CN111662963A - 一种检测土壤中大肠杆菌o157:h7活菌的方法 - Google Patents

一种检测土壤中大肠杆菌o157:h7活菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法。本发明的方法经土壤细胞提取和梯度密度分离处理，通过溴化叠氮丙锭与实时荧光聚合酶链式反应(PMA‑qPCR)快速定量检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌数。该方法能够对土壤中102‑106CFU/g范围内的大肠杆菌O157:H7活菌进行准确定量。与传统培养法相比，该方法具有快速、定量准确、灵敏度高和操作简便的优点。该检测方法优化了土壤悬液高浊度和高死活菌比例的限制因素，提高了该方法适用性。本发明建立的检测方法为土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的快速定量检测提供有效手段。

Description

一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于PMA-qPCR定量检测大肠杆菌O157:H7活菌的方法，以及PMA-qPCR应用于土壤体系条件的优化。
背景技术
大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的食源性病原菌，具有感染剂量低、致病性强的特点，对公众健康构成了重大威胁。近年来，越来越多的疫情爆发与食用被大肠杆菌O157:H7污染的新鲜农产品有关。农田土壤不仅是食源性病原菌的重要源，而且在病原菌的粪-口迁移途径中起重要作用。由于传统培养法耗时久、操作复杂，且不能检测病原菌的“活的非可培养状态(VBNC)”，不能满足目前对农田土壤进行风险评估及致病菌溯源的要求。因此，农产品安全行业亟需快速、准确定量土壤中大肠杆菌O157:H7活菌数的检测技术。
与传统培养法相比，荧光定量PCR(qPCR)技术具有快速、灵敏度高和特异性好的特点，被广泛应用于病原菌的定性和定量检测。由于PCR技术不能区分活菌和死菌，降低了病原菌检测的准确性。叠氮溴化丙锭(PMA)是一种具有光敏反应核酸结合染料，其原理是在强光照射下，PMA中的叠氮基转化为高活性的氮宾基，与DNA碱基反应形成稳定的氮碳键，在后续PCR过程中，形成交联的DNA不会被扩增。活菌具有完整的细胞膜能够阻止PMA渗入与DNA交联，PMA-qPCR能够准确检测病原菌活菌数。对于PMA-qPCR应用复杂土壤体系，排除土壤对PMA的干扰尤为重要。目前，PMA应用主要受限于两个因素：浊度和高比例死菌。土壤悬液体系的高浊度使光交联反应效率下降，导致假阳性结果；高比例的死菌的存在使PMA不足，导致假阳性结果。因此，亟需建立有效的前处理步骤，排除土壤对PMA干扰，实现PMA-qPCR准确定量土壤中大肠杆菌O157:H7活菌数。
发明内容
鉴于PMA-qPCR现有技术应用于土壤体系的不足，本发明解决的问题在于提供一种优化方法降低土壤体系的浊度和死菌的比例，实现PMA-qPCR对土壤中大肠杆菌O157:H7活菌数进行快速定量。本发明对农业中大肠杆菌O157:H7的监测和污染农产品的溯源都具有重要的意义。
本发明具体采用的技术方案如下：
一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其包括以下步骤：
a)分离土壤中的细胞；
b)对步骤a)中细胞悬液进行梯度密度分离处理；
c)以步骤b)收集的菌体DNA为模板，用优化建立的PMA-qPCR反应体系和反应条件，进行实时荧光定量PCR检测；
d)反应结束后，根据荧光定量PCR的扩增曲线和Ct值，基于大肠杆菌O157:H7与Z3276基因的定量标准曲线，计算检测样品中大肠杆菌O157:H7活菌数量。
在上述方案基础上，本发明的各步骤还可以进一步采用如下技术方案实现。
进一步的，所述步骤a)中的土壤中细胞的分离，包括以下步骤：
1)称取土壤样品，加入无菌0.15M PBS缓冲液，样品与PBS缓冲液的质量与体积比是1:9，于150rpm/min振荡5min混合，混合样品置于冰上超声1min，超声后样品置于4℃，500×g离心10min，然后吸取离心后的上清液，离心后的沉淀物重复进行PBS缓冲液混合和离心步骤3次，合并上清液，弃去最终沉淀物；
