl、ZF3引物0.2μl、ZB3引物0.2μl、ZFLP引物0.4μl、ZBLP引物0.4μl、MgCl2 3μl、BstDNA聚合酶1.5μl、模板DNA 1μl，加ddH2O至终体积为20μl。
有益效果：
本发明将大肠杆菌O157:H7的LAMP方法与胶体金检测技术相结合，提供了一种快速检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒。采用本发明试剂盒检测大肠杆菌O157:H7，仅需要一台恒温装置就可完成扩增，操作简单、成本低，时间短。采用胶体金进行检测，检测时间短，只需要几分钟，且不需要专门的仪器设备，可直接肉眼观察扩增结果。胶体金试纸上，只出现1条质控线时为阴性，同时出现检测线和质控线为阳性，判断标准统一。与传统的电泳检测相比，此检测方法具有高度敏感度、高度特异性、高准确性的特点。
附图说明
图1：胶体金试纸结构示意图，1-样品层析垫，2-胶体金结合垫，3-硝酸纤维素膜，4-检测线，5-质控线，6-吸水纸。
图2：LAMP扩增产物的凝胶电泳检测。
泳道M为DL2000DNA Plus Marker；泳道1为空白对照，泳道2为以大肠杆菌O157:H7基因组DNA为模板获得的LAMP扩增产物。
图3：胶体金试纸检测结果。其中1：60ul的PBST缓冲溶液层析结果。2：以大肠杆菌O157:H7基因组DNA为模板的LAMP扩增产物层析结果。
图4：各浓度模板LAMP扩增产物的胶体金试纸检测结果，1：模板浓度为105CFU/ml；2：模板浓度为104CFU/ml；3：模板浓度为103CFU/ml；4：模板浓度为102CFU/ml；5：模板浓度为10CFU/ml；6：模板浓度为1CFU/ml；C：空白泳道(模板为ddH2O)。
图5：胶体金试纸检测结果，其中P：大肠杆菌O157:H7扩增产物的层析结果；C：空白对照(ddH2O)的层析结果；1-3：环境样品扩增产物的层析结果；4-17：粪便样品扩增产物的层析结果：其中13,15和17为阳性扩增。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒的制备
大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒(以下缩写为本发明试剂盒)包括：LAMP引物组、胶体金试纸和LAMP反应体系中的其他试剂。
1.LAMP引物组
根据大肠杆菌O157:H7的z3276基因序列设计了LAMP引物组，包括引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP。其中，ZFLP和ZBLP均是带有标记的引物，ZFLP的5'端标记有FITC(异硫氰酸荧光素)，ZBLP的5'端标记有DIG(地高辛)。引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示，具体见表1。
表1引物信息
引物名称 引物序列(5’-3’) 序列编号
ZF3 gtgtcgtactactgcatca SEQ ID NO：1
ZB3 gctggttttacctaaagactct SEQ ID NO：2
ZFIP tcccagtaaacacgacacttttactagatggtattaatgttggggag SEQ ID NO：3
ZBIP atcttgtgatacgagcacggataatcgccattaccaaaaggc SEQ ID NO：4
ZFLP aaaggaagtttcattcgct SEQ ID NO：5
ZBLP atccaaagtgattgggttgaagttg SEQ ID NO：6
将引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
以无菌双蒸水为溶剂，分别配制20μM的ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP溶液。
2.胶体金试纸条
胶体金试纸结构如图1所示，在底板(PVC卡)上设有硝酸纤维素膜(NC膜)，在硝酸纤维素膜的两端分别设有胶体金结合垫和吸水纸，在胶体金结合垫的上方设有样品层析垫。在PVC卡上从下到上依次粘贴NC膜、胶体金结合垫、样品层析垫和吸水纸，用斩切机切成4mm宽的试纸条。
胶体金结合垫包被有抗地高辛单克隆抗体(上海凯博生物技术有限公司，BYm-0356M)的胶体金标记物。胶体金结合垫的制备方法如下：取1支1.5mL离心管用ddH2O清洗两遍，吸取1ml浓度为0.1g/L的胶体金(粒径60nm)加入管中，然后加入2μL的0.2M碳酸钾水溶液，震荡使其混合均匀，加入20μg抗地高辛单克隆抗体(上海凯博生物技术有限公司，BYm-0356M)，混匀后放置20min。加入100μL的10％BSA(牛血清白蛋白)溶液进行封闭反应20min。在11000r/min转速下离心20min，弃去上清，用500μL金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm×150mm的金垫，干燥。其中，金复溶液是含有0.5-1g/mL PEG20000、0.5-1g/mL海藻糖和1-2g/mL Tween20的水溶液。
硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线。其中，检测线包被有抗FITC单克隆抗体(抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体，赛默飞生物科技有限公司，MA5-17001)，质控线包被有葡萄球菌A蛋白(SPA，购自南京钟鼎生物科技有限公司，ZDP-03)。硝酸纤维素膜上检测线和质控线的包被方法如下：将抗FITC单克隆抗体稀释至0.6mg/mL，用点膜仪喷点在NC膜上作为检测线，一个试纸条的检测线上抗FITC单克隆抗体的包被量为0.6μg。将葡萄球菌A蛋白稀释至0.25mg/mL，喷点在NC膜上作为质控线，一个试纸条的质控线上葡萄球菌A蛋白的包被量为0.3μg。室温低湿度下干燥。
胶体金试纸的检测原理如下：LAMP扩增产物与胶体金结合垫中的抗地高辛单克隆抗体的胶体金标记物结合，层析至NC膜时，与包被在检测线上的抗FITC单克隆抗体相结合，从而显色。多余的抗地高辛单克隆抗体的胶体金标记物，层析至质控线，与其上包被的葡萄球菌A蛋白反应，显色。因此，样品检测后，如在检测线(T线)和质控线(C线)同时出现条带，那么检测结果为阳性(+)，样品中含有大肠杆菌O157:H7；如仅在质控线(C线)出现条带，那么样品中不含有大肠杆菌O157:H7；如质控线(C线)无条带，说明试纸无效。
2.LAMP反应体系中的其他试剂
LAMP(环介导等温扩增技术)反应体系中的其他试剂包括2×LAMP Mix、MgCl2(25mM)和Bst DNA聚合酶(8U/μl)，均购自于南京钟鼎生物有限公司。