2)收集步骤1)中的合并上清液过100μm细胞筛，将过筛后的细胞悬液于4℃，8000×g离心10min，再将菌体于200μL PBS缓冲液中重悬，得到细胞悬液A。
进一步的，所述步骤b)中对细胞悬液进行梯度密度分离处理，包括以下步骤：将步骤a)中得到的细胞悬液A平铺在1mL的50％Percoll细胞分离液上，于4℃，13000×g离心30min，收集Percoll溶液层中含细胞的中层和下层，置于另一个无菌2mL离心管内，用200μLPBS缓冲液洗去离心管内的Percoll溶液，得到细胞悬液B。
进一步的，所述步骤c)中PMA-qPCR反应体系和反应条件包含，PMA处理条件，大肠杆菌O157:H7的基因Z3276的引物和探针，内标的模板和探针，以及PCR反应体系和方法。
进一步的，所述PMA处理条件中，PMA处理细胞悬液B包含以下步骤：
1)向离心管内的细胞悬液B中加入PMA，使其终浓度为50μM，充分混匀后暗室孵育10min，然后将离心管水平放置在距离650W卤素灯20cm处的冰上15min，在光照期间，样品管定期振荡混匀样品；
2)将光照完毕后的样品于12000×g离心10min，弃上清后，收集到的沉淀用于DNA提取。
进一步的，所述大肠杆菌O157:H7的基因Z3276的引物和探针序列如下：
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的正向引物Z3276-F序列为：
5’-GCACTAAAAGCTTGGAGCAGTTC
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的反向引物Z3276-R序列为：
5’-AACAATGGGTCAGCGGTAAGGCTA
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的探针序列为：
FAM-CGTTGGCGAGGACC-MGBNFQ
扩增内标探针IAC正向引物IAC-F序列为：
5’-CAGGATTGACAGAGCGAGGTATG
扩增内标探针IAC反向引物IAC-R序列为：
5’-CGTAGTTAGGCCACCACTTCAAG
扩增内标探针IAC探针序列为：
VIC-AGGCGGTGCTACAGAG-MGBNFQ。
进一步的，所述步骤c)中的PCR反应体系如下：
每10μL反应体系含有：
2×Probe Premix：5μL
10μM的Z3276-F：0.1μL
10μM的Z3276-R：0.1μL
10μM FAM标记的Z3276 Probe：0.1μL
10μM的IAC-F：0.1μL
10μM的IAC-R：0.1μL
10μM VIC标记的IAC-Probe：0.1μL
内标PUC19 DNA：0.4μL
模板DNA：2μL
ddH2O：2μL。
进一步的，所述步骤c)中的PCR反应方法为：95℃预变性30s，之后循环40次，每个循环包括95℃变性10s，60℃退火1min，收集FAM和VIC两个荧光信号，循环结束后，结束反应。
本发明的方法经土壤细胞提取和梯度密度分离处理，通过溴化叠氮丙锭与实时荧光聚合酶链式反应(PMA-qPCR)快速定量检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌数。该方法能够对土壤中102-106CFU/g范围内的大肠杆菌O157:H7活菌进行准确定量。与传统培养法相比，该方法具有快速、定量准确、灵敏度高和操作简便的优点。该检测方法优化了土壤悬液高浊度和高死活菌比例的限制因素，提高了该方法适用性。本发明建立的检测方法为土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的快速定量检测提供有效手段。
附图说明
图1本发明中qPCR反应体系的标准曲线；
图2本发明中在高浊度和高死菌比例条件下，优化PMA-qPCR检测水稻土中大肠杆菌O157:H7活菌数。图中，将相同浓度接种到水中的大肠杆菌O157:H7活细胞作为阳性对照；PMA-qPCR和qPCR结果表明病原体浓度的平均值(n＝3)；误差棒代表平均值的标准偏差(SD)；“直接法”代表未经预处理的土壤样品；“步骤a”代表细胞洗脱后的土壤样品；“优化法”代表经过优化的预处理的土壤样品；“阴性对照1”和“阴性对照2”代表接种有热灭活的大肠杆菌O157:H7和不含大肠杆菌O157:H7的土壤样品；通过two-tailed paired Student’s t-test检验，比较了PMA处理后的存活大肠杆菌O157：H7的数量与阳性对照组的差异(*，p＜0.05)。