实施例2试剂盒的使用方法
采用实施例1中试剂盒检测大肠杆菌O157:H7。
(1)增菌
接种环蘸取-70℃保存的大肠杆菌O157:H7(购自上海三踏生物科技有限公司)，划线接种于山梨醇麦康凯琼脂平板，37℃培养18-20h，挑取单个菌落接种5mL LB(Luria-Bertani)液体培养基中，37℃培养12-20h，取出用于细菌基因组DNA的提取，作为后续LAMP扩增的模板。
(2)模板制备
细菌基因组的提取，可以采用常规的煮沸方法，也可以使用市售的商品化细菌基因组提取试剂盒。煮沸方法的基本操作：细菌培养液在12000rpm离心10min，以细菌培养液体积1/10的无菌双蒸水重悬菌泥，煮沸10min，12000rpm离心10min，取上清，得到大肠杆菌O157:H7基因组DNA。
(3)LAMP扩增
以步骤(2)获得的大肠杆菌O157:H7基因组DNA作为LAMP扩增的模板。按照表2中的扩增体系，在各组分加入到PCR离心管中，震荡混匀后离心。用PCR管架固定PCR管后，放置60℃的水浴槽中，孵育60min，然后再放置80℃水浴槽中孵育10min，以失活Bst DNA聚合酶。以无菌双蒸水作为空白对照。LAMP扩增结束后，将产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，阳性模板可以扩增出梯状条带(图2)。
表2：LAMP扩增体系
(4)胶体金试纸检测LAMP扩增产物
取以大肠杆菌O157:H7基因组DNA为模板获得的LAMP扩增产物(步骤(3)获得)1μl，加入到100μl的PBST溶液中，混匀后取60μl滴到胶体金试纸的样品层析垫上，反应10min，观察检测结果。以PBST缓冲溶液为阴性对照。结果如图3所示，试纸1为60μl PBST缓冲溶液的层析结果，只在质控线出现条带，结果为阴性；试纸2检测的样品是以大肠杆菌O157:H7基因组DNA为模板获得的LAMP扩增产物，可以看到层析后，在质控线和检测线均出现条带，结果为阳性，说明检测样品中有大肠杆菌O157:H7。
实施例3本发明试剂盒的性能
1.敏感性
考察本发明试剂盒(实施例1)对大肠杆菌O157:H7的敏感性。对大肠杆菌O157:H7进行增菌。将大肠杆菌O157:H7培养物进行10倍比稀释，浓度为1CFU/ml、101CFU/ml、102CFU/ml、103CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml，按照实施例2中方法制备模板DNA，对应的DNA浓度为0.5pg/ul、5pg/μl、50pg/μl、500pg/μl、、5ng/μl、50ng/ul，然后采用采用实施例2中方法进行LAMP扩增。
将各浓度模板的LAMP扩增产物，采用胶体金试纸检测(实施例2)，结果如图4所示，最低检测限为1CFU/ml(对应DNA浓度为0.5pg/ul)。因此，本发明试剂盒的最低检测限为1CFU/ml(0.5pg/ul)。
2.特异性分析
由于待检样品中可能有潜在交叉反应的细菌核酸，分别采用本发明试剂盒检测大肠杆菌O25、O26、O55、O78、O103、O111、O127、O121、O138、O139、O141、F4、APEC E058、EPECSEC627、EPEC SEC689、BL21、K12-MG1655，以及沙门氏杆菌、李斯特氏杆菌、巴氏杆菌、粪链球菌、葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、乳酸杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌2a、普罗威登斯菌(李丽，等。EHEC O157H7二重PCR的建立及应用。华北农学报，2011，26(6)：61。)。具体检测方法同实施例2。结果显示本发明试剂盒特异性良好，不能检测到其他非目标细菌。
实施例4本发明试剂盒在以非诊断为目的的检测大肠杆菌O157:H7中的应用
从淮安境内奶牛场采集临床样品17份，包括环境样品3个、粪便样品14个，分别增菌然后采用本发明试剂盒进行检测。
其中增菌方法如下：如果待检样品为固体，如粪便或者食物，取10克，打散或者研磨后加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取25mL加入到225mL心脑浸出液培养基(杭州微生物试剂制品公司)中，向培养基中再加入100uL浓度为50mg/mL的新生霉素，37℃培养18h，所得培养物用于制备模板。如果待检样品为液体，直接取25mL加入到225mL心脑浸出液培养基(杭州微生物试剂制品公司)中，向培养基中再加入100uL浓度为50mg/mL新生霉素，37℃培养18h，所得培养物用于制备模板。
其他步骤同实施例2。空白对照为ddH2O。
结果如图5，3个样品携带有大肠杆菌O157:H7，对应试纸条13、15和17，检测结果与文献(李丽，等.EHEC O157H7二重PCR的建立及应用。华北农学报，2011，26(6)：61。)中方法检测结果一致，但是敏感性显著高于该文献。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒及其应用
<130> 20190125
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ZF3
<400> 1
gtgtcgtact actgcatca 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ZB3
<400> 2
gctggtttta cctaaagact ct 22
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ZFIP
<400> 3
tcccagtaaa cacgacactt ttactagatg gtattaatgt tggggag 47
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ZBIP
<400> 4
atcttgtgat acgagcacgg ataatcgcca ttaccaaaag gc 42
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ZFLP
<400> 5
aaaggaagtt tcattcgct 19
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ZBLP
<400> 6
atccaaagtg attgggttga agttg 25

Claims (9)