图3应用优化PMA-qPCR检测四种典型农田土壤中大肠杆菌O157:H7活菌数。图中，优化的PMA-qPCR对在四种土壤中存在死细胞的情况下检测活的大肠杆菌O157:H7的灵敏度；横坐标表示大肠杆菌O157:H7的理论剂量(基于培养的方法)，纵坐标表示通过优化的PMA-qPCR方法检测到的基因Z3276的细胞当量；(A)黑土；(B)红壤；(C)潮土；(D)水稻土；PMA-qPCR结果显示了活的大肠杆菌O157：H7的平均浓度(n＝3)，误差棒代表平均值的标准偏差(SD)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，所用试剂若无特殊说明均可采用现有的市售产品。
实施例1：
一、qPCR反应体系的标准曲线的构建
(1)大肠杆菌O157:H7的培养及其基因组DNA的提取
本发明中使用的大肠杆菌O157:H7是大肠杆菌O157:H7 EDL933(ATCC43895)。将大肠杆菌O157:H7接种至LB培养基中，37℃复活培养12h至对数期(OD600＝1)。将OD600＝1的菌液梯度稀释后于LB平板计数，为菌落形成单位(CFU)。将梯度稀释的大肠杆菌O157:H7进行基因组DNA提取(革兰氏阴性菌基因组DNA提取试剂盒)，将所提DNA溶液于-20℃冻存。
LB培养基配方：10.0g胰蛋白胨、5.0g酵母膏、10.0g氯化钠，加入蒸馏水1000mL溶解，调节pH＝7，高温高压灭菌。
(2)qPCR反应体系的标准曲线的构建
通过使用来自大肠杆菌O157:H7 EDL933提取DNA的连续稀释液对基因进行回归分析，对应的Ct值得到标准曲线(Log CFU/反应-Ct)。标准曲线用于计算细胞当量。本实施例中，所得的荧光定量标准曲线如图1所示。
二、在高浊度和高死菌比例条件下，优化PMA-qPCR检测水稻土中大肠杆菌O157:H7活菌数
(1)为保证土壤中高死菌比例，以高温高压灭菌的水稻土作为研究对象，添加102CFU/g活菌和107CFU/g死菌大肠杆菌O157:H7并混合均匀(死活菌比例为0.001％)。设置三个实验组，分别是未经任何处理的土壤(记为直接法组)、经细胞分离的土壤悬液(记为步骤a组)和优化的预处理后的土壤(记为优化法组)。另外，将接种到水中相同浓度的大肠杆菌O157:H7活细胞作为阳性对照，将未添加大肠杆菌O157:H7和添加热灭活大肠杆菌O157:H7分别作为阴性对照。大肠杆菌O157:H7死菌的制备通过75℃水浴30min得到。
其中，上述优化法组中，检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的步骤如a)～d)所示：
a)分离土壤中的细胞，包括以下步骤：
1)称取土壤样品，加入无菌0.15M PBS缓冲液，样品与PBS缓冲液的质量与体积比是1:9，于150rpm/min振荡5min混合，混合样品置于冰上超声1min，超声后样品置于4℃，500×g离心10min，然后吸取离心后的上清液，离心后的沉淀物重复进行PBS缓冲液混合和离心步骤3次，合并上清液，弃去最终沉淀物；
2)收集上一步骤中的合并上清液过100μm细胞筛，将过筛后的细胞悬液于4℃，8000×g离心10min，再将菌体于200μL PBS缓冲液中重悬，得到细胞悬液A。
b)对步骤a)中细胞悬液进行梯度密度分离处理，包括以下步骤：将步骤a)中得到的细胞悬液A平铺在1mL的50％Percoll细胞分离液(比重1.067g/mL)上，于4℃，13000×g离心30min，收集Percoll溶液层中含细胞的中层和下层，置于另一个无菌2mL离心管内，用200μL PBS缓冲液洗去离心管内的Percoll溶液，得到细胞悬液B。
c)以步骤b)收集的菌体DNA为模板，用优化建立的PMA-qPCR反应体系和反应条件，进行实时荧光定量PCR检测。此处，PMA-qPCR反应体系和反应条件包含，PMA处理条件，大肠杆菌O157:H7的基因Z3276的引物和探针，内标的模板和探针，以及PCR反应体系和方法，其具体如i)～iv)所述：