1.一种大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒，其特征在于包括LAMP引物组和胶体金试纸；所述LAMP引物组包括引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP，所述引物ZFLP的5'端标记有FITC，所述引物ZBLP的5'端标记DIG；所述引物ZF3、ZB3、ZFIP、ZBIP、ZFLP和ZBLP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求书1所述大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒，其特征在于所述引物浓度均为15～25μM。
3.根据权利要求1或2所述大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒，其特征在于所述胶体金试纸包括硝酸纤维素膜和胶体金结合垫，所述胶体金结合垫包被有地高辛单克隆抗体的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有抗FITC抗体；所述质控线包被有葡萄球菌A蛋白。
4.根据权利要求3所述大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒，其特征在于所述抗FITC抗体包被浓度为0.5-0.7mg/mL，所述葡萄球菌A蛋白的包被浓度为0.15-0.35 mg/mL。
5.根据权利要求书4所述大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒，其特征在于所述胶体金试纸还包括吸水纸、样品层析垫和底板。
6.根据权利要求5所述大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试剂盒，其特征在于所述底板上设有硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜的两端分别设有吸水纸和胶体金结合垫，在胶体金结合垫上设有所述样品层析垫。
7.以非诊断为目的采用权利要求1所述试剂盒检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下步骤：
（1）提取大肠杆菌O157:H7的基因组DNA；
（2）将步骤1获得的基因组DNA作为LAMP反应中的模板DNA，进行LAMP扩增，获得扩增产物；
（3）将步骤（2）得到的扩增产物滴加到胶体金试纸上，观察结果；若只有质控线出现条带，则样品中无大肠杆菌O157:H7；若质控线和检测线均出现条带，则样品中含有大肠杆菌O157:H7。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于所述LAMP扩增的反应条件为55-65℃反应50-70 min，然后在75-90℃反应10-20 min。
9.根据权利要求书8所述方法，其特征在于LAMP扩增体系包括2×LAMP Mix 10μl、ZFIP引物0.8μl、ZBIP引物0.8μl、ZF3引物0.2μl、ZB3引物0.2μl、ZFLP引物0.4μl、ZBLP引物0.4μl、MgCl2 3μl、Bst DNA聚合酶1.5μl、模板DNA 1μl，加ddH2O至终体积为20μl。
CN201910077575.6A 2019-01-25 2019-01-25 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用 Pending CN109536578A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910077575.6A CN109536578A (zh) 2019-01-25 2019-01-25 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910077575.6A CN109536578A (zh) 2019-01-25 2019-01-25 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109536578A true CN109536578A (zh) 2019-03-29

Family

ID=65838381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910077575.6A Pending CN109536578A (zh) 2019-01-25 2019-01-25 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109536578A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172499A (zh) * 2019-06-05 2019-08-27 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法及应用
CN111662963A (zh) * 2020-07-06 2020-09-15 浙江大学 一种检测土壤中大肠杆菌o157:h7活菌的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103866030A (zh) * 2014-04-02 2014-06-18 江苏省农业科学院 大肠杆菌o157:h7的lamp检测引物及检测试剂盒
CN104278098A (zh) * 2014-10-13 2015-01-14 天津市畜牧兽医研究所 肠出血性大肠杆菌o157∶h7 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103866030A (zh) * 2014-04-02 2014-06-18 江苏省农业科学院 大肠杆菌o157:h7的lamp检测引物及检测试剂盒
CN104278098A (zh) * 2014-10-13 2015-01-14 天津市畜牧兽医研究所 肠出血性大肠杆菌o157∶h7 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REZA RANJBAR等: "Visual Detection of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Using Loop-Mediated Isothermal Amplification", 《ELECTRON PHYSICIAN》 *
夏学峰等: "可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7", 《食品安全质量检测学报》 *
王利丽等: "肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用", 《中国兽医科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172499A (zh) * 2019-06-05 2019-08-27 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种提高食源性致病微生物lamp扩增反应效率的方法及应用
CN111662963A (zh) * 2020-07-06 2020-09-15 浙江大学 一种检测土壤中大肠杆菌o157:h7活菌的方法
CN111662963B (zh) * 2020-07-06 2022-03-11 浙江大学 一种检测土壤中大肠杆菌o157:h7活菌的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Sequence of a cloned pR72H fragment and its use for detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish with the PCR
Zink et al. Plasmid-mediated tissue invasiveness in Yersinia enterocolitica
Yadav et al. Pathogenic ‘Bison-type’Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genotype characterized from riverine buffalo (Bubalus bubalis) in North India
Sharma et al. Identification and characterization of toxigenic Fusaria associated with sorghum grain mold complex in India
CN109536578A (zh) 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用
Sun et al. Spent culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis H37Ra improves viability of aged cultures of this strain and allows small inocula to initiate growth
CN102154472B (zh) 一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法
Karahan et al. Detection of Mycoplasma bovis in cattle with mastitis and respiratory problems in eastern Turkey
CN104662146A (zh) 食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法
CN104263839A (zh) 布鲁氏杆菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN107759674A (zh) 一种牛支原体免疫相关性蛋白、含有该蛋白的检测试剂盒及其在牛支原体抗体检测中的用途
CN104342496B (zh) 一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法
Corney et al. Rapid and sensitive detection of Avibacterium paragallinarum in the presence of other bacteria using a 5′ Taq nuclease assay: a new tool for diagnosing infectious coryza
CN107988405A (zh) 一种印第安纳沙门氏菌pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法
CN109517911B (zh) 瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌的双重pcr检测引物及检测方法
CN116445634A (zh) 牛乳房炎病原体多联检测试剂盒及其应用
Chen et al. Further studies on the use of a polymerase chain reaction test for the diagnosis of infectious coryza
Carter et al. Dissociation and virulence in strains of Pasteurella multocida isolated from a variety of lesions
Senthilnathan et al. Isolation and molecular confirmation of Mycoplasma synoviae infection from broiler breeder farms in Tamilnadu
CN111961705A (zh) 一种沙门氏菌的检测方法
Ahmed et al. Isolation and molecular diagnosis of the main bacterial species causing Pneumonia in small ruminants in the Duhok Abattoir-Kurdistan region of Iraq
Netsu et al. Bacterial leaf spot of hemp caused by Xanthomonas campestris pv. cannabis in Japan
CN106701994A (zh) 同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重pcr引物及其检测方法
CN203768362U (zh) 副鸡嗜血杆菌pyrG基因PCR检测试剂盒
CN1771331B (zh) 用于检测沙门氏菌种的stn基因寡核苷酸引物及使用该引物的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190329