i)PMA处理条件中，PMA处理细胞悬液B包含以下步骤：
1)向离心管内的细胞悬液B中加入PMA，使其终浓度为50μM，充分混匀后暗室孵育10min，然后将离心管水平放置在距离650W卤素灯20cm处的冰上15min，在光照期间，样品管定期振荡混匀样品；
2)将光照完毕后的样品于12000×g离心10min，弃上清后，收集到的沉淀用于DNA提取。
ii)大肠杆菌O157:H7的基因Z3276的引物和探针序列如下：
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的正向引物Z3276-F序列为：
5’-GCACTAAAAGCTTGGAGCAGTTC
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的反向引物Z3276-R序列为：
5’-AACAATGGGTCAGCGGTAAGGCTA
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的探针序列为：
FAM-CGTTGGCGAGGACC-MGBNFQ
扩增内标探针IAC正向引物IAC-F序列为：
5’-CAGGATTGACAGAGCGAGGTATG
扩增内标探针IAC反向引物IAC-R序列为：
5’-CGTAGTTAGGCCACCACTTCAAG
扩增内标探针IAC探针序列为：
VIC-AGGCGGTGCTACAGAG-MGBNFQ。
iii)PCR反应体系如下：
每10μL反应体系含有：
2×Probe Premix：5μL
10μM的Z3276-F：0.1μL
10μM的Z3276-R：0.1μL
10μM FAM标记的Z3276 Probe：0.1μL
10μM的IAC-F：0.1μL
10μM的IAC-R：0.1μL
10μM VIC标记的IAC-Probe：0.1μL
内标PUC19 DNA：0.4μL
模板DNA：2μL
ddH2O：2μL。
iv)PCR反应方法为：95℃预变性30s，之后循环40次，每个循环包括95℃变性10s，60℃退火1min，收集FAM和VIC两个荧光信号，循环结束后，结束反应。
d)反应结束后，根据荧光定量PCR的扩增曲线和Ct值，基于前述获得的大肠杆菌O157:H7与Z3276基因的标准曲线，计算检测样品中大肠杆菌O157:H7活菌数量。
另外，上述直接法组与优化法组的区别在于，不对土壤进行步骤a)和b)的处理，直接进行PMA-qPCR；上述步骤a组与优化法组的区别在于，对土壤进行步骤a)但不进行步骤b)的梯度密度分离处理，然后进行步骤c)和d)的PMA-qPCR。
图2展示了不同处理组中PMA-qPCR检测水稻土中大肠杆菌O157:H7活菌数的结果。结果表明，经过本发明优化法的预处理后，该优化法能够将水稻土悬液的浊度由3500NTU下降至28.4NTU，死活菌比例由0.001％提高至1.025％。
而且优化法组PMA-qPCR得到的活菌数与阳性对照组一致，而直接法组和步骤a组处理后均高估实际活菌数，造成假阳性结果(P＜0.05)。由此表明该优化PMA-qPCR方法定量准确，有效的排除了高浊度和高死菌比例的影响。
实施例2：
本实施例中，利用实施例1中的优化法对自然环境中的实际土壤进行大肠杆菌O157:H7活菌定量。将该优化法应用于四种典型土壤：黑土，红壤，潮土和水稻土，结果如图3所示。结果表明，在四种典型土壤中，该优化的PMA-qPCR方法能够对102-106CFU/g的大肠杆菌O157:H7活菌进行准确定量。
该优化的PMA-qPCR方法可节省大量时间(6小时相比24小时)，并且可实现与培养法相当的准确定量能力。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)分离土壤中的细胞；
b)对步骤a)中细胞悬液进行梯度密度分离处理；
c)以步骤b)收集的菌体DNA为模板，用优化建立的PMA-qPCR反应体系和反应条件，进行实时荧光定量PCR检测；
d)反应结束后，根据荧光定量PCR的扩增曲线和Ct值，基于大肠杆菌O157:H7与Z3276基因的定量标准曲线，计算检测样品中大肠杆菌O157:H7活菌数量。
2.如权利要求1所述的一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，所述步骤a)中的土壤中细胞的分离，包括以下步骤：
1)称取土壤样品，加入无菌0.15M PBS缓冲液，样品与PBS缓冲液的质量与体积比是1:9，于150rpm/min振荡5min混合，混合样品置于冰上超声1min，超声后样品置于4℃，500×g离心10min，然后吸取离心后的上清液，离心后的沉淀物重复进行PBS缓冲液混合和离心步骤3次，合并上清液，弃去最终沉淀物；
2)收集步骤1)中的合并上清液过100μm细胞筛，将过筛后的细胞悬液于4℃，8000×g离心10min，再将菌体于200μL PBS缓冲液中重悬，得到细胞悬液A。
3.如权利要求2所述的一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，所述步骤b)中对细胞悬液进行梯度密度分离处理，包括以下步骤：将步骤a)中得到的细胞悬液A平铺在1mL的50％Percoll细胞分离液上，于4℃，13000×g离心30min，收集Percoll溶液层中含细胞的中层和下层，置于另一个无菌2mL离心管内，用200μL PBS缓冲液洗去离心管内的Percoll溶液，得到细胞悬液B。
4.如权利要求3所述的一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，所述步骤c)中PMA-qPCR反应体系和反应条件包含，PMA处理条件，大肠杆菌O157:H7的基因Z3276的引物和探针，内标的模板和探针，以及PCR反应体系和方法。
5.如权利要求4所述的一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，所述PMA处理条件中，PMA处理细胞悬液B包含以下步骤：
1)向离心管内的细胞悬液B中加入PMA，使其终浓度为50μM，充分混匀后暗室孵育10min，然后将离心管水平放置在距离650W卤素灯20cm处的冰上15min，在光照期间，样品管定期振荡混匀样品；
2)将光照完毕后的样品于12000×g离心10min，弃上清后，收集到的沉淀用于DNA提取。
6.如权利要求4所述的一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，所述大肠杆菌O157:H7的基因Z3276的引物和探针序列如下：
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的正向引物Z3276-F序列为：
5’-GCACTAAAAGCTTGGAGCAGTTC
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的反向引物Z3276-R序列为：
5’-AACAATGGGTCAGCGGTAAGGCTA
大肠杆菌O157:H7的Z3276基因的探针序列为：
FAM-CGTTGGCGAGGACC-MGBNFQ
扩增内标探针IAC正向引物IAC-F序列为：
5’-CAGGATTGACAGAGCGAGGTATG
扩增内标探针IAC反向引物IAC-R序列为：
5’-CGTAGTTAGGCCACCACTTCAAG
扩增内标探针IAC探针序列为：
VIC-AGGCGGTGCTACAGAG-MGBNFQ。
7.如权利要求4所述的一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，所述步骤c)中的PCR反应体系如下：
每10μL反应体系含有：
2×Probe Premix：5μL
10μM的Z3276-F：0.1μL，
10μM的Z3276-R：0.1μL
10μM FAM标记的Z3276 Probe：0.1μL
10μM的IAC-F：0.1μL
10μM的IAC-R：0.1μL
10μM VIC标记的IAC-Probe：0.1μL
内标PUC19 DNA：0.4μL
模板DNA：2μL
ddH2O：2μL。
8.如权利要求4所述的一种检测土壤中大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征在于，所述步骤c)中的PCR反应方法为：95℃预变性30s，之后循环40次，每个循环包括95℃变性10s，60℃退火1min，收集FAM和VIC两个荧光信号，循环结束后，结束反应。
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